Chromatographie HPLC : Principes, Méthodes et Validation

INTRODUCTION
La chromatographie liquide haute performance (HPLC)
s'est imposée comme une technique analytique majeure
grâce à sa capacité à séparer et quantifier avec précision
des composés dans des matrices complexes. La spécificité
et la sélectivité constituent les piliers fondamentaux de
cette méthode, garantissant respectivement la mesure
exclusive de l'analyte cible et la distinction efficace entre
plusieurs composés. Ces caractéristiques dépendent
étroitement du choix judicieux de la colonne
chromatographique, dont les paramètres clés - nature de
la phase stationnaire, taille des particules, dimensions
géométriques et plage de pH - déterminent directement la
résolution et la sensibilité de l'analyse. Une
compréhension approfondie de ces éléments permet
d'optimiser les performances analytiques tout en
répondant aux exigences réglementaires strictes des
industries pharmaceutique, agroalimentaire et
environnementale. Cette approche méthodologique assure
la fiabilité des résultats et consolide la position de l'HPLC
comme outil de référence en chimie analytique moderne.

Chapitre 1 : INTRODUCTION CHROMATOGRAPHIE

I – Historique et définition :
Chromatographie est méthode de séparation physique d'un mélange dont les
composés sont répartis entre une phase stationnaire et une phase mobile. il’ y a
plusieurs types de chromatographie :
Chromatographie sur couche mince (CCM ou TLC en anglais).
Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou GC en anglais) également
Chromatographie en phase liquide (CPL ou LC en anglais).
Chromatographie en phase liquide à ultra performance (UPLC)
Chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP ou HPLC
en anglais)
- La chromatographie en phase liquide haute performance (HPLC) :
La chromatographie liquide à haute performance (HPLC) est une technique
d’analyse moderne dont les racines remontent à 1903, lorsque le botaniste russe
Mikhail Tswett introduisit pour la première fois la chromatographie en colonne pour
séparer des pigments végétaux. Bien que son travail soit initialement resté discret,
les bases de la chromatographie moderne furent véritablement établies dans les
années 1940 grâce aux travaux de Martin et Synge, qui développèrent la
chromatographie de partage et obtinrent le prix Nobel de chimie en 1952. À partir
des années 1960, les limites de la chromatographie liquide classique, notamment en
termes de lenteur et de faible résolution, ont conduit au développement de la HPLC.
En utilisant des particules de phase stationnaire de très petite taille, il devint
nécessaire d’appliquer une pression élevée pour forcer le solvant à traverser la
colonne, d'où le terme "High Pressure Liquid Chromatography", ensuite renommé
"High Performance Liquid Chromatography" pour souligner ses performances
analytiques accrues. Dès les années 1970-1980, l’introduction de pompes haute
pression, de colonnes hautement efficaces, et de détecteurs sensibles (UV,
fluorescence, spectrométrie de masse) a permis à la HPLC de s’imposer comme une
méthode de référence pour la séparation, l’identification et la quantification de
composés chimiques, tant dans les domaines pharmaceutique, environnemental,
alimentaire que biomédical. Aujourd’hui, des versions avancées comme l’UHPLC
(Ultra High Performance) offrent encore plus de rapidité et de sensibilité, consolidant
le rôle central de la HPLC en chimie analytique moderne.
Objectif - Evaluer la qualité d'un chromatogramme.
Déterminer les proportions d'un mélange par une méthode d'étalonnage.

Résumé chronologique :
Date
Événement clé
1903
Tswett découvre la chromatographie en colonne
Années 1940
Martin & Synge développent la chromatographie moderne
Années 1960
Naissance de la HPLC avec haute pression
Années 1980+
Améliorations techniques → HPLC performante
II – principe
Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant. Ce
mélange est introduit dans la phase mobile liquide (éluant). Suivant la nature des
molécules, elles interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire dans un
tube appelé colonne chromatographique.
III– Appareillage
Réservoir de la phase mobile (solvant)

Le plus souvent ce réservoir est une bouteille en verre dans lequel plonge un tube
avec une extrémité filtrante en téflon
Pompe
Elle délivre en continu la phase mobile sous pression avec un débit constant et
stable
Injecteur
Le type d'injecteur le plus couramment utilisé comporte une vanne à boucle1
d'échantillonnage d'une capacité fixe (10, 20, 50 μL…). Cette boucle permet
d'introduire l'échantillon sans modifier la pression dans la colonne.
Colonne (contenant la phase stationnaire)
en HPLC est l’élément central du système dans lequel se déroule la séparation des
composés d’un mélange
Détecteur
Mesure la concentration des analytes à la sortie de la colonne (par exemple, détecteur UV-
Vis ou MS).
Système d’intégration et impression
Permet de suivre et d’analyser les résultats
IV– Colonne (les différents types de séparation)
1- La chromatographie d'adsorption (liquide/solide)
•La phase stationnaire consiste en une matière solide à grand pouvoir d'adsorption.
Les composants sont simplement plus ou moins retenus à la surface de la phase
stationnaire. C'est une technique qui prend en compte la polarité des
composants
•Technique peu utilisée.
2- La chromatographie de partage (liquide/liquide)
Une technique chromatographique dans laquelle la séparation des composés repose
sur leur répartition entre deux phases liquides immiscibles :