Culture des cellules animales

CULTURE DE CELLULES
ANIMALES
Biotechnologies
Lallemand F.
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INTRODUCTION
Les cultures cellulaires existent depuis longtemps (1907, première culture de tissus réussie par
Ron Harrison), mais elles sont beaucoup plus connues depuis les années 40, mais surtout 5060 grâce à la découverte de la trypsine (enzyme protéolytique qui a permis d’isoler des
cellules), des antibiotiques (qui ont permis d’éviter plus facilement de nombreux problèmes
de contamination) et au développement de milieux de culture standardisés chimiquement.
La culture cellulaire est utilisée en recherche fondamentale (virologie, étude des interactions
cellules-cellules, étude des activités intracellulaires, mécanismes du cancer…), pour les
conseils génétiques (diagnostic pré-post natal), la thérapie génique, la fabrication d’OGM...
Elle est aussi utilisée pour les tests de toxicité (médicaments, cosmétiques, produits chimiques
divers). Dans le domaine industriel, la cellule peut être utilisée comme usine de production
(vaccins, interféron…). Pourquoi utiliser des cellules humaines à la place des bactéries pour
produire des protéines ? En fait, certaines protéines ne sont pas totalement correctes
lorsqu’elles sont produites par des procaryotes ou des eucaryotes inférieurs (finition non
complète, structure 3 D…).
La culture de cellules animales se distingue des cultures microbiennes par différents aspects :
- les concentrations cellulaires sont plus faibles (1 million /ml contre 10 milliards)
- tout est plus lent : il faut 15 à 40 h pour doubler la population contre 1 h ou 2 pour les
bactéries
- les cellules animales sont plus fragiles que les cellules microbiennes (température,
oxygénation, forces hydrodynamiques ou « cisaillement »…) et leurs exigences
nutritionnelles plus strictes.
1. TYPES DE CULTURES CELLULAIRES
Il existe 3 types de cultures et donc 3 méthodes de travail.
1.1. La culture d’organe ou culture organotypique
Elle correspond au maintien hors de l’organisme d’organes entiers ou de fragments
intacts ayant conservé une bonne partie de leurs structures et de leurs fonctions.
Elle implique que l’architecture caractéristique du tissu « in vivo » (3D) soit
préservée (donc pas de dissociation). C’est donc un modèle similaire à l’in vivo.
Le prélèvement sera maintenu à l’interface liquide-gaz, ce qui favorise le maintien
d’une structure tridimensionnelle.
Ce sont des cultures qui croissent très lentement et qui sont menées uniquement dans
le but d’études vu la survie limitée de l’explant.
Le mélange de cellules limite aussi la vision de chaque entité.
1.2. La culture de tissus ou culture histiotypique
Elle correspond au maintien du tissu hors de l’organisme d’une manière permettant la
conservation de fonctions spécifiques.
Des fragments de tissus issus d’un explant primaire sont déposés à l’interface
support-liquide où après adhésion et ancrage, la migration des cellules peut survenir
dans le plan du substrat solide.
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1.3. La culture de cellules
Les cellules échappées (mécaniquement, chimiquement, enzymatiquement) sont
dispersées en une suspension cellulaire qui peut être cultivée en monocouche.
Dans de telles cultures, la prolifération est favorisée et la propagation devient
possible ; les cellules sont toujours capables d’exprimer in vitro métabolismes et
fonctions spécifiques. C’est une culture primaire qui peut être dispersée et souscultivée pour devenir une culture secondaire.
Cette technique permet :
- de suivre la croissance des cellules en microscopie
- l’étude de cellules humaines qui ne se multiplient pas
…
2. MISE EN ROUTE D’UNE CULTURE
2.1. Différents types de culture de cellules et schéma général
On peut partir d’un œuf, d’un embryon (les cellules sont stériles à l’origine et
croissent facilement) ou d’un animal adulte (les cellules sont à traiter point de vue
stérilité et présentent une phase de latence).
La culture primaire s’obtient en laissant les cellules migrer seules en dehors des
fragments de tissus adhérant (cellules primaires) placés sur un support propice.
On peut, en désagrégeant un tissu, produire une suspension de cellules :
- mécaniquement
- chimiquement : l’EDTA, par exemple, perturbe les associations cellulaires
réalisées par Ca++-Mg++),
- ou enzymatiquement : les enzymes digèrent la matrice extracellulaire faite de
collagène, élastine, protéoglycane, glycoprotéine…
- endoprotéases (trypsine c’est la trypsinisation, ) agissent sur les
liaisons peptidiques mais cytotoxicité et non utilisable en
thérapie cellulaire
- métalloprotéases agissent sur les glycoprotéines et l’élastine
(élastase)
- collagénases
On obtient une « soupe cellulaire » de laquelle il faut séparer les cellules recherchées
par des méthodes physiques reposant sur la taille de la cellule, la capacité
d’adhérence à un support, l’expression de certains marqueurs du soi…
C’est le premier processus d’une série qui finalement fournira, par sélection, une
culture secondaire relativement homogène.
Quand la densité cellulaire devient importante et que les cellules recouvrent la surface
(cas des cellules adhérentes), on parle de confluence. Il se produit alors une inhibition
de contact, un appauvrissement du milieu et une accumulation de déchets
métaboliques. Il est nécessaire de faire un passage (= repiquage).
Outre la densité cellulaire, les indices de cet état est un jaunissement du milieu
(indicateur pH) et la modification morphologique des cellules (arrondissement,
décollement).
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Après le premier passage ou split, la culture primaire devient une culture secondaire
qui peut être propagée et sous-cultivée plusieurs fois.
À chaque passage, la fraction de la population dotée du plus fort taux de prolifération
va prédominer graduellement et les cellules peu ou moins proliférantes vont être
éliminées par dilution.
Après quelques passages, la culture tend à se stabiliser ; les cellules sont vigoureuses
et possèdent un haut taux de prolifération.
Après plusieurs passages (15-50), les cellules meurent (il faut alors repartir du tissu
ou d’une culture primaire congelée dans l’azote liquide) ou donnent naissance à une
lignée cellulaire continue : au cours d’une « crise spontanée » ou suite à l’action
d’agents mutagènes chimiques ou physiques, elles attrapent les caractéristiques des
lignées tumorales (immortalité).
Elles continuent à se multiplier sans effet apparent de sénescence ou de mort
programmée.
Les mécanismes de contrôles ont été inhibés par une modification de l’ADN lié à des
mutations ou à l’intégration d’ADN étranger.
Elles sont plus simples en culture que les primaires et s’adaptent plus facilement à des
conditions artificielles de culture.
On utilise aussi des cellules tumorales
- qui sont prélevées à partir de tumeurs malignes (HeLa = métastases d’un cancer du
col de l’utérus)
- ou qui ont été rendues immortelles suite à la contamination par un virus oncogène
- ou qui ont été modifiées, donc produites par génie génétique.
Elles constituent donc un outils de choix pour de nombreuses applications :
production de vaccin, d’anticorps monoclonaux ou de diverses protéines…
Remarque
Les lignées qui finissent par arrêter de se diviser et montrent des signes de
vieillissement sont appelées « finies » ; par contre, celles qui deviennent immortelles
sont appelées lignées continues.
En culture primaire ou secondaire, les cellules peuvent être sélectionnées par
clonage ; une cellule individuelle donnera une descendance que l’on peut
caractériser ; c’est une lignée clonée.
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Il y a aussi les cellules souches.
Une cellule souche est une cellule qui a la capacité de :
- s’auto-renouveler indéfiniment à l’identique
- produire différents types de cellules spécialisées.
Ce sont des cellules indifférenciées qui expriment beaucoup de marqueurs de surface
et qui ont un caryotype normal.
Elles ont plusieurs origines :
- Cellules souches embryonnaires ES Embryonic Stem
- cellules souches embryonnaires totipotentes : elles sont capables de donner
naissance à un organisme entier ; la plus indifférenciée est le zygote
(œuf) jusqu’au 4ième jour (morula) ; les ES sont prélevées sur l’embryon
donc possibilité de clonage reproductif.
- cellules souches embryonnaires pluripotentes : elles sont capables de générer
la plupart des tissus du corps adulte + les cellules germinales mais pas
de donner naissance aux tissus extra-embryonnaires (placenta, cordon
ombilical) ; elles sont prélevées à partir du blastocyste (= bille creuse
avec, à un endroit, un renflement dans lequel se trouvent les
cellules souches ; c’est de cet amas que doit émerger l’embryon au sens
strict) jusqu’à l’embryon de 5-7 jours.
Il y a de grands espoirs sur ces cellules embryonnaires car elles ont la capacité
de générer toutes les cellules spécialisées du corps MAIS il y a encore de
nombreuses inconnues, des problèmes comme le rejet ou la dérive en cellules
tumorales et des problèmes d’éthique vu qu’elles sont prélevées sur un
embryon (destruction) et que l’on pourrait faire du clonage reproductif (par
scission embryonnaire).
Une législation particulière est donc nécessaire.
Avantages :
pluripotentes donc capables de produire un gd nombre de tissus
différents
potentiel de division important
aptitude à la survie particulièrement élevée
Inconvénients : nécessitent la destruction d’embryons DONC problèmes
d’éthique
peuvent, plus que les cellules adultes, donner lieu à un
développement tumoral
doivent être isolées de très petits ensembles cellulaires
= DIFFICILE
Des chercheurs ont cartographié l’ensemble de signaux biologiques et chimiques
nécessaires à la programmation des cellules souches embryonnaires.
Ils ont obtenu des populations pures de 12 lignées mésodermales humaines, y
compris l’os, le muscle du cœur et le cartilage.
Ils ont bloqué les différenciations non désirées et orienté vers les cellules
différenciées choisies.
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- Les cellules souches adultes (Stem Cells = SC)
Elles sont les descendantes des souches embryonnaires mais sont déjà engagées
dans un programme cellulaire spécifique.
Ce sont des cellules souches multipotentes.
Elles sont prélevées sur les fœtus, le cordon ombilical et le placenta (cellules
souches néonatales) , chez le bébé, l’enfant, l’adulte.
La plupart des tissus qui nous composent, comportent en effet des structures de
remplacement qui permettent de maintenir l’homéostasie.
Les cellules ont en effet pour la plupart une vie limitée et doivent être
renouvelées = rôle des SC
Avantages :
connaissent un développement plus limité et donc une risque
moindre de donner naissance à des tumeurs
peuvent faire l’objet d’une « récolte » relativement aisée dans
les tissus
si elles sont prélevées sur le malade à traiter lui-même, cela
supprime tout risque éventuel de rejet car le greffon a
la même origine immunitaire que le greffé
ne soulèvent pas de problème d’éthique associé à leur origine
Inconvénients : à de rares exceptions près, ne peuvent NATURELLEMENT se
différencier que dans les types cellulaires qui constituent
le tissu dont elles sont issues
MAIS de nouvelles techniques peuvent les « forcer » à
évoluer autrement CCR/CSPi/Cellules souches clonées.
n’ont souvent qu’une durée de vie limitée, en particulier
associée à l’âge de celui sur lequel elles ont été prélevées
- Les cellules conditionnellement reprogrammées (CCR)
Ce sont des cellules somatiques (différenciées) qui, soumises à un traitement
spécifique, développent des propriétés de cellules souches sans en présenter les
inconvénients (non tumorigènes).
Une fois les conditions de cultures rétablies, elles reprennent leur
développement normal MAIS ne donnent que des cellules appartenant
au tissu dont elles proviennent.
Ces caractéristiques en font des candidates privilégiées pour la médecine
régénérative : prélever des cellules chez le patient, les transformer en CCR
pour les multiplier avant de les réimplanter.
+ aussi de médecine personnalisée : après avoir prélever des cellules tumorales
chez un patient, on les transforme en CCR puis on les multiplie à volonté afin
de tester sur elles diverses thérapies afin de déterminer la mieux adaptée à un
malade.
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- Les cellules souches pluripotentes induites (CSPi ou iPS)
L’idée de reprogrammer une cellule somatique, déjà engagée dans un
processus de différenciation remonte aux années 50.
Cela n’avait été possible qu’en procédant à des tentatives de fusion avec des
cellules souches embryonnaires (CSE) ou à des expériences de transfert
nucléaire, couronnées de succès en 1997 avec le clonage de la brebis Dolly.
Aujourd’hui, un simple cocktail de 3 ou 4 gènes (on utilise 1 rétrovirus ou 1
plasmide) suffit aux chercheurs pour réveiller le potentiel de cellules
somatiques et créer des CSPi.
Ces CSPi maintiennent une mémoire transitoire de leur tissu d’origine,
mémoire qui s’efface graduellement avec le maintien en culture ou le
traitement par des agents modifiant la chromatine.
Ces CSPi = nouvel outil de choix pour établir des lignées cellulaires
correspondant aux différentes maladies génétiques.
Ces modèles cellulaires pourraient se révéler utiles pour l’étude d’une
maladie et pourraient être plus informatifs que les modèles animaux classiques
pour l’évaluation des thérapies testées.
La possibilité de reprogrammer une cellule somatique éclaire d’un jour
nouveau la question de la médecine personnalisée : utiliser des cellules issues
d’un patient permettrait en effet de surmonter les obstacles
d’histocompatibilité dans le cas de greffes et d’envisager dans d’autres cas, la
correction de défauts génétiques.
- Les cellules souches clonées
Technique du clonage =
- utiliser le noyau des cellules de la peau, qui dans ce cas contenait
l’ADN d’un nouveau-né de 8 mois,
- pour le transférer dans des ovules humains
- les ovules ont produit des embryons
- à partir desquels les cellules souches embryonnaires ont été extraites
Elles ont la capacité de se différencier comme des cellules souches
embryonnaires normales en différents types de cellules (nerveuses, hépatiques
et cardiaques).
De plus, comme ces cellules souches reprogrammées peuvent être obtenues à
partir de matériau génétique du noyau du malade, il n’y a aucun problème de
rejet des cellules implantées.
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2.2. Différentes techniques de culture
On distingue :
- des cellules adhérentes : elles ont besoin d’un support pour s’y fixer et bien
proliférer (ex : les cellules diploïdes humaines, les cellules rénales MDCK (MadinDarby canine kidney) les fibroblastes murins et d’embryons de poulet, les
macrophages et de nombreuses lignées cellulaires utilisées pour la production de
vaccins.). On peut aussi les fixer sur des microcarriers en suspension dans le milieu.
Le mécanisme d’adhérence cellulaire est complexe et comporte plusieurs étapes :
- tout d’abord, l’adsorption des facteurs d’adhésion (présent dans le milieu) sur
le support,
- l’interaction entre un récepteur cellulaire et un site spécifique du facteur
d’adhésion.
Après avoir adhéré, la cellule peut alors s’étaler afin de croître et se diviser.
- des cellules non adhérentes (ex : hybridomes, lignées tumorales…) , en suspension
et qui flottent librement dans le milieu ou peuvent être emprisonnées dans des
microcarriers en suspension dans le milieu.
Les splits (passages) s’effectuent de manières très différentes.
Passage pour les cellules libres
Passage pour les cellules adhérentes
Remarque importante :
- Une alternative à la constitution de cultures par culture primaire consiste à acheter des
cultures cellulaires constituées auprès d’organisations telles que l’American Type Culture
Collection (ATCC ; www.atcc.org) ou le Coriell Institute for Medical Research
(arginine.umdnj.edu). Ces 2 organisations proposent des lignées de qualité qui sont
soigneusement testées afin d’assurer l’authenticité des cellules.
- Plus fréquemment, les chercheurs obtiennent (empruntent) des lignées cellulaires auprès
d’autres laboratoires, mais, dans ce cas, il y a des risques importants d’introduction de
contaminations dans le laboratoire de culture cellulaire...
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3. PRINCIPAUX INSTRUMENTS/EQUIPEMENTS
- Hotte à flux laminaire (horizontal ou vertical pour jouer le rôle de barrière) ou hotte BioHazard (si organismes très dangereux) assure la stérilité des manipulations et la
préservation du manipulateur et de de l’environnement. Le travail doit être précis et
minutieux pour ne pas être vecteur de contamination.
Un filtre HEPA retient 99,97% des particules de diamètre supérieur ou égal à 0,3 microns.
- Incubateur conventionnel pour les cultures en récipients fermés) ou avec CO2 (pour le
contrôle du pH) et un bac d’eau (pour réduire l’évaporation des milieux qui modifierait
l’osmolarité) pour les cultures en systèmes ouverts (non scellés).
- Stérilisation : système de filtration sur membrane, autoclave, four.
- Réfrigération : frigo (4°C pour les milieux, le FCS,…), freezer (-25°C pour le FCS, la
glutamine, les antibiotiques,…), deepfreezer (-80°C pour le FCS, les enzymes,…), de
l’azote liquide (-196°C) pour les lignées cellulaires.
- Microscope (à contraste de phase) afin de suivre la morphologie, la densité des cellules
et l’absence de contamination.
- Appareil de purification d’eau (en pharmacie, il faudra de l’eau apyrogène).
- Centrifugeuse pour la trypsinisation.
- Vaisselle (lavage au détergent spécial et nombreux rinçages).
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- Local : y organiser une disposition rationnelle,
lutter contre la dispersion des particules
et le désinfecter par formolisation.
Classification des locaux en fonction du nombre de particules par pied cube :
- classe
100 : moins de 100 particules de 0,5µ /p3
1000 : 100 à 1000 particules de 0,5µ /p3
10000 :1000 à 10000 particules de 0,5µ /p3
Classification des locaux en fonction de leur activité :
- classe A : enseignement, recherche et développement,
- classe B : production de volumes supérieurs à 10l.
Classification des locaux en fonction du niveau de confinement :
- classe I=P1 : pour les micro-organismes non recombinants et non pathogènes ; elle
est régie par les « règles de bonne pratique », exemple : brasserie ;
- classe II=P2 : pour les micro-organismes recombinants, mais non pathogènes ;
- classe III=P3 : pour les micro-organismes recombinants, mais pathogènes ; cependant,
en cas de contamination, un traitement existe ;
- classe IV=P4 : idem III sauf qu’aucun traitement n’est possible en cas de
contamination.
Normes P4 de l’OMS :
- maintenir en dépression les sous-unités grâce à des cascades de dépression
- niveau d’étanchéité supérieur à celui d’un P3
- sas pour l’accès et la sortie, en décontaminations chimiques
- équipements de traitement de l’air, filtres redondants notamment
- utilisation de scaphandres maintenus en surpression
- l’ensemble des équipements et des matériaux sont soumis à différentes études de
dangerosité
- procédure très stricte et très formalisée de maintenance et de travail
- maintenance coûteuse car préventive : au-delà d’une certaine durée de vie, tout matériel
est remplacée en prévention d’une panne
- contrats d’entretien spécifiques et particulier
- formation et test obligatoires pour obtenir l’autorisation de travailler là
- contrôle d’accès très surveillé.
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4. LE CHOIX D’UN MILIEU
Ce choix n’est pas évident et est souvent empirique.
Le milieu doit permettre à la cellule de croître, de se multiplier et de conserver son
génotype et son phénotype.
La composition qualitative et les proportions des éléments varient en fonction des
exigences des différents types de cellules.
Les premiers milieux utilisés ont été des milieux biologiques (sérum, lymphe).
Actuellement, de nombreux milieux sont synthétiques. Ils contiennent des facteurs
parfaitement identifiés. Ils portent le nom de leur auteur.
Exemples : MEM (minimum essentiel médium), DMEM (Dulbico minimum essentiel
médium), EAGLE, PARKER, …
Les milieux nutritifs se rencontrent généralement sous 2 formes : l’une liquide pouvant
être concentrée jusqu’à 10 fois, l’autre en poudre. Avant utilisation, ils doivent être
stérilisés par ultrafiltration ou autoclavage.
À ces milieux, on ajoute souvent du sérum de veau fœtal (SVF = FCS) ou du sérum de
veau nouveau-né (SVNN = CS) dans des proportions allant de 2 à 10%. Le rôle du sérum
n’est pas totalement connu ; il est censé apporter des hormones, des facteurs de
croissance, des facteurs d’adhérence (collagène), des anti-trypsine,…
La préférence va au FCS car il ne contient pas beaucoup d’anticorps qui pourraient poser
problème ( purification, interférences,…)
Les problèmes liés à son utilisation sont nombreux : prix élevé, présence de facteurs de
différenciation qui entraînent une dérive de l’activité biologique, composition non
constante, approvisionnement non garanti, risque de contamination (virus,
mycoplasme,…) et conservation à –20°C.
On a donc essayé de trouver un substituant synthétique du sérum (composition stable et
donc conditions de croissance reproductibles, faible taux de protéines facilitant les
purifications ultérieures, pas de fluctuation d’approvisionnement, constance ou diminution
du prix de revient) ou on tente un essai d’adaptation des cellules.
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5. COMPOSITION GENERALE DES MILIEUX
5.1. Éléments non spécifiques qui sont requis pour toutes les cellules (ENS)
5.1.1. Solution saline : ions indispensables : Na+,K+,Mg++,Ca++,HCO3-,PO4--- et Cl- ;
ils jouent un rôle dans le maintien de la pression osmotique, le transport
membranaire, le métabolisme,…
5.1.2. Glucides : surtout le glucose (1 g/l) ; c’est la principale source énergétique.
5.1.3. Acides aminés : il y a 9 acides aminés essentiels : his, iso, leu, lys, met, phé,
thré, cys, thyr. On ajoute aussi très souvent de la glutamine (1% ou du glutamate)
qui sert pour la synthèse des bases puriques et pyrimidiques, des acides aminés et
des sucres aminés. C’est aussi une source d’énergie (oxydation) et un régulateur
de la réplication de l’ADN.
5.1.4. Vitamines : les besoins sont variables suivant le type cellulaire ; 8 vitamines
sont indispensables in vitro : choline, acide folique, riboflavine, thiamine,
pyridoxal, inositol, acide nicotinique, acide pantothénique.
Elles interviennent comme cofacteurs enzymatiques ou comme précurseurs ; une
carence s’exprime par des problèmes de survie et de croissance.
5.1.5. Hormones :
- insuline : utilisée à en concentration de 5 à 10 µg/ml, c’est une substance
essentielle à la croissance de presque toutes les cellules en culture, elle stimule
l’entrée du glucose et des acides aminés) ; elle est peu stable et intervient surtout
en début de culture (remplaçable par l’IGF).
- hormone de croissance, hormone thyroïdienne.
5.1.6. Protéines de liaison :
- albumine, utilisée à une concentration maximale d 5g/l (souvent 0,1 à 1g/l), elle
lie des vitamines, lipides, hormones, …Elle contribue aussi à une détoxification
et protège les cellules des effets mécaniques de l’agitation.
- transferrine, utilisée en concentration de 1 à 100 mg/l, elle lie le fer et d’autres
métaux (détoxification). Elle est souvent indispensable pour des cellules à
croissance rapide).
5.1.7. Facteurs d’ancrage : collagène, laminine, fibronectine, …Ils facilitent
l’attachement sur les supports (ou entre les cellules lors des cultures de tissus). Il
y a aussi la polylysine qui possède de nombreuses charges+ ; en entourant les
cellules, elle favorise leur attachement sur les charges- des supports
5.1.8. Lipides : pour la structure des membranes, le stockage d’énergie ou source
d’énergie.
5.1.9. Antioxydants : dans les cultures sans sérum, ils inactivent les peroxydes
générés pendant la croissance (β mercaptoéthanol, Se…)
5.1.10. L’eau est déminéralisée et bidistillée ou déminéralisée et ultrafiltrée.
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5.2. Éléments requis pour la spécificité des cellules : surtout des facteurs de
croissance
- PDGF (platelet derived growth factor) : c’est une protéine libérée par les plaquettes
au cours de la coagulation ; c’est une substance mitogène pour les cellules
d’origine mésenchymateuse.
- EGF (epidermal growth factor).
- IGF (insulin growth factor) présente des effets similaires à l’insuline, mais de
manière quantitativement différente : l’activité métabolique des IGF est 60 fois
plus faible que l’insuline, mais l’activité mitogène est 60 fois plus forte.
- FGF (fibroblaste growth factor).
5.3. Sérum (5 à 10%) : facteurs de croissance (EGF, FGF, PDGF, …), facteurs de
différenciation (fibronectine), BSA, acides aminés, …
5.4. Antibiotiques (1%) : pénicilline, streptomycine, …
Mycostatiques : nystatine…
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6. PROPRIETES PHYSIQUES
6.1. pH : la majorité des cellules croissent à un pH variant autour de 7,5 (7,2-7,6) ; le
milieu est très souvent tamponné. On utilise souvent un tampon physiologique
H2CO3/HCO3-. L’équilibre est maintenu grâce à une atmosphère contenant 5 à 10%
de CO2 selon le type de cellules:
CO2 + H2O
H2CO3 + H2O
H2CO3
HCO3- + H3O+
De plus, le métabolisme cellulaire est visualisé grâce à l’utilisation d’un indicateur
pH coloré, souvent le rouge phénol.
A pH normal (7,4), la coloration est rose (fuchsia).
Elle devient rouge en cas d’alcalinisation (problème fongique) et jaune en cas
d’acidification : soit il y a trop de cellules et donc dégagement de CO2 : cela signifie
alors qu’il faut renouveler le milieu OU il y a contamination (jeter ou traiter) OU
mort cellulaire (jeter).
6.2. Viscosité : elle est influencée par la concentration en sérum. Dans la plupart des cas,
elle aura peu d’influence sur la croissance cellulaire.
7. STERILISATION
7.1. Milieux
- autoclavage : chaleur humide, 20 minutes à 120°C.
- irradiation : rayons gamma.
- filtration : filtres ou cassettes 0.22µ pour les molécules fragiles.
- achat de milieux prêts et stériles.
7.2. Tissus, cellules
- La plupart des tissus sont déjà stériles sauf ceux qui sont en contact avec l’extérieur
comme la peau, les voies respiratoires ; il suffira donc d’éviter les contaminations
extérieures lors du prélèvement.
- Quand le risque existe, on peut pratiquer une stérilisation en lavant dans des
solutions concentrées d’antibiotiques avant de cultiver dans un milieu ayant des
concentrations normales de ces produits.
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8. SUPPORTS/CONTENANTS D’UNE CULTURE (ADHESIFS ET NON ADHESIFS)
Ce sont des supports réalisés en verre ou en plastique (polymère, PVC, polystyrène, …
stérilisés par une bombe au Co et disposables) : boîtes à puits, T flask, roller, spinner,
réacteur, …
- Pour les cultures en mono-couche (adhérentes), on utilise surtout les flacons multi-puits,
les boites de Pétri, T flask, cellfactories... Il est parfois nécessaire d’effectuer un prétraitement chimique ou de recouvrir les boites d’une matrice de collagène afin d’améliorer
l’adhérence.
- Pour les cultures en suspension, on utilise les T flask, roller (vitesse de rotation : 0,1-1
rpm à 4 rpm), Spinner, Erlen agités, bioréacteurs.
Récemment, on a développé les billes micro-porteuses (microcarrier). Ce système
augmente la surface de contact et permet de séparer facilement les cellules du milieu
(Sephadex).
- La présence de bouchons à filtre assure les échanges gazeux dans le cadre d’un système
de culture semi-clos.
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9. CONDITIONS EXTERIEURES
9.1. Phase gazeuse
- Les besoins en oxygène d’une culture varient : 25 % pour des cultures cellulaires,
95 % pour des cultures d’organes. La différence provient probablement d’une
différence dans la diffusion de l’oxygène à travers la géométrie des cellules.
- Le gaz carbonique joue un rôle assez complexe, il intervient dans le maintien du pH.
La nécessité d’addition de gaz carbonique dépend de la concentration cellulaire
(5 – 15 %).
- L’air doit être humide (84-85%) ce qui évite l’évaporation des milieux si semi-clos.
- Certains types cellulaires nécessitent également une atmosphère enrichie N2.
9.2. Température
La température optimale pour incuber les cellules dépend de la température corporelle
de l’animal dont elles proviennent.
Une hyperthermie prolongée (+ 2 °C) se révèle très dommageable après quelques
heures.
Par contre, une chute de température est mieux tolérée (4°C, -196°C).
10. UNE CULTURE EN PRATIQUE
1.Prélever aseptiquement un organe.
2. Le dissocier avec un instrument coupant le plus finement possible.
3. Mettre ensuite dans du tampon PBS (phosphate buffered saline) afin d’éliminer les
débris cellulaires et les exsudats.
4. Incuber les morceaux dans une solution contenant de la trypsine (maximum 15 minutes)
puis ajouter du sérum afin d’arrêter l’action de l’enzyme.
5. Centrifuger ; resuspendre le culot dans du milieu, dénombrer et évaluer la viabilité des
cellules par microscopie.
6. Distribuer dans les récipients adéquats avec du milieu adéquat.
7. À confluence, réaliser un split.
8. Conserver une partie des cellules dans l’azote liquide.
Remarque : on réalise souvent un clonage par dilution limite.
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11. COURBE DE CROISSANCE CELLULAIRE
Remarques importantes :
- Des déchets apparaissent dans le milieu, par exemple l’ammoniaque et le lactate ayant
un effet inhibiteur sur la croissance cellulaire et/ou la production de substances
biologique.
- L’apoptose ou mort cellulaire physiologique est essentiellement due à l’activation d’une
famille de protéases spécifiques, les capsases (cystéine aspartate protéase). C’est un
phénomène naturel qui permet par exemple le renouvellement tissulaire, l’élimination des
cellules anormales, virosées. Lorsque sa régulation est perturbée, on observe des
problèmes comme les maladies neuro-dégénératives, maladies auto-immunes, émergence
de cancers…
12. CONTAMINATIONS
12.1.
Contamination bactérienne : le milieu devient trouble ; pour éviter ce genre
de problème, on ajoute des antibiotiques.
12.2.
Contamination par mycose : c’est un problème gênant, car les spores
persistent longtemps dans l’incubateur.
12.3.
Contamination par mycoplasmes : ils sont introduits par l’homme (salive)
ou des produits biologiques contaminés (sérum).
Cette contamination est difficile à diagnostiquer.
Précautions : filtration sur 0,1µ (car flexibles), désinfection (alcool,
javel), appareil à pipetter, …
Sinon, traitement par antibiotique spécifique.
12.4.
Contamination virale (BVD par exemple).
12.5.
Contamination chimique : c’est la plus difficile à détecter, car elle est due à
des agents tels que les endotoxines, plastifiants, ions métalliques ou
traces de désinfectants chimiques qui sont invisibles.
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13. AVANTAGES - INCONVENIENTS DES CULTURES DE CELLULES
13.1.
Avantages
Contrôle physico-chimique de l’environnement facile : température, pH, oxygène, …
Homogénéité biologique : les lignées cellulaires sont homogènes ; on peut les acheter
à l’American Type Culture Collection.
Économie : lors d’une production chez un animal, 90 % du produit est éliminé (reins,
réaction de l’animal, …).
13.2.
Inconvénients
Coût : matériel, milieu.
Travail.
Instabilité génétique après un certain temps.
14. CARACTERISATION-SUIVI DES CULTURES CELLULAIRES
Les caractéristiques des cellules cultivées sont le résultat de leur origine (foie, cœur, ...) et
de leur faculté d’adaptation aux conditions de culture.
- Des marqueurs morphologiques ou ultra-structuraux peuvent être examinés. Ces
caractéristiques sont fréquemment perdues ou modifiées en conséquence du placement des
cellules dans un environnement artificiel.
- En pratique, pour évaluer l’état de santé général, on suit l’évolution de la vitesse de
croissance.
- Des marqueurs biochimiques peuvent être utilisés pour déterminer si les cellules sont
toujours bien porteuses des fonctions spécialisées qui sont les leurs in vivo (par exemple,
des cellules hépatiques secrétant de l’albumine).
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15. CRYOCONSERVATION
15.1.
Introduction
La culture de cellules génétiquement instables, à durée de vie limitée, rares,
l’isolement d’une souche cellulaire avec des caractéristiques déterminées sont autant
de situations qui nécessitent une conservation stable du matériel cellulaire.
La constitution de collections (ou banques) de cellules assure une réserve destinée à
protéger les cellules contre les modifications de leur patrimoine génétique, le
vieillissement in vitro, les risques de contamination (microbienne, fongique, virale)
ou encore des problèmes techniques de culture.
La conservation des cellules doit éviter toute modification de leur matériel génétique ;
elle doit donc permettre la récupération de cellules avec une expression génétique
identique à celle de la population initiale. Les caractéristiques morphologiques et
fonctionnelles des cellules récupérées doivent également être similaires à celle des
échantillons avant l’étape de congélation. La conservation des cellules dans les
conditions chimiques requises pour annuler toutes modifications cellulaires
préjudiciables est la seule façon de garantir le meilleur niveau de stabilité du matériel
cellulaire.
Cette conservation à long terme s’effectue à -196°C, dans l’azote liquide.
En effet, à cette température, le métabolisme est bloqué.
15.2.
Rappels
L’eau est l’élément essentiel de toute cellule vivante. Les phénomènes de congélation
sont donc liés aux propriétés de l’eau à basse température.
L’eau contient des sels minéraux, des matières organiques qui peuvent modifier les
phénomènes de congélation et de cristallisation.
Lorsque la température atteint 0°C, l’eau pure se solidifie et on note alors une
augmentation de volume de 8 %.
Pour une solution saline, comme du NaCl 9 pour 1000, les premiers cristaux
apparaissent vers –0,5 °C. La concentration en sel dans la solution résiduelle va
augmenter jusqu’au moment où toute la solution saline va cristalliser.
Ceci permet d’expliquer le choc osmotique que peuvent subir les cellules lors de la
congélation.
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CC 25
15.3.
Congélation des cellules
La température minimale de congélation est de -70°C car c’est la température
nécessaire pour un ralentissement de l’horloge biologique et l’inactivité des
ribonucléases et la température nécessaire pour arrêter complètement l’horloge
biologique est de -190°C (donc, azote liquide à -196°C).
La vitesse de refroidissement est quant à elle, l’un des facteurs essentiels ayant des
répercussions sur la survie des cellules après décongélation, sont choix est souvent
empirique.
Chaque type cellulaire possède une vitesse de refroidissement caractéristique
optimale, influencée cependant par la présence d’agents cryoprotecteurs.
Les termes « lent » et « rapide » pour un type cellulaire donné sont définis par rapport
à cette vitesse optimale.
La diminution de survie à des vitesses supérieures à la vitesse optimale est due à la
présence probable de glace intracellulaire. Si la formation de glace intracellulaire
pendant le refroidissement n’est pas nécessairement nuisible, les conséquences de
leur présence pendant l’étape de réchauffement sont généralement létales.
En fait, jusqu’à -5°C, la cellule et le milieu ne sont pas gelés, en raison de la présence
du cryoprotectant et de l’effet de surfusion. Entre -5°C et -15°C, il y a formation de
glace dans le milieu extracellulaire, alors que la cellule et son contenu sont toujours
en situation de surfusion ; il en résulte une exosmose de l’eau qui va diluer le milieu
extracellulaire devenu hypertonique, la formation de glace retirant l’eau libre de la
solution. Le mouvement se poursuit ainsi, entraînant la déshydratation cellulaire.
En effet, les parois des cellules sont perméables aux petites molécules et très peu pour
les grosses molécules.
La suite va dépendre de la rapidité du refroidissement.
Dans un système constitué de cellules en environnement aqueux, les vitesses lentes
de refroidissement conduisent à la congélation du compartiment extracellulaire alors
que les cellules restent au-dessus du point de congélation.
Une première conséquence de la congélation extracellulaire est l’exclusion des corps
dissous de la structure des cristaux de glace et leur accumulation dans une fraction
liquide résiduelle. Cette fraction accumule rapidement de grandes quantités de solutés
et devient donc hypertonique par rapport au milieu cellulaire au fur et à mesure du
refroidissement, imposant un stress osmotique croissant aux cellules non congelées.
Les cellules réagissent en perdant de l’eau et en réduisant leurs volumes.
Elles peuvent subir des dommages mécaniques, car leur membrane devient réduite.
La glace extracellulaire va coexister avec la fraction non congelée jusqu’à la
température eutectique, point de cristallisation des solutés.
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Lors d’un refroidissement rapide (moyen), les cellules sont incapables de perdre de
l’eau suffisamment vite pour maintenir l’équilibre osmotique ; elles ont tendance à se
contracter et contiennent quelques gros cristaux de glace, dommageables pour les
cellules.
Lors d’un refroidissement très rapide (rapide), les cellules contiennent un grand
nombre de petits cristaux de glace, non dommageables.
Donc lors d’un refroidissement lent et puis très rapide, on a formation de quelques
cristaux intracellulaires, compatibles avec la survie de la cellule.
Les cellules conservent donc un équilibre osmotique par une élimination d’eau.
Exemple : de +20 à -7°C, la température est réduite de 4°C par minute. Pourquoi -7°C
et pas 0°C ? Tout simplement parce qu’il n’y a pratiquement plus d’eau et qu’une
suspension comme celle qui règne dans les cellules risque peu de se figer avant -7°C.
Pendant quelques secondes, on laisse la température se stabiliser puis on procède au
« seeding ». Une pente décroissante est alors entamée permettant à raison de 0,3°C
par minute d’accéder à -30°C. À partir de ce moment-là, le processus de
refroidissement peut être accéléré et autorise de refroidir les cellules à raison de 30 à
40°C par minute jusqu’à atteindre -196°C.
Les agents cryoprotecteurs
15.4.
Ce sont des substances qui améliorent la survie cellulaire.
Elles sont caractérisées par une solubilité élevée dans l’eau et une faible toxicité pour
la cellule.
15.4.1. Rôle
Les agents cryoprotecteurs n’atténuent pas les effets de la congélation
intracellulaire ; au contraire, ils diminuent la vitesse de refroidissement à laquelle
la nucléation intracellulaire se produit en premier. Ces agents sont donc
seulement efficaces dans la protection des cellules contre les dommages liés au
refroidissement lent.
Lorsque la concentration initiale du cryoprotecteur est augmentée, la vitesse de
refroidissement optimale est abaissée et la survie des cellules augmente.
La température de conservation optimale dépend donc de la concentration en
agent cryoprotecteur.
15.4.2. Exemples
Les classes d’agents cryoprotecteurs sont en général divisées en fonction de leur
diffusion ou non à l’intérieur des cellules.
La majorité des agents cryoprotecteurs efficaces sont des molécules relativement
petites capables d’être incorporées dans les cellules (agents pénétrants). Les
agents utilisés pour le stockage par congélation de cellules comprennent : le
diméthyl sulfoxyde (CH3)2SO (DMSO), le glycérol, le saccharose, le méthanol,
la proline, le fructose, le galactose et le lactose.
Ils forment des ponts H avec l’eau (eau liée) et diminuent le point de congélation.
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Il existe aussi un autre groupe d’agents cryoprotecteurs, principalement de hauts
polymères, comme l’hydroxyéthyl amidon, le dextran et le polyvinyl-pyrrolidone
qui, en raison de leur taille, ne peuvent pénétrer rapidement dans les cellules
(agents non pénétrants). Ils préservent surtout la viabilité plutôt que la
morphologie cellulaire. Ils agissent par effet osmotique sur les échanges de
solutés à travers les membranes plasmiques pour obliger l’eau à sortir des
cellules.
Leur utilisation reste limitée, car leur viscosité augmente avec l’abaissement de
la température, mais ils permettent cependant de réduire la quantité d’eau
éliminée par les cellules.
15.5.
Décongélation
Si la congélation doit être progressive, l’étape de décongélation doit, en revanche être
rapide pour obtenir un rendement optimal en évitant l’agrégation des microcristaux
(ronds) en cristaux plus grands et plus coupants, car de forme hexagonale
(recristallisation).
Exemple pratique :
Le principe consiste à placer l’ampoule dans un bain d’eau à 37°C pendant environ
une minute en fonction du volume, jusqu’à décongélation complète de la suspension
cellulaire.
Sous hotte à flux laminaire et après nettoyage à l’éthanol 70°, le cryotube est ouvert,
la suspension cellulaire est transférée dans un tube contenant le milieu de culture
approprié, puis dispersée.
Après une centrifugation destinée à éliminer toutes traces d’agent cryoprotecteurs, le
culot est remis en suspension dans le milieu complet et les cellules sont placées dans
un flacon de culture T25 à 37°C en présence d’un mélange air-gaz carbonique.
À ce stade, il est important de suivre l’évolution de la culture, en particulier son
adhérence au support, et de remplacer le milieu de culture au plus tard 24H après.
Lors de la mise en culture, un test de viabilité (coloration au bleu Trypan) permet de
connaître le rendement de la congélation.
Un milieu contenant une concentration plus élevée de sérum lors de la mise en culture
améliore parfois le rendement.
15.6.
Conservation de courte durée
Des conditions suboptimales de cultures permettent de conserver des cellules pendant
un temps relativement court (de 10 à 20 jours).
Le processus de « vie ralentie » de la culture peut être réalisé en modulant plusieurs
paramètres : la concentration de sérum dans le milieu, l’apport nutritif, la température
de culture (20°C).
Bien que le métabolisme cellulaire soit ralenti, il est nécessaire de changer le milieu
au moins une fois par semaine.
Ce type de conservation nécessite une validation pour des types cellulaires fragiles.
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15.7.
La vitrification
Cette technique est considérée comme l’avenir de la conservation de matériel
biologique. Elle permet le refroidissement ultrarapide de cellules et de tissus en
évitant, autant que possible, la formation de cristaux de glace intra et/ou
extracellulaires.
Cette méthode consiste en la solidification ultrarapide d’une solution à basse
température dont la viscosité s’élève alors de façon extrême au cours du
refroidissement. Lors du passage de la température ambiante à -196°C, celle de
l’azote liquide, l’eau libre et les solutés dissous forment une phase vitreuse, dite aussi
amorphe. On évite ainsi les effets délétères des cristaux de glace et les chocs
osmolaires grâce à 2 paramètres. D’une part, une concentration élevée en agents
cryoprotecteurs, qui permet à la solution de rester en surfusion jusqu’à de très basses
températures, de maintenir sa viscosité élevée et rend impossible le réarrangement des
molécules pour former des cristaux.
D’autre part, une vitesse de refroidissement très rapide obtenue par le volume
contenant l’échantillon à congeler, quelques microlitres, et le type de support utilisé.
Ce dernier paramètre est crucial et on distingue 2 types de support.
Dans le support OPS (open pulled straw), la paillette contenant l’échantillon a un
diamètre extrêmement fin qui nécessite un volume minimum de milieu à vitrifier, de
l’ordre de 0,1 microlitre, et est directement plongée dans l’azote liquide pendant 1
minute. Ce contact direct de l’échantillon et de l’azote permet une vitesse de
refroidissement de -20 000°C/min, empêchant toute cristallisation. Dans l’autre type
de support, dit « straw in straw », littéralement « paillette dans paillette », l’OPS
contenant l’ovocyte par exemple, est mise dans une autre paillette de contenance de
0,5 millilitre, fermée hermétiquement avant d’être plongée dans l’azote liquide. Un tel
système a l’avantage d’éviter tout contact entre les cellules et l’azote liquide, les
protégeant donc d’une éventuelle contamination par des pathogènes. La vitesse de
refroidissement est alors plus lente -2000°C/min, mais la technique est totalement
aseptique.
Techniquement plus difficile et contraignante à réaliser qu’une congélation standard
(les fortes concentrations en agents cryoprotecteurs obligent à des temps de
préparation et contact très courts, pour éviter leurs effets mutagènes, qui rendent
difficiles une automatisation du procédé).
La phase de réchauffement est aussi très délicate (sans problème si le volume est
inférieur à 1 ml). Pour les volume plus grands, des essais utilisent des nanoparticules
d’oxyde de fer autour et dans les tissus auxquelles on applique un champ magnétique
susceptible de les exciter et de générer de la chaleur ; cette technique a donné de très
bons résultats sur des artères de porcs (volume 50ml ; difficulté = diffusion des
nanoparticules dans tout l’organe, les tissus).
Les essais sur les tissus humains devraient suivre et permettraient de conserver des
organes en vue d’une transplantation par exemple.
La vitrification est aussi plus coûteuse et n’est pas encore optimale pour toutes les
cellules.
15.8.
Applications
Congélation d’ovocytes, de spermatozoïdes, d’embryons, de cellules, de tissus,
d’organes, …
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CC 29
16. QUELQUES DOMAINES D’APPLICATIONS DE LA CULTURE CELLULAIRE
Quelques références en Belgique : Straticell, Celyad, TiGenix, MaSThercell, BiopTis,
Oxurion, Promethera Therpeutics, Novadip, Bone Therapeutics, Univercells, NCardia…
16.1.
Ingénierie tissulaire
Cela consiste en la mise au point d’un produit qui contient des cellules ou tissus
d’origine humaine ou animale ou les 2 avec des substances supplémentaires telles que
des biomolécules, des biomatériaux, des substances chimiques ou des matrices dans
le but de régénérer partiellement ou complètement des parties déficientes du corps.
- Peau : pour la culture de peau pour les grands brûlés, on part d’une biopsie de peau
du patient puis on fait se multiplier les cellules afin d’obtenir une bande
épidermique qui sera greffée (sans pilosité, ni glandes sudoripares) ; il y a la
possibilité d’ensemencer cette culture de tissu avec d’autres cellules ou avec
des mélanocytes pour une peau pigmentée.
Temps d’obtention de 1 m2 à partir d’un morceau de quelques cm =3 semaines.
Idem pour le traitement des ulcères aux jambes chez les diabétiques (produit
Apligraf d’Organogenesis)
- Futur et déjà présent : implantation d’appareils (scaffolds) pour la régénération du
tissu in vivo. Les scaffolds sont composés d’un matériau biologique ou d’un
polymère non toxique pour l’organisme. Ils peuvent ou non contenir les
cellules au moment de leur implantation ; les cellules proviennent souvent du
patient et peuvent être des cellules souches ou d’autres types en fonction du
tissu à réparer.
- Remplacement de la mandibule excisée pour tumeur : modèle en titane et
matrice de cellules osseuses
- Imprimante 3D à partir de cellules de peau ou de cellules souches sur des
matrices biocompatibles ou avec des biomatériaux (vessie artificielle
2009)
16.2.
Cellules souches
- Système nerveux central : les essais sont anciens mais la demande est de plus en
plus forte vu les pathologies liées au vieillissement
- Maladie de Parkinson (GSK) = perte progressive des neurones spécialisés
dans la production d’un neuromédiateur, la dopamine : démarche
hésitante, des mouvements répétitifs et de faible amplitude de la tête
et des membres surtout.
Thérapie : analogue de dopamine mais effet diminuant donc
augmentation des doses avec des effets indésirables
Idée : implanter des cellules (neurales ou autres) qui produiraient cette
dopamine ; essais pas concluants
- Alzheimer (GSK) , …
- Sclérose latérale amyotrophique (Hôpital Bordet) = destruction de la gaine de
myéline
Idée : introduire des cellules qui produiraient cette myéline
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CC 30
- Cœur : injection de cellules qui pourraient « réparer » la zone lésée en cas d’infarctus
CELYAD (ex Cardio 3)
- Sang : injection de cellules souches issues du compartiment interne des os plats (ou
cordon) et qui sont capables de régénérer le sang (si leucémie, aplasie de la
moelle osseuse ou déficiences immunitaires congénitales)
-Intestin : injection de cellules souches pour réparer des lésions suite à la maladie de
Krohn ou fistules
- Pancréas : en cas de diabète, introduction de cellules susceptibles de produire de
l’insuline (essai partiellement encourageants)
- Foie : Promethera Therpeutics travaille sur la lutte contre l’insuffisance
aiguë chronique compliquant une maladie chronique du foie (introduction
d’hépatocytes pour patienter en attendant une greffe ou pour régénérer son
propre foie)
- Régénération osseuse : Bone Therapeutics, …
- Cancer : c’est un traitement ciblé, individualisé qui ne remplace pas les autres
traitements et qui peut venir en complément. Ce n’est le remède miracle car il
n’est efficace que contre certains cancers : mélanomes, glioblastome, cancers
colorectaux, neurologiques (cerveau), tumeurs solides.
Le principe consiste à extraire des cellules dans le sang, les ganglions
lymphatiques ou la tumeur du patient pour les remanier en laboratoire et les
réinjecter au patient afin de stimuler son immunité contre les cellules
cancéreuses uniquement.
On épargne ainsi les tissus sains.
16.3.
Thérapie cellulaire
Elle consiste à greffer un gène sain sur un organisme porteur d’un gène défectueux
dans l’espoir de corriger ou de combattre la maladie ; elle repose sur la possibilité
d’introduire dans le noyau d’une cellule vivante une portion d’ADN qui contrôle la
fabrication d’une protéine manquante ou défectueuse.
VOIR BIOLOGIE MOLECULAIRE
Pour cela, on prélève des cellules somatique malades chez le patient, on les met par
exemple en contact avec un rétrovirus modifié puis on les réintroduit dans
l’organisme.
Il y a eu de nombreux essais infructueux (1963, 1980) ou partiellement réussis
(1990).
-
Déficits immunitaires (BB bulle) : premier essai en 1993 puis 10 essais en 19992000 mais 2 leucémies donc modifications de protocole et reprise de l’essai en
2004.
Au final, en 2010, on comptait 17 enfants sur 20 qui ont de nouveau un système
immunitaire normal.
-
Autres maladies ciblées : mucoviscidose, myopathie, hémophilie …
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16.4.
Divers
- Production de viande cellulaire (Aleph Farm à Tel-Aviv) à partir de cellules souches
car : population mondiale en croissance, souffrance animale, impact
environnemental de l’agriculture, contrôle de la chaîne de production,
gain de temps….
MAIS - études ne sont pas toutes d’accord et intérêt des
consommateurs ???
- consommation énergétique (38,5°C dans les incubateurs,
matières premières pour la préparation des milieux de
culture,...
- utilisation de disposables en très grandes quantités
( plastiques à usage unique pour garantir la stérilité)
- qu’adviendra-t-il des agriculteurs bovins ?
- …..
- Production de foie gras in vitro : culture de cellules hépatiques de canards
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