Numération des parasites : procédure de diagnostic microscopique du paludisme

VERSION 1 – DATE EFFECTIVE : 01/01/2016
NUMÉRATION DES PARASITES
DIAGNOSTIC MICROSCOPIQUE DU PALUDISME
MODES OPÉRATOIRES NORMALISÉS – DMP-MON-09
1. OBJECTIF ET CHAMP D’ACTION
Fournir une description détaillée de la procédure à suivre pour compter le nombre de parasites du
paludisme sur les frottis minces et les gouttes épaisses.
Cette procédure ne peut être modifiée qu’avec l’approbation du coordonnateur national pour l’assurance
de la qualité du diagnostic microscopique du paludisme. Toutes les procédures exposées ici sont
obligatoires pour tous les techniciens de la microscopie travaillant dans les laboratoires nationaux de
référence, dans les laboratoires des hôpitaux ou dans les laboratoires médicaux de base au sein des
établissements sanitaires où sont eectués des examens microscopiques pour le diagnostic du paludisme.
2. HISTORIQUE
La densité parasitaire nous renseigne sur la gravité de l’infection et sur la façon dont celle-ci réagit
au traitement. Les numérations sont eectuées pour les formes asexuées de P. falciparum, P. vivax,
P. malariae et P. ovale. Sauf indication contraire dans le protocole, on ne compte pas les gamétocytes,
même si leur présence est toujours signalée. Toutes les espèces parasitaires identifiées devraient être
notifiées, même si elles sont comptées ensemble.
La plupart du temps, on procède à la numération des parasites sur les gouttes épaisses. S’il n’y a pas
de goutte épaisse ou qu’elle est endommagée, on peut dénombrer les parasites sur le frottis mince.
Les parasites sont également comptés sur le frottis mince si le nombre de parasites est > 100 dans chaque
champ de la goutte épaisse, ce qui correspond à > 80 000 parasites/µl.
3. FOURNITURES, MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENTS
• Un microscope composé, équipé d’une paire d’oculaires 10x ; des objectifs 10x, 40x et 100x et
une platine mobile (un marqueur à objectif, ainsi qu’un objectif 60x peuvent être montés le
cas échéant).
• Un compteur manuel multiple ou un compteur manuel à deux touches, une pour les parasites et
l’autre pour les leucocytes.
• Les étalements de sang colorés au Giemsa que vous devez examiner.
• De l’huile à immersion de type A d’excellente qualité.
• Du papier pour objectif.
• Un stylo et un crayon.
• Une calculatrice de poche.

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DMP–MON–09 : NUMÉRATION DES PARASITES
4. PROCÉDURE
SCHÉMA DESCRIPTION DE L’ACTIVITÉ
4.1. Numération des parasites sur
une goutte épaisse et calcul de la
densité parasitaire
1. Placez
la lame en verre sur
le microscope, étiquette du
côté gauche.
2. Déterminez la présence de parasites
du paludisme, leur espèce et leur stade,
et enregistrez vos informations (voir DMP
MON 6b et DMP-MON 08).
3. En commençant par la partie
supérieure gauche du frottis, cherchez
un champ typique contenant des
parasites et des leucocytes. Commencez
à compter.
4. Appuyez sur la touche
correspondante du compteur manuel
à chaque fois que vous observez un
parasite ou un leucocyte.
5. Après avoir dénombré tous les
parasites et tous les leucocytes dans
un champ, passez au champ suivant,
répétez la procédure de numération,
et ainsi de suite.
4.1. Numération des parasites sur une goutte
épaisse et calcul de la densité parasitaire
Note : Avant de commencer à compter,
examinez 100 champs sur la goutte épaisse pour
détecter la présence de parasites à l’objectif à
immersion 100x.
1. Placez la lame en verre sur le microscope,
étiquette du côté gauche. Cela permet d’adopter
une approche normalisée pour le point de départ
du décompte et d’enregistrer les emplacements
des parasites en utilisant les divisions marquées du
porte-lame.
2. Si vous détectez des parasites du paludisme (voir
DMP-MON-08 : Examen microscopique des
frottis et des gouttes épaisses pour l’identification
de parasites du paludisme), comptez les formes
asexuées (dans des cas d’infections mixtes ou
unique) sans les stades sexués (gamétocytes),
que l’on ne comptabilise pas mais que l’on signale.
Dans les cas d’infections mixtes, tous les parasites
dans leur forme asexuée sont comptés ensemble
et on signale la présence de diérentes espèces
(voir DMP-MON 6a : Enregistrement et notification
des résultats de l’examen microscopique).
3. En commençant tout en haut de l’étalement,
cherchez un champ présentant un regroupement
de leucocytes de bonne taille et commencez à les
dénombrer.
4. En utilisant un compteur manuel multiple, comptez
les parasites et les leucocytes en même temps
en appuyant sur la touche correspondante à
mesure que vous observez des parasites ou
des leucocytes. Si vous utilisez deux compteurs
manuels, utilisez le premier pour la numération
des leucocytes et l’autre pour celle des parasites.
5. Après avoir dénombré tous les parasites et tous
les leucocytes dans un champ, passez au champ
suivant en suivant le cheminement illustré sur la
Figure 1 et répétez la procédure de numération,
et ainsi de suite. Veillez à ce qu’il n’y ait pas de
chevauchement entre les champs.
Figure 1. Cheminement pour le décompte des
parasites et des leucocytes

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DMP–MON–09 : NUMÉRATION DES PARASITES
SCHÉMA DESCRIPTION DE L’ACTIVITÉ
6. Selon le nombre de parasites
observés, arrêtez de compter après avoir
examiné 200 ou 500 leucocytes.
• Si, après avoir compté
200 leucocytes, vous avez trouvé
100 parasites ou plus, arrêtez de
compter et enregistrez le résultat sous
la forme du nombre de parasites
pour 200 leucocytes.
• Si, après avoir compté
500 leucocytes, vous avez obtenu
99 parasites ou moins, arrêtez de
compter et enregistrez le résultat sous
la forme du nombre de parasites
pour 500 leucocytes.
7. Comptez tous les parasites et
les leucocytes présents dans le
dernier champ.
8. Enregistrez le nombre réel de
parasites et de leucocytes que vous
avez comptés.
9. Calculez la densité parasitaire :
Parasites / µl
de sang =
Nombre de
parasites comptés
x 8000 leucocytes/µl
Nombre de
leucocytes comptés
6. Décidez quand vous devez arrêter de compter en
respectant les règles suivantes :
• Si, après avoir compté 200 leucocytes,
vous avez trouvé 100 parasites ou
plus, arrêtez de compter et enregistrez
le résultat sous la forme du nombre de
parasites pour 200 leucocytes.
• Si, après avoir compté 500 leucocytes,
vous avez obtenu 99 parasites
ou moins, arrêtez de compter et
enregistrez le résultat sous la forme
du nombre de parasites pour
500 leucocytes.
7. Comptez tous les parasites et les leucocytes
présents dans le dernier champ, même si le
nombre de leucocytes est supérieur à 200 ou 500.
8. Enregistrez sur une feuille de calcul adaptée le
nombre réel de parasites et de leucocytes que
vous avez comptés.
9. Lorsque vous avez terminé de compter, calculez
la densité parasitaire sur la base de la véritable
numération leucocytaire du patient. Si celle-ci
n’est pas disponible, utilisez une moyenne de 8000
leucocytes/µl.
Eectuez vos calculs à l’aide de la formule
suivante :
Parasites / µl
de sang =
Nombre de
parasites comptés
x 8000 leucocytes/µl
Nombre de
leucocytes comptés

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DMP–MON–09 : NUMÉRATION DES PARASITES
SCHÉMA DESCRIPTION DE L’ACTIVITÉ
4.2. Numération des parasites sur
une goutte épaisse et calcul de la
densité parasitaire
1. Si
des globules rouges
infectés sont présents, comptez
toutes les hématies parasitées et
enregistrez les.
2. En commençant par la section
supérieure de l’étalement, cherchez un
champ typique avec des globules rouges
sains et des hématies parasitées.
3. Appuyez sur la touche
correspondante du compteur manuel
à chaque fois que vous observez un
globule rouge sain ou parasité.
4. Après avoir dénombré toutes les
hématies parasitées et tous les globules
rouges sains dans un champ, passez au
champ suivant et répétez la procédure
de numération.
5. Après avoir examiné 20 champs du
frottis, arrêtez de compter et enregistrez
toutes les hématies saines et parasitées.
4.2. Numération des parasites sur un frottis mince et
calcul de la densité parasitaire
Note : si 100 parasites ou plus sont présents
dans chaque champ de la goutte épaisse sous
l’objectif 100x, calculez la densité parasitaire sur le
frottis mince.
1. Si des globules rouges infectés sont présents,
comptez toutes les hématies parasitées. Si vous
observez des formes sexuées (gamétocytes),
ne les comptez pas mais signalez-les. Dans les cas
d’infections mixtes, toutes les hématies parasitées
sont comptées ensemble et on signale la présence
de multiples espèces de parasites.
2. Dans la section supérieure du frottis, trouvez
un champ comportant environ 250 hématies.
Comptez le nombre total d’hématies dans ce
champ et le nombre d’hématies parasitées.
Un champ typique (grossissement de 100x) devrait
contenir environ 250 globules rouges.
3. En utilisant un compteur manuel multiple, comptez
les hématies saines et parasitées en appuyant sur
les touches correspondant aux globules parasités
et non parasités. Si vous utilisez deux compteurs
manuels, utilisez le premier pour la numération
des hématies parasitées et l’autre pour les
hématies non parasitées.
4. Après avoir dénombré tous les parasites et tous
les leucocytes dans un champ, passez au champ
suivant en suivant le cheminement illustré dans
la Fig. 1 et répétez la procédure de numération,
et ainsi de suite. Veillez à ce qu’il n’y ait pas de
chevauchement entre les champs. Continuez de
manière longitudinale, en couvrant peu à peu
toute la surface de l’étalement. Comptez tous les
globules rouges parasités et non parasités dans
chaque champ, même si la numération totale des
hématies par champ est supérieure à 250.
5. Arrêtez de compter lorsque vous avez compté
environ 20 champs comportant 250 hématies
(environ 5000 hématies au total). Enregistrez sur
une feuille de calcul adaptée le nombre réel de
globules rouges parasités et les autres globules
rouges que vous avez comptés. Utilisez ces chires
pour calculer la densité parasitaire totale par µl
de sang.

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DMP–MON–09 : NUMÉRATION DES PARASITES
SCHÉMA DESCRIPTION DE L’ACTIVITÉ
6. Enregistrez le nombre total
d’hématies parasitées et le nombre
total d’hématies comptabilisées dans
les 20 champs du frottis. Calculez
la densité parasitaire à l’aide de la
formule suivante:
Parasites /µl =
Nombre d’hématies
parasitées x 5 000 000
20 champs x 250
globules rouges
6. Lorsque vous avez terminé de compter, calculez
la densité parasitaire sur la base de la véritable
numération des hématies du patient. Si celle-
ci n’est pas disponible, utilisez une moyenne de
5 000 000 hématies/µl, ainsi que la formule
suivante. Veuillez noter que le résultat final doit
être arrondi au nombre entier le plus proche.
Nombre de parasites par µl de sang :
Parasites /µl =
Nombre d’hématies
parasitées x 5 000 000
20 champs x 250
globules rouges
5. MODES OPÉRATOIRES NORMALISÉS CONNEXES
DMP-MON-06b : Enregistrement et notification des résultats de l’examen microscopique
DMP-MON-08 : Examen microscopique des frottis et des gouttes épaisses pour l’identification de
parasites du paludisme
6. RÉFÉRENCES
OMS. Planches pour le diagnostic microscopique du paludisme. Genève, 2010.
OMS. QA manual for malaria microscopy. 2nd Edition. Geneva; 2015.
WHO. Techniques de base pour le diagnostic microscopique du paludisme. – Partie I : Guide du stagiaire.
Deuxième édition. Genève, 2010.
WHO. National malaria slide bank standard operating procedures. Geneva; 2015 (en cours).
7. HISTORIQUE DU DOCUMENT
Date
(mois/année) Version Commentaires Personne responsable (Nom, prénom)
Janvier 2016 1
Examiné et finalisé par
des experts, édité et mis
en page
Gonzales, Glenda
Fonctionnaire technique,
WPRO
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