chromatocol 04

GRAMEGNA MORCHIO 09.06 – 10.06 2004
Andrea Biochimie
1
CHROMATOGRAPHIE
Purification d’un produit
organique à l’aide d’une colonne
chromatographique
1. But
Le but de cette expérience est de séparer deux produits organiques
(alcool et ester) d’un colorant alimentaire par la méthode de chromatographie
sur colonne.
2. Partie théorique
La chromatographie sur colonne est une méthode importante pour la
séparation d’un produit contenant des impuretés difficiles à enlever par
distillation ou cristallisation. Cette technique sert également à séparer des
produits organiques d’un mélange. Il existe deux types de chromatographie :
la première est celle avec l’oxyde d’aluminium, tandis que la deuxième est
celle avec le gel de silice (c’est la plus moderne des deux). Les deux ont le
même principe d’utilisation, cependant la première se fait avec plusieurs
solvants allant du moins polaire au plus polaire. Je vais utiliser la deuxième
méthode pour faire cette expérience. Cette dernière me permettra de travailler
avec un seul mélange de solvant, ce qui est plus pratique ; avec cette
méthode le rendement final est en général assez bon.
Les diverses substances introduites au sommet de la colonne de gel
de silice sont plus ou moins retenues à la surface du support, suivant leur
polarité. Elles sont donc plus ou moins facilement entraînées par le solvant
qui migre dans la colonne. Le plus polaire passera en premier et ainsi de
suite.

GRAMEGNA MORCHIO 09.06 – 10.06 2004
Andrea Biochimie
2
3.Partie expérimentale
Mode opératoire
Avant de commencer l’expérience, il faut préparer environ 500 ml
d’éluant (71 ml d’acétate d'éthyle et 428 ml de chlorure de méthylène) ; des
plaques ccms (trois pour commencer et s’il faut, plus) ; une cuve ccm avec de
l’éluant à l’intérieur et un rack d’éprouvettes numérotées de 1 à 12 - si besoin
est en préparer d’avantage.
Un peu d’ouate a été mise au fond de la colonne chromatographique
avec une spatule de sable ainsi que 30 ml d’éluant. Il a fallu préparer une
pâte avec 50 g de silice et 125 ml d'éluant : le tout a été versé dans la
colonne. J'ai dû tasser jusqu'à ce que le niveau de silice ne bouge plus ; j'ai
ajouté par la suite une spatule de sable de quartz.
Une fois la colonne prête, j'ai ajusté le niveau supérieur du solvant à la
hauteur de la silice.
Le mélange brut à séparer (200 mg) a été dissout dans environ 2 ml
d'éluant ; le mélange a été introduit très délicatement dans la colonne (la
solution contenant le mélange doit être régulièrement réparti sur la surface de
la silice). Quand le produit est en tête de colonne, le robinet doit être fermé
(cela évite que la colonne ne sèche pendant qu'on rince le flacon ayant
contenu l'échantillon). Il faut rincer les parois de la colonne 2-3 fois avec un
minimum de solvant. J'ai dû par la suite couvrir la tête de la colonne avec
l'éluant jusqu'en haut en évitant toujours de perturber la surface de la silice.
J'ai ensuite élué et ai récolté des fractions de 5 ml du mélange ; une fois que
le deuxième produit est sorti, j'ai pris des fractions de 20 ml cette fois-ci.
(Schéma de la colonne cf. ANNEXE I)
J'ai récolté toutes les fractions des différents produits et les ai passé au
rotavapor pour éliminer le solvant. Grâce à la chromatographie sur couche
mince, j'ai décidé parmi les deux produits obtenus lequel est l'alcool et lequel
est l'ester. Pour finir, j'ai déterminé le rendement de la colonne, les masses de
l'alcool pur et la masse de l'ester pur.

GRAMEGNA MORCHIO 09.06 – 10.06 2004
Andrea Biochimie
3
Résultats :
Attention: pour chaque ccm, il faut faire un spot de la solution de
référence et un pour l'ester (les deux solutions sont données par les
assistants).
J'ai récolté trois fractions de 5 ml chacune, puis j'ai fait trois spots
correspondants à chaques fractions sur une plaque ccm ; j'ai passé celle-ci
sous UV pour voir s'il y avait ou non un produit. En examinant la première
ccm contenant les trois premiers spots, on peut remarquer qu'il n'y a pas de
produit.

GRAMEGNA MORCHIO 09.06 – 10.06 2004
Andrea Biochimie
4
J'ai donc repris trois autres fractions et ai procédé comme
précédemment. En examinant les trois spots, on remarque que le deuxième
produit est passé. J'en ai donc conclu que le premier produit est passé dans
le volume mort. En ce qui concerne ce dernier, de plus amples détails sont
expliqués à la page n°7.

GRAMEGNA MORCHIO 09.06 – 10.06 2004
Andrea Biochimie
5
Pour les trois autres fractions, j'ai récolté 20 ml du mélange. J'ai
procédé comme pour les autres fractions pour voir s'il y avait bien du produit.