Génie génétique - Cours de Pr. Aziza Kouchou

Génie génétique
Pr. Aziza Kouchou
2023-2024
Plan
 Génie Génétique
 Clonage moléculaire
 Organisme génétiquement modifié (OGM)
 Evolution du génétique
 Applications des OGM
 Outils du génie génétique
• Enzymes de restriction
• Vecteur de clonage
• Hôtes de clonage
 Amplification en Chaîne par Polymérase
 Séquençage enzymatique de Sanger
Génie génétique
Le génie génétique est un ensemble de techniques de biologie
moléculaire permettant d'isoler des gènes spécifiques, de les
reconstruire puis de les réinsérer dans des cellules ou des
organismes.
Ces techniques ont fourni à la médecine et à l'industrie un moyen
efficace de produire en grandes quantités des protéines spécifiques,
qui, auparavant, n'étaient disponibles (si elles l'étaient) qu'en
quantité extrêmement faibles.
Ces techniques ont permis également d'étudier la régulation de leur
expression et ainsi de mieux comprendre le développement de
maladies génétiques.
Génie génétique
Le premier apport de cette technologie à la médecine fut de
rendre des protéines thérapeutiques telles : insulines, HGH
(human growth hormone), disponibles en quantités suffisantes.
La médecine a retiré bien d’autres bénéfices de la technologie de
l’ADN recombinant, vaccins (anti hépatite, rage,….etc.), sondes
(diagnostique, identification….etc.), agents thérapeutiques (acides
nucléiques anti sens, thérapie génique, ….etc.)
Génie génétique
Cellule?
 Unité de base de la vie qui constitue tout organisme, animal ou
végétal.
 Le corps humain est composé de plusieurs milliards de cellules de
différents types (cellules de peau, des os, du sang…) qui, pour la
plupart, se multiplient, se renouvellent et meurent.
 Des cellules identiques assemblées entre elles forment un tissu.
Visibles au microscope, les cellules sont composées généralement
d'un noyau qui contient l'ADN et d'un cytoplasme limité par une
membrane.
 Une cellule devient cancéreuse lorsqu'elle se modifie et se
multiplie de façon incontrôlée.
Génie génétique
Qu'est-ce que l'ADN ?
L’ADN, abréviation d’acide désoxyribonucléique, se trouve dans le
noyau de la plupart des types de cellules. Ils contient les
instructions propres à la cellule et détermine comment les traits
d’une personne seront transmis d’une génération à l’autre.
Le noyau d’une cellule humaine, on compte 23 paires de
chromosomes, soit 46 chromosomes en tout.
Génie génétique
Formation d’une molécule d’ADN: nucléotides
Les mots de l’ADN sont de petites molécules appelées nucléotides.
L’ADN est constitué de quatre éléments complémentaires, les
nucléotides : l’adénine, la thymine, la guanine et la cytosine : A, T, G,
C.
Chaque nucléotide comprend une
armature et une base azotée.
L’armature sert à attacher les
nucléotides ensemble.
Clonage moléculaire
• Le clonage moléculaire est une des bases du génie génétique.
• Le clonage moléculaire consiste à produire des molécules d’ADN
recombinant et à les utiliser pour transformer un organisme hôte,
dans lequel elles sont répliquées.
• Une réaction de clonage moléculaire fait généralement intervenir
les deux éléments suivants : Le fragment d’ADN d’intérêt
(dénommé insert) à répliquer, un vecteur plasmidique contenant
tous les composants nécessaires à sa réplication dans l’organisme
hôte.
• Cloner un gène consiste donc à l’insérer dans un plasmide. La
capacité de cloner l’ADN ouvre la voie à de nombreuses
applications.
Les outils du génie génétique
Clonage moléculaire
Clonage reproductif
Clonage thérapeutique
Insertion
d’une
séquence
d’ADN
dénommé insert dans
un vecteur approprié
puis son introduction
dans une cellule-hôte
afin
d’en
obtenir
plusieurs copies.
Créer un individu
génétiquement
identiques
Créer des tissus à
partir de cellules
souches
pour
effectuer des greffes
compatibles avec le
receveur
OGM
Un organisme génétiquement modifié (OGM) est un organisme
vivant - micro-organisme, végétal ou animal - ayant subi une
modification, non naturelle, de ses caractéristiques génétiques
initiales, par ajout, suppression ou remplacement d'au moins un
gène. L'opération correspondante est dite transgénèse.
Elle peut s'effectuer aussi bien sur des cellules germinales (gamètes)
transmettant la modification à la descendance que sur des cellules
somatiques (non reproductrices). Dans ce cas, le caractère modifié
n'est pas transmissible.
OGM
Le principe est de transférer, dans une cellule de l'organisme
receveur, un ou plusieurs gènes prélevés dans un autre organisme
vivant, y compris si celui-ci n'est pas de la même espèce que “l'hôte”
: une compatibilité possible grâce à l'universalité du code génétique .
OGM
Les gènes introduits peuvent provenir de n’importe quel organisme
Plante
Bactérie
Champignon
Animal
Virus
On peut modifier les êtres vivants unicellulaires et pluricellulaires
 Bactéries
 Végétaux
 Animaux
Grâce au GENIE GENETIQUE
OGM
Le génie génétique permet ainsi de :
‒ modifier,
‒ supprimer,
‒ ou introduire certains caractères
• La transformation peut consister selon le cas à:
‒ Apporter une fonction nouvelle
‒ Inactiver ou augmenter une fonction déjà existante
Evolution du génie génétique
Avant l'arrivée des OGM
8000 av. J-C. Les hommes domestiquent des plantes pour la culture et des animaux pour
l'élevage.
1663
Robert Hooke découvre l'existence des cellules en observant des tissus végétaux
au microscope.
1830
Les protéines sont découvertes.
1859
Charles Darwin publie son œuvre maîtresse L'Origine des espèces. La théorie de
l'évolution des espèces par sélection naturelle est née.
1865
Gregor Mendel énonce les lois de l'hérédité. Il est considéré comme le père de la
génétique moderne. Par ses recherches, notamment sur les pois, il démontre
comment les gènes sont transmis de génération en génération. Ses découvertes
ont une grande influence sur les techniques de sélection des espèces animales et
végétales.
1870-1910 À compter de 1870, Luther Burbank, considéré comme le père des techniques
modernes de sélection des plantes, obtient par sélection plus de 800 nouvelles
variétés de fruits, de légumes et de fleurs. L'une de ses premières réalisations est
la pomme de terre Burbank.
Le premier hybride expérimental de maïs est mis au point par William James Beal,
professeur de botanique à l'Académie des sciences du Michigan.
Evolution du génie génétique
1933
1944
1953
1968
1971
1973
1974
Le premier maïs hybride issu d'un croisement est disponible aux États-Unis.
Oswald Theodore Avery et ses collaborateurs, les scientifiques canadiens Colin
MacLeod et Maclyn McCarty, font la preuve que l’ADN contenu dans le noyau
d'une cellule porte les éléments d'information nécessaires au maintien de la vie.
Ils établissent ainsi les fondements de la génétique moderne et de la biologie
moléculaire.
James Watson et Francis Crick décrivent la structure à double hélice de l'ADN.
Marshall W. Niremberg et Har Gobind Khorana se voient attribuer un prix Nobel
pour avoir déchiffré le code génétique des 20 acides aminés; par la suite, les
chercheurs ont pu conclure que le code génétique est universel chez toutes les
créatures vivantes.
Première synthèse complète d'un gène.
Stanley Cohen et Herbert Boyer réalisent avec succès la première
expérimentation de génie génétique en insérant un gène d'un dactylèthre
africain (un amphibien) dans de l'ADN bactérien.
Des scientifiques canadiens utilisent les techniques de sélection pour créer un
canola hâtif à partir de la navette. L'huile de canola est caractérisée par une
faible teneur en acide érucique et en glucosinolate, substances responsables de
l'amertume de la navette. Le canola a été officiellement homologué à la fin des
années 1970.
Evolution du génie génétique
L'arrivée des OGM
L'arrivée des OGM peut être considérée de façon différente : en continuité ou en rupture
avec ce qui se faisait auparavant. Elle soulève ainsi des questions importantes qui
peuvent remettre en cause certaines représentations culturelles et spirituelles sur ce
qu'est la vie et ce qu'est l'être humain.
1978
L'insuline humaine est produite pour la première fois par une bactérie
transgénique.
1983
Vente autorisée au Canada du 1er produit issu du génie génétique, l'insuline
humaine.
1990
La commercialisation du 1er produit alimentaire modifié par la
biotechnologie, la chymosine, est approuvée au Canada et aux États-Unis en
tant que substitut à la présure, utilisée pour cailler le lait.
1994-1995 Mise en vente au Canada de la 1re pomme de terre issue du génie
génétique résistante au doryphore de la pomme de terre. Cette pomme de
terre n'est plus commercialisée présentement.
Approbations américaine et canadienne de la tomate transgénique Flavr
SavrTM, à mûrissement retardé. Cette tomate n'est plus commercialisée
présentement.
Evolution du génie génétique
1996-1997 Premières plantes transgéniques commercialisées aux États-Unis pour tolérer
un herbicide et résister aux insectes : le soja Roundup Ready et le coton
Bollgard.
2003
50e anniversaire de la découverte de la structure de la double hélice de l'ADN
par Watson et Crick.
2012
2020
Entrée en vigueur du Protocole de Cartagena encadrant les mouvements des
OGM entre les frontières des pays membres de ce traité.
Mise au point du système d’édition génomique CRISPR-Cas9 par Emmanuelle
Charpentier et Jennifer Doudna de l’Université de Californie à Berkeley.
Emmanuelle Charpentier et Jennifer Doudna remportent le prix Nobel de
chimie pour la mise au point de la technologie CRISPR-Cas9.
Les applications des OGM
Agronomie
Plantes résistantes aux stress (sécheresse, gel, chaleur)
Plantes résistantes aux insectes, aux parasites et aux virus
Plantes tolérantes aux herbicides
Les applications des OGM
Alimentation
Retardement du mûrissement d'un aliment
Augmentation
des
qualités
nutritionnelles
d'un
(meilleure qualité ou plus grande quantité de nutriments)
Réduction du pouvoir allergène de certains aliments
Production d'animaux à croissance accélérée
Production de lait sans lactose
aliment
Les applications des OGM
Médecine
Au cours des dernières décennies, les chercheurs ont
développé un ensemble de techniques appelées
biotechnologies, qui permettent de manipuler et
réorganiser les gènes des divers organismes vivants
(bactéries, plantes, animaux), principalement dans le
but de fabriquer des médicaments.
Utilisation des animaux à des fins de recherche
Les applications des OGM
Industrie
Production à grande échelle de matériaux issus du règne animal
Production de matières plastiques biodégradables
Production de biocarburants
Les applications des OGM
De nombreux OGM ont été développés en laboratoire à diverses fins.
Cependant, peu de ces organismes sont approuvés pour la
commercialisation; ils servent davantage à des fins de recherche.
On ne connaît pas encore toutes les répercussions à long terme des
OGM sur l'environnement et sur la santé puisqu'il s'agit d'une
technologie récente. Il faudra attendre encore plusieurs années pour
être en mesure d'évaluer avec justesse les bienfaits et les méfaits des
OGM. D'ici là, de plus en plus d'organisations réclament un étiquetage
obligatoire des aliments contenant des OGM afin que les gens puissent
faire un choix éclairé.
Les outils du génie génétique
Les enzymes de restriction
La découverte de cette technique a été une étape essentielle car,
jusque là, il était difficile d'isoler précisément un gène déterminé en
raison notamment de la fréquente structure en mosaïque du
génome et de sa complexité.
Aujourd’hui plusieurs centaines d’enzymes de restriction différentes
sont disponibles commercialement. Elles font parties des outils
(ciseaux moléculaires) indispensables aux biologistes moléculaires.
Ces outils permettent de couper l’ADN afin d’isoler certains
fragments, de construire des cartes génétiques (cartes de restriction),
de créer de nouvelles combinaisons d’ADN, etc. Les enzymes de
restrictions ont permis l’avènement de la biologie moléculaire.
Les outils du génie génétique
Les enzymes de restriction
Lorsqu’un bactériophage infecte une bactérie, il lui « injecte » son
ADN. Sans système de défense adapté, de nombreux bactériophages
seront alors produits dans la bactérie qui sera finalement lysée. De
manière à résister à cette infection la bactérie synthétise des enzymes
de restriction qui vont fragmenter l'ADN viral étranger. Parallèlement,
la bactérie possède des méthylases capables de modifier (méthyler)
son propre ADN afin qu’il ne soit pas reconnu par les enzymes de
restriction.
Les outils du génie génétique
Les enzymes de restriction
Les enzymes de restriction sont des endonucléase qui peuvent
couper un fragment d’ADN au niveau d’une séquence spécifique (4
à 6 paires de bases) appelée site de restriction.
Plusieurs centaines d'enzymes de restriction sont actuellement
connues, on en retrouve naturellement dans un grand nombre
d'espèces de bactéries.
Elles sont produites par les bactéries pour se protéger de l’ADN
étranger provenant d’autres organismes.
Elle constitue un mécanisme de défense contre les infections par
les bactériophages, des virus spécifiques des bactéries.
Les outils du génie génétique
Les enzymes de restriction
Les enzymes de restrictions appartiennent à la classe des
endonucléases, c'est-à-dire des enzymes capables de cliver les
liaisons phosphodiester entre deux nucléotides à l'intérieur de la
chaîne d'un acide nucléique.
Les endonucléases diffèrent des exonucléases, puisqu'elles peuvent
cliver les brins d'acide nucléique de manière interne, alors que les
exonucléases n’attaquent la molécule d'acide nucléique qu'au niveau
de ses extrémités.
Les outils du génie génétique
Les enzymes de restriction
Séquences reconnues par les enzymes de restriction
Les séquences de nucléotides reconnues par les enzymes de
restriction sont habituellement des séquences dites palindromiques.
Ces séquences palindromiques sont le plus souvent constituées de 4,
5 ou 6 paires de bases
Les enzymes de restriction clivent au niveau des liaisons
phosphodiester.
Les outils du génie génétique
Les enzymes de restriction
• Elles coupent de manière définie et reproductible l'ADN
bicaténaire.
• Ce sont les enzymes permettant l'ouverture spécifique du
vecteur et le découpage défini de l'ADN à cloner.
• Ce sont des enzymes produites par de très nombreuses
bactéries au moment des infections lysogéniques.
• L'analyse de leurs coupures de l'ADN montre qu'elles se font en
des sites spécifiques.
• Plus de 1200 différentes enzymes de restriction ont été
caractérisées
Les outils du génie génétique
Les outils du génie génétique
Les enzymes de restriction
Nomenclature des enzymes de restriction
Les enzymes de restriction présentent une nomenclature bien
précise. Leur nom comporte plusieurs lettres (3 ou 4).
La première lettre de dénomination de l'enzyme est écrite en
majuscule, elle correspond au genre de la bactérie d'où a été extraite
l'enzyme.
La seconde lettre et la troisième lettre (en minuscules)
correspondent à l'espèce de la bactérie d'où l'enzyme est extraite.
On peut avoir une quatrième lettre écrite en majuscule
correspondant à la souche bactérienne.
Enfin pour terminer, un chiffre romain indique l'ordre de
caractérisation de ces enzymes.
Les outils du génie génétique
Les enzymes de restriction
Nomenclature des enzymes de restriction
Exemple : Enzyme de restriction EcoRI
Genre: Escherichia
Espèce: coli
Souche:RY317
Ordre de découverte: (I)
Les outils du génie génétique
Les enzymes de restriction
Notion d'isoschizomères
Des enzymes de restriction différentes peuvent reconnaître des
mêmes sites spécifiques, on les appelle isoschizomères. Les
isoschizomères fournissent souvent après clivage enzymatique des
fragments
dont
les
extrémités
sont
différentes.
Exemple :
Soit la séquence suivante: GGTACC, cette séquence est coupée par l'enzyme Kpn I
et l'enzyme Acc65 I :
Kpn I:
5'-G-G-T-A-C/C-3'
Ces enzymes sont des isoschizomères, elles
3'-C/ C-A-T-G-G-5'
reconnaissent en effet la même séquence
Acc65 I:
nucléotidique GGTACC. On voit tout de suite
que les extrémités des fragments obtenus
5'-G/G-T-A-C-C-3'
diffèrent.
3'-C-C-A-T-G/G-5'
Les outils du génie génétique
Les enzymes de restriction
Lorsqu’une endonucléase de restriction coupe un ADN,
plusieurs extrémités peuvent être générées
Les outils du génie génétique
Les enzymes de restriction
Extrémités franches ou bouts francs
• La coupure a lieu au milieu du site de restriction.
• Pas de liaison spontanée entre les fragments qui ont
résulté de cette coupure.
• La T4 ligase peut rétablir la ligation des deux brins d’ADN
Les outils du génie génétique
Les enzymes de restriction
Extrémités cohésives ou bouts cohésifs
• Les coupures sont décalées l’une par rapport à l’autre sur les
deux brins.
• Les parties simples brins peuvent s’apparier
Les outils du génie génétique
Les enzymes de restriction
Types d’enzymes de restriction
Selon la relation spatiale entre la séquence reconnue et le lieu de
coupure, on distingue trois types d’enzymes de restriction:
Enzymes de type I : L’enzyme reconnaît un site particulier qui n’a
aucune symétrie et coupe l’ADN à environ 1000 jusqu’à 5000
nucléotides plus loin.
Enzymes de type III : L’enzyme reconnaît une séquence mais coupe à
une vingtaine de paires de bases plus loin
Les outils du génie génétique
Les enzymes de restriction
Types d’enzymes de restriction
Enzymes de type II : les plus utilisées en génie génétique. Leurs
sites de restrictions sont des séquences palindromiques. Elles
coupent au niveau de leurs sites de restriction.
Les outils du génie génétique
Les enzymes de restriction
Types d’enzymes de restriction
Les outils du génie génétique
Autres outils enzymatiques
I. Exonucléases
Des enzymes qui éliminent des nucléotides un a un à partir d’une
extrémité de l’ADN.
Exemple :
Bal31: obtenue de cultures d’Alieromonas espejana, elle élimine des
nucléotides à partir des deux extrémités des deux brins.
L’exonucléase 3: obtenue a partir d’E coli, elle catalyse l’hydrolyse
séquentielle des nucléotides d’un ADN à partir de l’extrémité 3’ libre.
Les outils du génie génétique
Autres outils enzymatiques
II. Endonucléases non spécifiques
Des enzymes capables de rompre des liaisons phosphodiesters
internes.
Exemple :
La DNAse 1: extraite du pancréas, coupe préférentiellement après
une base pyrimidique (les principales bases pyrimidiques sont
l'uracile, la thymine et la cytosine )
La nucléase S1: extraite de culture d'Aspergillus oryzae dégrade
seulement les acides nucléiques monocaténaires.
Les outils du génie génétique
Autres outils enzymatiques
III. Les polymérases
Sont des enzymes qui synthétisent un nouveau brin d’ADN
complémentaire à une matrice d’ADN ou ARN.
Deux types de polymérases sont couramment utilisées en génie
génétique :
L’ADN polymérase I: Extraite d’E-coli, elle se fixe à une région
monobrin et synthétise totalement le brin complémentaire. L’activité
polymérasique s’effectue dans le sens 5’-3’ à partir d’une amorce
3’OH.
Les outils du génie génétique
Autres outils enzymatiques
III. Les polymérases
La transcriptase réverse: Codée par les gènes Pol des rétrovirus,
elle transcrit l’ARN en ADN complémentaire.
L’activité polymérasique s’effectue dans le sens 5' vers 3’
Les outils du génie génétique
Autres outils enzymatiques
IV. Les ligases
Des enzymes qui permettent de relier deux fragments d’ADN
double brins.
ADN ligase: elle assure la formation des liaisons phosphodiesters
entre une extrémité 3’OH et une extrémité 5’phosphate de
fragments d’ADN à bout cohésifs.
T4 ligase: Elle est capable d’effectuer des ligations entre deux
fragments d’ADN à bouts francs.
Les outils du génie génétique
Expérience
Les outils du génie génétique
Utilités des enzymes de restriction
Les enzymes de restriction peuvent être utilisées en génie
génétique pour:
Faire produire à des cellules hôte une protéine exogène. Les
enzymes de restriction jouent un rôle crucial dans ce processus
car elles permettent l’intégration d’un brin d’ADN exogène dans
un plasmide dans le but de l’exprimer dans la cellule hôte.
Etablir une carte génétique appelée « carte de restriction » d’une
molécule d’ADN. Cette carte donne l’ordre des sites de restriction
le long de cette molécule, et la taille des fragments produits.
Les outils du génie génétique
AATTC
G
Gène
d’intérêt
G
CTTAA
Les outils du génie génétique
Utilités des enzymes de restriction
Carte de restriction
Une carte de restriction identifie dans l’ADN une suite linéaire de
sites de restriction séparés par une distance réelle (en nombre de
paires de bases). Ces sites correspondent à des coupures de la
séquence par des enzymes de restriction.
Elle permet de déterminer les positions des sites de restrictions:
1. Sur un ADN linéaire: Cartes d’ADN linéaire
2. Sur un plasmide: Cartes d’ADN circulaire
Les outils du génie génétique
Utilités des enzymes de restriction
Carte de restriction
•L’utilisation de modèles mathématiques pour constituer la carte de
restriction s’appuie sur les résultats obtenus après digestion de la
séquence d’ADN.
•En contrôlant les conditions expérimentales, on peut réaliser soit
une digestion totale ou partielle de la séquence d’ADN.
•En condition de digestion totale, tous les sites de coupure sont
coupés.
•Dans une digestion partielle, une proportion des sites de coupures
restent intactes.
Les outils du génie génétique
Utilités des enzymes de restriction
Carte de restriction
Carte de restriction: approche
1. Déterminer si l’ADN a été digéré
2. La digestion est elle complète ou partielle?
3. Nombre de coupures?
4. Les positions relatives
Les outils du génie génétique
Utilités des enzymes de restriction
Carte de restriction
1. Déterminer si l’ADN a été digéré
Comparez au témoin non digéré
Quelles échantillons n’ont pas été digérés?
Quelles échantillons ont été digérés?
Les outils du génie génétique
Utilités des enzymes de restriction
Carte de restriction
1. Déterminer si l’ADN a été digéré
Comparez au témoin non digéré
Quelles échantillons n’ont pas été digérés?
1 et 4
Quelles échantillons ont été digérés?
2 et 3
Les outils du génie génétique
Utilités des enzymes de restriction
Carte de restriction
2. Type de digestion
Digestion partielle
Digestion totale (complète)
Les outils du génie génétique
Utilités des enzymes de restriction
Carte de restriction
3. Nombre de coupure
Le nombre de sites de restriction dépend de la nature de l’ADN.
•Pour un ADN circulaire, le nombre de site de restriction=nombre de
fragments ADN obtenus
•Pour un ADN linéaire, le nombre de site de restriction=nombre de
fragments ADN obtenus-1
Les outils du génie génétique
Utilités des enzymes de restriction
Carte de restriction
4. Les positions relatives
La taille des fragments représente la distance entre les sites de
restriction.
Les outils du génie génétique
Utilités des enzymes de restriction
Carte de restriction
Exemple carte linéaire
Carte de restriction
Pour une molécule d’ADN linéaire de 7Kb.
La digestion avec l’enzyme HindIII permet l’obtention de 2 fragments :
4 et 3 Kb
Il existe donc 1 site de restriction pour cette enzyme.
Carte de restriction
La digestion avec l’enzyme SalI permet l’obtention de 2 fragments : 5
et 2 Kb
Il existe donc 1 site de restriction pour cette enzyme.
Carte de restriction
La double digestion avec HindIII et SalI permet l’obtention de 2
fragments:3 et 2Kb.
Carte de restriction
Les outils du génie génétique
Vecteur de clonage
• Vecteur de clonage: La molécule d'ADN dans laquelle on insère le
fragment d'ADN à étudier.
• L'ADN inséré est appelé insert ou ADN étranger ou ADN exogène.
• Ces séquences nucléotidiques sont capables de s'auto-répliquer
car, elles possèdent dans leur génome les signaux nécessaires à
leur réplication, mais sont incapables de se multiplier seuls. Il est
donc nécessaire de les introduire dans les cellules-hôtes pour
réaliser une multiplication de ceux-ci.
• On distingue le vecteur natif lorsqu'il ne contient que son ADN
propre et le vecteur recombiné lorsqu'il a intégré un fragment
d'ADN étranger.
Les outils du génie génétique
Vecteur de clonage
•
Utilité
‒
‒
‒
‒
Permet de conserver une séquence d'ADN donnée.
Permet de la multiplier pour en accroître la quantité.
Permet de la modifier pour y introduire des mutations, délétions.
Permet de la réintroduire dans des cellules.
•
Éléments nécessaires pour réaliser un clonage
1. Un Vecteur
Circulaire
Linéaire
2. Une Cellule hôte
Procaryote
Eucaryote
3. Un fragment d'ADN
d'intérêt.
ADN génomique
ADNc
Les outils du génie génétique
Vecteur de clonage
• ADN génomique est le support physique de l'ensemble des
gènes de la cellule.
• ADN complémentaire (ADNc) est la copie en ADN des ARNm.
Les outils du génie génétique
Vecteur de clonage
Chaque vecteur de clonage doit contenir les éléments suivants :
1. Origine de réplication : C'est la région qui code pour le début de la
synthèse d'ADN, ce qui lui donne la qualité de pouvoir se répliquer
indépendamment de l'ADN chromosomique, soit dans un système
bactérien soit dans un système d'expression de levure.
Les outils du génie génétique
Vecteur de clonage
2. Agent de sélection : Ce sont des gènes contenus dans la séquence
vectorielle, qui confèrent des caractéristiques supplémentaires au
système de clonage (bactéries, levures, etc.), qui permettent
l'identification et la sélection de clones recombinants, c'est-à-dire
des clones qui contiennent le fragment d'ADN d'intérêt.
Exemples :
Les gènes qui codent pour la résistance aux antibiotiques, tels que ceux pour la
résistance à l'ampicilline ou à la tétracycline, ou inversement, ils peuvent être des
marqueurs métaboliques tels que le gène lac Z, qui code pour la synthèse de
l'enzyme bêta galactosidase.
Les outils du génie génétique
Vecteur de clonage
3. Site de multiclonage (polylinker) : région contenue dans les
séquences des gènes qui codent pour les marqueurs, qui
contiennent plusieurs sites de restriction, c'est-à-dire plusieurs sites
de reconnaissance pour les enzymes de restriction, qui permettent
l'insertion de fragments d'ADN à cloner dans un système.
Les outils du génie génétique
Les caractéristiques d'un vecteur de clonage idéal
Les outils du génie génétique
Catégories du vecteur
Renferme une origine de réplication et
permet de cloner un segment d’ADN ou
un gène qui y est intégré et à amplifier le
nombre de copies.
Renferme un promoteur, il est destiné
à transférer un gène et le faire
exprimer dans une cellule hôte qui
n'est pas sa cellule d'origine.
Les outils du génie génétique
Vecteur de clonage
4. Un promoteur, ou séquence promotrice, est une région de l'ADN
située à proximité d'un gène et indispensable à la transcription de
l'ADN en ARN. Le promoteur est la zone de l'ADN sur laquelle se
fixe initialement l'ARN polymérase, avant de démarrer la synthèse
de l'ARN. Les séquences promotrices sont en général situées en
amont du site de démarrage de la transcription
Les outils du génie génétique
Propriétés des vecteurs de clonage
1. Réplication autonome et indépendante de l’ADN de la cellule hôte.
2. Petite taille: pour permettre l’insertion de grand fragment d’ADN
étranger.
3. Présence de gènes de sélection: sélection des cellules hôtes qui
ont intégré un vecteur.
Les outils du génie génétique
Propriétés des vecteurs de clonage
4. Présence de sites de restriction localisés dans les gènes de
sélection: permet de sélectionner les cellules hôtes qui ont
intégré un vecteur recombinant.
5. Stabilité: maintient sans modification dans la cellule hôte, quel
que soit le nombre de division.
Les outils du génie génétique
Les vecteurs
Propriétés d’un bon vecteur
• Réplication active et autonome dans la cellule hôte
• Présence d’un grand nombre de sites polylinkers localisés
dans les gènes de sélection
• Sa présence ne doit pas perturber la physiologie de cellule
hôte et vice versa
• Facile à isoler sous forme purifiée
Les outils du génie génétique
Types de vecteurs
Plusieurs types de vecteurs sont utilisés en manipulations génétiques à
savoir
Vecteurs
Hôte
Plasmides
Phages lambda
Cosmide
YAC (Yeast Artificial Chromosome)
BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
Bactérie
Bactérie
Bactérie
Levure
Bactérie
Insert
(Kb)
10
25
45
1000
300
Les outils du génie génétique
Les plasmides
Les plasmides sont des petits éléments génétiques extrachromosomiques doués de la réplication autonome, ce sont
typiquement des molécules d'ADN double brin, circulaires, Ils
contiennent des gènes codants souvent pour des protéines qui
donnent un ou des avantage(s) à la cellule hôte. Comme par
exemple :
- Résistance aux antibiotiques
- Résistance aux métaux lourds
- Dégradation de composés aromatiques
Les outils du génie génétique
Les plasmides
Composants basiques d'un vecteur plasmidique qui peut se
répliqué chez E. coli.
Les outils du génie génétique
Les plasmides
Les outils du génie génétique
Les classes de plasmides
a. Plasmides de première génération : Ce sont les premiers à avoir
été utilisés en génie génétique. Ce sont des plasmides à l’état
naturel, non modifiés au laboratoire. Il s’agit des plasmides
suivants : ColE1 ; RSF 2124 et pSC 101.
Ces types de plasmides n'ont pas les propriétés requises pour les
manipulations génétiques.
Les outils du génie génétique
Les classes de plasmides
b. Plasmides de deuxième génération : Les plasmides pBR
• Des plasmides artificiels.
• La série la plus importante de ces plasmides est la série pBR312
à pBR322.
• Le plasmide pBR322 est constitué d’environ 4,4Kb.
• Possède deux gènes de résistance à la tétracycline et à
l’amplicilline.
• Il possède 20 sites de restriction uniques dont 11 localisés sur
les deux gènes de résistance
Les outils du génie génétique
Les classes de plasmides
Les plasmides pBR
L’introduction d’un ADN étranger
dans l’un de ces sites se traduit
donc par la perte de la résistance à
l’antibiotique correspondant.
Les outils du génie génétique
Les classes de plasmides
c. Plasmides de 3ème génération :
• Des plasmides artificiels: la famille des pUC de pUC 8 à 19.
• Ont une taille qui avoisine 2,6Kb.
• Un plasmide pUC est un plasmide pBR dans lequel on a remplacé
le gène de résistance à la tétracycline par un gène bactérien lac Z
(fragment de l’opéron lactose) qui code pour l’extrémité NH₂ de la
B- galactosidase. Au sein de ce gène est placée une région
renfermant des sites de clonage multiple (MCS) ou site polylinker
(site d’insertion de l’ADN étranger).
• Les différents pUC (de pUC8 à pUC19) ne différent que par le
nombre de nucléotides et l’emplacement du polylinker
Les outils du génie génétique
Les classes de plasmides
Plasmides de 3ème génération
L’interruption du gène
Lac Z (par insertion de
l’ADN étranger) entraîne
une perte de l’activité
de la protéine qui code
la galactosidase.
Les outils du génie génétique
Les phages
Les outils du génie génétique
Les phages
• Découvert par E.M. Lederbergen 1950.
• Deux parties sont individualisées dans le phage lambda:
1. La tête du virus: Elle renferme l’ADN viral (ADN double
brin de 48 kb).
2. La queue du virus: Elle permet la fixation du virus sur la
cellule hôte bactérienne.
• A chaque extrémité 5’ de l’ADN se trouve une région
monocaténaire de 12 nucléotides l’une complémentaire à l’autre.
• Leurs association donne une structure circulaire à l’ADN dans la
cellule hôte.
Les outils du génie génétique
Les phages
• Leur multiplication est rapide et le nombre de copies / cellule
est élevé.
• Le rendement d’une infection phagique est supérieur à ce qui
est obtenu lors de la transformation par un plasmide.
Les outils du génie génétique
Classes des bactériophages
Deux phages sont fréquemment utilisés en génie génétique:
• Le phage lambda (de première génération) est un virus
bactériophage qui infecte la bactérie Escherichia coli. Ce
bactériophage est un virus à ADN double brin.
• Le phage M13 (deuxième génération) est un phage dont la forme
libre est constituée d’une membrane entourant un ADN simple
brin de 6,4kb.
Les outils du génie génétique
Les phages
• Les vecteurs phagiques les plus connus et les plus utilisés pour le
clonage sont dérivés du phage lambda (λ). Celui-ci peut se
multiplier selon 2 modes : selon le cycle lytique et le cycle
lysogénique.
• Lorsque le phage λ est utilisé comme vecteur de clonage, c’est le
cycle lytique qui nous intéresse puisqu’il entraîne la production
d’un grand nombre de nouveaux phages qui vont à leur tour
infecter d’autres bactéries et ainsi de suite
Les outils du génie génétique
Les phages
• L’ADN intégré se recombine avec le chromosome bactérien.
• L'intégration peut ensuite entraîner soit une réponse lysogénique,
soit une réponse lytique.
• Lorsque la réponse lysogénique se produit, les gènes viraux
responsables de la réplication virale ne sont pas exprimés. L’ADN
viral est alors qualifié de prophage. La bactérie continue de se
reproduire par scissiparité est dite lysogène.
• Une réponse lysogénique n’a pas toujours de conséquence sur la
vie de la cellule.
Les outils du génie génétique
Les phages
•Sous l’effet d’un stress, la réponse lysogénique peut devenir
lytique.
•La réponse lytique consiste en la production d’un grand nombre de
phages, et ensuite à l’éclatement de la bactérie infectée.
Les outils du génie génétique
Les phages
Les outils du génie génétique
Les cosmides
• Vecteurs artificiels constitués de molécules d’ADN circulaires
qui combinent à la fois les avantages des plasmides et des
phages.
• Ce sont des hybrides constitués d’un plasmide classique auquel
on a ajouté les extrémités cos du phage λ.
• Ils possèdent une origine de réplication plasmidique, un ou
plusieurs marqueurs de sélection, une région des sites de
clonage multiple MCS et un site cos (pour l’encapsidation in
vitro de grands fragments d’ADN).
• Ils permettent l’insertion de grands fragments d’ADN allant
jusqu’à 45 Kb.
Les outils du génie génétique
Les cosmides
Les outils du génie génétique
Les cosmides
Les outils du génie génétique
Cosmide: Etape d’empaquetage
1.Les sites cos rendent possible l’empaquetage in vitro du plasmide
porteur d’un insert dans la tête du phage lambda.
2.Les cosmides sont coupés en un site de restriction unique par
l’action d’une enzyme de restriction.
3.On mélange les molécules linéarisées avec les fragments d’ADN
constituant l’insert coupés avec la même enzyme.
Les outils du génie génétique
Cosmide: Etape d’empaquetage
4. Les cosmides et les fragments s’unissent au hasard.
5. Un clivage enzymatique aux sites cos crée des bouts collants et,
en présence des composants du phage, l’empaquetage des
molécules recombinantes s’effectue.
6. Après l’addition de la queue, la particule peut injecter son ADN
recombinant dans une bactérie. L’ADN injecté se circularise, via les
sites cos, et se réplique comme un plasmide. On peut détecter sa
présence dans la cellule, par l’expression de gènes de résistance à
des antibiotiques, codés par le plasmide.
Les outils du génie génétique
YAC : Yeast Artificial chromosome
• YAK (chromosome artificiel de levure) : Les YAC sont des
chromosomes de levure artificielle.
• Ces chromosomes de levure artificielle permettent le clonage
de gros morceaux d'ADN, allant jusqu’à 2000kb.
Les outils du génie génétique
YAC : Yeast Artificial chromosome
• Un vecteur YAC contient:
• Un centromère (CEN)et deux télomères (TEL)
• Une séquence de réplication autonome (ARS)
pour la prolifération dans les cellules hôtes
• Des sites de restriction SmaI et BamHI
• Un marqueur de sélection à l’ampicilline
(AmpR)
• Des gènes qui codent des enzymes nécessaires
dans la synthèse d'acides aminés: u+ (Ura), t+
(Trp), h+(His)et a+(Ade).
Les outils du génie génétique
YAC : Yeast Artificial chromosome
Human ADN
YAC Vector
Les outils du génie génétique
YAC : Yeast Artificial chromosome
• Une digestion par BamHI et EcoRI libère trois fragments : l’un
contient t+, ARS et CEN ainsi qu’un télomère, le second contient u+ et
un télomère et le troisième uniquement h+.
• Ces fragments de tailles différentes peuvent être séparer par
électrophorèse sur gel d’agarose
• Les deux gros fragments sont mélangé avec les fragments d’ADN à
insérer ayant des extrémités cohésives compatibles.
• Après action de la ligase on obtient un minichromosome recombiné
qui possède deux télomère, un centromère, la séquence ARS, AmpR
et t+ et u+.
Les outils du génie génétique
BAC (chromosome artificiel bactérien)
Un BAC est un chromosome artificiel bactérien, basé sur le
plasmide de fertilité (facteur F) des bactéries. C'est le plus utilisé.
Le facteur F est un plasmide à réplication indépendante qui
transfère des informations génétiques lors de la conjugaison
bactérienne.
Les BAC sont circulaires et très stables, donc ils ne se cassent pas.
La taille totale d'un BAC est d'environ 7,4 kb
Les outils du génie génétique
BAC (chromosome artificiel bactérien)
• parA, parB and repE sont des gènes requis pour la stabilité du
BAC.
• OriS est une origine de réplication
• CM : gène de résistance au chloramphénicol
Les outils du génie génétique
Hôtes de clonage
Pour se répliquer, un vecteur doit être incorporé dans une cellule
hôte spécifique de chaque type de vecteur.
Pour obtenir de grande quantité d’ADN l’hôte idéal doit:
•
•
•
•
•
Se développer rapidement dans un milieu de culture peu onéreux.
Être non pathogène.
Être capable d’incorporer l’ADN.
Être stable en culture
Possède des enzymes appropriées pour la réplication du vecteur.
Les outils du génie génétique
Hôtes de clonage
Les hôtes répondant à ces critères sont des microorganismes
eucaryotes ou procaryotes dont les génomes sont bien connus car
entièrement séquencés, génétiquement manipulables.
Les outils du génie génétique
Hôtes de clonage
1. Les hôtes bactériens
Ce sont les hôtes les plus utilisés car ils se multiplient rapidement
et sont faciles à manipuler. Les bactéries utilisées ne sont pas
pathogènes et sont modifiées afin de diminuer les risques de
dissémination accidentelle.
La bactérie de choix est E. coli qui doit être :
- une souche : ne produit pas des enzymes de restriction pour
ne pas détruire l’ADN étranger inséré.
- Incapable de recombiner l’ADN bactérien avec l’ADN inséré.
- Réceptrice donc incapables de transmettre le plasmide
qu’elles ont reçu ; par opposition aux souches donatrices.
Les outils du génie génétique
Hôtes de clonage
2. Les hôtes eucaryotes
Peuvent être des cellules animales en culture, des levures ou des
plantes. Leur manipulation est complexe et coûteuse. Ils ne sont
utilisés que :
- lorsqu’on travaille avec des vecteurs ayant une origine de
réplication eucaryote.
- lorsqu’on veut étudier la régulation in vivo d’un gène eucaryote.
- lorsqu’on veut faire exprimer une protéine qui ne peut être
fonctionnelle qu’à la suite de certaines modifications posttraductionnelles (une modification chimique d'une protéine,
réalisée le plus souvent par une enzyme, après sa synthèse ou au
cours de sa vie dans la cellule) que la bactérie ne peut pas réaliser.
Les outils du génie génétique
Exemple d’hôtes de clonage
Les outils du génie génétique
Hôtes de clonage
Le processus d’intégration de l’ADN étranger est appelé:
Transformation dans les cas des bactéries
Transfection pour les eucaryotes
Les outils du génie génétique
Hôtes de clonage
Transformation bactérienne: Consiste à faire entrer le plasmide
recombinant porteur du gène d’intérêt dans une cellule hôte où il
pourra se répliquer en grande quantité
Ce n’est pas un phénomène naturel donc :
• Rendre les bactéries
compétentes
• Fragiliser
la
paroi
bactérienne pour faciliter
l’entrée du plasmide
• Utilisation des méthodes physico-chimiques : choc thermique (de
0 à 42°C) ou choc électrique (électroporation) pour faire entrer
l’ADN plasmidique.
Les outils du génie génétique
Hôtes de clonage
Transformation bactérienne
1. Méthodes physico-chimiques
Les outils du génie génétique
Hôtes de clonage
Transformation bactérienne
 On insère le vecteur recombinant dans des bactéries.
 Attention car toutes les bactéries n’ont pas forcément intégré
le gène d’intérêt. On peut avoir des bactéries vides, des
bactéries avec le plasmide vide et des bactéries avec le vecteur
recombinant.
 Seules les colonies ayant intégrées le plasmide recombinant
sont intéressantes.
Les outils du génie génétique
Hôtes de clonage
Transformation bactérienne
Les outils du génie génétique
Hôtes de clonage
Sélection des bactéries transformées
Il est fondamental de disposer de système de sélection double
capable de discriminer à la fois :
 Les bactéries transformées des bactéries non transformées
 Les bactéries transformées par un vecteur recombinant ou non
recombinant.
Deux méthodes de sélection des bactéries : Résistances au
antibiotiques ou le Lac Z.
Les outils du génie génétique
Hôtes de clonage
Sélection des bactéries transformées
1. Criblage utilisant la résistance aux antibiotiques
Les outils du génie génétique
Hôtes de clonage
Sélection des bactéries transformées
1. Criblage utilisant la résistance aux antibiotiques
• La transformation d’une bactérie sensible à un antibiotique par des
plasmides portant un gène de résistance au même antibiotique
aboutit à l'apparition d'une résistance uniquement pour les
bactéries ayant incorporé les plasmides.
• Cette première étape permet de séparer les bactéries avec
plasmides et les bactéries sans plasmides
• Les bactéries sans plasmide sont tuées.
Les outils du génie génétique
Hôtes de clonage
Sélection des bactéries transformées
1. Criblage utilisant la résistance aux antibiotiques
• La deuxième étape consiste à distinguer les bactéries avec
plasmides intacts des bactéries avec plasmides recombinants.
• On utilise pour cela une résistance à un second antibiotique.
• L’insertion du fragment d’ADN dans le plasmide doit inactiver le
gène de résistance au deuxième antibiotique.
• Les bactéries transformées par les plasmides recombinants sont
donc résistantes au premier antibiotique et sensibles au
deuxième antibiotique. Les bactéries transformées par les
plasmides recombinants meurt.
Les outils du génie génétique
Hôtes de clonage
Sélection des bactéries transformées
2. Criblage par α-complémentation (Criblage sur la couleur des colonies ou criblage
blanc/bleu) :
Tous les vecteurs qui contiennent le Lac Z’ peuvent être utilisés.
Les outils du génie génétique
2. Criblage par αcomplémentation
(Criblage sur la couleur
des colonies ou criblage
blanc/bleu) :
Le milieu de culture devra
donc
contenir
de
l'ampicilline, de l'IPTG et
du X-gal, entre autres
composants habituels.
Les outils du génie génétique
Hôtes de clonage
Sélection des bactéries transformées
2. Criblage par α-complémentation (Criblage sur la couleur des colonies ou criblage
blanc/bleu) :
Après incubation :
• les bactéries sans plasmide ne poussent pas.
• les bactéries avec plasmide non recombinant (refermé vide)
donnent des colonies bleues.
• les bactéries avec plasmide recombinant (bactéries recherchées)
donnent des colonies blanches seront ensuite cultivées sur un
milieu nutritif.
Les outils du génie génétique
Hôtes de clonage
Sélection des bactéries transformées
2. Criblage par α-complémentation (Criblage sur la couleur des colonies ou criblage
blanc/bleu) :
• La première étape est identique à la méthode de sélection 1.
• La deuxième étape consiste à utiliser un système enzymatique
appartenant à l’opéron lactose à la place du second antibiotique.
• L’insertion du fragment d’ADN dans le plasmide aboutit à
l’inactivation du gène qui code pour la b-galactosidase.
• Pour vérifier la présence ou l’absence de l’activité enzymatique bgalactosidase, on utilise un galactoside X-gal dont la couleur passe
de l’incolore au bleu quand il est clivé par la bgalactosidase.
Les outils du génie génétique
Hôtes de clonage
Sélection des bactéries transformées
2. Criblage par α-complémentation (Criblage sur la couleur des colonies ou criblage
blanc/bleu) :
• Pour pouvoir métaboliser le X-gal, la cellule doit être exposée à un
inducteur le IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside).
• En présence d'IPTG et de X-gal, les bactéries transformées par les
plasmides recombinants se présentent sous forme de colonies
blanchâtres.
• Par contre, les bactéries non transformées par les plasmides
recombinants se présentent sous forme de colonies bleues.
• La sélection visuelle des bactéries transformées par les plasmides
recombinants est donc possible.
Les outils du génie génétique
Hôtes de clonage
Méthodes d'introduction de l'ADN à cloner dans la cellule
hôte
Il y’a plusieurs méthodes sont largement utilisées pour introduire
l’ADN dans les cellules hôtes.
N.B. Chez les bactéries on peut transférer l'ADN à cloner par trois
méthodes:
la transformation,
la transduction et
la conjugaison.
Les outils du génie génétique
Hôtes de clonage
1. Électroporation : L’ADN est introduit par choc électrique.
Cette technique implique l’exposition de l’hôte à des décharges
électriques afin d’ouvrir les pores (temporairement) dans la
membrane par lesquels, l’ADN cloné, ajouté dans le milieu, peut
pénétrer sans lyse des cellules
Les outils du génie génétique
Hôtes de clonage
2. Un canon à particules:
La transfection des cellules cibles se fait par des billes métalliques
recouvertes d’acides nucléiques, en perçant parois et membranes
plasmiques sans provoquer de lyse cellulaire.
Les outils du génie génétique
Hôtes de clonage
3. Micro-injection : Dans les cellules animales, l’ADN peut être injecté
dans le noyau par micro-injection.
Les outils du génie génétique
Eléments nécessaires au clonage
Une expérience typique de clonage nécessite les éléments suivants :
• l'ADN d’intérêt, appelé également ADN étranger ou ADN exogène.
• un vecteur de clonage (ou véhicule), dans l'exemple il s'agit d'un
plasmide c'est à dire un élément génétique bactérien, extrachromosomique, capable de réplication autonome.
• une nucléase de restriction
• une ligase
• une cellule (procaryote ou eucaryote) pouvant servir d'hôte
biologique.
Amplification en Chaîne par Polymérase
PCR est l'abréviation de l’expression anglaise Polymerase Chain
Reaction (le terme français équivalent, Amplification en Chaîne par
Polymérisation ou ACP, est rarement utilisé).
• La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique
d'amplification de l'ADN utilisée en biologie moléculaire.
• Il produit des milliers à des millions de copies d'un fragment
d'ADN particulier.
• Donc c’est une technique de purification ou de clonage.
• Cette méthode a été développée par Kary Mullis en 1983.
Amplification en Chaîne par Polymérase
• Dans cette technique, le fragment d'ADN à amplifier sert de
matrice et l'enzyme ADN polymérase ajoute des nucléotides
complémentaires à l'amorce qui est disponible dans le mélange
PCR.
• À la fin de la réaction de PCR, de nombreuses copies de
l'échantillon d'ADN sont synthétisées (En moyenne une PCR
comporte entre 20 et 40 cycles. Et chaque cycle est composé de
3 étapes).
Amplification en Chaîne par Polymérase
Eléments nécessaires à la PCR
• L'amplification en chaîne par polymérase est réalisée dans un
mélange réactionnel qui comprend l'extrait d'ADN (ADN matrice),
l’ADN polymérase, les amorces et les quatre désoxyribonucléoside
triphosphates (dNTP) en excès dans une solution tampon.
Amplification en Chaîne par Polymérase
Eléments nécessaires à la PCR
1. L’ADN matriciel
En théorie une copie ADN de la séquence recherchée est suffisante
pour avoir une amplification, il faut cependant tenir compte de la
probabilité de « rencontre » des molécules d’ADN matrice avec les
amorces. Dans la pratique plusieurs copies sont nécessaires pour
avoir un résultat correct.
Amplification en Chaîne par Polymérase
Eléments nécessaires à la PCR
2. Les amorces
Comme les autres ADN polymérases, la Taq polymérase ne peut
produire de l'ADN que si on lui donne une amorce, une courte
séquence de nucléotides qui fournit un point de départ pour la
synthèse de l'ADN.
Dans une réaction PCR, l'expérimentateur détermine la région de
l'ADN qui sera amplifiée, par les amorces qu'il choisit.
Amplification en Chaîne par Polymérase
Eléments nécessaires à la PCR
2. Les amorces
Les amorces PCR sont de courts morceaux d'ADN simple brin,
généralement d'une longueur d'environ 20 nucléotides.
Deux amorces sont utilisées dans chaque réaction PCR et elles sont
conçues de manière à flanquer la région cible (région qui doit être
copiée). C'est-à-dire qu'on leur donne des séquences qui les feront
se lier aux brins opposés de l'ADN matrice, juste aux bords de la
région à copier. Les amorces se lient à la matrice par appariement
de bases complémentaires.
Amplification en Chaîne par Polymérase
Eléments nécessaires à la PCR
3. L’ADN polymérase
Comme la réplication de l'ADN dans un organisme, la PCR nécessite
une enzyme ADN polymérase qui fabrique de nouveaux brins
d'ADN, en utilisant les brins existants comme matrices.
L'ADN polymérase généralement utilisée en PCR est appelée Taq
polymérase, d'après la bactérie tolérante à la chaleur à partir de
laquelle elle a été isolée (Thermus aquaticus).
Amplification en Chaîne par Polymérase
Eléments nécessaires à la PCR
3. L’ADN polymérase
T. aquaticus vit dans les sources chaudes et les sources
hydrothermales. Son ADN polymérase est très stable à la chaleur
et est plus active autour de 70 °C (une température à laquelle
une ADN polymérase humaine ou d’E. coli serait non
fonctionnelle). Cette stabilité thermique rend la Taq polymérase
idéale pour la PCR.
Amplification en Chaîne par Polymérase
Eléments nécessaires à la PCR
4. Les DésoxyriboNucléotides-Tri-Phosphates
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Les dNTPs (Désoxyribonucléotides-TriPhosphates) sont des molécules de base,
qui constituent l’ADN, utilisés par la Taq
polymérase pour la synthèse du nouveau
brin d’ADN complémentaire.
Désoxyribonucléotide
triphosphate
(dXTP)
Amplification en Chaîne par Polymérase
Eléments nécessaires à la PCR
5. Le tampon
Le tampon crée un environnement optimal pour que la réaction PCR
se produise.
Il sert à maintenir stable le pH du milieu réactionnel au niveau
optimal pour la Taq polymérase (Tris HCl à pH basique 8,5 à 9).
Il contient des cations bivalents Mg 2+, cofacteurs indispensables pour
la réaction de polymérisation avec la Taq polymérase.
Amplification en Chaîne par Polymérase
Eléments nécessaires à la PCR
5. Le tampon
N.B: La présence dans le milieu réactionnel des cations bivalents Mg2+
et de cations monovalents (K+ ou NH4+) vont neutraliser les charges
négatives des groupements phosphates au niveau de l’ADN et ainsi
stabiliser les hybrides ADN/ADN.
En pratique, la concentration en sel doit cependant rester compatible
avec l’activité de l’ADN polymérase.
Amplification en Chaîne par Polymérase
Les étapes de la PCR
• Chaque cycle d'amplification (cycle de PCR) comprend trois étapes :
- La dénaturation;
- L'hybridation d'amorces ;
- L'extension de brin.
Ces étapes s’effectuent à des températures différentes permettant
de contrôler l’activité enzymatique
Amplification en Chaîne par Polymérase
Les étapes de la PCR
1. l’étape de dénaturation, est réalisée à environ 95°C,
2. l’étape d’hybridation se fait à une température qui sera définie
selon la nature des amorces (cette température varie de 50 à
60°C).
3. l’étape de polymérisation est à environ 72°C, température de «
travail » de l’ADN polymérase thermorésistante utilisée.
Les températures de dénaturation et de polymérisation sont fixes,
seule la température d’hybridation devra être calculée pour chaque
nouvelle PCR.
Cette température d’hybridation dépend de la composition en bases
des oligonucléotides amorces
Amplification en Chaîne par Polymérase
Les étapes de la PCR
La température d’hybridation dépend de la composition en bases des
oligonucléotides amorces.
Elle est légèrement inférieure (environ de 5°C) au Tm qui est la
température de demi-dénaturation.
Pour calculer la température de demi-dénaturation (Tm) d’un
oligonucléotide inférieur à 30 nucléotides, on utilise la relation
suivante :
Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)
(Où A, T, G et C sont respectivement le nombre de chacune de ces
bases dans l’oligonucléotide).
Amplification en Chaîne par Polymérase
Les étapes de la PCR
La réaction de la PCR
Une PCR classique se déroule dans un petit
tube lui même placé dans un
thermocycleur.
Cet appareil permet d’exposer les tubes à
des températures choisies et pour des
durées déterminées par l’expérimentateur.
La réaction PCR est extrêmement rapide et
ne dure que quelques heures (2 à 3 heures
pour une PCR de 30 cycles).
Amplification en Chaîne par Polymérase
Les étapes de la PCR
La réaction de la PCR
L’appareil contient un bloc chauffant où l’on insère les tubes
contenant notre mélange pour la réaction de PCR et où la
température peut varier très rapidement et très précisément de 0°C à
100°C.
Le thermocycleur est alors programmé pour effectuer les différents
cycles de la PCR. Ainsi, chaque cycle est composé d’une succession de
paliers de température prédéterminée, et d’une durée bien définie.
Ces deux paramètres, température et temps, dépendent de la taille
de la séquence à amplifier de la taille et de la composition en
désoxyribonucléotides des amorces.
Amplification en Chaîne par Polymérase
Les étapes de la PCR
La réaction de la PCR
• On met tous les « acteurs » de la PCR sont introduits dans le
même tube. Il s'agit de l'ADN à amplifier, des oligonucléotides (ou
amorces), spécifiques du segment d'ADN voulu, de la Taq
polymérase
et
enfin
du
mélange
des
quatre
désoxyribonucléotides constitutifs de l'ADN.
• Tous sont ajoutés en large excès par rapport à l'ADN.
• Et le 1er cycle commence avec ses 3 étapes
Amplification en Chaîne par Polymérase
Les étapes de la PCR
La dénaturation
• La température dans le tube est
réglée à 95°C.
• A cette température, les liaisons
faibles qui assuraient la cohésion
de la double hélice d'ADN sont
rompues pour donner deux
simples brins d'ADN. Alors l’ADN
se dénature
Amplification en Chaîne par Polymérase
Les étapes de la PCR
L’hybridation
La température est descendue à la température dite d’hybridation.
Cette dernière est généralement comprise entre 50°C et 60°C et
elle est fonction de la composition en désoxyribonucléotides (dATP,
dTTP, dGTP, et dCTP) des amorces.
Les amorces reconnaissent et se fixent à leurs séquences
complémentaires en reformant des liaisons hydrogène. On dit que
les amorces s’hybrident au brin d’ADN.
Amplification en Chaîne par Polymérase
Les étapes de la PCR
L’élongation
• Puis la température est réglée à 72°C, température idéale pour
l’activité de la Taq polymérase.
• Les amorces hybridées à l'ADN servent de point de départ , à la
polymérisation du brin d'ADN complémentaire de l'ADN matrice. La
polymérisation
se
fait
par
ajout
successif
des
désoxyribonucléotides. Chaque base ajoutée est complémentaire
de la base correspondante du brin matrice.
Amplification en Chaîne par Polymérase
Les étapes de la PCR
Le nombre de cycle est défini par l’expérimentateur selon le
degré d’amplification souhaité, dans la plupart des cas, ce
nombre est d’environ 30. En théorie (et seulement en théorie!)
il y a un facteur d’amplification de l’ordre de (2n, n : représente
le nombre de cycles) 230 soit un facteur d'un milliard.
Amplification en Chaîne par Polymérase
Les étapes de la PCR
A partir d’une copie d’ADN cible, on pourra donc obtenir 1 milliard
de copie d’ADN cible.
Amplification en Chaîne par Polymérase
Les étapes de la PCR
Amplification en Chaîne par Polymérase
Les applications de la PCR
La PCR est très couramment utilisée dans de nombreux domaines, ses
champs d'application sont variés. Par exemple, la PCR est utilisée
pour :
• L’identification et la caractérisation des agents infectieux ;
• La détection directe de micro-organismes dans les prélèvements
des patients ;
• L’identification des micro-organismes cultivés en culture ;
• La détection de la résistance aux antimicrobiens chez les
microorganismes;
• L’empreintes génétiques (demande médico-légale/test de
paternité) ;
• La détection de mutation (investigation de maladies génétiques) ;
• Le clonage de gènes.
Amplification en Chaîne par Polymérase
Limite de la PCR
• Comme toutes les enzymes, les ADN polymérases sont
également sujettes aux erreurs, ce qui provoque à son tour des
mutations dans les fragments PCR générés.
• Une autre limitation de la PCR est que même la plus petite
quantité d'ADN contaminant peut être amplifiée, ce qui
entraîne des résultats trompeurs ou ambigus.
Amplification en Chaîne par Polymérase
Variantes de la PCR
La polyvalence de la PCR a conduit au développement d'un
grand nombre de variantes de la PCR. Parmi eux :
• La PCR en temps réel (Real-time PCR) " dite également "PCR
quantitative, qPCR", cette technique consiste à mesurer la quantité
d’ADN polymérisé à chaque cycle (temps réel) grâce à un marqueur
fluorescent. Elle permet de détecter le produit de la PCR au fur et à
mesure qu'il s'accumule.
 L'accumulation des séquences d'ADN cible dans le milieu
réactionnel se traduit par une augmentation d'une émission de
fluorescence. Ce système expérimental permet de suivre en temps
réel, cycle par cycle, l'évolution de la réaction PCR.
Amplification en Chaîne par Polymérase
Variantes de la PCR
• RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) : est une technique qui
permet de faire une PCR à partir d'un échantillon d'ARN.
 L'ARN est tout d'abord rétrotranscrit grâce à une enzyme appelée
transcriptase inverse, qui permet la synthèse de l'ADN
complémentaire (ADNc). Ce dernier est ensuite utilisé pour
réaliser une PCR.
 Elle est certainement la méthode la plus sensible pour détecter
et quantifier, les ARN messagers au niveau d'un organe, d'un tissu
ou d'une cellule.
Amplification en Chaîne par Polymérase
Variantes de la PCR
• PCR Multiplex : consiste à amplifier, dans un tube unique, avec
plusieurs couples d’amorces spécifiques et différents, une partie
du gène à étudier.
 Les produits de PCR ne seront alors compétitifs que pour la
polymérase, les dNTP et, éventuellement, le marqueur d’ADN. Il
est également possible d’amplifier différents types d’ADN
reconnus par un même couple d’amorces, les produits
d’amplifications doivent avoir chacun une taille différente de
manière à pouvoir les différencier lors de l’analyse
éléctrophorétique.
Amplification en Chaîne par Polymérase
Variantes de la PCR
• PCR sur colonie : la PCR sur colonie (Colony PCR) est un protocole
qui permet d'amplifier de façon simple de l'ADN de microorganisme (bactéries, archées ou levures) en inoculant directement
la colonie dans le milieu réactionnel de la PCR.
 Durant les premières étapes de dénaturation, les cellules sont
lysées et leur ADN est libéré dans le milieu réactionnel. L'ADN ainsi
libéré peut alors servir de matrice.
 La PCR sur colonie est utilisée notamment pour vérifier l'efficacité
d'une transgénèse. Elle fut très utilisée lors de la construction des
BAC dans les grands programmes de séquençage.
 La PCR sur colonie est largement utilisée en recherche
microbiologique afin de caractériser sur le plan phylogénétique les
souches étudiées.
Séquençage de l'ADN
Qu'est-ce que le séquençage de l'ADN?
 Le séquençage de l'ADN est la détermination d'un ordre précis
des nucléotides - adénine, guanine, cytosine et thymine dans un
fragment d'ADN donné.
 Les informations génétiques sont stockées dans les séquences
d'ADN en utilisant le bon ordre des nucléotides. Par conséquent, il
est très important de trouver l'ordre précis des nucléotides dans
un fragment d'ADN pour connaître la structure et la fonction des
gènes.
Séquençage de l'ADN
• Le protocole de séquençage de l'ADN implique différents
processus:
 La première étape est l'isolement de l'ADN intéressé ou de l'ADN
génomique d'un organisme. En utilisant la PCR (comme décrit
auparavant), la région souhaitée de l'ADN doit être amplifiée.
 Le produit de PCR amplifié doit être séparé par électrophorèse sur
gel et purifié.
 Les fragments amplifiés servent de modèles pour le séquençage.
Le séquençage peut être effectué en suivant le séquençage Sanger
ou la méthode de séquençage à haut débit.
Séquençage enzymatique de Sanger
Cette technique consiste à la synthèse in vitro du brin d’ADN
complémentaire à l’un des 2 brins de l’ADN que l’on désire
séquencer.
Elle repose sur l’utilisation dans le milieu réactionnel (contenant les
dNTPs, une amorce marquée et une ADN polymérase) de nucléotides
de synthèse modifiés et analogues structuraux de nucléotides: les
didésoxyribonucléosides triphosphates (ddNTPs) dépourvus du
groupement OH (fonction alcool) en 3’ nécessaire pour former une
liaison avec le nucléotide triphosphate suivant.
Séquençage enzymatique de Sanger
1. Structure d’un ddNTP
Une fois incorporé dans la chaîne en cours
d’élongation, le ddNTP provoque l’arrêt de
la synthèse de l’ADN à partir de leur
incorporation : c’est un inhibiteur de la
réplication.
Didésoxyribonucléotide
-triphosphate (ddXTP)
Séquençage enzymatique de Sanger
2. Etapes du séquençage selon Sanger
 Quatre réactions sont préparées à partir d’une matrice d’ADN
simple brin (la séquence recherchée) et une fraction d’amorce
marquée. Chaque tube reçoit une petite quantité d’un ddNTP
différent (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), ainsi que les 4 dNTPs
normaux.
 Un ddNTP sera incorporé au hasard à des sites distincts selon la
synthèse ayant lieu dans le tube à essai.
 Donc tous les tubes contiendront un mélange d’ADN de tailles
différentes (correspondant chacune au site d’incorporation du
ddNTP spécifique du tube, et donc de l’arrêt de croissance de la
chaîne d’ADN) en fonction du point d’arrêt de la polymérisation et
qui seront terminés par l’une des 4 bases possibles de l’ADN.
Séquençage enzymatique de Sanger
3. Autoradiogramme d’un gel de séquençage
Les fragments tronqués sont ensuite séparés par électrophorèse sur
gel de polyacrylamide (pouvant séparer 2 fragments d’ADN dont la
longueur ne diffère que d’un nucléotide) et visualisés par
autoradiographie (marquage radioactif de la sonde par
fluorescence).
L’autoradiogramme contient donc 4 colonnes pour les résultats
obtenus dans les 4 tubes (les plus petits fragments migrent toujours
le plus vite). La lecture de l’autoradiogramme se fait du bas vers le
haut dans le sens 5’ vers 3’ pour le brin complémentaire (radioactif
ou fluorescent). Il suffit d’en déduire la séquence du brin matriciel
par complémentarité dans le sens 3’ vers 5’ puis de l’écrire dans le
sens conventionnel 5’ vers 3’.
Séquençage enzymatique de Sanger
4. Principe du Séquençage automatisé de l’ADN à l’aide des 4 ddNTPs
marqués à des fluorochromes différents
Actuellement, le séquençage est devenu automatisé : « séquençage
automatique » qui présente le même principe sauf qu’au lieu de
marquer les fragments d’ADN par des amorces radioactives, les
machines de séquençage les plus récentes marquent les 4 types de
ddNTP par des fluorochromes de couleur différentes spécifiques
pour chaque type de nucléotide (ddTTP-ROX (rouge), ddATP-JOE
(vert), ddGTP-TAMRA (noir) et ddCTP-5-FAM (bleu)).
Séquençage enzymatique de Sanger
4. Principe du Séquençage automatisé de l’ADN à l’aide des 4 ddNTPs
marqués à des fluorochromes différents
Les produits de la réaction sont déposés sur un gel d’électrophorèse :
gel de séquence et les données de séquence sont enregistrées au
cours de l’électrophorèse grâce à un rayon laser qui capte la
fluorescence émise par chacun des 4 fluorochromes au cours de la
migration des fragments d’ADN.
L’information est ainsi enregistrée et interprétée dans la banque de
données de l’ordinateur. Les réactions peuvent ainsi se dérouler dans
le même tube.
Principe de la technique de séquençage enzymatique de Sanger
utilisant le ddNTP
Principe de la technique de séquençage enzymatique de Sanger
utilisant le ddNTP
Principe de la technique de séquençage enzymatique de Sanger
utilisant le ddNTP
Principe de la technique de séquençage enzymatique de Sanger
utilisant le ddNTP
Séquençage de l'ADN
• Le séquençage de Sanger nécessite une électrophorèse capillaire
des fragments d'ADN résultants.
• La détermination de l'ordre correct des nucléotides peut être
effectuée par lecture manuelle d'autoradiographies ou en utilisant
des séquenceurs d'ADN automatisés.
Séquençage de l'ADN
• Le séquençage des gènes a contribué au projet du génome
humain et a facilité la cartographie du génome humain en 2003.
• En criminalistique, le séquençage de l'ADN a permis
l'identification d'individus qui présentent des séquences d'ADN
uniques et identifient les criminels.
• En médecine, le séquençage de l'ADN peut être utilisé pour
détecter les gènes responsables de maladies génétiques et
autres, trouver des gènes défectueux et les remplacer par des
gènes corrects.
• En agriculture, les informations de séquençage de l'ADN de
certains micro-organismes sont utilisées pour produire des
cultures transgéniques aux caractéristiques économiquement
souhaitées.
PCR vs séquençage d'ADN
Quelle est la différence entre la PCR et le séquençage d'ADN?
PCR
Séquençage d'ADN
Le processus de PCR crée des milliers à des Le séquençage de l'ADN est le processus de
millions de copies du fragment d'ADN détermination de l'ordre précis des
intéressé.
nucléotides dans un fragment d'ADN donné.
Résultat
La PCR crée des milliers à des millions de Il en résulte l'ordre correct des bases dans un
copies d'un fragment d'ADN particulier
fragment d'ADN particulier.
Implication des ddNTP
La PCR ne nécessite pas de ddNTP. Il utilise Le séquençage de l'ADN nécessite des ddNTP
des dNTP.
pour terminer la formation des brins.
PCR vs séquençage d'ADN
 La PCR et le séquençage de l'ADN sont des outils très importants
dans de nombreux domaines de la biologie moléculaire.
 L'amplification des fragments d'ADN se fait par la technique de
PCR tandis que l'ordre correct des nucléotides d'un fragment
d'ADN est déterminé par le séquençage de l'ADN. C'est la
différence entre la PCR et le séquençage d'ADN.