Utilisation de souches de bactéries lactiques
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! ! Utilisation de souches de bactéries lactiques recombinantes en santé ! ! ! ! MEMOIRE BIBLIOGRAPHIQUE DU MASTER Sciences et Technologies du Vivant et de l’Environnement « Nutrition et santé» Institut National de la Recherche Agronomique o Adresse : Domaine de Vilvert, 78350 Jouy-en-Josas o Equipe : ProbiHote, Luis Bermudez et Philippe Langella o Unité : Microbiologie de l’Alimentation au service de la Santé (MICALIS) L'Institut des sciences et industries du vivant et de l'environnement, AgroParisTech Master : Nutrition Santé Enseignant référent : Anne Marie Davila Etudiant : Thomas LARCHER, 2ème année de master 1 REMERCIEMENTS Je remercie Philippe Langella et Luis Bermudez pour m’avoir permis de réaliser ce mémoire au sein de l’unité d’écologie et physiologie du système digestif à l’INRA de Jouy en Josas. Je remercie tout particulièrement Luis Bermudez et Anne Judith Waligora-Dupriet pour leurs disponibilités et leurs conseils. 2 SOMMAIRE !"! !#$%&'()$*&#+"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""+,! -"! ./+0#1+'23*1$&*%4+5*)%&6*4##4+""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""+,! 7"! 80$(%4+'41+9%&6*&$*:(41+"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""+;! <"! =%&6*&$*:(41+4$+5>)0#*154+'4+?2*55(#*$>"+""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""+@! !!"! 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E"! <&#)?(1*&#1+4$+94%194)$*G41+"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""+D@! !!!"! 7*6?*&B%093*4+"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""+S/! 3 SOMMAIRE DES FIGURES 4 LEXIQUE Ag ANSES BLGM CAT CD CPA DC FAO GALT GC GRAS hIL-10 IFN IL LAB LB MICI NDR OGM PPR ROS SOD TLR TNBS UC WHO ! Antigène Agence National de Sécurité Sanitaire Bactérie Lactique Génétiquement Modifié Catalase Maladie de Crohn Cellule(s) présentatrice(s) d'antigène(s) Cellule(s) Dendritique(s) Food and Agriculture Organization Gut Associated Lymphoïd Tissu Guanine - cytosine Generally Recognized As Safe Cytokine humaine 10 Interféron Interleukine Bactérie Lactique (Acid Lactic Bacteria) Lymphocyte B Maladie Inflammatoire Chronique de L'intestin Nod Like Receptor Organisme génétiquement modifié Patterns Recognition Receptor Espèces réactives de l'oxygène Superoxyde dismutase Toll Like Receptor 2,4,6-acide trinitrobenzene sulfonic Rectocolite hémorragique World Health Organization ! 5 I. INTRODUCTION ! A. 50 ans d’histoire microbienne Henry Tissier fut le premier à isoler une bifidobactérie à partir d’enfants nourris aux seins. Il affirma que cette bifidobactérie pourrait remplacer la bactérie protéolytique qui cause des diarrhées chez l’enfant. Metchnikoff au début du XXème siècle est le précurseur des recommandations sur les effets bénéfiques des bactéries (Dobrogosz et al., 2010). Le terme probiotique sera introduit par Lilly et Stillwell en 1965, le définissant comme « facteur d’origine microbienne qui stimule la croissance d’autres organismes » (Lilly and Stillwell, 1965). Dès lors, les premiers articles sont publiés et les premières opinions sont émises sur l’effet des probiotiques sur la santé. Certains clament aux effets bénéfiques tandis que d’autres sont sceptiques quant au traitement par des souches bactériennes. La divergence des avis tente d’être recadrée en 1998 par Guarner et Shaafsma lors d’un court communiqué (Guarner and Schaafsma, 1998). Néanmoins, il faudra attendre 2001 pour que la commission d’experts de la Food and Agriculture Organization (FAO) et WHO adopte l’idée de Guarner et Schaafsma définissant le terme probiotique par des « micro-organismes vivants qui, ingérés en quantité convenable, ont des effets bénéfiques sur la santé allant au-delà des vertus nutritives inhérentes des aliments » (Fao Who, 2001). En 2001, la notion de modulation du microbiote par les probiotiques est supprimée, l’effet des probiotiques est généralisé à des vertus sur la santé. Le tube digestif contient 100 milliards de bactéries qui fournissent une moyenne de 600.000 gènes. Principalement situées dans le colon, il a été dénombré une centaine d’espèces bactériennes. La diversité inter-individuelle du microbiote est remarquable. Comme un code génétique unique à chaque individu, il diffère en fonction du génotype de l'hôte et de la colonisation initiale à la naissance. Chez l'adulte sain, la composition de l'écosystème intestinal se subdivise en trois familles dominantes : Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobactérie (?4+(%4/!") (Guarner et al., 2012). Au cours des dernières décennies, la recherche tente d'élucider les différents effets probiotiques mais la complexité de l'écosystème gastro-intestinal met à rude épreuve l’actuelle compréhension du microbiote. Aujourd’hui, la demande des consommateurs des 6 méthodes de traitement "naturel" se faisant de plus en plus forte, les industriels voient un marché florissant dans l'utilisation de bactéries lactiques. Danone est l'exemple même avec ses deux produits phares que sont Activia avec Bifidobacterium et Actimel avec Lactobacillus. casei (Mercenier et al., 2003). Ce marché s’élèverait aujourd’hui à 6 milliards de dollars. Néanmoins, les réglementations actuelles sont de plus en plus restreintes. ANSES n’autorise plus ces produits commerciaux à vanter les effets probiotiques tant qu’il n’existe pas des preuves cliniques. C'est donc avec précaution et beaucoup d'intérêt que la sélection de probiotiques naturels et bénéfiques sur la santé doit s'établir. B. Nature des probiotiques Un probiotique est généralement d’origine humaine et non pathogène. La bibliographie le décrit comme : « Generally Recognized As Safe » (GRAS). Ils sont génétiquement stables, résistants à la bile et aux acides intestinaux (?4+(%4/!:) (Gupta and Garg, 2009). En effet, on leur reconnaît des propriétés bénéfiques dans la santé, cliniquement prouvées. Les traitements probiotiques, décrits dans la littérature, prouvent une inhibition de la population microbienne pathogène (Kotowska et al., 2005), une capacité d’induire une communication avec les cellules épithéliales pour stimuler les mécanismes de l’immunité (Moussu et al., 2012). Aujourd’hui il n’y a que très peu de recommandation médicale en France sur l’utilisation des probiotiques. Des études sont en développement et montrent des implications potentielles. Les résultats d’une méta-analyse de Doege et al. en 2012 démontrent un effet protecteur significatif sur l’eczéma des enfants prédisposés, lors d’administration prénatale de lactobacilles (Doege et al., 2012). Outre les levures, Lactobacillus, Bifidobacterium, Escherichia, Enterococcus, Bacillus et Streptococcus sont les genres bactériens les plus communément utilisés dans les préparations probiotiques. Les bactéries lactiques (LAB) incluant les Lactobacillus et Bifidobacterium sont habituellement utilisées pour la préservation des aliments ou comme agent de fermentation. Les LAB constituent un groupe très hétérogène de micro-organismes qui occupent une large niche écologique à la surface du tube digestif. 7 ! Tableau 1 Composition microbiote intestinal (Mahowald et al., 2009). R42-%&*,0%-%1! @ R#!7&46,(,1! @ R#!-3%-4,*-4*<,2&*;! @ R#!*54-/1! L2-,;*+42-%&,4! @ R,S,0*+42-%&,/<! ,;74;-,1! @ R#!+&%5%! @ R#!(*;6/<! P,&<,2/-%1! @ Q(*1-&,0,/<!1))#! @ P#!)&4/1;,-T,,! @ Q(*1-&,0,/<! +*(-%4%! Tableau 2 Caractéristiques générales d’un probiotique F82/&,-8! @ A&,6,;%!3/<4,;%! @ B*;!)4-3*6C;%! @ DE%<)-%!0%!742-%/&1!0%!5,&/(%;2%! ?%23;*(*6,%! @ G8;8-,./%<%;-!1-4+(%! @ H,4+(%!4/!2*/&1!0%!(4!74+&,24-,*;!%-!(%!1-*2I46%! @ J81,1-4;2%!4/E!+42-8&,*)346%1! @ K&*)&,8-81!1%;1*&,%((%1! @ L)-%!M!(4!)&*)464-,*;!M!6&4;0%!%23%((%! P*;2-,*;;4(,-81! @ ?*(8&4;2%!4/!1/2!641-&,./%!%-!M!(4!+,(%! @ H,4+(%!%-!<8-4+*(,./%<%;-!42-,5%!N/1./OM!14!2,+(%! @ L038&%;-!M!(4!</./%/1%!,;-%1-,;4(%! D77%-1!14;-8! @ Q(,;,./%<%;-!)&*/58%! Sources AM. Davilla 8 Ce sont des bactéries Gram-positives, anaérobies facultatives, non sporulantes, avec la capacité à produire de l’acide lactique à partir de glucides (Bermúdez-Humarán, 2009). De plus, les bactéries lactiques ont fait l’objet d’études cliniques sur le syndrome du colon irritable (IBS). En 2008 l’équipe de Zeng montre une diminution de la perméabilité de l’intestin grêle, mais pas du côlon (Zeng et al., 2008). La même année une équipe française a montré des résultats dans la diminution des douleurs abdominales et la fréquence des selles. Drouault-Holowacz et al. ne montrent pas de différence significative dans le soulagement de la douleur entre le mélange probiotiques administré et le placebo (Drouault-Holowacz et al., 2008). Zhang et al., en 2012, concluent que les probiotiques LAB permettent de minimiser l’apparition de maladies infectieuses de l’intestin, sources de cancers colorectaux. Ils auraient comme attribut d’éviter les translocations bactériennes, d’améliorer l’efficacité immunitaire et prévenir du stress (Zhang et al., 2012). Les essais cliniques de LAB sont peu nombreux et montrent des résultats modérés sur le traitement de maladies. Ils auraient, toutefois, des aspects préventifs admis. C. Probiotiques et mécanisme de l’immunité. La muqueuse intestinale est la première ligne de défense contre les invasions pathogènes et toxiques provenant des aliments. Après ingestion, les antigènes sont en contact avec le GALT (tissu lymphoïde associé à la muqueuse). C’est une organisation extrêmement contrôlée pour protéger l’hôte des pathogènes par stimulation du système immunitaire, ou bien moduler la réponse immune en vue de tolérer les bactéries commensales (Figure 1). Le transport d’antigènes (Ag) vers les GALT est effectué par des cellules spécialisées, appelées cellule M (Kim et al., 2012). Les cellules M sont des cellules épithéliales dépourvues de microvillosité qui présentent une invagination en poche. Des cellules B, cellules T, et macrophages sont localisés dans les plaques de Players formant un follicule sous les cellules M. Les Ag transitant à la surface peuvent être transportés au sein des follicules lymphoïdes, induisant la différenciation des LB en plasmocytes. Ces derniers migrent le long de la sous-muqueuse produisant des IgA dans la lumière et induisent une réponse immunitaire de type Th1, Th2, ou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igure 1 Modulation de la réponse adaptative dans l’intestin par le microbiote a. La réponse immunitaire adaptative est initiée dans les plaques de Player. Les cellules B et T quittent le tissu lymphoïde pour la lamina propria de l’intestin par la voie systémique. Les bactéries peuvent être en contact directement avec les cellules dendritiques qui traversent la paroi épithéliale. b. Les produits dérivant du microbiote activent les Toll-like receptors (TLR) qui sont exprimés par les cellules épithéliales. La liaison d’un Antigène au TLR va induire une activation des cellules B et T dépendantes et indépendantes de la sécrétion d’IgA. Les cellules plasmatiques vont sécréter des IgA dans la lumière intestinale. c. Les Cellules Dendritiques (DC) induisent, au contact avec un antigène, FOXP3 et les cellules T régulateurs qui vont réguler la balance Th1/Th2/Th17. Th17 (Medzhitov, 2007). Les Ag peuvent être également endocytés par des cellules présentatrices d’antigènes (CPA) dans le but d’induire la réponse immunitaire adaptative. Les cellules de l’immunité innée, telles que les phagocytes, reconnaissent les bactéries grâce aux « Patterns Recognition Receptor » (PPR). Les PPR regroupent l’ensemble des récepteurs de surface Toll Like Receptor (TLR) et les récepteurs intracellulaires Nod Like Receptor (NOD). L’association d’un PPR à un ligand bactérien va induire l’activation de MyD88, qui activera à son tour la cascade de transduction liée à Nf-!B pour produire des cytokines proinflammatoires du type IL-1, IL-6, IL-8 ou encore TNF-" conduisant la réponse immune innée et/ou adaptative (Lee et al., 2007). Le dialogue entre hôte et microbiote intestinal est régi par un équilibre essentiel. Les médiateurs de cette homéostasie sont les cellules T régulateurs (Treg) qui régissent l’équilibre Th1/Th2/Th17 induisant une tolérance entre microbiote et système immunitaire (De Moreno de Leblanc et al., 2011). La rupture de cet équilibre par la modification de l’écosystème, par exemple une dysbiose, engendrera des conséquences pour l’hôte telle que l’induction inflammatoire anormale caractéristique des MICI (Kaur et al., 2011). Pour lutter contre les infections chroniques, les recherches de bactéries commensales probiotiques ont fait l’objet d’articles de qualité. Sokol et al. en 2008, ont étudié les propriétés modulatrices du système immunitaire de la souche Faecalibacterium prausnitzii A2-165. Une étude clinique précédente mettait en évidence la diminution de F.prausnitzii dans l’iléon des patients qui rechutaient après une opération par rapport à des patients en rémission de la maladie de Crohn (CD). Des recherches in vivo ont prouvé que cette souche modifiait la sécrétion de cytokines pro/anti-inflammatoires. Ces résultats ont été confirmés par des études in vitro, démontrant l’inhibition de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires via la voie Nf-!B (Sokol et al., 2008). II. LES BACTERIES MODIFIEES LACTIQUES GENETIQUEMENT La découverte d’effets probiotiques des LAB est prometteuse. Les scientifiques considèrent la possibilité de les utiliser en tant que vecteur génétique. Cette nouvelle science est un domaine d’avenir en terme de biothérapie. Les implications sont multiples et les premières perspectives 10 sont d’améliorer les propriétés d’adhésion à la paroi intestinale (Gleinser et al., 2012), de surexprimer des protéines à intérêt dans l’objectif de créer de nouveaux types de vaccins (Bermúdez-Humarán et al., 2011), ou de moduler le système immunitaire (Philippe et al., 2011). Dans ce mémoire bibliographique, je me suis efforcé d’exploiter les connaissances actuelles des bactéries lactiques génétiquement modifiées (BLGM) et leurs implications sur la santé, notamment sur la modulation du système immunitaire. J’ai ensuite orienté mes recherches sur les perspectives potentielles que peut apporter le genre LAB : Bifidobacterium. Aujourd’hui, des données dans la littérature supportent l’idée que les LAB sont d’excellents candidats pour délivrer des vecteurs thérapeutiques. Néanmoins, les stratégies envisagées ne déboucheront pas dans l’immédiat à une utilisation médicale pour des raisons législatives d’interdiction des OGM en Europe. Les discussions autour de ce sujet s’intensifient (Séralini et al., 2012; ANSES, 2012). Dans un avenir proche, espérons qu’il sera possible de constater un retour des opinions en faveur de ces avancés en santé. A. BLGM vecteur d’antigènes et de pathogènes Le papillomavirus humain de type 16 (HPV-16) est un virus à potentiel oncogène que l'on retrouve dans 90% des cancers du col de l'utérus. Les stratégies actuelles mises en vigueur pour prévenir ou traiter l’infection sont prometteuses mais couteuses. Deux vaccins Gardasil et Cervarix ont été autorisés, ils contiennent des pseudo-virus qui ne sont pas infectieux, et doivent nécessairement être injectés avant le début de la vie sexuelle (Pasteur, 2012). Des polémiques sur des effets secondaires de ces vaccins ont fait l’objet de nombreuses revendications. La présence de particules antigéniques dans les tissus vasculaires cérébraux pourrait, selon une équipe scientifique, être à l’origine de problèmes neurologiques et de réactions auto-immunes (Tomljenovic et al., 2012). Récemment la Haute Autorité de Santé a rendu un avis du comité de la transparence notant l’efficacité du vaccin et l’absence d’effet secondaire anormal. L'équipe de Philippe Langella et Luis Bermùdez-Humaran travaille depuis 10 ans sur la construction d’une souche vaccinale afin de lutter contre l'HPV-16. L’objectif à long terme serait de développer un vaccin plus économique et plus stable pour des populations dont les moyens de santé sont faibles (Cortes-Perez et al., 2009). La facilité d'administration d'un 11 Figure 2 Protection des tumeurs par traitement des BLGM in vivo dans un modèle murin. Chaque groupe de souris a été immunisé au jour 0, 14, et 28 par la souche L. Lactis (LL), L. Lactis recombinante avec l’antigène E7 (LL-E7), et L. Lactis recombinante avec l’antigène E7 et IL-12. La figure A représente le volume des tumeurs en cm3 à la fin de la 5ème semaine. La figure B représente l’évolution dans le temps du volume des tumeurs et l’importance des tumeurs est indiquée entre parenthèses. 100% des souris traitées à LL développent des tumeurs malignes, 35% des souris traitées à LL-E7 présentent des tumeurs libres et 65% pour les souris traitées avec le vecteur LL-E7-IL12. La co-délivrance de IL-12 permet d'augmenter significativement la protection de tumeur chez le modèle murin. vaccin muqueux est moins contraignante qu'un vaccin systémique. Il est moins cher à développer et moins invasif ; c’est un atout pour les populations en bas âge et les patients immunodéprimés. De plus les voies intestinales permettent de stimuler les IgG plasmatiques et les IgA des muqueuses. Les recherches les ont menés à découvrir que l'administration de l'antigène E7 par L. Lactis recombinant, induisait chez la souris une réponse immunitaire spécifique (Figure 2). La codélivrance de IL-12 permet d'augmenter significativement la protection de tumeur chez le modèle murin. La mise au point d’un vecteur codant pour une protéine dont la structure est semblable à la protéine de capside L1 du HPV-16 est une nouvelle approche de vaccination plus sécurisée. L’efficacité a été prouvée sur le modèle murin (Bermúdez-Humarán et al., 2005). Mohamadzadeh et al. en 2009 ont pour objectif de construire un vaccin contre B. anthracis via une souche Lactobacillus acidophilus génétiquement modifiée. L'originalité de leurs manipulations réside dans la fusion de l'antigène avec un peptide spécifique des cellules dendritiques (DCpep) (Mohamadzadeh et al., 2009). Les DC captent les antigènes dans la lumière intestinale via des ramifications qui s’étendent entre les jonctions des cellules épithéliales. Les auteurs tirent à leur avantage ce système, en utilisant un peptide 12-mer qui se lie spécifiquement à la surface des membranes DC. Le DC-pep stimulerait plus efficacement le système immunitaire et induirait la maturation des cellules T (Curiel et al., 2004; Mohamadzadeh et al., 2008). 75% des souris vaccinées avec DCpep survivent contre seulement 25% avec la souche recombinante seule (Figure 3). Ensuite l'induction des cytokines est mesurée avant et après exposition au pathogène. IL-6, TNF-" sont surexprimés avant tout contact avec l'antigène dans la souche L. acidphilus GM+DCpep (Figure 4A). Mais les taux de cytokines proinflammatoires sont plus faibles après contact, le système immunitaire ne semble pas s’emballer (Figure 4B). Ces premiers résultats mettent en lumière l'efficacité des BLGM avec un antigène microbien couplé à un DCpep. Cette stratégie de vaccination entrainerait une protection robuste. Elle engendrerait l'activation des médiateurs de la réponse immunitaire (TNFalpha, IL-6, IL-12) et des cytokines anti-inflammatoires modulatrices du système immunitaire (IL-10). Le contact au pathogène entraine une mobilisation de la réponse humorale, induite par la voie Th1. 12 ,( -( Figure 3 Protection contre B. anthracis par des BLGM recombinées avec un vecteur couplé à un DCpep. (Mohamadzadeh, Duong, Sandwick, Hoover, & Klaenhammer, 2009) La figure A représente la survie des souris vaccinées par : L. acidophilus NCK1838 (PA-Ctrlpep), NCK1839 (PA-DCpep), et NCK1835 (vecteur vide), rPA+Alhydrogel (vaccin actuel contre B. anthracis) après injection du pathogène B. antracis. La figure B est un histogramme du pourcentage de souris vivantes à 40 jours après infection par le pathogène. Figure 4 Mesure des taux de cytokines anti/pro-inflammatoires suite à l'administration des BLGM Induction des cytokines in vivo dans le sang de souris avant (A) et après (B) infection par l’agent pathogène. On observe une activation des médiateurs de la réponse immunitaire (TNFalpha, IL-6, IL-12) et des cytokines antiinflammatoires modulatrices du système immunitaire (IL-10). B. BLGM promoteur de la réponse anti-inflammatoire Le diabète de Type 1 (T1D) est une maladie auto-immune provoquée par des lymphocytes T CD4+ et CD8+ qui se caractérise par une brèche dans la tolérance aux cellules # pancréatiques productrices d'insuline. A l’heure actuelle le traitement courant au diabète de type 1 est un traitement de remplacement par l’insuline exogène. Les interventions visant à arrêter la destruction des cellules # pancréatiques n'ont pas été une réussite. La seule solution qui apporte l’induction d’une tolérance immunitaire est l’injection d’anticorps spécifiques de la molécule CD3 (étroitement associée à la surface de la cellule T, au récepteur de la reconnaissance à l’antigène) chez des souris récemment diabétiques (Chatenoud, 2006). Des expériences avec des doses importantes d’anti-CD3 montrent potentiellement une modification du T1D, mais entrainent des effets délétères importants, par exemple une réactivation du virus d’Epstein Barr. Ce type de traitement à forte dose doit être accompagné par une reprogrammation de la tolérance du système immunitaire vis à vis des cellules # pancréatiques. Les études DEFEND-1 et Protégé ont récemment remis en question l’administration de faibles doses d’anti CD3 pour lutter contre la destruction des cellules # pancréatiques (Sherry et al., 2011). L’étude de Takiishi et al. en 2012 utilise Lactococcus Lactis génétiquement modifiée pour sécréter un antigène humain pro-insulinique seul ou bien en combinaison avec des cytokines IL-10. L’objectif est de lutter contre les réactions auto-immunes des diabétiques nouvellement diagnostiqués dans un modèle murin NOD (Takiishi et al., 2012). Pour cela ils utilisent des souches sécrétrices de la pro-insuline et des cytokines IL-10, administrées en combinaison avec un traitement anti-CD3. En effet les études précédentes montrent qu’une administration Ag de cellules # pancréatiques ne modulait pas la maladie lorsque l’individu établissait son immunité. Le choix d’Ag est donc primordial et doit s’accompagner d’immunomodulateurs pour la reprogrammation des lymphocytes T. Les premiers résultats de cette étude sont très intéressants, puisque 59% des animaux ont un TD1 restauré et stable (Figure 5). Ces animaux ne montrent aucun effet secondaire, leur glycémie est standard. Des études immunohistologiques confirment l'action des bactéries, les cellules # pancréatiques sont préservées et l’inflammation est réduite. 13 ( Figure 5 Effet sur le TD1 d'une BLGM antigène pro-insulinique + IL 10 (Takiishi et al., 2012) Pourcentage de souris qui sont diabétiques selon différents traitements contenant la BLGM (LL), la pro-insuline (PINS), IL-10 (hIL 10), Anti-CD3. Les résultats montrent que 59% des animaux ont un TD1 restauré et stable avec anti-CD3+ LLPINS+hIL 10. C. BLGM et l’allergie Des auteurs ont créé une souche Lactoccocus Lactis recombinante exprimant à sa surface la Fibronectine Binding Protein amplifiant considérablement sa capacité d'invasion des cellules de la muqueuse intestinale (Guimarães et al., 2005). L'idée est de délivrer des constructions d'ADN dans les cellules hôtes pour moduler la réponse immunitaire vis à vis d'un allergène. Dans cette étude les chercheurs ont travaillé in vivo et in vitro et ont déterminé la capacité du vecteur à transférer son contenant. Le plasmide est un ADNc de la bovine beta-lactoglobuline (BLG), un allergène majeur du lait de vache. In vitro, L. Lactis recombinée est internalisée plus efficacement (Figure 6). In vivo, le vecteur d'intérêt a été couplé à une GFP. Une évaluation histologique et une évaluation de la production de BLG (Figure 7) confirment l'hypothèse que le plasmide est transféré dans les cellules et que BLG est produite par les entérocytes (Pontes et al., 2012). Par la suite, des expérimentations sur la réponse immune et principalement sur les IgE pourraient permettre d'affirmer si ce type de vecteur est un bon candidat pour lutter contre des allergies. D. BLGM et son action antioxydante Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont des produits du métabolisme de l’oxygène qui peuvent jouer un rôle important dans la signalisation cellulaire. Néanmoins des concentrations élevées produisent un stress oxydant et endommagent les structures et macromolécules de la cellule (ADN, ARN, protéine, lipides) (Berlett and Stadtman, 1997). Lors d’une inflammation, les cellules immunitaires sécrètent en grande quantité des ROS. Ces ROS provoquent un stress oxydant et induisent la production de molécules pro-inflammatoires au niveau des cellules intestinales et perpétuent ainsi l’inflammation (Simmonds et al., 1992). Certaines enzymes permettent de lutter contre le stress oxydant. C’est le cas des catalases (CAT) ou des superoxides dismutases (SOD) qui sont capables de réduire ce stress et de réguler l’infiltrat lymphocytaire, entrainant la diminution de l’inflammation (Hardy et al., 1994). La rectocolite hémorragique (UC) et la maladie de Crohn (CD) sont deux formes de MICI qui sont depuis les dix dernières années un problème majeur en gastroentérologie. Ces maladies aux symptômes très proches, ont pourtant des mécanismes de l’immunité associés différents. 14 Figure 6 Capacité d'invasion du vecteur LL-FnBA (Pontes et al., 2012) Les cellules Caco-2 sont pré-incubées par LL-wt, LL-BLG, LL-FnBPA+, LL-FnBPA+ BLG, et ensuite lysées et mesurées par CFU. In vitro, L. Lactis recombinée est internalisée plus efficacement. Figure 7 Production de BLG en fonction de la souche GM avec le vecteur + Fibronectine Binding Protein. (Pontes et al., 2012) On administre aux souris pendant 3 jours les souches LL-wt, LL-BLG ou LL-FNBA + BLG pré-incubées. Les taux de BLG présentés sont extraits des entérocytes du côlon. Dans une étude récente, LeBlanc et al. décrivent l’impact à utiliser des probiotiques recombinants de la souche Lactobacillus casei BL23, connue pour posséder un potentiel antiinflammatoire (Foligne et al., 2007), afin de produire CAT (CAT+) ou SOD (SOD+) dans un modèle de maladie de Crohn murin induite par TNBS (LeBlanc et al., 2011). Au bout de 7 et 14 jours de traitement au TNBS, les animaux ayant été supplémentés par la souche CAT+ ne présentent pas de dommages histologiques différents comparés aux animaux contrôles. Ils observent une réduction significative du taux IFN-$ chez les animaux supplémentés au niveau intestinal (Figure 8A). Quant aux taux d’IL-10, ils ne sont pas augmentés chez les animaux supplémentés (Figure 8B). Seul le groupe TNBS présente un fort taux de cytokines anti-inflammatoires. De plus, la sévérité de l'inflammation est diminuée chez les souris recevant des souches supplémentées en CAT+ et SOD+. Les résultats de cette étude suggèrent l’intérêt de BLGM productrices d’enzymes antioxydantes comme prometteuses afin de prévenir et diminuer des pathologies intestinales causées par des espèces réactives de l’oxygène. E. BLGM et l’obésité La leptine est une cytokine de 16kDa (Zhang et al., 1948), qui module de nombreux processus physiologiques et comportementaux. Sa fonction principale correspond à un effet satiétogène via les voies neuroendocriniennes des noyaux arqués et paraventriculaires de l’hypothalamus. Néanmoins, une modification de la leptinémie (restriction calorique, réduction pondérale) augmente le désir de manger, et modifie le comportement des réserves énergétiques. De plus, la leptine contribuerait à la régulation de l’homéostasie métabolique par la modulation de la sécrétion d’insuline, de la production de glucose hépatique, ou encore du métabolisme lipidique. Ces effets biologiques de la leptine suggèrent une importante cible thérapeutique dans des maladies telles que l’obésité ou le diabète (Myers and Cowley, 2008). L'objectif thérapeutique de contrôler le poids et la prise alimentaire pour des personnes obèses est d'un intérêt majeur. L'INRA, en partenariat avec l'INSERM, a travaillé sur la construction d'une souche Lactococcus lactis capable de produire et sécréter de la leptine humaine en vue de réguler les fonctions physiologiques de la leptine. Une expérience contrôle in vitro a permis de certifier la leptine sécrétée par L. lactis comme biologiquement active. In vivo, cette sécrétion de leptine met en évidence une prise alimentaire significativement plus basse chez les souris ob/ob (déficiente pour le gène de la leptine) et une réduction pondérale à partir du 15 Figure 8 Evolution du taux d’IFN-! et de la cytokine anti-inflammatoire IL-10 après un traitement au TNBS (LeBlanc et al., 2011) Les taux d’IFN-! (A) et IL-10 (B) sont mesurés dans l’intestin des animaux après traitement au TNBS. On observe une réduction significative du taux IFN-! chez les animaux supplémentés au niveau intestinal. Quant aux taux d’IL-10, ils ne sont pas augmentés chez les animaux supplémentés. Seul le groupe TNBS présente un fort taux de cytokines anti-inflammatoires. 4ème jour d'administration intranasale (Figure 9). Finalement, c’est avec un intérêt majeur que cette étude s’inscrit dans la recherche thérapeutique vis à vis de l’obésité (BermúdezHumarán et al., 2007). Nous avons vu un ensemble d’études utilisant des techniques d’approches différentes dans l’utilisation des BLGM. Certaines équipes ont travaillé sur l’administration d’un antigène couplé avec des cytokines pour moduler l’inflammation, tandis que d’autres ont souhaité améliorer le contact de l’Ag avec le système immunitaire via des peptides spécifiques aux DC ou via la modification des bactéries lactiques pour les rendre plus invasives. Chaque étude répond à un besoin thérapeutique majeur, et apporte des solutions pour lutter contre des maladies dont les traitements ne sont pas efficaces à 100%. Les études se heurtent à des difficultés, c’est le cas de l’obésité où dans la majorité des cas, les malades obèses présentent paradoxalement des taux de leptine circulante élevés qui sont incapables d’induire une réponse adéquate malgré des administrations de leptine exogène de plus en plus importantes (Myers and Cowley, 2008). Cette difficulté majeure est encore mal connue, et les recherches sur le thème de l’obésité sont d’une importance capitale dans le contexte actuel de santé publique où l’ANSES compte 20% de la population Européenne en surpoids. F. Les bifidobactéries génétiquement modifiées, une avancée vers de nouvelles thérapies ? 1. Le rôle probiotique de souches sauvages de bifidobactéries Des études ont montré que des espèces Bifidobacterium possédaient la capacité à métaboliser une variété importante de polysaccharides et des glucides non digestibles pour l’hôte et pourraient résider entre 3 et 7 jours dans le tube digestif. Ces avantages pourraient être un caractère compétitif dans la flore intestinale (Parche et al., 2007). Bifidobacterium est une des bactéries du microbiote humain dominante et reconnue pour ses effets bénéfiques sur la santé de l’hôte. Elle fait partie du phyla Actinobactérie, elle est Gram-positive, anaérobie stricte, possède un haut pourcentage en GC (Van Der Werf and Venema, 2001). Sa production d’acétate et de lactate fait de Bifidobactérie un membre des bactéries lactiques. Elle fut isolée 16 Figure 9 Evolution du poids des souris après administration de la souche recombinante (Bermúdez-Humarán et al., 2007) L’administration intranasale de BLGM avec de la leptine (LL-Lep) recombinante est quotidienne. Le graphique représente la prise de poids des souris ob/ob selon une administration : par du PBS (contrôle), par la souche LL ou par la souche LL-Lep. On observe une réduction pondérale à partir du 4ème jour d'administration intranasale. pour la première fois par Tissier en 1899, et il lui donna le nom de Bacillus bifidus. En effet de part sa similarité avec les lactobacilles, Bifidobactérie a été classée parmi les membres du genre Lactobacillus durant une grande partie du 20ème siècle. Ce n’est que très récemment que le genre Bifidobacterium est reconnu comme un genre à part avec 37 espèces, divisées en quatre taxons (Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium thermacidophilum) (Turroni et al., 2011). Le séquençage de dix génomes de Bifidobactéries a permis de mieux connaître ce genre bactérien mettant en évidence les capacités d’adaptation des Bifidobacterium à la compétition des nutriments (Klijn et al., 2005). Une méta-analyse de 74 études et 84 essais cliniques, sur des probiotiques, a permis de reconnaitre une efficacité de traitement dans les Pouchites par VSL#3 (mélange d’espèce de Bifidobacterium et Lactobacillus) (Ritchie and Romanuk, 2012). Les Pouchites sont des inflammations causées par la pose d’un rectum artificiel après colectomie. Un traitement à forte dose de souches B. infantis démontre un effet significatif dans la réduction du syndrome du colon irrité. Néanmoins, les résultats présentés dans cette métaannalyse ne montrent pas des efficacités importantes. L’effet bénéfique sur la santé des probiotiques Bifidobacterium doit être réévalué pour des sous-groupes de population (Hoveyda et al., 2009). Une revue écrite par B.Sánchez en 2012 référence un certain nombre d’études cliniques sur les effets bénéfiques sur la santé à utiliser une ou plusieurs souches bifidobactériennes (Sánchez et al., 2012). 2. Bifidobacterium génétiquement modifiée pour délivrer des protéines anti-inflammatoires L'intérêt des Bifidobacterium en tant que probiotique ne cesse d'intéresser les industriels. Comme nous l'avons vu précédemment le clonage de vecteurs ou les techniques de transformations permettent de délivrer des protéines d'intérêt thérapeutiques. La cytokine humaine IL-10 (hIL-10) est une cytokine régulatrice induite par les Treg. L'activité de cette cytokine entraine une inhibition de la voie de signalisation de NF-!B, conduisant à l’inhibition de la synthèse de cytokine pro-inflammatoire, de la différenciation lymphocytaire B et de la production d’anticorps (Mosser and Zhang, 2008). Ainsi des études signalent que la déficience hIL-10 serait un facteur clé des MICI. 17 Dans une étude en 2011, J.Yao et son équipe ont travaillé sur l'expression de hIL-10 par B. longum NCC 2705 (BL-IL-10) pour prévenir le développement de rectocolite hémorragique (UC) et rétablir les fonctions du système immunitaire (Yao et al., 2011). Le traitement au LPS des cultures in vitro induit une augmentation du TNF-" et de la cytokine pro-inflammatoire IL-6 (Figure 10). Or, une fois BL-IL-10 ajoutée au milieu de culture cette augmentation est inhibée significativement. Les expériences in vivo confirment ces observations. Les souris dont la UC est induite par du DSS présentent des troubles intestinaux importants. Néanmoins, un traitement par BL-hIL-10 supprime significativement cette induction d'UC et résulte d'une réduction de l'expression de NF-!B. La quantification d’ARNm par RT-PCR a permis de démontrer que la souche Bifidobacterium recombinée diminuait l'expression de protéines pro-inflammatoires. Enfin une cytométrie de flux a permis de mettre en évidence l'action positive de hIL-10 sur le pourcentage de CD4+CD25+ Treg dans la circulation sanguine périphérique (Figure 11). CD4+CD25+Foxp3+ sont considérés comme des biomarqueurs naturels des Treg qui sont essentiels au maintien de la tolérance immunitaire dans l'intestin. Foxp3 est un membre de la famille des forkhead. Ce facteur de transcription joue un rôle essentiel dans le développement des facteurs CD4+ CD5+. L'administration de hIL-10 via Bifidobacterium induirait l'expression de Foxp3 permettant l'activation de CD4+CD5+ Treg, entrainant une réduction de l'inflammation dans des pathologies de rectocolites hémorragiques. Yu at al. ont voulu, dans un objectif proche de celui de Yao et son équipe, induire l’expression de la cytokine IL-12 dans la souche B. longum NCC 2705. IL-12 est impliqué dans la différenciation des cellules T en Th1 pour produire des IFN-$. Cette réponse immunitaire adaptative est essentielle contre les infections virales (Yu et al., 2011). Dans cette étude, la stratégie thérapeutique est de protéger l’organisme de maladies et de virus infectieux par l’expression de CD4+ Th1 (Yu et al., 2012). De nouvelles perspectives de thérapie de cancer ont vu le jour il y a quelques années avec pour originalité d’utiliser des Bifidobacterium génétiquement modifiées. Les régions hypoxiques ou nécrotiques sont caractéristiques des tumeurs cancéreuses et sont des régions privées d’oxygène. Des chercheurs ont donc eu l’idée d’exploiter ces bactéries anaérobiques dans ces régions pour délivrer des molécules anti-cancéreuses (Fujimori, 2006). En 2011, Zhu et al. travaillent sur une thérapie anti-angiogenèse à partir de cette technique novatrice. Le VEGF est un facteur de croissance vasculaire de cellules endothéliales et endosserait un rôle 18 Figure 10 Profil d'expression des cytokines en fonction des différents traitements Le LPS induit la réaction Th1 : c’est le contrôle positif. Le « normal group » est le contrôle négatif. Les différents traitements en fonction des concentrations en IL-10 sont présentés en abscisse.(( Le traitement au LPS des cultures in vitro induit une augmentation du TNF-" et de la cytokine proinflammatoire IL-6. Or, une fois BL-IL-10 ajoutée au milieu de culture cette augmentation est inhibée significativement. Figure 11 Pourcentage de CD4+ CD5+ Treg dans la circulation sanguine périphérique et la lymphe Une cytométrie de flux a permis de mesurer le pourcentage de CD4+ CD5+ Treg dans le sang périphérique et dans la lymphe des souris UC selon différents traitements : contrôle positif, contrôle négatif, la bactérie seule, la BLGM avec le plasmide vide et BLGM + IL-10 majeur dans le processus d’angiogenèse, ainsi il serait associé à la croissance et à la progression des tumeurs. VEGF se lie à un récepteur transmembranaire de la famille de tyrosine kinase Flt-1. Quant à sa forme soluble : sFlt-1, elle exercerait des fonctions antiangiogenèses (Kendall et al., 1996). La construction d’une souche Bifidobacterium infantis génétiquement modifiée pour exprimer la protéine sFlt-1 inhiberait la prolifération de tumeurs cancéreuses (Zhu et al., 2011). G. Conclusions et perspectives Les MICI sont caractérisées par une dérégulation du système immunitaire et principalement par la perte d’homéostasie intestinale entraînant une réponse inflammatoire anormale et récurrente vis à vis du microbiote. Comme nous l’avons vu tout au long des études présentées dans ce mémoire, la recherche avance et découvre de nouvelles thérapies à partir de bactéries lactiques génétiquement modifiées. Ces nouvelles souches aux propriétés anti-inflammatoires se révèlent être une stratégie prometteuse, non invasive, moins couteuse et efficace sur les modèles murins. Les mécanismes du dialogue hôte-bactérie mais aussi au sein de la flore elle-même sont encore à éclaircir. Le traitement chez l’homme par des BLGM est actuellement complexe en raison des mesures législatives sur les OGM. Cependant, ces traitements pourraient alléger et diminuer les thérapies lourdes et contraignantes, voir inefficaces, des patients atteints de MICI. Les applications thérapeutiques évoluent de manière qu’il serait envisageable, aujourd’hui, d’autoriser les BLGM pour des essais cliniques. En 2006, une étape essentielle a été franchie. L’utilisation de bactéries lactiques recombinantes a permis la mise en place du premier essai clinique de phase I (Braat et al., 2006). Les souches Bifidobacterium génétiquement modifiées ont fait leurs preuves dans la délivrance de cytokines pouvant moduler les Treg. Il serait donc envisageable de construire une souche GM permettant de stimuler les voies anti-inflammatoires du système immunitaire pour réduire considérablement l’engrenage des MICI. Les approches variées des thérapies à partir de Bifidobacterium recombinée sont dignes d’intérêt et apportent des perspectives nouvelles dans la lutte contres les maladies chroniques. L’avenir des BLGM est aujourd’hui en pleine évolution, et c’est dans cette dynamique que je souhaite à partir de janvier, lors de mon stage de master deuxième année, participer à l’élaboration de projets scientifiques voués à faire avancer la recherche thérapeutique. 19 ! III. BIBLIOGRAPHIE ! ANSES, 2012. AVIS de l’Agence nationale de sécurité sanitaire de l’alimentation, de l’environnement et du travail relatif à l'analyse de l’étude de Séralini et al. (2012) «!Long term toxicity of a ROUNDUP herbicide and a ROUNDUP-tolerant genetically modified maize”. Berlett, B.S., Stadtman, E.R., 1997. Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress. The Journal of biological chemistry 272, 20313–6. Bermúdez-Humarán, L.G., 2009. Lactococcus lactis as a live vector for mucosal delivery of therapeutic proteins. Human Vaccines 5, 264–267. 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(Pontes et al., 2012)!""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""! $'$ Figure 8 Evolution du taux d’IFN-! et de la cytokine anti-inflammatoire IL-10 après un traitement au TNBS (LeBlanc et al., 2011)!""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""! $($ Figure 9 Evolution du poids des souris après administration de la souche recombinante (Bermúdez-Humarán et al., 2007)! """""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""! $)$ Figure 10 Profil d'expression des cytokines en fonction des différents traitements! """"""""""""""""""""""""""""""! $*$ Figure 11 Pourcentage de CD4+ CD5+ Treg dans la circulation sanguine périphérique et la lymphe!"""""""""! $*$
