Cours SL partie I

Cours de Biologie moléculaire
de Licence professionnelle 2011
Sommaire
1. Introduction
2.1. La structure de l’ADN
2.2. La structure de l’ARN
2.3. Du gène à la protéine
2.3.1. La réplication
2.3.2. La transcription
2.3.3. La traduction
3. Biotechnologie de l’ADN
3.1. Technologie de l’ADN recombinant
3.1.1. Isolation d’ADN et d’ARN
3.1.2. Fragmentation de l’ADN
(les Endonucléases)
3.1.3. Analyse d’ADN sur d’agarose et
d’acrylamide
3.1.4. Les vecteurs de clonage
3.1.5. La ligation
3.1.6. Transformations de bactéries
3.1.7. Techniques d’hybridation d’acides
nucléiques
3.2. Le séquencage
3.3. La réaction en chaîne en présence de polymérase
(PCR)
2.1. La structure de l’ADN : La double hélice
2.1. La structure de l’ADN : le nucléotide
5’
3’
1’
3’-5’ phosphodiester link
Schéma d’un nucléotide
L’ADN est une succession linéaire de nucléotides.
2.1. La structure de l’ADN : le ribose et le desoxyribose
Les pentoses
ribose
OH
2-désoxyribose
H
Le pentose de l’ADN est le 2-désoxyribose.
2.1. La structure de l’ADN : les bases azotées
adénine
uracil
cytosine
thymine
Pyrimidine
Purine
guanine
L’ADN contient : l’adénine (A), la guanine (G),
la cytosine (C) et la thymine (T)
2.1. La structure de l’ADN : Structure chimique du
désoxy-AMP
L’atome C5 du sucre peut être
estérifié par un, deux ou trois
groupes phosphoryle.
Les groupements phosphate
confèrent un caractère acide
aux nucléotides.
HH
2.1. La structure de l’ADN :
La structure d’un seul brin
Le phosphate de chaque nucléotide est
lié au glucide du nucléotide suivant.
Les nucléotides sont liées par un pont
phosphodiester entre les atomes de
carbone 3’ et 5’.
2.1. La structure de l’ADN :
l’orientation chimique d’un
polynucléotide
5’end
Sur une extrémité la chaîne se termine
sur le carbone 5 (portant un
groupement phosphate) du sucre,
sur l’autre extrémité sur le carbone 3
(portant un groupe hydroxyl).
Convention : les polynucléotides sont
tracés et lus dans le sens 5’-3’
3’end
2.1. La structure de l’ADN :
Structure chimique du désoxy-ATP
γ
β
α
Η
2.1. La structure de l’ADN : la prolongation de la chaîne
extrémité 5’phosphate
extrémité 3’hydroxyl
La synthèse des polynucléotides se fait dans le sens 5’ – 3’
2.1. La structure de l’ADN : l’appariement des bases
Campbell (2eéd.) — Figure 16.6 : 315
2.1. La structure de l’ADN : la double hélice
L’orientation des deux brins est anti-parallèle
OH
extrémité 5’
5’
2’
1’
3’
1’
4’
4’
3’
2’
extrémité 3’
5’
extrémité 5’
extrémité 3’
OH
OH
Campbell (2eéd. Fra.)
— Figure 16.5 : 314
2.1. La structure de l’ADN : l’hélice bicaténaire
L’orientation des deux chaînes est anti-parallèle :
un brin est orienté dans le sens 5’-3’, alors que l’autre brin est 3’-5’.
2.1. La structure de l’ADN : la double hélice
OH
extrémité 5’
5’
2’
1’
3’
1’
4’
4’
3’
2’
extrémité 3’
5’
extrémité 5’
extrémité 3’
OH
OH
Campbell (2eéd. Fra.)
— Figure 16.5 : 314
2.1. La structure de l’ADN : la double hélice d’ADN
AA
B
A. Le squelette sucre-phosphate est à l’extérieur et porte des
charges négatives.
B. Hélice vue d’une de ses extrémités.
2.1. La structure de l’ADN : dénaturation et
renaturation de deux molécules d’ADN
Séparation des deux brins sans rupture des liaisons covalentes et leur
réassociation.
2.1. La structure de l’ADN : Absorption de lumière
ultra-violette (260nm)
40%G/C : Tm = 87°C
La température à laquelle la moitié des bases de l’ADN ont perdu
leur appariement est appelée Tm (melting temperature).
2.2. La structure de l’ARN : Squelette pentose-phosphate
de l’ARN
L’ARN contient du ribose à la place désoxyribose.
Il contient l’uracile (U) à la place de la thymine (T).
Il existe plutôt sous forme monocaténaire.
2.2. La structure de l’ARN : une structure secondaire
Micrographie électronique d’un ARN
L’ARN est monocaténaire mais certaines de ses régions sont appariées.
2.2. La structure de l’ARN : structures secondaires et
tertiaires
Tige-boucle
Epingle à
cheveux
Pseudo-nœud
On trouve un appariement de segments non jointifs complémentaires
de molécules d’ARN.
Structure secondaire et tertiaire d’un plasmide d’ADN
Micrographie électronique de l’ADN isolé
d’un virus
Forme I : superhélicoïdale
Forme II : cercle relâché
On obtient la forme II par incision d’un des deux brins.
2.3. Du gène à la protéine :
Les voies génétiques fondamentales
L’information est conservée
grâce à la réplication.
transcription
L’information est exprimée
grâce à la transcription et
à la traduction.
traduction
2.3.1. La réplication :
Principes généraux de la synthèse des acides nucléiques
-L’expression de l’information génétique est en général
unidirectionnelle.
- La traduction de l’ARN en protéine est toujours irréversible.
-Le brin d’acide nucléique grandit uniquement dans le sens 5’-3’.
-Les ADN polymérases copient l’ADN en ADN additionnel; la
copie précise d’un acide nucléique par une polymérase exige
toujours une matrice et une amorce (3’-OH).
-Les ARN polymérases copient l’ADN en ARN; elles exiges aussi
une matrice mais peuvent débuter la synthèse d’un brin d’acide
nucléique de novo.
2.3.1. La réplication : le mécanisme semi-conservatif
Fragments
Okazaki
Chaîne Chaîne
précoce tardive
2.3.1. L’initiation à la réplication chez les bactéries
2.3.1. La réplication : Synthèse d’une amorce d’ADN
L’ADN primase peut débuter une
nouvelle chaîne
polynucléotidique.
Elle synthétise de courtes amorces
d’ARN dont l’ADN polymérase a
besoin sur la branche tardive.
2.3.1. L’ADN polymérase III holoenzyme d’E. coli
The DNA polymerase III holoenzyme is a multisubunit complex, which consists of 17
polypeptides. It contains four subassemblies. First, the core polymerase consists of
three subunits: alpha (the polymerase); etha (the 3'–5' exonuclease); and teta (the
stimulator of the 3'–5' exonuclease). Second, the tau subunit is responsible for
dimerization of the core DNA polymerase. Third, the sliding clamp comprises two
homodimers of the beta subunit, which provides the ring structure that is needed for
processivity. Fourth, five other subunits have clamp-loader functions.
2.3.1. La réplication :
Synthèse d’un fragment
d’ADN sur le brin tardif
Intervention de :
-
la primase
l’ADN polymérase III
l’ADN polymérase I
la ligase
2.3.1. La réplication : l’ADN ligase
La ligase utilise une
molécule d’ATP pour
activer l’extrémité 5’ au
niveau de la brèche
2.3.1. La réplication : « le problème d’enroulement »
Figure 5-24
.
For a bacterial replication fork moving at 500 nucleotides per second, the
parental DNA helix ahead of the fork must rotate at 50 revolutions per second.
2.3.1. La réplication : l’ADN topo-isomérase
ADN topo-isomérase avec une tyrosine
Elle se fixe de façon covalente sur un
phosphate coupant une liaison phosphodiester
Les deux extrémités peuvent tourner l’une par
rapport à l’autre et soulager la tension accumulée
L’énergie de la liaison phosphodiester est conservée dans la
liaison phosphotyrosine, ce qui rend la réaction réversible
2.3.1. La réplication : Principaux types de protéines
qui agissent au niveau de la fourche de réplication
DNA polymérase
Topo-isomérase
amorce d’ARN
Fragment Okazaki
DNA hélicase
DNA primase
protéines de liaison à
l’ADN simple brin
Primosome