FACULTE DES SCIENCES DE TUNIS DEPARTEMENT DE BIOLOGIE FASCICULE DES TRAVAUX PRATIQUES DE PHYSIOLOGIE ANIMALE Physiologie des systèmes et homéostasie Section: LUSVE2 Enseignante : Mme Neziha EL ELJ Année Universitaire 2022-2023 SOMMAIRE Etude des éléments figurés du sang (frottis sanguin). Immuno-phénotypage du groupe sanguin (système ABO et facteur Rhésus). Etude de la perméabilité cellulaire (perméabilité des globules rouges et observation du phénomène d’Hémolyse). Mesure du volume sanguin et détermination de l’hématocrite chez le rat. Régulation de la Diurèse chez le rat. INSTRUCTIONS GENERALES Ces manipulations permettent : de familiariser l’étudiant avec les principaux aspects de l’expérimentation. de lui apprendre à mettre au point les démonstrations convenant à son enseignement théorique de physiologie animale. MATERIEL INDISPENSABLE 1) Trousse à dissection comprenant Une paire de petits ciseaux Une paire de grands ciseaux Une aiguille fine Deux pinces fines Deux grandes pinces 2) Une blouse blanche ELABORATION D’UN COMPTE RENDU Plan du compte rendu : 1) 2) 3) 4) 5) But de la manipulation Principe Résultats obtenus et analyse Interprétation des résultats obtenus Conclusion ETUDE DES ELEMENTS FIGURES DU SANG FROTTIS SANGUIN I- Introduction : Le sang est un tissu liquide contenu dans les espaces vasculaires. Il comprend une phase liquide; le plasma et des cellules ou fragments de cellules en suspension dans la phase liquide; les éléments figurés. Le sang assure plusieurs fonctions importantes dans l’organisme: a) Transport de l’oxygène et des substances nutritives, des produits de dégradation du métabolisme cellulaire et des hormones produites par les glandes endocrines. b) Homéostasie: maintien de la composition du milieu intérieur en particulier les liquides interstitiel et intracellulaire et le maintien de la température corporelle. c) Défense de l’organisme: contre les infections et les agressions grâce aux anticorps et aux globules blancs, et contre la perte sanguine grâce au système de la coagulation. II- Les éléments figurés du sang : Frottis sanguin Le sang est composé d'un liquide jaunâtre, appelé plasma, dans lequel baignent des millions de cellules, notamment les globules rouges qui lui donnent sa couleur. Les éléments figurés représentent environ 45 % du volume total du sang. Son odeur est très caractéristique. L'organisme d'un adulte en bonne santé contient en moyenne entre 4,5 et 6 litres de sang, soit un onzième du poids du corps. Les éléments figurés du sang se subdivisent en trois groupes : -Les globules rouges ou hématies ou érythrocytes. -Les globules blancs ou leucocytes. - Les plaquettes ou thrombocytes. 1) Matériel : - Lancettes de Bensaude stériles - Solution de May Grunwald - Solution de Giemsa - Eau distillée - Lames et lamelles - Alcool - Coton - Microscopes 2) Protocole expérimental : a- Etalement du sang sur une lame - Piquer le doigt par une lancette stérile. - Déposer à l’extrémité d’une lame propre une goutte du sang. - Prendre ensuite une lamelle et appliquer l’un de ses côtés sur la goutte, de manière telle que les deux lames font entre elles un angle de 35° environ. Attendre que la goutte de sang soit étalée le long de l’arête de la lamelle, et glisser celle-ci rapidement sur la lame (voir figure). - Sécher rapidement l’étalement de sang par agitation à l’air libre. b) Fixation Pour assurer une bonne fixation recouvrir le frottis avec la solution alcoolique de May Grunwald (éosine bleu de méthylène). Laisser agir trois minutes. c) Coloration - Après les trois minutes de fixation, verser un nombre de gouttes d’eau distillée égal à celui des gouttes de May Grunwald utilisé précédemment. Mélanger par agitation douce et attendre une minute. - Rejeter le May Grunwald et égoutter la lame sur un papier filtre. - Préparer un bain de Giemsa dans une cuve de coloration, à raison de trois gouttes de Giemsa pour 2 ml d’eau distillée, et y plonger les préparations fixées. Attendre 20 minutes. - Sortir ensuite la lame, la laver à l’eau distillée à l’aide d’une pissette et l’égoutter rapidement sur un papier filtre. c) Observation de la lame colorée - Observer la lame au microscope à un grossissement (40x40) - La préparation va présenter les éléments suivants : 1- Les hématies : Les globules rouges appelés hématies ou érythrocytes. Ils contiennent l'hémoglobine, responsable de la coloration rouge du sang. Ils sont fortement déformables afin de pouvoir se frayer un passage à travers les vaisseaux sanguins étroits (capillaires). Il y a environ 5 millions de globules rouges par mm³ de sang. Ils assurent le transport de l'oxygène dans l'organisme. Les globules rouges Diamètre : 7,5 µm Noyau : anucléés Cytoplasme : pas de granulations. 2- Les globules blancs : Ils sont dits blancs parce qu'ils forment une pâte blanchâtre lorsqu'on les sépare des autres cellules sanguines. On en dénombre entre 4000 et 10000 par mm³ de sang. Granulocytes, lymphocytes ou monocytes, ils assurent par leur spécificité propre les fonctions de défense de l'organisme contre les agents pathogènes. On sépare les leucocytes en fonction de leur morphologie en "Polynucléaires" (neutrophiles, éosinophiles et basophiles) et en "mononucléaires" (lymphocytes et monocytes). Les Mononucléaires ou unilobés: - Les lymphocytes : de 8 à 10µ de diamètre, avec noyau arrondi volumineux par rapport à un protoplasme réduit. La plupart des lymphocytes sont formés au niveau de la moelle osseuse, mais ils peuvent aussi être élaborés au niveau du système lymphatique (ganglions lymphatiques, thymus et rate). Les lymphocytes interviennent dans les réactions immunologiques de l’organisme. - Les Monocytes : Les monocytes sont de grandes cellules. Leur noyau est réniforme. Les monocytes sont capables de se mouvoir ainsi que d’ingérer les bactéries et les particules de débris. Les Polynucléaires ou multilobés: Ce sont des leucocytes à noyau multilobé généralement étranglé en plusieurs points, et dont le protoplasme est chargé de granulations qui permettent d’en distinguer trois types : * Les Polynucléaires neutrophiles : ce sont des cellules avec de fines granulations cytoplasmiques. Après coloration les granulations sont rouges le noyau est plurilobé. * Les Polynucléaires éosinophiles : le cytoplasme possède de nombreuses granulations que l’éosine colore en rouge. Le noyau est bilobé. * Les Polynucléaires basophiles: les granulations sont grosses, nombreuses. Après coloration, elles sont bleu noires. Les granulations noirâtres se trouvent sur le noyau qui est lobé. Les globules blancs Les neutrophiles Diamètre : 9-12 µm Les basophiles Diamètre : 8-10 µm Les éosinophiles Diamètre : 10-14 µm Noyau : souvent bilobé. Noyau : aspect en trèfle, Noyau : polylobé (2 à 5 lobes souvent masqué par de grosses Cytoplasme : grosses en général) granulations. granulations arrondies Cytoplasme : granulations Cytoplasme : grosses peu nombreuses granulations irrégulières et nombreuses basophiles (bleuviolet) Les Lymphocytes Les lymphocytes Diamètre: 8 à 10 µm Noyau: arrondi occupant presque toute la cellule. Cytoplasme: granulations peu fréquentes. Les Monocytes Diamètre : 12 à 15 µm Noyau : irrégulier, encoché (en forme de rein). Cytoplasme : granulations fines et nombreuses. Souvent présence de vacuoles. IMMUNO-PHENOTYPAGE DU GROUPE SANGUIN SYSTEME ABO ET FACTEUR RHESUS I- Les groupes sanguins : le système ABO et le facteur Rhésus : Un groupe sanguin est un ensemble de propriétés antigéniques du sang. Il permet de classer les individus, afin de permettre des transfusions dans des conditions optimales de compatibilité. Différentes cellules sanguines portent des antigènes et il y a donc plusieurs sortes de groupes sanguins. Les globules rouges peuvent porter plusieurs sortes d'agglutinogènes déterminant les groupes érythrocytaires. Les groupes érythrocytaires sont des systèmes d'antigènes situés à la surface des globules rouges (hématies) et contrôlés génétiquement. * Le système ABO Les hématies (globules rouges) portent des antigènes spécifiques dont la présence détermine l'appartenance du sujet au groupe sanguin A, B, O ou AB. De plus, dans le système ABO, il existe dans le sérum des anticorps (agglutinines) naturels c'est-à-dire présents sans qu'il y ait eu contact avec l'antigène auparavant. Ainsi, si le sujet appartient au groupe A, son sérum comporte des anticorps dirigés contre l'antigène B. On ne peut donc pas lui transfuser du sang de groupe B ou AB sous peine de voir apparaître une hémolyse (destruction des globules rouges) et un choc transfusionnel. Un sujet de groupe B ne peut pas être transfusé avec du sang de groupe A car il possède des anticorps anti-A. Les sujets du groupe AB portant les deux antigènes sur leurs globules rouges peuvent recevoir indifféremment du sang de groupe A ou de groupe B. Ils sont dits receveurs universels. Ils n'ont ni anticorps anti-A ni anticorps anti-B dans leur sérum. Par contre, ils ne peuvent donner leur sang qu'aux sujets de groupe AB. Les sujets du groupe O ne portent pas d'antigène du système ABO sur leurs hématies. Ils sont donneurs universels car on peut transfuser leur sang aussi bien aux sujets du groupe O qu'à ceux des groupes A, B et AB. Ils ne peuvent par contre recevoir que du sang du groupe O car leur sérum contient des anticorps anti-A et anti-B. * Le Système Rhésus Le système Rhésus est le second système antigénique attaché aux globules rouges. Les sujets Rhésus positif sont ceux qui possèdent l'antigène D sur la surface des hématies. Ils représentent 85% de la population blanche. Les autres (15%) sont Rhésus négatif puisqu’ils ne possèdent pas l’antigène D sur la surface de leurs hématies. Par exemple, un sujet du groupe O et porteur de l'antigène D aura comme groupe sanguin : O positif; un sujet du groupe AB n'ayant pas par ailleurs l'antigène D sera AB négatif. Les individus Rhésus négatif ne possèdent pas spontanément d'agglutinines anti-D, mais ils en fabriquent lorsqu'ils sont mis en contact avec des hématies portant l'antigène D ou facteur Rhésus. Lors d'une deuxième transfusion de sang Rhésus positif, ils feront un accident transfusionnel. On oppose ces agglutinines acquises anti-rhésus aux agglutinines naturelles des groupes ABO qui existent même sans sensibilisation préalable. Les antigènes des globules rouges, qui déterminent le groupe sanguin, sont eux toujours innés. Le risque d'iso-immunisation Rhésus nécessite une surveillance pendant la grossesse et l'accouchement chez les femmes Rhésus négatif. * Règles de transfusion Lors d’un contact entre un antigène et l’anticorps dirigé contre lui, il y aura agglutination et lyse massive des globules rouges du donneur. Le respect de la compatibilité doit être absolu car l’accident fait courir au sujet un risque mortel. On peut donc dresser le tableau suivant : Groupe Antigène Anticorps A qui donner De qui recevoir A A anti-B A, AB A, O B B anti-A B, AB B, O AB A et B - AB A, B, AB, O O - anti A et anti B A, B, AB, O O A la lecture du tableau, on voit que le sujet de groupe O peut donner du sang à chacun des autres groupes. ; c’est un donneur universel. Cependant, certains sujets du groupe O peuvent être dangereux en tant que donneurs car ils possèdent des antigènes appartenant à d’autres systèmes (voir système Rh par exemple). De même, certains patients receveurs peuvent avoir développé des anticorps acquis. Il faut donc toujours effectuer les tests de compatibilité avant de pratiquer une transfusion. Dans les cas d’extrême urgence cependant, et si on est en dehors du milieu hospitalier, on doit se contenter d’une transfusion respectant les groupes. * Iso immunisation Rhésus Lorsqu’une mère Rh(-) porte son premier enfant Rh(+); des globules rouges fœtaux passent la barrière placentaire comme dans toute grossesse normale. A l’accouchement, le décollement du placenta accentue ce passage et la mère peut produire une réponse primaire contre les antigènes Rh(+) introduite ainsi dans sa circulation. Lors d’une grossesse ultérieure avec un autre enfant Rh(+), la mère produira une réponse secondaire. Certains des anticorps produits peuvent passer la barrière placentaire et être nocifs pour le fœtus. En réalité, seulement 10 % des femmes Rh(-) portant un enfant Rh(+) se sensibilisent. Cependant, une transfusion ne tenant pas compte des groupes rhésus pourrait sensibiliser la mère Rh(-). Dans ce cas, elle pourrait avoir une réponse secondaire dès sa première grossesse avec enfant Rh (+). II- Détermination du groupe sanguin ABO : 1) Matériel : - Lancette de Bensaude - Lammes - Coton - Alcool - Sérums: antiA , antiB, antiA-B, anti D 2) Protocole expérimental: Sur une lame de verre bien propre déposer, à quelques cm l’une de l’autre. Une goutte de sérum anti-A Une goutte de sérum anti-B Une goutte de sérum anti-AB Une goutte de sérum anti-D - Prélever une goutte de sang de la pulpe du doigt, déposer une gouttelette de sang en face de chaque sérum-test. - Mélanger successivement chaque goutte de sang avec la goutte voisine de sérum à l’aide d’un coin d’une lamelle. - Changer le coin de la lamelle pour chaque goutte de sérum. - Observer les agglutinations éventuelles 3) Résultats: Anti B Anti A Anti AB Détermination Pas de réaction Agglutination Agglutination Groupe A Agglutination Pas de réaction Agglutination Groupe B Agglutination Agglutination Agglutination Groupe AB Pas de réaction Pas de réaction Pas de réaction Groupe O ETUDE DE LA PERMEABILITE CELLULAIRE PERMEABILITE DES GLOBULES ROUGES ET OBSERVATION DU PHENOMENE D’HEMOLYSE La membrane plasmique cellulaire constitue une barrière séparant les compartiments intra- et extracellulaire. Sa perméabilité à l'eau et aux substances dissoutes, électrolytiques ou organiques, est un phénomène indispensable à la nutrition et à l'élimination des déchets cellulaires. Les échanges d’eau font intervenir des phénomènes osmotiques, tandis que la perméabilité aux substances dissoutes fait intervenir divers phénomènes: des forces de diffusion, des forces électrostatiques et dans certains cas des forces développées activement par la cellule qui fournit l’énergie nécessaire grâce à son métabolisme. Pression osmotique et membrane de l’érythrocyte Les érythrocytes ou hématies sont des cellules hautement spécialisées dépourvues de noyau et assimilables à une éponge imprégnée d’hémoglobine et enveloppée d’une membrane hémiperméable. Placées dans un milieu hypertonique, les hématies se rétractent et perdent leur eau ; on dit qu’il y a plasmolyse. Par contre, dans une solution hypotonique, elles absorbent de l’eau ; on parle de turgescence. Cependant, alors que les cellules végétales pourvues d’une paroi peuvent résister au gonflement, les globules rouges éclatent et libèrent l’hémoglobine qui passe en solution ; il y a hémolyse. Le principe de la manipulation est de mettre en évidence les échanges d’eau à travers la membrane plasmique des hématies et la résistance de celle-ci en fonction de la pression osmotique du milieu extracellulaire. Calcul de la Pression Osmotique La pression osmotique = KTC (atm) M K : Constante qui dépend du solvant (K=0,082) C : Concentration pondérale de la solution (g/l) T : Température absolue = 273+ t° C M : Poids moléculaire du corps dissous : g/molécule 1) Matériel : - Sang - Eau distillée - Solution de NaCl à 15‰ - Tubes à essai - Tubes à hémolyse - Pipettes 2) Protocole expérimental : - Numéroter les tubes à essai de 1 à 8 et les remplir avec de l’eau distillée et de la solution de NaCl à 15‰ en suivant les volumes indiqués dans le tableau ci-dessous. N° du tube NaCl à 15‰ (ml) Eau distillée (ml) Concentration de la solution obtenue 1 15 0 15‰ 2 12 3 12‰ 3 9 6 9‰ 4 8 7 8‰ 5 6 9 6‰ 6 4 11 4‰ 7 2 13 2‰ 8 1 14 1‰ - Prélever 4 ml de chacune des solutions obtenues et les introduire dans des tubes à hémolyse numérotés. - Ajouter deux gouttes de sang frais, mélanger et centrifuger pendant 5 minutes à 2000 tours/mn. 3) Résultats et interprétation : a- Dans le tube à hémolyse n°8, on a mis 14 ml d’eau distillée et 1ml de solution de NaCl et du sang. On remarque que le tube présente une suspension trouble qui est due à l’hémoglobine libérée par l’éclatement de la membrane de l’hématie. On dit qu’il y a hémolyse. L’eau étant hypotonique par rapport aux globules rouges, pénètre d’une manière massive à l’intérieur de l’hématie. La membrane de celui-ci n’étant pas indéfiniment extensible finit par éclater et libérer ainsi l’hémoglobine. b- Dans le tube n°1 on a mis une solution de NaCl plus quelques gouttes de sang ; le tube, après quelques temps, présente un culot surmonté d'un liquide incolore. Décanter l'eau, et observer quelques globules au microscope. Ils présentent un aspect crénelé. En effet, placés dans une solution hypertonique, ils ont perdu de l'eau. c- Détermination de la résistance globulaire: La résistance globulaire mesure dans quelles limites des globules supportent, sans hémolyse, un milieu hypotonique. Il s'agit de déterminer à partir de quelle dilution la solution saline provoque l'hémolyse (début d'hémolyse). La concentration saline la plus basse où apparaît un début d'hémolyse, mesure la résistance des globules. Elle représente la concentration hémolysante limite. Observer les colorations limpide ou rosâtre (plus ou moins intense) du surnageant et la présence ou absence du culot rouge au fond des tubes. Interpréter. Observation microscopique : Les résultats observés à l’œil nu seront complétés par une observation microscopique. Pour cela, déposer un prélèvement du surnageant (dans le cas de l’hémolyse) entre lame et lamelle. Pour les tubes présentant un culot, renverser le surnageant et recueillir à l’aide d’une pipette une goutte du culot et l’étaler entre lame et lamelle. Observer la forme et la taille des globules rouges dans les différents cas. Dans les tubes où il n’y a pas d’hémolyse, les globules subissent des modifications qui consistent en une variation de volume, détectée par microscopie. - Dans une solution hypertonique au sang, les globules vont perdre de l’eau et présenter un aspect crénelé : plasmolyse. - Dans une solution légèrement hypotonique au sang, les globules vont augmenter de volume par passage d’eau de l’extérieur vers l’intérieur du globule. Cette augmentation de volume se fait sans rupture de la membrane globulaire et par conséquent sans diffusion de l’hémoglobine dans la solution : turgescence sans hémolyse. - Dans une solution isotonique au sang, les globules n’ont pas leurs dimensions modifiées. * Déterminer la ou les solutions dans lesquelles a eu lieu : l’isotonie, l’hémolyse totale et l’hémolyse partielle en justifiant votre réponse pour chaque cas. * Noter les tubes où il ya eu résistance globulaire et ceux où il y a eu plasmolyse. Justifier votre réponse en se basant sur l’observation macroscopique et microscopique. * Calculer la valeur de la pression osmotique pour les 8 solutions. On considère que la température dans laquelle est maintenue la solution de NaCl est égale à 25°C. Osmolarité = C/M x nombre de particules = pour NaCl le nombre de particules = 2 (il correspond à la dissociation de NaCl en Na+ et Cl-) et M= 58g/mol. (g/l) /(g/mol) = mol/l MESURE DU VOLUME SANGUIN ET DETERMINATION DE L’HEMATOCRITE CHEZ LE RAT Le volume sanguin total est la somme du volume globulaire et du volume plasmatique présent à l'intérieur de l'espace vasculaire. La plus grande partie du volume total circule activement dans les vaisseaux: (c'est la seule qui soit accessible à la mesure), l'autre emprisonnée dans les sinus veineux, circule si lentement qu'elle peut être considérée comme stagnante. Si l'on introduit dans la circulation une quantité connue d'un indicateur, et qu'on mesure sa concentration dans le sang, après le temps nécessaire à sa répartition uniforme, on peut déduire le volume de dilution de cet indicateur, qui correspond en première approximation au volume plasmatique circulant. L'indicateur choisi doit remplir certaines conditions: - il doit être facile à doser - ne pas être toxique aux doses utilisées - ne pas avoir de propriétés pharmacologiques susceptibles de modifier l'équilibre circulatoire - ne pas être détruit dans le sang - ne pas être rapidement excrété - ne pas diffuser hors de l'espace vasculaire, ni pénétrer à l'intérieur des cellules Ces conditions idéales sont difficilement réalisables. Il existe cependant certaines substances, comme le bleu Evans, pour lesquelles les processus de diffusion, de destruction ou d'excrétion sont très lents. Le prélèvement pour le dosage devra donc se faire après que la substance utilisée ait été diluée de façon homogène, et avant qu'une fraction non négligeable ait été éliminée de la circulation. Le temps s'écoulant entre l'injection du colorant et le prélèvement sanguin dépendra donc de la substance utilisée et de l'animal choisi pour l'expérience. Formule chimique de Bleu d'Evans: (Acide (Dimethyl-3,3'Biphenylene-4,4'Bisazo)-2,2'Bis-(amino-8Hydroxy1Naphtalenedisulphonique-5,7); PM 960,817) 1) Matériel : - Centrifugeuse et tubes à centrifugation de 10 ml gradués au 1/10 - Electrocolorimètre et cuves appropriées - Seringue à insuline pour injection - Pince à artère - Seringues de 1 ml et 5 ml - Solution de bleu Evans à 500mg/l dans NaCl 9‰ - Héparine en solution à la concentration de 10 mg/ml - Uréthane (1,2 g/kg P.C. injection intrapéritonéale) ou hydrate de chloral (0,36 g/kg P.C injection intrapéritonéale). - Sérum physiologique (NaCl à 9‰) - Fil, coton bécher, pipette de 1 ml - Rat 1) Protocole expérimental - Etablir la courbe d'étalonnage pour des solutions de bleu Evans de 5, 10, 15, 20 et 30mg/l. On prépare un blanc avec NaCl 0.9%. La courbe d'étalonnage est une droite (on porte en ordonnée les densités optiques et en abscisse les concentrations). - Prendre un rat, le peser et noter son poids. Faire une injection intra péritonéale d'une solution anesthésiante. - Fixer l’animal sur la planche avec des lacets par les pattes. - Inciser la partie antérieure du cou entre le larynx et le sternum. Ecarter les glandes salivaires. - Découvrir les muscles. Dilacérer le tissu conjonctif à l'aide de pinces en restant toujours dans le plan sagittal. - Localiser la veine jugulaire ; elle est superficielle (entre la peau et la paroi musculaire). - Repérer la carotide. Elle est profonde située prés de la trachée. La carotide apparaît animée de très faibles pulsations visibles sous une certaine incidence lumineuse. - Dégager cette artère sur la plus grande longueur possible en la séparant du nerf pneumogastrique et du rameau sympathique. Passer un fil au dessous. Utiliser une pince à artère, pour empêcher une éventuelle hémorragie. - Injecter dans la veine jugulaire une solution de Bleu Evans à 500mg/l à la dose de 1ml/kg soit 0.5mg/ml/kg. - Eviter toute perte d’indicateur coloré qui fausserait les résultats ultérieurs. - Trois minutes après l’injection de Bleu Evans, soulever la carotide par le fil, l’inciser et prélever du sang. Le tube dans lequel on prélève le sang doit être hépariné et sec afin d’éviter tout risque d’hémolyse. - Verser le sang prélevé dans un tube à centrifugation et dans un tube à hématocrite gradué jusqu’à 1 ml. Centrifuger pendant 10 mn à 5000 tours/mn. - Evaluer l’hématocrite - Prélever à l’aide d’une pipette en évitant de remettre les hématies en suspension, 1 ml de plasma et le placer dans la cuve de l’électrocolorimètre. Ajouter 1 ml de sérum physiologique (facteur dilution = 2). Mesurer la densité optique à une longueur d’onde de 750 nm. - En se reportant à la courbe d’étalonnage, déduire la concentration C du plasma en Bleu Evans en mg/l. Puis multiplier par le facteur de dilution (2). 2) Résultats : Calcul du volume sanguin : - Si P est le poids de l’animal en kg, la quantité de bleu Evans « m » injectée en mg est égale à : m = P x 0,5 Puisque nous avons injecté 1 ml par kg de la solution mère de Bleu Evans à 500mg/l, soit 0,5 mg/ml/kg. - Le volume plasmatique total Vp, exprimé en l, est égale au rapport de la quantité de Bleu Evans injectée sur la concentration C de l’indicateur coloré dans le plasma soit : * Vp = m/C = P. 0,5/C = volume plasmatique total (L) Ht = VG/ Vs 1 – Ht = Vp / Vs Vs = Vp / (1-Ht) * Vs = Vp / (1-Ht) = volume sanguin total (L) REGULATION DE LA DIURESE CHE RATZ LE I. Rappel La diurèse est l’élimination d’une urine abondante et de faible osmolarité. L’une des fonctions essentielles du rein est de contrôler l’élimination du sel et de l’eau et donc de limiter les variations du volume et de l’osmolarité du milieu extracellulaire. Il contribue de ce fait au maintien de l’équilibre hydro-électrolytique. L’équilibre du bilan de l’eau dépend de l’apport d’eau (eau alimentaire et eau métabolique) et des pertes d’eau (urine, eau expirée, eau éliminée par la peau et les fèces). Dans les conditions normales de fonctionnement du néphron, il existe une réabsorption d’eau au niveau du tube collecteur. Cette réabsorption est fonction du gradient osmotique entre les milieux tubulaire et péritubulaire et dépend également du taux plasmatique d'hormone antidiurétique (ADH). En présence d’ADH, la réabsorption de l’eau (retour de l’eau filtré au niveau du glomérule vers le sang) conduit à une urine hyper-osmotique au plasma ; en absence d’ADH, il se produit une diurèse aqueuse (urine à peu prés iso-osmotique au plasma). La sécrétion d’ADH est principalement modulée par la pression osmotique sanguine et le volume circulant. II. But de la manipulation Il s’agit de mettre en évidence le contrôle osmotique et neuroendocrinien de la réabsorption de l’eau par le rein, organe essentiel de l’équilibre hydrique. III. Matériels et Méthodes III.1. Matériel Un rat mâle Un cadre grillage et lacets Une canule à mandrin Une seringue de 5 ml Une seringue de 2 ml Une sonde gastrique Un bécher de 50 ml Un cathéter en polyéthylène Une solution d’alcool à 12% Une solution de mannitol à 12% Une solution de vasopressine Liquide de Ringer Eau distillé Un chronomètre III.2. Préparation de l’animal - Pendant 3 jours, le rat reçoit un régime riche en eau (carotte…). - Une demi-heure avant la manipulation, on administre par gavage gastrique 5 cc par 100 g de poids corporel d’alcool à 12%. Ceci a un double intérêt : anesthésie et surcharge d’eau. Cette dernière est complétée tout au début de la séance par l’administration de 6 cc d’eau par 100g, ce qui porte la surcharge hydrique à 8 cc par 100g. - Le tubage : fixer par les quatre membres l’animal, face ventral en haut, tirer la tête vers l’avant avec un lacet passé sous les incisives supérieures. Introduire doucement la sonde dans la bouche puis la glisser dans l’œsophage. Opérations Mise en place d’une canule à mandrin dans la veine du pénis (cf manip. 1). Sondage de la vessie - Epiler aux ciseaux la partie inferieure du ventre. - Faire une incision longitudinale de la peau de 1cm juste ½ cm au dessus de la ceinture scapulaire. - Ouvrir le plan musculaire et sortir la vessie de la cavité abdominale. - Préparer la sonde : engager une aiguille à injection à l’extrémité non renforcée du tube de polyéthylène. Remplir la seringue de sérum physiologique, l’adapter à l’aiguille et injecter le sérum dans la sonde. Laisser la seringue branchée jusqu’à la mise en place définitive de la sonde dans la vessie. - Préparer une ligature lâche autour de la vessie et l’inciser à son pole supérieur. Elle va se vider immédiatement. Saisir un bord de l’incision avec une pince, introduire l’extrémité renforcée de la sonde dans la vessie. Ligaturer la vessie sur la sonde, celle-ci ne doit pénétrer que de quelque millimètres. Retirer aiguille et seringue, fixer la sonde avec un morceau de sparadrap dans le prolongement de la vessie. IV. Mesures IV.1. Diurèse aqueuse L’ingestion d’eau (surcharge provenant de l’alimentation et des deux tubages) est à l’origine de la diurèse aqueuse. L’eau absorbée par l’intestin induit des modifications de l’osmolarité et du volume sanguin, ce qui inhibe la sécrétion d’ADH. IV.2. Diurèse osmotique La diurèse osmotique apparait lorsque des substances non réabsorbables sont filtrées dans le tubule, par exemple le mannitol. Pour des raisons d’équilibre osmotique, ces substances fixent l’eau dans le tubule, l’eau étant ensuite éliminée avec la substance : les 2/3 environ de l’urine primitive sont réabsorbées le long du tube proximal du néphron. La réabsorption de l’eau y est passive, elle est dite obligatoire car elle succède à la réabsorption active de Na +, Cl-, HCO3 -, etc. pour atteindre l’équilibre osmotique. En effet, l’urine primitive reste isotonique au plasma le long de ce segment. La présence d’une molécule non réabsorbable dans le fluide tubulaire, réduit le gradient osmotique, ce qui limite la réabsorption d’eau. Il s’ensuit une fuite urinaire très importante. Sans interrompre le comptage des gouttes d’urine. Faire une injection intraveineuse d’une solution de mannitol à 10% à raison de 0,6 cc par 100g de poids corporel. La polyurie dure une dizaine de minutes. Noter le moment précis de l’injection et poursuivre le comptage jusqu’au retour à la normale. IV.3. Contrôle hormonal Injecter dans la canule intraveineuse 0,5ml de la solution de vasopressine (ADH). La diurèse va marquer une nette diminution, voire un arrêt. Noter le moment de l’injection, et poursuivre le comptage jusqu’au retour du débit initial. Les mesures terminées, tuer le rat en injectant 10 cc d’eau dans la veine du pénis, retirer sonde et canule. Nettoyer le matériel et la paillasse. V. Représentation Graphique des Résultats Reporter les résultats sur papier millimétré et tracer une courbe représentant le nombre de gouttes d’urine en fonction du temps. 34