tutorat2012 sujet ue12

Tutorat C2P1 2012-­‐2013 Université Paris Descartes UE1 Chimie/Biochimie Sujet n°2 Durée de l’épreuve : 3 heures J Vérifiez que le sujet comporte 46 pages imprimées recto-­‐verso, numérotées de 1 à 46. J Ce sujet est composé de 60 QCM, plusieurs cases sont à cocher.
J La notation des questions à réponses multiples s’effectue par comparaison avec les réponses attendues. Pour une question notée sur 1 point : pas de différence = 1 point ; une différence = 0,5 point ; deux différences = 0,2 point ; trois différences et plus = 0 point ; aucune réponse = 0 point. La notation des questions à réponse unique s’effectue de manière binaire : réponse juste ou réponse fausse. Il n’y a pas de points négatifs. J La grille individuelle qui vous est fournie par le C2P1 est à compléter au stylo à bille noir exclusivement, et constitue l’unique support qui pourra intervenir dans le calcul de la note.
J N’oubliez pas de marquer en haut de votre grille vos nom, prénom et n°C2P1, ainsi que de remplir les cases d’identification selon les consignes exposées en début d’épreuve.
J L’usage de la calculatrice est interdit.
Bon courage ! Cercle Cartésien des PAES – C2P1
Bureau T203 ∗ 45, rue des Saints-Pères 75006 Paris
01 42 86 40 59 ∗ [email protected] ∗ http://c2p1.fr
GRILLE DE CORRECTION RAPIDE IMPORTANT : Cette grille n’est présente que pour vous permettre de reporter vos réponses et vous permettre de vous corriger rapidement lorsque la correction vous sera distribuée. Elle ne doit en aucun cas être rendue à la place de la grille qui vous a été distribuée, qui seule peut intervenir dans le calcul de votre note. 2
CHIMIE De nombreuses substances utilisées chez l’homme sont issues de la synthèse chimique. De l’objectif thérapeutique des médicaments à la formation des gaz d’airbag, en passant par la synthèse des arômes, parfums et colorants, ces substances recouvrent des objectifs très variés. Parmi ces molécules, s’en trouve une classe aux objectifs plus… récréatifs. Exercice I : Les amphétamines, le cas de la MDMA. 𝑥 0,01 0,4 5 5,5 100 250 ln (𝑥) −4,5 −0,9 1,6 1,7 4,5 5,5 𝑒 ! 1,01 1,5 150 250 2,7.10!" 3,7.10!"# !,!
On considère qu’à T = 300K, on a RT = 2,5 kJ. mol!! et R = !"" kJ. K !! . mol!! L’amphétamine est une substance chimique utilisée comme drogue par les étudiants pour ses effets anorexigène (= coupe-­‐faim) et psychoanaleptique (= accélérateur de neurones) sous le nom de speed. Elle présente néanmoins comme inconvénient un « bad trip » assez chargé, dont le détail des symptômes est assez long: citons tout de même « crises de tétanie », « dépression » mais surtout « problèmes érectiles majeurs » … CH3
H2N
H
Un énantiomère de l’amphétamine Point culture : Le nom « amphétamine » provient de son nom chimique :
α-méthyl-phényléthanamine (d'où a-m-phe-eth-amine = amphétamine).
Dans un premier temps on se place en conditions standards et on cherche à évaluer l’énergie de résonnance du cycle benzénique de l’amphétamine. La réaction d’hydrogénation, notée réaction 1, de l’amphétamine est la suivante : CH3
NH2
+ 3 H2
CH3
NH2
𝑎𝑚𝑝ℎé𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛𝑒 𝑠 + 3𝐻! 𝑔 ⇄ 𝑐𝑦𝑐𝑙𝑜ℎ𝑒𝑥𝑦𝑙𝑝𝑟𝑜𝑝𝑎𝑛2𝑎𝑚𝑖𝑛𝑒(𝑠) On note 𝐾! la constante d’équilibre associée à cette réaction. Les données thermodynamiques à notre disposition sont résumées dans le tableau suivant : Température 𝐾! ∆! 𝐻°! ∆! 𝑆°! A T = 300 K 200 ? −100 𝐽. 𝐾 !! A T = 330 K 2 De plus, on considère qu’entre 300 et 330K ∆! 𝐻°! et ∆! 𝑆°! ne varient pas. 3
Question 1 : A propos de la réaction d’hydrogénation de l’amphétamine, quelle(s) est (sont) la (les) proposition(s) exacte(s) ? –note, le « (q1) » désigne le fait que l’on parle du calcul fait à la question 1-­‐ A. On peut penser que la réaction est exothermique. B. On a ∆! 𝐻°! 𝑞1 ≅ 315 𝑘𝐽. 𝑚𝑜𝑙 !! [+/−5] C. On a ∆! 𝐻°! 𝑞1 ≅ −125 𝑘𝐽. 𝑚𝑜𝑙 !! [+/−5] D. Le signe de ∆! 𝑆°! est en accord avec une disparition de dihydrogène gazeux. E. Les données ne permettent pas de calculer ∆! 𝐻°! 𝑞1 En se servant des énergies de liaison, on cherche à évaluer l’énergie de résonnance du cycle benzénique de l’amphétamine. Liaison H-­‐H C-­‐C C=C C-­‐H C-­‐N N-­‐H !!
∆! 𝐻° 𝑘𝐽. 𝑚𝑜𝑙 -­‐440 -­‐350 -­‐615 -­‐415 -­‐300 -­‐390 De plus, ∆!"# 𝐻° 𝑎𝑚𝑝ℎé𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛𝑒 = 20100 𝑘𝐽. 𝑚𝑜𝑙 !!
et !!
∆!"# 𝐻° 𝑐𝑦𝑐𝑙𝑜ℎ𝑒𝑥𝑦𝑙𝑝𝑟𝑜𝑝𝑎𝑛2𝑎𝑚𝑖𝑛𝑒 = 20000 𝑘𝐽. 𝑚𝑜𝑙 Question 2 : A propos de la réaction d’hydrogénation de l’amphétamine, quelle(s) est (sont) la (les) proposition(s) exacte(s) ? –note, le « (q2) » désigne le fait que l’on parle du calcul fait à la question 2-­‐ H
H
H
H H
H
H
H
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C H C
H
H C
H
H
H
C
CH N H
H C H CH N
H
C
H H
H
C
H
H
H
H
H
H
H
H
H
Amphétamine Cyclohexylpropan2amine A. On a ∆! 𝐻°! 𝑞2 = 3∆! 𝐻° 𝐶 − 𝐶 + 6∆! 𝐻° 𝐶 − 𝐻 − 3∆! 𝐻° 𝐶 = 𝐶 − 3∆! 𝐻° 𝐻 − 𝐻 B. On a ∆! 𝐻°! 𝑞2 = − 375 𝑘𝐽. 𝑚𝑜𝑙 !! C. On a ∆! 𝐻°! 𝑞2 = − 275 𝑘𝐽. 𝑚𝑜𝑙 !! D. On a ∆!"# 𝐻° 𝐻! = 0 𝑘𝐽. 𝑚𝑜𝑙 !! car 𝐻! est un corps pur. E. Le calcul est impossible car on ne connait pas ∆!"# 𝐻° 𝐻! Question 3 : A propos de l’énergie de résonance du cycle benzénique, quelle(s) est (sont) la (les) proposition(s) exacte(s) ? A. ∆! 𝐻°! 𝑞1 correspond à la valeur la plus proche de la réalité B. ∆! 𝐻°! 𝑞2 correspond à la valeur la plus proche de la réalité C. Le fait d’avoir trouvé deux valeurs différentes de ∆! 𝐻°! est une incohérence qui ne nous permet pas d’évaluer l’énergie de résonnance de l’amphétamine. D. L’énergie de résonnance du cycle benzénique de l’amphétamine est 𝐸! = −60 𝑘𝐽. 𝑚𝑜𝑙 !! E. Au sein de la molécule d’amphétamine, les liaisons C/C du cycle benzénique sont plus longues que les liaisons C/C des atomes de carbones en dehors du cycle. 4
Les amphétamines peuvent être synthétisées selon plusieurs voies. La 1ère que l’on considère est la suivante, notée réaction 2 : CH2
NH3 (aq)
CH3
+
NH2
(s)
+ NH4 (aq)
(s)
En condition standard et à T = 300K, la constante d’équilibre de cette réaction est 𝐾! = 250. De plus, on a ∆! 𝑆°! = −480 𝐽. 𝐾 !! Question 4 : A propos de la thermodynamique de la réaction 2, quelle(s) est (sont) la (les) proposition(s) exacte(s) ? A. On a ∆! 𝐻°! = 136,25 𝑘𝐽. 𝑚𝑜𝑙 !! B. Le signe de ∆! 𝐻°! montre que la réaction est exergonique en conditions standards. C. ∆! 𝐺°! = −13,75 𝑘𝐽. 𝑚𝑜𝑙 !! D. Les conditions standards n’imposent qu’une pression de 1 atm et une concentration de 1 mol/L à tous les solutés. E. Aucune des propositions précédentes n’est exacte. Une autre voie de synthèse, notée réaction 3, permet d’obtenir de l’amphétamine : H2O
(l)
+ NH3(aq)+
CH3
CH3
Br H
(aq)
H2N
H (aq)
+
-
+
+
Br
H3O
(aq)
(aq)
[(2R)-2-bromopropyl]benzene
2BPB
On se place en milieu aqueux (l’eau est en excès), à P = 1 atm et T = 300K, et on fixe le pH à 5. On note 𝐾! la constante d’équilibre de cette réaction et Г! le quotient réactionnel de cette réaction à un instant t. Données : ∆! 𝐺°′!,!"!! = −6,75 𝑘𝐽. 𝑚𝑜𝑙 !! à T = 300K 𝑙𝑛 𝑥 = 2,3 𝑙𝑜𝑔 𝑥 Question 5 : A propos de 𝐊 𝟑 !𝐩𝐇!𝟔 et ∆𝐫 𝐆°!𝟑,𝐩𝐇!𝟔 , quelle(s) est (sont) la (les) proposition(s) exacte(s) ? A.On a ∆! 𝐺°!!,!"!! = ∆! 𝐺°! − 34,5 𝑘𝐽. 𝑚𝑜𝑙 !! B. On a ∆! 𝐺°!!,!"!! = −1 𝑘𝐽. 𝑚𝑜𝑙 !! C. On a 𝐾! !!"!! = 150 D. On a 𝐾! !!"!! = 1,5 E. D’après le principe de Le Chatelier, une augmentation de pH favorise la réaction dans le sens direct. Question 6 : On se place à pH = 6, sachant que la composition du milieu 𝐚𝐦𝐩𝐡é𝐭.
réactionnel est telle que 𝐁𝐫 ! = 𝟏, 𝟓 𝐦𝐨𝐥. 𝐋!𝟏 et que 𝟐𝐁𝐏𝐁 = 𝟐𝟎𝟎, quelle quantité de 𝐍𝐇𝟑 faut-­‐il introduire pour que la réaction s’inverse ? A. 𝑁𝐻! < 2 𝑚𝑜𝑙. 𝐿!! B. 𝑁𝐻! > 4 𝑚𝑜𝑙. 𝐿!! C. 𝑁𝐻! < 4 𝑚𝑜𝑙. 𝐿!! D. 𝑁𝐻! > 2 𝑚𝑜𝑙. 𝐿!! E. Aucune des propositions précédentes n’est exacte 5
Un des dérivés d’amphétamine bien connue pour son utilisation à des fins disons… ludiques a pour formule : O
HN
O
Métamphétamine
On s’intéresse à ce composé, dénommé couramment ecstazy. Question 7 : Cochez la (les) proposition(s) exacte(s). A. Le cycle de la MDMA est aromatique avec 8 électrons délocalisables B. Les doublets non liants des atomes d'oxygènes peuvent se délocaliser sur le cycle C. Le doublet non liant de l'azote est dans une orbitale sp3. D. Les carbones de l’hexacycle sont hybridés sp3. E. Aucune de ces réponses n'est exacte. Question 8 : Cochez la (les) proposition(s) exacte(s). A. La règle de Hund précise que dans une même case quantique deux électrons ne peuvent avoir le même état quantique. B. Si il existe une liaison entre un atome A et un atome B, alors plus l'ordre de liaison est grand, plus la distance A-­‐B est faible et plus la liaison est forte. C. Le cycle est inductif donneur. D. Le groupement -­‐NH est inductif attracteur. E. L ‘azote possède le même nombre d’électrons de valence que les éléments de la même période. La vente de MDMA se fait dans des conditions pour le moins particulières, et il arrive que les acheteurs se retrouvent à consommer un de ses dérivés, la MDA, de formule : O
NH2
O
MDA
Question 9 : Cochez la (les) proposition(s) exacte(s). A. Un hydrogène d'un des groupements méthyle peut établir une liaison H avec l'azote. B. Cette molécule est achirale. C. Le carbone asymétrique est de configuration R. D. L'azote de la MDMA est plus nucléophile que l''azote de la MDA. E. Aucune de ces propositions n'est correcte. 6
Voici plusieurs molécules : N
O
O
O
O
Molécule B
Molécule A
H
H
N
N
O
O
O
O
Molécule C
Molécule C
Question 10 : Cochez la (les) proposition(s) exacte(s). A. La molécule A est une forme tautomère de la MDMA. B. La molécule B est une forme tautomère de la molécule A. C. La molécule C est une forme mésomère de la MDMA. D. La molécule D est une forme mésomère de la MDMA. E. Dans une liaison π, le recouvrement orbitalaire est axial. Les amphétamines sont des excitants. Elles agissent par stimulation du système nerveux, H
H
par exemple par amplification de H
la transmission synaptique. HO
N
Celle-­‐ci est contrôlée par des O
H
H
protéines dédiées, qui ont pour rôle de contrôler la quantité en ions de la cellule. On s’intéresse à O
O
l’une de ces protéines, la Na/K-­‐
P
O
ATPase, et à son site de fixation CH3
O
de l’ATP. O
P
Thr610
O
O
O
O
P
H
O
O
H2C
H2
NH3
C
O
O
CH2
CH2
691
N
N
N
NH2
N
VAGDA
O
Fe2+
Asp710
O
O
O
Asp714
Lys
Asp369
7
Question 11 : Cocher la (les) proposition(s) exacte(s). A. La présence de l’ion fer permet la stabilisation de charges positives B. Les atomes de carbone des fonctions carboxyle des résidus 710 et 714 sont rendus moins électrophiles par la présence du fer. C. La liaison ionique entre les résidus 369 et 692 permet d’augmenter la nucléophilie de l’atome d’oxygène chargé – du résidu 369. D. Le complexe a 18 électrons dans sa couche de valence E. La géométrie autour du fer est octaédrique. Question 12 : Cocher la(les) proposition(s) exacte(s). A. Le fer est ici complexé par deux ligands polydentes. B. Toutes les orbitales d du fer sont dans le même état énergétique. C. Fe2+ est plus mou que Fe3+ car il est plus polarisable. D. Le spin de ce complexe sera plus élevé que celui du complexe 𝐹𝑒(𝐻! 𝑂)! 2+ E. Aucune des propositions précédentes n’est exacte. Exercice II : La morphine et ses dérivés. La morphine est un composé aromatique utilisé comme antalgique puissant. De la morphine ont découlé des dérivés aux effets particulièrement intéressants, parmi lesquels l’héroïne. L’héroïne, ou diacétylmorphine, est un opioïde obtenu par acétylation de la morphine, le principal alcaloïde issu du pavot à opium. Son usage chronique entraîne une très forte dépendance physique. Elle a pour structure : 1
O
O
2O
H9
3
4
N
O
O
8
7
5
6
Héroïne
Question 13 : Cocher la (les) proposition(s) exacte(s). A. Il y a opposition de résonance dans cette molécule. B. Le carbone noté1 est plus nucléophile que celui noté 8. C. L’héroïne est un très bon nucléophile, notamment grâce à sa fonction amine tertiaire. D. L’atome d’azote est un centre de chiralité de la molécule. E. L’héroïne a au maximum 32 stéréoisomères de configuration. 8
Question 14 : Quelle est la projection de Newman de C4 vers C5 ? A. B. C. D. E. Aucune des projections n’est correcte. L’héroïne est un dérivé d’un analgésique puissant, la morphine. La double acétylation de celle-­‐ci pour former l’héroïne peut se faire en présence d’anhydride acétique (C4O3H6). On s’intéresse à la réaction de première acétylation de la morphine : HO
H
O
O
O
O
N
HO
Morphine
anhydride acetique
9
Question 15 : Cocher la (les) proposition(s) exacte(s). A. Le mécanisme est le suivant : H
O
HO
O
O
O
+
+
H
O
O
O
H
O
O
N
N
HO
HO
O
O
O
+
A/B
HO
H
O
N
HO
B. Le mécanisme est le suivant : HO
HO
O
O
O
O
+
+
H
O
O
O
H
O
N
N
HO
O
H
HO
O
+
A/B
O
HO
H
O
N
O
C. La morphine joue le rôle de nucléophile et réagit via une orbitale sp2. D. L’anhydride acétique joue le rôle de nucléophile et réagit via une orbitale sp2. E. La réaction aurait été plus rapide avec du chlorure d’acétyl (C2H3OCl) : Cl
10
O
chlorure d'acétyl Question 16 : Cocher la (les) proposition(s) exacte(s). A. La réaction va être difficile à réaliser car l’acétate est un très mauvais groupe partant. B. Une catalyse acide spécifique permettrait d’augmenter l’électrophilie des carbones de l’anhydride. C. Une catalyse basique spécifique permettrait d’augmenter l’électrophilie de la morphine. D. C’est une substitution nucléophile selon un mécanisme d’addition/élimination. E. Aucune de ces propositions n’est exacte. Question 17 : Cocher la (les) proposition(s) exacte(s). A. Cette réaction est stéréospécifique. B. Cette réaction est régiospécifique. C. L’autre fonction alcool de la morphine aurait pu être acétylée en premier. D. Un des deux carbones de l’anhydride sera attaqué préférentiellement par la morphine. E. L’acétylation de l’autre fonction alcool de la morphine pour former l’héroïne se fera selon le même mécanisme. Un autre dérivé de la morphine est la codéine. Elle est moins puissante que la morphine, et ce bien qu’elle soit métabolisée en morphine par les enzymes du foie. Elle a pour représentation : 3
O
2
4
1
5
7
13
6
O
H
9
14
8
10
HO
17
11
15
12
N
18
16
Question 18 : concernant la codéine, cochez la (ou les) réponse(s) exacte(s) : A. Une molécule qui possède des carbones asymétriques est toujours chirale. B. La codéine possède 6 carbones asymétriques. C. La molécule a 32 stéréoisomères de conformation au maximum. D. La molécule possède 32 couples d’énantiomères au maximum E. Toutes les réponses précédentes sont fausses Question 19 : Cochez la (ou les) réponse(s) exacte(s). A. Les configurations des carbones 8 et 9 sont respectivement : R et S B. Les configurations des carbones 12 et 14 sont respectivement : S et R C. La liaison C5-­‐C6 est une liaison cis. D. Dans la molécule de codéine, on a au moins une liaison double trans. E. Aucune des réponses précédentes n’est exacte. 11
Concernant les isomères de la codéine, Question 20 : Cochez (la ou les) réponse(s) inexacte(s) : A. Un mélange racémique de la codéine et de la molécule suivante est optiquement inactif par compensation : O
H
O
N
HO
B. Dans la molécule de codéine, on a au moins une liaison double trans. On mesure l’activité optique de la codéine, qui est α > 0 C. La molécule est dextrogyre. D. Le pouvoir rotatoire dépend de la configuration des carbones asymétriques. E. Deux énantiomères ont les mêmes propriétés de solubilité et de changement d’état mais ont des activités optiques différentes et interagissent différemment avec une molécule chirale. La codéine est le précurseur de la synthèse de désomorphine, un analogue de cette classe de molécules, et « principe actif » de la drogue crocodile, exportée de Sibérie jusque chez nos voisins germanophones l’année dernière. O
O
Chlorure de thionyle
O
O
S
H
Cl
Cl
H
O
N
N
OH
Cl
O
HO
réduction
catalytique
déméthylation
O
H
O
N
H
N
La première étape de la synthèse est composée de deux mécanismes de substitution nucléophile. 12
EN(S) = 2,5 EN(Cl) = 3 Question 21 : Cochez la (les) proposition(s) exacte(s). A. Le mécanisme de la première étape est (mécanisme 1) : O
O
O
H
O
H
O
H
O
N
N
N
OH
Cl
O
OH
S
O
Cl
Cl
S
Cl
Cl
B. Le mécanisme de la première étape est (mécanisme 2) : O
O
H
O
H
O
O
Cl
S
Cl
S
Cl
O
O
O
Cl
N
N
N
OH
H
O
+
Cl
+
O
O
S
Cl
C. Dans le mécanisme 1, la première étape est le déplacement d’un doublet dans une orbitale σ. D. Dans le mécanisme 2, l’attaque du chlore se fait selon un mécanisme de SN2. E. Le soufre du chlorure de thionyle joue le rôle d’électrophile. Question 22 : Concernant la suite de la synthèse, cochez la (les) proposition(s) exacte(s). A. La réduction d’une espèce libère des électrons. B. Une déshydrogénation est généralement une réduction. C. L’oxygène porteur du groupement méthyle est plus nucléophile après la déméthylation. D. Le cycle portant la double-­‐liaison réduite n’est jamais plan. E. Aucune de ces propositions n’est exacte. 13
Exercice III : La cocaïne, son effet vasoconstricteur. La cocaïne fait partie des substances dites à « usage récréatif ». Elle entraine néanmoins, malgré son côté ludique, certains effets indésirables, tels que paranoïa, crises d’épilepsie… Parmi ces effets, on remarque l’hypertension, entrainant une augmentation de la tension. La lutte contre l’hypertension se fait en général à l’aide de dérivés nitrés, qui après métabolisation, libèrent du NO, vasodilatateur. On s’intéresse ici à la cinétique de ce gaz. On considère sa réaction d’oxydation par le dioxygène, en solution aqueuse à 25°C : (1) 4 NO + O2 + 2 H2O → 4 NO-­‐2 + 4 H+ Aide au calcul : 298*308 ≈ 3002 ; e15,5 ≈ 5,4.106 ; e16,5 ≈ 14,7.106 Question 23 : Cochez la (les) proposition(s) exacte(s). A. v = k[NO]4[O2]1[H2O]2 d [ NO] d [O2 ]
v=−
−
4dt
dt B. v = # d [ NO_ ] d [ H + ] &
d [O2 ]
d [ H 2O]
d [ NO]
2
(
+4
+2
= −%%
+
dt
dt
dt
dt
dt ('
$
€ C. D. En mettant NO et H2O en excès, l’ordre apparent de la réaction vaut 1. E. Toutes les réponses précédentes sont fausses. €
On effectue une série d’expériences en prenant des concentrations de NO et de d [ NO]
−
dt (en M.s-­‐1). dioxygène (en M) différentes et on mesure la valeur de d [ NO]
Expérience [NO] [O2] −
dt -­‐4 -­‐8 1 10-­‐5 10
8.10
€
2 10-­‐5 2.10-­‐4 1,6.10-­‐7 -­‐5
-­‐4
3 2.10 2.10 6,4.10-­‐7 €
4 5.10-­‐5 2.10-­‐4 4.10-­‐6 On donne a et b les ordres partiels de NO et O2 Question 24 : Cochez la (les) proposition(s) exacte(s). A. L’ordre partiel de O2 vaut 1 B. L’ordre partiel de NO vaut 1 C. L’ordre global de la réaction vaut 2 D. Dans l’expérience 2 on a : v = kapp[NO]1 avec kapp = k[O2]b E. Toutes les réponses précédentes sont fausses. Expérimentalement, on a mesuré l’énergie d’activation qui vaut 9(8,3) kJ.mol-­‐1 14
Question 25 : Cochez la (les) proposition(s) exacte(s). A. La constante de vitesse k vaut 2.106 s-­‐1 B. Selon la loi d’Arrhénius, on peut tracer la courbe ln(k)=f(1/T) telle que la pente vaut Ea/R C. Un catalyseur permettrait d’augmenter la valeur de k, notamment en diminuant la valeur de l’énergie d’activation. D. La constante de vitesse vaut 5,4.106 s-­‐1 à une température de 35°C. E. Toutes les propositions précédentes sont fausses. Revenons sur la relation entre l’enthalpie libre et la cinétique … Question 26 : Cochez la (les) proposition(s) exacte(s). A. Ici, la réaction (1) possède un intermédiaire réactionnel. B. La catalyse permet d’augmenter le rendement de la réaction. C. Le chemin réactionnel emprunté témoigne d’un phénomène de micro réversibilité, notamment parce qu’il présente une constante cinétique élevée. D. Une augmentation de la température permettrait de favoriser le franchissement de la barrière énergétique. E. Toutes les réponses précédentes sont fausses. On prendra pour la suite, [O2]0 = 2.10-­‐4 M et [NO]0 = 10-­‐5 M Question 27 : Cochez la (les) proposition(s) exacte(s). A. On peut affirmer que la réaction présente un pseudo ordre 2. B. Ici, [NO] suit une loi exponentielle. C. Concernant la loi cinétique d’évolution du NO, il existe une constante homogène à 400 L.mol-­‐1.s-­‐1. D. Le temps de demi – réaction (en considérant la cinétique d’évolution du NO) vaut ainsi 62,5 s. E. Toutes les réponses précédentes sont fausses. Pour en revenir à la cocaïne, de représentation : O
CH3
7
N
H3C
6
1
5
2
4
O
O
8
3
O
C’est le produit illicite le plus expérimenté après le cannabis. Question 28 : Cochez la (les) proposition(s) exacte(s). A. Le carbone 2 est de configuration R. B. Le carbone 3 est de configuration R. C. Le carbone 1 a un DO égal à + I. D. Le carbone 2 a un DO égal à 0. E. Aucune des propositions précédentes n'est exacte. 15
La stovaïne ou amylocaïne est l’analogue non cyclique de la cocaïne. Elle est utilisée dans les anesthésies spinales pour ses propriétés analgésiques. CO2CH3
CO2CH3
H2C
H
C
H
C
H2C
CH
N-CH3
H2C
C
H
H
C
H
C
CH
N-CH3
OCOC6H5
H2C
CH2
C
H
OCOC6H5
CH2
Stovaïne
Cocaïne
La voie de synthèse de la stovaïne se déroule en trois grandes étapes : H3C
Cl
HN(CH3)2
O
H3C
CH3CH2MgBr
N
1
2
O
H3C
N
OH
H3C
H3C
(C6H5CO)2O
N
3
OCOC6H5
H3C
Stovaine
La réaction 3 se déroule en catalyse acide spécifique. On s’intéresse à la première étape de la synthèse, qui a pour mécanisme : H
H
Cl
O
+
H3C
N
H3C
CH3
Cl
N
CH3
H3C
N
O
H3C
Question 29 : Cochez la (les) proposition(s) exacte(s). A. Le nucléophile Cl-­‐ est remplacé par un nucléofuge HN(CH3)2 B. Dans une réaction de type SN2, la formation du carbocation est l'étape cinétiquement déterminante. C. Une SN1 nécessite l'emploi d'un nucléophile fort. D. Un nucléophile est d'autant plus réactif qu'il est peu polarisable. E. Pour un même atome, la nucléophilie augmente avec la densité électronique et diminue avec l'encombrement stérique. 16
O
La deuxième étape se déroule selon : H
BrMg
H3C
H3C
H3C
CH3
H
N
H3C
H3C
O
H3C
A/B
N
N
OH
O
+ BrMg
Question 30 : Cochez la (les) proposition(s) exacte(s). A. La réaction se fait selon un mécanisme d'addition/élimination. B. R-­‐Mg-­‐Br joue ici un rôle semblable à celui d'un nucléophile. C. La catalyse acide sert en général à augmenter la nucléophilie alors que la catalyse basique sert à augmenter l'électrophilie. D. L'électrophilie augmente lorsque la résonance augmente. E. Aucune des propositions précédentes n'est exacte. Concernant la dernière étape de la synthèse, Question 31 : Cochez la (les) proposition(s) exacte(s). A. Elle a pour mécanisme (voie 1) : H3C
H3C
H3C
N
N
N
H3C
H3C
H3C
H
O
O
O
H
H
Ph
Ph
O
O
O
Ph
O
O
Ph
O
O
B. Elle a pour mécanisme (voie 2) : H3C
N
H3C
H3C
N
H
O
H3C
OH
Ph
Ph
O
O
O
O
O
OH
Ph
Ph
H
O
H3C
O
H
O
H3C
N
H3C
N
H3C
N
H3C
H3C
O
HO
O
OH
Ph
O
O
Ph
C6H5COOH
H
HO
Ph
Ph
O
17
C. La première étape du mécanisme présenté voie 1 est une addition/élimination. D. Même si (C6H5CO)2O était introduit en excès, la réaction ne serait pas totale. E. L'étape intermédiaire entre l'addition nucléophile et l'élimination de la voie 2 n'est pas indispensable. La cocaïne est le précurseur de nombreuses autres molécules utilisées comme anesthésiques, parmi lesquelles la lidocaïne. O
O
N
H3C
CH3
O
O
O
N
H2N
Procaine
O
Cocaïne
H
N
2
N
1
O
Lidocaine
Question 32 : Cochez la (les) proposition(s) exacte(s). A. La lidocaïne présente un groupement ester. B. L'azote N1 est plus basique que N2. C. L'azote N2 est hybridé sp2 et son doublet est dans une orbitale sp2. D. La lidocaïne n'est pas une molécule aromatique. E. Aucune des propositions précédentes n'est exacte. Pour synthétiser la lidocaïne, les laboratoires disposent de plusieurs voies de synthèse. On en considère deux. Une première voie appelée voie F O
NH2
F1
+
A
Cl
Cl
A
18
HN
+
F2
B
Une deuxième appelée voie G O
G1
HN
+
C
Cl
Cl
NH2
C
G2
D
+
La réaction F1 a pour mécanisme : Cl
Cl
NH2
O
+
R
H2N
O
NH
O
O
R
H
Cl
Cl
Cl
R
NH2
R
Cl
Cl
A
Question 33 : Cochez la (les) proposition(s) exacte(s). A. L'oxygène chargé négativement attaque, par l'un de ses doublets, l'orbitale σ de la liaison C-­‐Cl. B. Le bilan de cette réaction est une addition-­‐élimination C. Le mécanisme réactionnel fait intervenir une prototropie. D. La catalyse n'est pas indiquée mais est nécessaire E. Aucune de ces propositions n’est exacte. Question 34 : Cochez la (les) proposition(s) exacte(s). Concernant le produit C de la réaction G1, il a pour formule O
O
Cl
Cl
HN
N
A. B. 19
Concernant la réaction G2, elle a pour mécanisme : Cl
O
Cl
N
H2N
O
+ H2N
N
Cl
C. Cl
O
NH2
O
+ H2N
N
N
Cl
D. E. Aucune de ces propositions n’est exacte. 20
BIOCHIMIE A
Le but de la prochaine étude est de montrer l’importance de l’approche biochimique et génétique par les techniques de biologie moléculaire dans certaines situations critique en médecine. On s’intéressera pour cela tout particulièrement à un syndrome nommé le « Lesh-­‐Nyhan syndrome» (LNS). Sur le plan descriptif, ce syndrome est une importante gravité où l’on décrit des nouveaux nés normaux à la naissance mais qui développent au bout de quelques mois de vie un retard de développement avec hypotonie (bébé ne pouvant même pas ramper), des signes d’atteinte cérébrales avec hyper réflexivité et spasticité musculaire voire même des tendances compulsives à l’automutilation. Ce syndrome est d’autant plus grave que les enfants atteins sont conscients de leurs troubles et en souffrent. Face à de telles situations, tout bon médecin doit bien sûr chercher à comprendre le syndrome dans le but d’aider ces enfants à travers une démarche thérapeutique si possible, en cherchant tous les angles d’attaques. On soupçonne une mutation au niveau de la protéine HGPRT (Hypoxanthine-­‐guanine phosphoribosyltransferase) qui pourrait avoir un rôle éthiologique au niveau de ce syndrome, on se focalisera donc d’abord sur cette protéine. I-­‐ PARTIE PROTEINE : On commence l’étude sur deux patients, un témoin sain (avec une protéine HGPRT Wild-­‐
Type, c’est à dire non muté), et un atteint par le LNS. Afin de purifier les protéines HGPRTwt (Wild-­‐Type) et HGPRT* (Mutante), on réalise une chromatographie d’interaction hydrophobe (Figure 1A) et une chromatographie en phase inverse (Figure 1B) . Figure 1 A: Chromatographie d’interaction hydrophobe : en 1 HGPRT-­‐wt, en 4 HGPRT*. En 2 et 3 diverses protéines du lysat cellulaire. . Figure 1B : Chromatographie en phase inverse : en 1 différentes protéines du lysat cellulaire, en 2 HGPRTwt et en 3 : HGPRT* 21
B
Question 35 : D’après l’analyse de la Figure 1, que pouvez-­‐vous supposer ? A. L’élution se fait avec de l’acétonitrille B. On peut affirmer en regardant le profil d’élution de la chromatographie d’interaction hydrophobe que les AA composant HGPRT* sont plus hydrophobes que ceux de HGPRTwt. C. La ou les mutations d’HGPRT affectent très probablement la structure globale de la protéine. D. Utiliser la chromatographie d’interaction hydrophobe comme première étape de purification n’était pas forcément très ingénieux car on ne pourra plus étudier la fonction d’HGPRT. E. Aucune des propositions précédentes n'est exacte
Question 36 : Concernant la figure 1 toujours, quelles est (sont) la (ou les) proposition(s) exacte(s) : A. Ayant comme critère de purification l’hydrophobicité, le chromatographie en phase inverse est complètement fausse : on devrait avoir les mêmes résultats que pour la chromatographie d’interaction hydrophobe. B. On peut supposer qu’HGPRTwt a un cœur très hydrophobe et une partie externe plutôt hydrophile. C. On peut supposer d’HGPRTwt est une protéine transmembranaire car elle est très hydrophobe. D. La protéine mutante HGPRT* a probablement des gros problèmes structurels (et existentiels… la pauvre… L). E. Pour l’élution on a probablement utilisé de l’éthylène glycol. On effectue ensuite une électrophorèse bidimensionnelle afin de comparer la protéine
HGPRT* mutante chez 5 personnes (notée 1, 2, 3, 4 et 5) et HGPRT-wt (notée WT). On
révèle au bleu de Coomassie.
.Figure 2 : électrophorèse bidimensionnelle des protéines HGPRT-wt (WT) et HGPRT* mutantes (1, 2, 3,
4 et 5)
22
Question 37 : A propos de l'électrophorèse bidimensionnelle, quelle(s) proposition(s) est (sont) exacte(s) ? A. Dans l'électrophorèse bidimensionnelle, on réalise d'abord un SDS-­‐PAGE, puis une isoélectrofocalisation. B. Les mutations semblent toutes différentes, on peut supposer plusieurs mutations différentes dans le gène. C. La protéine WT a une masse moléculaire inferieur a la protéine 1 D. La protéine 3 a un pI supérieur à la protéine de la famille 5 E. La protéine HGPRT* a comme nous l’avons vu des problèmes structurels, la chaperonine GroEL pourrait grâce à ses deux sites et à son effet cage l’aider à prendre une conformation meilleurs. Par séquençage, on montre que l’ARNm épissé d’HGPRT contient 654 nucléotides. On sait
également que parmi les 654 nucléotides, 411 nucléotides codent pour des acides aminés ; les
243 autres nucléotides appartiennent à des régions non traduites.
Question 38 : En utilisant vos connaissances, faites une approximation de la masse
moléculaire de la protéine HGPRT normale.
A. Entre 650 kDa et 660 kDa.
B. Entre 13 kDa et 16 kDa.
C. Entre 8 kDa et 9 kDa.
D. Entre 50 kDa et 70 kDa.
E. Aucune des propositions précédentes n'est exacte.
Afin de mieux connaitre la protéine HGPRT normale, on réalise un SDS-­‐PAGE en conditions non Réductrices (figure 3A) et un autre SDS en condition réductrice : . Figure 3 et 4 : SDS page en condition non réductrice (Figure 3) ou réductrice (Figure 4) de HGPRT. 23
Question 39 : D'après les résultats du SDS-­‐PAGE uniquement, quelle(s) proposition(s) est (sont) exacte(s) ? A. Comme on observe une seule bande sur le SDS-­‐PAGE, la protéine HGPRT normale est forcément un monomère. B. La protéine HGPRT normale pourrait être un hétérotétramère C. L’utilisation d’Urée ou de Guanidinium à la place de SDS aurait donné le même profil de migration. D. Grâce à ce SDS Page, on peut supposer que HGPRT a une masse moléculaire de 60KDa. E. La migration électrophorétique, contrairement au calcule à partir du nombre de paire de base du gène, est la seul technique en Biochimie qui permet d’avoir la valeur exacte de la masse moléculaire d’une protéine. Question 40 : A ce stade de l'exercice, en fonction uniquement des réponses précédentes,
que peut-on supposer à propos de la protéine HGPRT normale ?
A. Il y a une contradiction entre l'approximation faite à la question 4 et les masses
moléculaires trouvées au niveau des figures 3 et 4.
B. L’approximation faite à la question 4 donne une idée de la taille de la protéine HGPRT
sous sa conformation en structure quaternaire.
C. La protéine HGPRT normale pourrait subir une modification post-traductionnelle, ce qui
explique la différence de masse moléculaire.
D. La protéine a pu subir une modification post-traductionnelle d’ubiquitination, ce qui
expliquerait la différence de masse moléculaire observée.
E – Aucune des propositions précédentes n'est exacte.
Question 41 : A propos des deux SDS-­‐PAGE, quelle(s) proposition(s) est (sont) exacte(s) ? A. Les conditions réductrices sont obtenues grâce à un agent dénaturant, le β-­‐
mercaptoéthanol. B. Dans le noyau, une sous-­‐unité de HGPRT doit à peu près faire 20kDa. C. Les sous-­‐unités de la protéine HGPRT sont reliées par des ponts disulfures. D. Les ponts disulfures sont des liaisons faibles entre 2 cystéines. E . Les ponts disulfures sont fait par des protéines Chaperonnes, en effet ces protéines ont un grand rôle structurale, notamment dans la prise de conformation. 24
On regarde maintenant la structure 3D de la sous-­‐unité Question 42 : A propos de la structure de la protéine HGPRT normale, quelle(s) proposition(s) est (sont) exacte(s) ? A. La sous-­‐unité est constituée de 2 domaines. B. Les domaines ont une architecture de type sandwich C. Chaque domaine a une organisation en α/β. D. La sous-­‐unité a une organisation en α+β. E. Petite question de par cœur, parmi les 3 types d’ancrage à la membrane présentés ci dessous, le 2ième est une Myristoylation. On décide maintenant de séquencer une partie de la protéine. On utilise pour cela d’abord du BrCN et de la trypsine afin de cliver le peptide à séquencer en plus petits peptides. On séquence ensuite par la méthode d’Edman les différents peptides obtenues. . Suite à la digestion par le BrCN on obtient les fragments suivants : GGH GLIM DRTERLARDVM KEM . Suite à la digestion par la trypsine on obtient : GLIMDR DVMK TERLAR EMGGH
25
Question 43 : quelle est la séquence de la protéine ? A. GLIMDRTERLARDVMKEMGGH B. DRTERLARDVMGLIMGGHKEM C. GGHDRTERLARDVMGLIMKEM D. GLIMDRDVMKTERLARKEMGGH E. DVMKTERLARGLIMDREMGGH Afin d’étudier les modifications post traductionnelles présentes dans une partie de la protéine, on effectue un séquençage par la méthode de la spectrométrie de masse. La fragmentation des chaînes peptidiques se fait principalement au niveau des liaisons peptidiques selon le schéma ci-­‐dessous : La charge positive retenue côté COOH fournit les fragments de type « y ». L’acide aminé C terminal verra sa masse augmenter de 19. En vous aidant des données figurant dans le tableau B3, il est possible de déterminer la séquence du peptide de rapport m/z : 2408,0000. Figure 6 : Masse approximative en Da des résidus d’acides aminés (56 + R). . De plus on rappelle que : Type de modification post-­‐traductionnelle Masse de la modification (en Da) Méthylation +15 acétylation +43 hydroxylation +17 Phosphorylation +81 . On obtient des peptides ayant les rapports m/z suivants : 1003 548 832 304 761 133 647 76
26
Question 44: Au vu des résultats et des données présentés dans les tableaux, quelle est la ou quelles sont les séquence(s) possible(s) du peptide de rapport m/z 1003 A. Marg-­‐Ala-­‐Asn-­‐Val-­‐ Ptyr – AceLys -­‐ Gly B. Gly – Arg – Ala – Pro -­‐ Val et après il doit y avoir une erreur car aucun aa n’a une masse de 244 Da. C. Marg -­‐ Ala – Hpro -­‐ Val – Ptyr – AceLys -­‐ Gly D. Arg – Ala – Gly – Leu – Tyr – Lys -­‐ Gly E. toutes ces propositions sont fausses : les masses trouvées sont incohérentes avec les données ! NB : -­‐ Marg = arginine Méthylé -­‐ HPro = Hydroxy Proline -­‐ Ptyr = PhosphoTyrosine -­‐ AceLys = Lysine Acétylée le schéma de l’interaction entre HGPRT et 5GP, ligand naturel de HGPRT :
Voici Figure 7 : Schéma de l’interaction entre le 5GP et la protéine HGPRTwt Question 45 : Quelles suppositions théoriques pouvez-­‐vous faire ? A. Le remplacement de la phénylalanine 186 par un tryptophane ne devrait pas trop modifier la fonction de l’enzyme. B. Le remplacement de l’isoleucine 135 par une leucine serait fatal pour HGPRT. C. On peut remplacer la glycine 139 par une proline : de toute façon c’est la partie constante de l’acide aminé qui interagit avec le 5GP. D. Aucuns des Acides Aminés présents dans ce site actif a un pHi supérieur à 8. E. Une modification d’acide aminé au sein du site actif est à priori plus gênante que dans une partie externe de la protéine.
27
II-­‐ PARTIE BIOLOGIE MOLECULAIRE : Etape de Diagnostic. L’analyse structurale de la protéine nous permet de comprendre comment une mutation au niveau de l’ADN pourra avoir un effet néfaste sur son fonctionnement. Il s’agira donc à présent de se lancer dans une approche génétique. Or on sait que le syndrome de Lesch-­‐Nyhan est une maladie génétique poly allélique, c’est à dire que plusieurs mutations sur le même locus du gène codant pour HGPRT peuvent être responsables du phénotype pathologique décrit. Affin d’essayer de brasser un maximum de ces mutations nous étudierons 4 familles présentant des sujets atteints par le LNS. De plus, on sait aussi que cette maladie est une maladie récessive liée à l’X. FAMILLE A : Il y a deux cas du LNS dans la famille A, il s’agit de deux frères. On cherche à savoir quelle est la mutation à l’origine de la maladie. Dans un premier temps, on effectue un western blot et northern blot sur les deux frères, leur mère et un sujet contrôle (non porteur de la mutation). Figure 8 : Western Blot et Northern Blot de HGPRT à partir d’un échantillon de sang chez les sujets de la famille A et chez un sujet contrôle. Question 46 : A partir de ces résultats : A. On peut supposer que la mère est hétérozygote. B. Ces résultats montrent que la mutation a entraîné l’apparition d’un site d’épissage alternatif conduisant à une protéine plus petite. C. Ce Northern blot suggère que la mutation a entraîné l’apparition d’un codon STOP prématuré. D. On peut penser que la mutation est une substitution nucléotidique ponctuelle. E. Le mécanisme à l’origine de l’anomalie génétique supposée peut être la désamination d’une méthylcytosine. 28
Par la suite, on décide de séquencer les gènes des différents protagonistes. On obtient la figure ci-­‐dessous : Figure 9 : Southern blot de séquençage des sujets de la Famille A, et d’un sujet contrôle. Les triangles indiquent où se trouve l’anomalie. Question 47 : A propos des techniques de séquençage : A. Le pyroséquençage utilise des ddNTP, qui sont ajoutés dans un mélange contenant le brin à séquencer, l’ADN polymérase et des dNTP. B. La technique utilisant du pyrophosphate est le pyroséquençage. C. Dans la méthode Sanger on utilise des nucléotides particuliers : lorsqu’ils sont incorporés, la synthèse s’arrête. D. Ici, il s’agit d’une méthode de pyroséquençage. E. Le BET est un intercalant de l’ADN qui permet un marquage globale non spécifique. Question 48 : A partir de ce séquençage, que peut-­‐on dire ? A. La mutation est une substitution de C en G. B. Cette expérience confirme l’hypothèse que la mère est hétérozygote pour l’allèle normal et l’allèle mutant. C. La mutation est une insertion d’un G. D. La mutation fait apparaître un codon STOP prématuré mais la séquence polypeptidique n’est pas modifiée avant celui-­‐ci (acides aminés identiques). E. Les deux enfants étant malades et le syndrome de Lesch-­‐Nylan étant une maladie récessive, le père est porteur de la mutation. 29
FAMILLE B : On s’intéresse à présent à une deuxième famille, qui compte un membre malade. On présente dans la figure 1 l’arbre généalogique de cette famille : Figure 10 : Arbre généalogique famille B. L’individu II6 est malade et l’individu I1 sain On effectue un Southern Blots sur le gène codant HPRT des individus I1, II2, II3, II4, II5, II6, pour étudier la séquence ADN. Figure 11 : Résultats obtenus après Southern Blot du gène codant HPRT Question 49 : Cochez la (les) proposition(s) correcte(s) A. Les résultats du southern blot montrent que la maladie de II6 n’est pas liée à la séquence du gène codant l’enzyme HPRT B. L’intensité plus faible de la bande de l’individu II6 est sûrement due à la maladie C. On peut affirmer que le témoin est une fille D. Ce southern blot montre que les individus I1, II2, II3, II4, II5, II6 ont tous un allèle en commun E. On observe un défaut de transcription de L 'ARNm chez II-­‐6, ce qui explique en partie la présence du LNS chez cet individu. Suite à ces résultats, on décide d’amplifier le gène par PCR et de le soumettre à des enzymes de restrictions. Ils obtiennent alors un profil intéressant concernant la région allant de l’exon 7 à l’exon 8. Cette région particulière de (499 paires de bases) est alors amplifiée seule puis digérée par l’enzyme de restriction Hinf1 qui reconnait la séquence GATTC présente dans l’intron 7 (Figure 12) 30
Figure 12 : Résultats de PCR de la région allant de l’exon 7 à 8 Question 50 : Cochez la (les) proposition(s) correcte(s) A. Les enzymes de restriction sont des endonucléases B. Les résultats de l’individu II6 sont compatibles avec une mutation ponctuelle de type délétion au niveau de la séquence GATTC de l’intron 7 C. Les individus II4 et II5 sont hétérozygotes alors que l’individu II6 est homozygote pour la maladie D. Il est possible que le gène soit délété de l’intron 7 E. Les résultats de cette expérience sont en désaccord avec le southern blot effectué précédemment Grâce à des techniques de séquençage, on arrive par la suite à déterminer précisément la mutation : il s’agit d’une substitution T>A dans l’intron 7. On souhaite déterminer l’impact de cette mutation plus en aval. On étudie donc par RT-­‐PCR l’ARNm transcrit à partir du gène normal et du gène muté (Figure 4) Figure 13 : Résultats RT-­‐PCR de l’ARNm transcrit à partir de l’allèle muté (P) et de l’allèle normal (N) 31
Question 51 : Cochez la (les) proposition(s) correcte(s). A. La RT-­‐PCR est une technique très sensible. B. Pour effectuer une RT-­‐PCR, on utilise une amorce ADN C. La RT-­‐PCR, contrairement à la PCR, n’utilise pas d’ADN polymérase D. Lors d’une PCR, l’élongation du brin néoformé à partir de l’amorce se fait de 3’ en 5’ E. La mutation du gène HPRT ne peut avoir d’effet sur la protéine puisqu’elle se situe dans un intron Question 52 : Cochez la (les) proposition(s) correcte(s) A. La mutation T>A a pu avoir pour effet de retenir l’intron 7 après épissage dans l’ARNm B. On peut supposer que la mutation T>A a pu affecter un site d’épissage C. D’après cette expérience, on peut imaginer que l’exon 8 a été excisé avec les introns 7 et 8 D. La mutation peut entrainer un décalage du cadre de lecture E. Les anomalies observées sur l’ARNm de HGPRT sont le résultat d’une délétion de plusieurs centaines de bases touchant la séquence ADN Il se trouve que la protéine étudiée est une enzyme. On effectue donc maintenant des recherches sur l’enzyme HPRT elle-­‐même. On effectue un Western Blot et un test d’activité sur les protéines produites par 4 membres de la famille. Les résultats sont regroupés dans la figure 5. Western Blot Activité de l’enzyme I1 II2 II4 Témoin II6 50% 100% 50% 0% 100% Figure 14 : Western Blot des protéines prélevées chez les individus I1, II2, II4, II6 (on utilise des anticorps marqués peu spécifiques, reconnaissant aussi bien les formes natives que mutées de HGPRT) Question 53 : Cochez la (les) proposition(s) correcte(s) A. Les résultats montrent qu’une protéine est produite à partir de l’ARNm muté mais que celle-­‐ci n’est pas fonctionnelle B. Il est probable que la mère I1 ait transmis la mutation à son fils. C. L’activité enzymatique de l’individu II4 montre qu’il est malade D. La protéine produite à partir de l’ARNm provenant du gène muté a une taille plus importante que celle provenant du gène non muté, ce qui explique son défaut d’activité E. On peut imaginer que la mutation détectée précédemment sur l’ARN du sujet atteint est masquée par la protéine Hsp90 dans les cellules du sujet. En effet cette protéine est une protéine chaperon et pourrait atténuer l’effet de la mutation en favorisant un meilleur repliement. Question 54 : Cochez la (les) proposition(s) correcte(s) A. L’individu II6 est malade homozygote du fait d’une anomalie d’épissage due à une mutation dans l’intron 7 32
B. Il y a des chances que l’individu II6 rencontre d’autre cas dans sa famille chez les individus à naître. C. L’individu II6 est malade car il ne comporte, dans son génome, qu’une seule copie du gène HPRT, ce qui empêche toute compensation par un 2ème allèle D. Des séquences consensus sont des séquences conservées que l’on retrouve d’un individu à l’autre. E. Aucune de ces réponses sont exactes. FAMILLE C : La mutation dans la famille C entraine un retard dans le développement moteur, une hyperuricémie, une insuffisance rénale... L'enzyme chez cette famille pour les individus atteints a une faible activité de 0.011 nmol/min/mg d'hémoglobine. On admettra que cette activité est faible, et elle sera considérée comme pathologique. Figure 15 : PCR après digestion par l'enzyme de restriction Bfa1 (qui reconnaît la séquence CTAG) du gène codant HGPRT (arbre généalogique de la famille C au dessus). Figure 16 : On obtient deux ARNm différents dut à la mutation (types a dans 70% des cas et
type b dans 30% des cas). Les nucléotides encadrés G et T ont été délétés et les nucléotides
soulignés ACT codent pour un acide aminé (repère).
33
Figure 17 : Mutation dans la famille C (2è ligne) Question 55 : quelle(s) est(sont ) la(les) proposition(s) FAUSSE(S)? A. On peut affirmer que la mère est transmettrice de la maladie, qu'elle est hétérozygote et qu'elle a certainement inactivé le chromosome contenant l'allèle muté vu qu'elle n'est pas malade. B. On a une faible activité enzymatique, les deux ARNm pourraient donc amener à des protéines fonctionnelles partiellement. C. On a une faible activité enzymatique, on peut imaginer qu’un seul des ARNm pourrait aboutir à une protéine fonctionnelle. D. Il y a délétion de 2 nucléotides donc décalage du cadre de lecture au niveau de ces deux ARN, soit à cause de la délétion elle même, soit à cause d’une anomalie d’épissage. E. Si au lieu d’une PCR classique on avait utilisé la méthode de « Tac Man », on aurait put, en plus de voir si il y a mutation ou pas pour un sujet, savoir exactement le nombre de copie du gène HGPRT (muté ou non muté) chez chacun des individus. FAMILLE D : On s’intéresse à une dernière famille, la famille D. Un diagnostique indirecte (diagnostique permettant de savoir qu’il y a une mutation quelque part sans pour autant pouvoir dire laquelle) nous a permit de cibler une partie du gène codant pour HGPRT, nous permettant de soupçonner fortement une mutation au niveau de l’exon 5 où l’ont connaît un « point chaud » pour une mutation qui est classiquement la délétion d’un nucléotide A. Pour confirmer ce diagnostique indirect on mettra en place une expérience utilisant l’enzyme de restriction XcmI. Le problème c’est que tel quel, XcmI n’est pas sensible à la mutation supposée que l’on cherche dans cette famille, en effet elle reconnaît le site : 5’-­‐-­‐-­‐GGTNNNNNN NNNACC -­‐-­‐-­‐ 3’ Avec N = n’importe quel nucléotide (A,T,C ou G) 3’-­‐-­‐-­‐ CCANNNN NNNNNTGG -­‐-­‐-­‐ 5’ XcmI
Or, si on regarde le séquence normale, ce site de retriction n’apparaît nulle part : Délétion supposé au niveau
Et pour le fragment mutant recherché : du point chaud
On retrouve cette fois une séquence proche de la séquence de restriction (soulignée), c’est à dire la séquence : 3’ -­‐-­‐-­‐ TCANNNNNNNNNTGG -­‐-­‐-­‐ 5’ Si on arrivait par une PCR imparfaite à changer le TCA côté 3’ en CCA, on aurait alors pour le mutant une séquence de restriction reconnaissable par XcmI et donc l’enzyme de restriction 34
XcmI serait alors sensible à la mutation ce qui permettrait d’établir le diagnostic une bonne fois pour toute. Pour cela on utilise une des caractéristique de la PCR qui est le fait que l’amorce nécessaire à l’élongation n’a pas obligatoirement à être parfaitement hybridée du côté 5’ de l’amorce pour que la PCR se fasse, si on laisse un seul mésapareillement entre l’amorce d’ADN pour la PCR et le fragment à dupliquer, celle ci se fait quand même et cela permet de changer une base si cela nous intéresse comme c’est le cas ici. C’est ce qu’on appelle la PCR truquée. On choisit pour cela une amorce « HXCM1 » (appelée aussi primer) pour le côté 3’ du fragment, HCB1 constitue une amorce classique côté 5’ permettant à la PCR de se faire : Figure 18A : schéma du mésapariement de l’amorce HXCM1 au fragment présentant la mutation côté 3’. On note bien que ce mésappariement n’empêche pas la PCR de fonctionner ADN : 3’ -­‐-­‐ tatcGTACAAACACAGTAATCACTTT -­‐-­‐-­‐(etc…) -­‐-­‐-­‐ 5’ HXCM1 : 5’ -­‐-­‐ atagCATGTTTGTGcCATTAGTGA -­‐-­‐ 3’ Mésappariement
1
2
3
4
5
Figure 1 8B : Southern Blot d’ADNc, après PCR truquée à l’aide des amorces HXCM1 et HCB1 (marquées par du γATP) puis digestion par Xcm1. La colonne ST sert de témoin de taille. A
35
Figure 1 9 : Altération de l’ADNc. Question 55 : Quel(s) est(sont) la(les) proposition(s) exacte(s) : A. Pour arriver à ce southern Blot, le protocole suivie a put être : traitement de l’ADN avec d’abord l’extraction, puis une première digestion par un pool d’enzymes de restriction pour fragmenter l’ADN et l’avoir sous une forme plus maniable de pleins de petits fragments. On a ensuite ajouté les amorces HXCM1 et HCB1 (marquées au gama ATP) avec une ADN polymérase. Une fois les réaction d’élongation finies on a ajouté XcmI. Pour finir on a procédé aux étapes de séparation des fragments par electrophorèse, fait un transfert sur membrane et traité la membrane pour enfin finir par une étape de révélation par autoradiographie. B. Le southern Blot présente un artéfact, en effet l’enzyme de restriction est sensée couper l’allèle muté en 2 fragments, or la colonne 4 ne présente qu’un seul fragment. L’autre fragment a dut être dégradé par des DNAses traînant dans le labo. C. Dans le contexte de l’expérience, Xcm1 est sensible à la mutation prédite par le diagnostique indirect. D. La mutation mise en évidence par ce southern blot entraîne une petite altération de l’ADN (une base en moins), mais ne doit pas avoir d’impacte majeure sur la protéine au final E. Les tâches de taille 133pb pour les colonnes 3 et 4 correspondent à des pseudogènes. III-­‐ PARTIE BIOLOGIE MOLECULAIRE : Transfection Viral Cet éventail de famille nous a donc permis de cerner un peu plus les différents types d’altérations génétiques sur le gène de HGPRT entraînant un phénotype pathologique. L’idée maintenant est bien sûr de chercher des solutions pour traiter les patients atteints du syndrome de Lesch-­‐Nyhan. En parallèle de l’étude génétique que l’on vient de mener, une étude métabolique a montré, comme le montre le schéma suivant qu’une partie de la maladie s’explique par une accumulation d’Acide Urique à cause de l’inefficacité de HGPRT. Une des première solution proposée a donc été l’utilisation d’allopurinol, permettant de faire baisser la trop forte concentration en acide urique et ainsi de réduire l’impacte de celle ci sur les reins. Cependant malgré cela de fort troubles neurologiques persistent. 36
5’
La deuxième piste de recherche est donc la thérapie génique. L’idée est d’introduire dans leur génome une séquence exogène codant pour une enzyme HGPRT fonctionnelle, « de remplacement ». Pour ce faire, on utilisera des constructions de type « plasmide » dont les séquences sont, en partie, d’origine rétrovirale (rétrovirus : virus dont le génome est porté par un ARN). Ces plasmides portent donc une séquence codant pour une enzyme HGPRT fonctionnelle. Une séquence codant pour une enzyme HGPRT humaine fonctionnelle et des séquences LTR5’ et LTR3’ peut être trouvés dans des banques génomiques. On les y trouve sous forme d’ADNc. Ils sont portés par les plasmides p4aA8 (pour la séquence HGPRT), pMSV-­‐il (pour la séquence LTR5’) et pMLV-­‐1 (pour la séquence LTR3’). On utilisera donc une « combinaison » astucieuse à partir de ces plasmides pour créer les « plasmides finaux » qu’on transfectera dans les cellules Typiquement, un ARN rétroviral code pour trois protéines uniquement, indispensables à son cycle : GAG, POL et ENV. Ces trois protéines sont codées dans cet ordre dans le génome viral. Leurs séquences correspondantes se retrouvaient dans cet ordre sur les plasmides pMSV-­‐il et pMLV-­‐1. La présence simultanée de ces trois protéines est nécessaire pour que de nouveaux virus « bourgeonnent » d’une cellule infectée selon un cycle lytique classique. Cet ARN rétroviral présent dans nos vecteurs de type plasmidique peut donc être représenté ainsi : GAG
POL
ENV
LTR5’
LTR3’
3’
Lors de la fabrication des « plasmides finaux » (qui transfecteront les cellules HGPRT-­‐ ), les séquences virales GAG et POL sont malheureusement entièrement délétées et la séquence ENV est fortement tronquée. Grossièrement, on peut considérer que le gène HGPRT est présent « à leur place », dans les « plasmides finaux ». On s’arrange pour que le cadre de lecture de la séquence HGPRT soit ouvert dans ces plasmides. Il faut noter que la séquence HGPRT utilisée possède une région en 3’ qui porte deux sites potentiels de polyadénylation. Lors de la construction des « plasmides finaux » qui seront utilisés pour la transfection, on fabrique un premier type de plasmide qui possède la séquence HGPRT entière (« plasmide final » pLPAL). Dans d’autres plasmides, on insère une séquence HGPRT « modifiée » pour laquelle, on a délété la région qui possédait ces sites de polyadénylation (« plasmide final » pLPL). Cependant, cette région 3’ n’est pas codante, et est dans le secteur 3’UTR. Au cours des expériences, on sera ammenés à utiliser un milieu de culture appelé « milieu HAT ». Le milieu HAT contient de l’aminoptérine, qui inhibe la synthèse du THF, précurseur des acides nucléiques. On rappelle que les mécanismes de division cellulaires nécessitent la réplication du génome Cependant la présence d’une enzyme HGPRT fonctionnelle permet la synthèse du seul autre précurseur efficace des acides nucléiques : l’IMP. Seule HGPRT peut conduire à la synthèse d’IMP. On utilise des cellules HGPRT-­‐ (n’exprimant pas une enzyme fonctionnelle, car leur séquence HGPRT est mutée). Elles sont nommées LNSV (origine humaine) et 208F (origine rat). On utilise 37
comme témoins des cellules HGPRT+ : WA (cellules de rat), Hela et GM367 (cellules humaines) qui expriment toutes une enzyme HGPRT fonctionnelle. P: pst I R: Rsa I B: Bam HI Hp: Hpa I H: Hind III S: Sal I E: Eco RI [A]n : site de polyadénylation 38
Pour la construction des « plasmides finaux », on donne les abréviations des sites de restrictions
possibles.
Figure 2 0 : Schéma expliquant la fabrication des deux types de plasmides finaux. On transfectera ensuite ces plasmides dans des cellules 208F. 39
Question 56: Concernant ces propositions sur la construction des plasmides qui serviront à la transfection et le résultat de cette transfection, laquelle (lesquelles) est (sont) vraie(s) A. Lors de la construction du plasmide pLPAL, on a utilisé chacune des enzymes de restriction Hind III et Rsa I qu’une seule fois. B. Suite à la transfection des plasmides pLPAL ou pLPL dans les cellules de rat 208F, ces cellules pourraient éventuellement exprimer certaines protéines rétrovirales. C. On peut supposer, a priori, que certaines cellules LNSV peuvent survivre dans le milieu HAT. D. On obtient logiquement des ARNm (codant HGPRT) de tailles variables, suite à la transfection de cellules 208F par des plasmides pLPAL. E. Des cellules 208F, transfectées par des plasmides pLPL, pourraient produire des virus qui porteraient la séquence HGPRT « fonctionnelle » dans leur génome viral (et qui iraient infecter d’autres cellules voisines). On est amenés à utiliser des rétrovirus dit « virus assistants » : Mo-­‐MuLV, FBJ-­‐MuLV et 1504A. Ces trois virus sont capables de se « reproduire » en grande quantité dans les cellules. On rappelle que pour pouvoir se « reproduire », les rétrovirus doivent insérer leur génome viral, sous forme d’ADN (après une rétro transcription) dans le génome de la cellule hôte. Des cellules de rat HGPRT-­‐ (pas du type 208F) sont transfectées par les plasmides pLPL ou pLPAL. On les infecte ensuite par un des trois virus assistants (au choix). Ces cellules sont alors mises en culture. Le milieu de culture est prélevé, vers le 6ième jour post-­‐infection et centrifugé à 5000g (pendant 7 minutes). Le surnageant de cette centrifugation contient alors les virus assistants uniquement. D’ailleurs, lorsque l’on prendra le « milieu de culture » dans les expériences suivantes, il s’agira toujours du surnageant de ce milieu de culture après centrifugation. Des cellules 208F (originales) sont mises au contact du surnageant. On s’aperçoit plus tard que certaines de ces cellules sont résistantes au milieu HAT. On quantifie les colonies de cellules 208F résistantes au milieu HAT (en cfu : colony-­‐forming unit). La quantité virale du milieu de culture est estimée par un test (« XC »). Le résultat est exprimé en pfu (plaque forming unit). Plus le résultat pfu est élevé, plus la charge virale est importante. Le test « XC » n’est pas adapté pour le virus 1504A. On obtient ces résultats : Figure 2 1 : 208F-­‐LPL: cellule 208F infectée par le milieu de culture [de cellules de rat transfectées pLPL puis infectées par un virus assistant] par 208F-­‐LPAL: cellule 208F infectée par le milieu de culture [de cellules de rat transfectées par pLPAL puis infectées par un virus assistant] 40
Seul le virus 1504A est capable d’infecter des cellules humaines. On transfecte des cellules de rat HGPRT-­‐ par pLPL ou pLPAL. On les infecte ensuite par le virus 1504A. On récupère (comme précédemment) le milieu de culture de ces cellules de rat, et on y met des cellules LNSV. On obtient aussi une résistance au milieu HAT pour certaines cellules LNSV. On réalise la même expérience avec des cellules humaines. Or, seul le virus 1504A est capable de les infecter. On transfecte donc des cellules de rat HGPRT-­‐ par pLPL ou pLPAL. On les infecte ensuite par le virus 1504A. On récupère (comme précédemment) le milieu de culture et on y expose les cellules LNSV. On observe, encore une fois, une résistance au milieu HAT pour certaines cellules LNSV. On réalise alors un SDS-­‐page des protéines produites par les cellules LNSV HAT-­‐résistantes et 208F HAT-­‐résistantes. On recherche spécifiquement les enzymes HGPRT (tous types confondus) par western blot. On utilise aussi pour ce SDS-­‐page des cellules Hela, LNSV « non modifiées » et 208F « non modifiées ». Les résultats de ces expériences sont résumés dans la figure 3. 1 2
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4
5
6
7
8
v
v
v
Figure 22 : Western Blot de HGPRT dans : 1-­‐ 208F LPL-­‐INF : cellule 208F infectée par le milieu de culture [de cellules de rat transfectées par pLPL puis infectées par un virus assistant] 2-­‐ -­‐ 208F LPAL-­‐INF : cellule 208F infectée par le milieu de culture [de cellules de rat transfectées par pLPAL puis infectées par un virus assistant] 3-­‐ Hela : cellules Héla non modifiées 4-­‐ 208F : cellules 208F non modifiés 5-­‐ LNVS, p4aA8-­‐TX : cellules LNVS infectées par p4aA8 6-­‐ LNVS, pLPL-­‐TX : cellules LNVS infecté par pLPL 7-­‐ LNVS, LPL-­‐INF : cellules LNVS infectées par le milieu de culture [de cellules de rat transfectées par pLPL puis infectées par un virus assistant] 8-­‐ LNVS : cellules LNVS non modifiées PS : on sous-­‐entend par « infection par le milieu de culture » : infection par des agents infectieux présents a priori dans le milieu de culture. Valable jusqu’à la fin du sujet. 41
8
Question 57 : D’après les résultats obtenus, on peut supposer que : A. Certains virus assistants semblent avoir intégré dans leur génome une séquence codant pour une HGPRT fonctionnelle, initialement portée par les plasmides pLPL et pLPAL. B. En regardant la figure 21, on peut imaginer que l’intégrité des sites de polyadénylation de la région 3’UTR pourrait être bénéfique à la transgénèse. C. La présence d’une enzyme HGPRT dans les cellules infectées est avérée par ce western blot. D. Classsiquement on sélectionne une cellule transfectée par un plasmide en vérifiant d’abord si le plasmide a put rentrer dans la cellule grâce à un antibiotique comme l’ampicilline, puis en faisant le test blanc/bleu grâce au gène LacZ : les colonie devenant bleu sont les colonies ayant correctement incorporé le vecteur. E. Pour les cellules LNSV, les résultats seraient forcément différents si on les infectait par des virus Mo-­‐MuLV possédant la séquence HGPRT « fonctionnelle » dans leur génome. On analyse à présent les ARNm produits par les cellules transfectées par les plasmides pLPL ou pLPAL, et ceux produits par les cellules qui ont été infectées par des virus capables de réaliser la transgénèse (introduction de gènes dans un organisme) de la séquence HGPRT « fonctionnelle ». On rappelle pour une seconde fois que tous les virus utilisés jusqu’à là sont des rétrovirus. Leur génome (ARN) s’insère sous forme d’ADN dans le génome cellulaire. Les cellules transcrivent alors cet ADN viral sous forme d’ARNm. Attention ! La séquence de l’ADN viral « intégrée au génome cellulaire » est identique à celle de l’ARN viral, et elle s’insère dans le « bon sens ». On utilise deux sondes : une sonde ciblant les séquences LTR et un autre sonde ciblant la séquence HGPRT « fonctionnelle ». On hybride ces sondes sur un Northern blot (obtenu à partir de l’ensemble des transcrits produits par les différentes cellules). On obtient la figure 23 : 2
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5
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7
1
Figure 23 : Northern Blot de cellules infectée ou transfectées par les différents vecteurs précédamment obtenue -­‐ 208F : cellules 208F non modifiés -­‐ LPAL-­‐TX : cellules 208F transfectées par la construction de type plasmidique pLPAL 42
-­‐ LPAL – INF : cellule 208F infectée par le milieu de culture [de cellules de rat transfectées par pLPAL puis infectées par un virus assistant] -­‐ LPAL/FBH-­‐INF : cellule 208F infectée à la fois par des virus assistants « natifs » FBJ-­‐MuLV, et par le milieu de culture [de cellules de rat transfectées par pLPAL puis infectées par un virus assistant] Question 58 concernant les ARNm produits par les cellules infectées (par les virus) ou transfectées (par les plasmides), on peut dire que : A. Des sites différents de polyadénylation sont utilisés lors de la transcription, pour les cellules 208F LPAL-­‐INF. B. Les cellules 208F LPAL /FBJ-­‐INF produiront a priori des protéines HGPRT de même taille. C. Les cellules 208F originales ne possèdent visiblement pas de gène HGPRT. D. Pour les cellules 208F LPAL/FBJ-­‐INF, certaines des sondes LTR semblent se lier sur des séquences LTR d’origine non-­‐virale. E. Nos constructions on été obtenue à partir de banques de cADN, si on avait voulu vérifier la représentativité de ces banques, on aurai évaluer la taille minimum (c’est à dire le nombre de clone qu’elles contiennent) qu’elles auraient dut avoir notamment en fonction de la taille de l’insert accepté par le vecteur : plus cette taille est grande, plus la taille de la banque aurait été grande. Les régions LTR possèdent toutes un unique site de restriction pour Sst I. Il n’existe pas d’autre site de restriction Sst I dans les plasmides pLPL, pLPAL (on a donc 2 sites de restrictions dans ces plasmides : un pour le LTR3’, un autre pour le LTR5’). On rappelle que le plasmide p4aA8 ne contient pas de matériel d’origine rétrovirale ; p4aA8 n’a aucun site de restriction pour Sst I. On considère que l’information portée par un plasmide ne peut pas s’intégrer dans le génome cellulaire de manière autonome (ce qui est différent pour les rétrovirus, 3ième rappel). Pour la séquence du plasmide pLPL, il y a environ 4kpb entre les deux LTR (de part et d’autre de la séquence HGPRT). On réalise un southern blot sur de l’ADN cellulaire de cellules LNSV originale, transfectées ou infectées. Avant la mise sur électrophorèse pour migration, ces séquences seront digérées par SstI. On cible les séquences HGPRT (la spécificité n’est pas absolue car on se place en condition de faible stringence) avec des sondes. On considèrera que les cellules LNSV sont de caryotype 46, XX. On obtient la figure 24 : Figure 24 -­‐ LNSV : cellule témoin -­‐ p4aA8-­‐TX : cellule LNSV transfectée par p4aA8 -­‐ pLPL-­‐TX : cellule LNSV transfectée par pLPL -­‐ LPL-­‐INF : cellule LNSV infectée par le milieu de culture [de cellules de rats transfectées par pLPL puis infectées par le virus assistant 1504A]. 43
La révélation de ce southern blot est otenue grâce à une sonde d’oligonucléotide marquée par random priming Question 59 : D’après les résultats de cette expérience, on peut dire que : A. Les deux bandes présentes dans la colonne LNSV sont aberrantes car les cellules LNSV sont HGPRT-­‐ et ne devraient donc pas avoir de séquence d’ADN HGPRT dans leurs génomes. B. Le génome de la cellule p4aA8-­‐TX possède au moins 3 copies du gène HGPRT. C. Le génome de la cellule LPL-­‐INF possède au moins 3 copies du gène HGPRT. D. Les génomes des cellules pLPL-­‐TX et LPL-­‐INF possèdent tous deux la séquence HGPRT correspondante à la bande de 4kbp. E. La séquence du plasmide pLPL comprise entre LTR5’ et LTR3’ semble, a priori, se retrouver inchangée dans le génome des cellules LPL-­‐INF. Ceci est de bonne augure dans l’optique d’une thérapie génique chez des patients atteints du LNS. demain J. 44
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Ce sujet a été réalisé par : Pour la partie Chimie : Lucile DANARD (PCEM2), Maxime DANJEAN (PCEP2), Camille GORIN (PCEM2), Sophie LANDRÉ (PCEM2), Thomas SAMOYEAU (PCEM2) Pour la partie Biochimie: Pour la partie Biochimie : Yves KAM (PCEM2), Pierre LOAP (PCEM2), Amélie CAMBRIEL (PCEM2), Bénédicte LE CLEC’H (PCEM2), Sophie VERGELY (PCEM2), Tatiana BERNARDINI (PCEM2), Satchel COHEN (PCEM2), Mathieu GAÏOTTI-­‐GRAS Un grand merci aux équipes enseignantes pour la relecture du sujet particulièrement à Nathalie Eilstein et Karine Le Brach pour le sujet de Chimie Et aux Professeurs Hainque et Beldjord pour leurs relectures, leurs modifications et leurs conseils pour la partie de Biochimie. Merci aux PAES testeurs : Ines et Benjamin Sous la coordination d’Amaël Ouassou et Costa Salachas Nous sommes à votre disposition pour répondre à toutes vos questions sur les forums à l'adresse suivante: www.ampcfusion.com, rubrique Tutorat / UE1 Le rendu de votre grille est obligatoire. Un corrigé vous sera distribué en échange de votre grille. Encore une fois, il s'agit d'un concours : n'attachez donc d'importance qu'au classement final ! Votre classement est disponible sur le site www.c2p1.fr Le tutorat est une initiative du C2P1. 46