Culture des cellules animales

Biotechnologies
Lallemand F. CC 1
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CULTURE!DE!CELLULES!
ANIMALES!
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INTRODUCTION
Les cultures cellulaires existent depuis longtemps (1907, première culture de tissus réussie par
Ron Harrison), mais elles sont beaucoup plus connues depuis les années 40, mais surtout 50-
60 grâce à la découverte de la trypsine (enzyme protéolytique qui a permis d’isoler des
cellules), des antibiotiques (qui ont permis d’éviter plus facilement de nombreux problèmes
de contamination) et au développement de milieux de culture standardisés chimiquement.
La culture cellulaire est utilisée en recherche fondamentale (virologie, étude des interactions
cellules-cellules, étude des activités intracellulaires, mécanismes du cancer…), pour les
conseils génétiques (diagnostic pré-post natal), la thérapie génique, la fabrication d’OGM...
Elle est aussi utilisée pour les tests de toxicité (médicaments, cosmétiques, produits chimiques
divers). Dans le domaine industriel, la cellule peut être utilisée comme usine de production
(vaccins, interféron…). Pourquoi utiliser des cellules humaines à la place des bactéries pour
produire des protéines ? En fait, certaines protéines ne sont pas totalement correctes
lorsqu’elles sont produites par des procaryotes ou des eucaryotes inférieurs (finition non
complète, structure 3 D…).
La culture de cellules animales se distingue des cultures microbiennes par différents aspects :
- les concentrations cellulaires sont plus faibles (1 million /ml contre 10 milliards)
- tout est plus lent : il faut 15 à 40 h pour doubler la population contre 1 h ou 2 pour les
bactéries
- les cellules animales sont plus fragiles que les cellules microbiennes (température,
oxygénation, forces hydrodynamiques ou « cisaillement »…) et leurs exigences
nutritionnelles plus strictes.
1. TYPES DE CULTURES CELLULAIRES
Il existe 3 types de cultures et donc 3 méthodes de travail.
1.1. La culture d’organe ou culture organotypique
Elle correspond au maintien hors de l’organisme d’organes entiers ou de fragments
intacts ayant conservé une bonne partie de leurs structures et de leurs fonctions.
Elle implique que l’architecture caractéristique du tissu « in vivo » (3D) soit
préservée (donc pas de dissociation). C’est donc un modèle similaire à l’in vivo.
Le prélèvement sera maintenu à l’interface liquide-gaz, ce qui favorise le maintien
d’une structure tridimensionnelle.
Ce sont des cultures qui croissent très lentement et qui sont menées uniquement dans
le but d’études vu la survie limitée de l’explant.
Le mélange de cellules limite aussi la vision de chaque entité.
1.2. La culture de tissus ou culture histiotypique
Elle correspond au maintien du tissu hors de l’organisme d’une manière permettant la
conservation de fonctions spécifiques.
Des fragments de tissus issus d’un explant primaire sont déposés à l’interface
support-liquide où après adhésion et ancrage, la migration des cellules peut survenir
dans le plan du substrat solide.

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1.3. La culture de cellules
Les cellules échappées (mécaniquement, chimiquement, enzymatiquement) sont
dispersées en une suspension cellulaire qui peut être cultivée en monocouche.
Dans de telles cultures, la prolifération est favorisée et la propagation devient
possible ; les cellules sont toujours capables d’exprimer in vitro métabolismes et
fonctions spécifiques. C’est une culture primaire qui peut être dispersée et sous-
cultivée pour devenir une culture secondaire.
Cette technique permet :
- de suivre la croissance des cellules en microscopie
- l’étude de cellules humaines qui ne se multiplient pas
…
2. MISE EN ROUTE D’UNE CULTURE
2.1. Différents types de culture de cellules et schéma général
On peut partir d’un œuf, d’un embryon (les cellules sont stériles à l’origine et
croissent facilement) ou d’un animal adulte (les cellules sont à traiter point de vue
stérilité et présentent une phase de latence).
La culture primaire s’obtient en laissant les cellules migrer seules en dehors des
fragments de tissus adhérant (cellules primaires) placés sur un support propice.
On peut, en désagrégeant un tissu, produire une suspension de cellules :
- mécaniquement
- chimiquement : l’EDTA, par exemple, perturbe les associations cellulaires
réalisées par Ca++-Mg++),
- ou enzymatiquement : les enzymes digèrent la matrice extracellulaire faite de
collagène, élastine, protéoglycane, glycoprotéine…
- endoprotéases (trypsine c’est la trypsinisation, ) agissent sur les
liaisons peptidiques mais cytotoxicité et non utilisable en
thérapie cellulaire
- métalloprotéases agissent sur les glycoprotéines et l’élastine
(élastase)
- collagénases
On obtient une « soupe cellulaire » de laquelle il faut séparer les cellules recherchées
par des méthodes physiques reposant sur la taille de la cellule, la capacité
d’adhérence à un support, l’expression de certains marqueurs du soi…
C’est le premier processus d’une série qui finalement fournira, par sélection, une
culture secondaire relativement homogène.
Quand la densité cellulaire devient importante et que les cellules recouvrent la surface
(cas des cellules adhérentes), on parle de confluence. Il se produit alors une inhibition
de contact, un appauvrissement du milieu et une accumulation de déchets
métaboliques. Il est nécessaire de faire un passage (= repiquage).
Outre la densité cellulaire, les indices de cet état est un jaunissement du milieu
(indicateur pH) et la modification morphologique des cellules (arrondissement,
décollement).

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Après le premier passage ou split, la culture primaire devient une culture secondaire
qui peut être propagée et sous-cultivée plusieurs fois.
À chaque passage, la fraction de la population dotée du plus fort taux de prolifération
va prédominer graduellement et les cellules peu ou moins proliférantes vont être
éliminées par dilution.
Après quelques passages, la culture tend à se stabiliser ; les cellules sont vigoureuses
et possèdent un haut taux de prolifération.
Après plusieurs passages (15-50), les cellules meurent (il faut alors repartir du tissu
ou d’une culture primaire congelée dans l’azote liquide) ou donnent naissance à une
lignée cellulaire continue : au cours d’une « crise spontanée » ou suite à l’action
d’agents mutagènes chimiques ou physiques, elles attrapent les caractéristiques des
lignées tumorales (immortalité).
Elles continuent à se multiplier sans effet apparent de sénescence ou de mort
programmée.
Les mécanismes de contrôles ont été inhibés par une modification de l’ADN lié à des
mutations ou à l’intégration d’ADN étranger.
Elles sont plus simples en culture que les primaires et s’adaptent plus facilement à des
conditions artificielles de culture.
On utilise aussi des cellules tumorales
- qui sont prélevées à partir de tumeurs malignes (HeLa = métastases d’un cancer du
col de l’utérus)
- ou qui ont été rendues immortelles suite à la contamination par un virus oncogène
- ou qui ont été modifiées, donc produites par génie génétique.
Elles constituent donc un outils de choix pour de nombreuses applications :
production de vaccin, d’anticorps monoclonaux ou de diverses protéines…
Remarque
Les lignées qui finissent par arrêter de se diviser et montrent des signes de
vieillissement sont appelées « finies » ; par contre, celles qui deviennent immortelles
sont appelées lignées continues.
En culture primaire ou secondaire, les cellules peuvent être sélectionnées par
clonage ; une cellule individuelle donnera une descendance que l’on peut
caractériser ; c’est une lignée clonée.

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Il y a aussi les cellules souches.
Une cellule souche est une cellule qui a la capacité de :
- s’auto-renouveler indéfiniment à l’identique
- produire différents types de cellules spécialisées.
Ce sont des cellules indifférenciées qui expriment beaucoup de marqueurs de surface
et qui ont un caryotype normal.
Elles ont plusieurs origines :
- Cellules souches embryonnaires ES Embryonic Stem
- cellules souches embryonnaires totipotentes : elles sont capables de donner
naissance à un organisme entier ; la plus indifférenciée est le zygote
(œuf) jusqu’au 4ième jour (morula) ; les ES sont prélevées sur l’embryon
donc possibilité de clonage reproductif.
- cellules souches embryonnaires pluripotentes : elles sont capables de générer
la plupart des tissus du corps adulte + les cellules germinales mais pas
de donner naissance aux tissus extra-embryonnaires (placenta, cordon
ombilical) ; elles sont prélevées à partir du blastocyste (= bille creuse
avec, à un endroit, un renflement dans lequel se trouvent les
cellules souches ; c’est de cet amas que doit émerger l’embryon au sens
strict) jusqu’à l’embryon de 5-7 jours.
Il y a de grands espoirs sur ces cellules embryonnaires car elles ont la capacité
de générer toutes les cellules spécialisées du corps MAIS il y a encore de
nombreuses inconnues, des problèmes comme le rejet ou la dérive en cellules
tumorales et des problèmes d’éthique vu qu’elles sont prélevées sur un
embryon (destruction) et que l’on pourrait faire du clonage reproductif (par
scission embryonnaire).
Une législation particulière est donc nécessaire.
Avantages : pluripotentes donc capables de produire un gd nombre de tissus
différents
potentiel de division important
aptitude à la survie particulièrement élevée
Inconvénients : nécessitent la destruction d’embryons DONC problèmes
d’éthique
peuvent, plus que les cellules adultes, donner lieu à un
développement tumoral
doivent être isolées de très petits ensembles cellulaires
= DIFFICILE
Des chercheurs ont cartographié l’ensemble de signaux biologiques et chimiques
nécessaires à la programmation des cellules souches embryonnaires.
Ils ont obtenu des populations pures de 12 lignées mésodermales humaines, y
compris l’os, le muscle du cœur et le cartilage.
Ils ont bloqué les différenciations non désirées et orienté vers les cellules
différenciées choisies.