Métabolomiques et voies enzymatiques dans les maladies

BCM 6225 – ENZYMOLOGIE MOLÉCULAIRE &
MÉCANISTIQUE
Cours du 18 novembre 2016
Métabolomiques et voies enzymatiques dans
les maladies: Analyses de flux métaboliques
Christine Des Rosiers
Professeur titulaire
Départment of nutrition, Université de Montréal,
et Directrice, Plateforme métabolomique,
Centre de recherche,
Institut de cardiologie de Montréal
1
Références générales
1) Wolfe RR (1992) Radioactive and stable isotope tracers in medicine. Wiley-Liss, New York.
2) Brunengraber H, Kelleher JK, Des Rosiers C (1997) Applications of mass isotopomer analysis to
nutrition research. Ann. Rev. Nutr. 17: 559-596.
3) Ruiz M, Gélinas R, Vaillant F, Lauzier B, Des Rosiers C (2015) Metabolic tracing using stable
isotope-labeled substrates and mass spectrometry in the perfused mouse heart. In: Christian M.
Metallo, editor, Methods in Enzymology, Vol 561, Burlington: Academic Press, pp. 107-147. **
4) Bueschner, JM, et al. (2015) A roadmap for interpreting 13C-metabolite labeling patterns from
cells. Curr. Opinion in Biotechnology 34: 189-201, 2015.
5) Hellerstein MK (2003) In vivo measurements of fluxes through metabolic pathways. The missing
links in functional genomics and pharmaceutical research. Annu. Rev. Nutri. 23: 379-472.
6) Dufner D, Previs SF (2003) Measuring in vivo metabolism using heavy water. Curr Opi Clin Nutr
Metabol Care 6: 511-517.
7) Hiller K & Metallo CM (2013) Profiling metabolic networks to study cancer metabolism. Curr.
Opinion in Biotechnology 24: 60-68.
8) Metallo CM & Vander Heiden MG (2013) Understanding metabolic regulation and its influence on
cell physiology. Molecular Cell 49: 388-398.
N.B. Des références spécifiques sont aussi citées tout au long de cette présentation.
** Ce livre récent dont le titre est “Metabolic analysis using stable isotopes” comporte 10 chapitres
décrivant diverses méthodes d’intérêt pour l’analyse de flux métaboliques.
2
OBJECTIFS
- Aperçu général des notions de base et principes sousjacent à l’analyse de flux métaboliques (“metabolic flux
analysis = MFA”)
(i)
Comprendre les avantages, défis et limites;
(ii) Analyser de façon critique la littérature;
(iii) Pouvoir envisager l’application cette approche dans un
contexte de recherche.
Qu’est-ce qu’une analyse de flux métabolique?
Pourquoi ? Comment ?
3
PLAN DU COURS
1. Introduction
2. Les isotopes: notions de base
• 2.1 Isotopes stables versus radioactifs
• 2.2 Les isotopes stables et l’analyse d’isotopomères
3. L’analyse de flux métaboliques: Applications
• 3.1 Considérations générales
• 3.2 Exemples: Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
• 3.3 Exemples: La recherche du traceur idéal
4. Conclusion & discussion
4
1. INTRODUCTION - INVESTIGATIONS
MÉTABOLIQUES: Concepts, défis et intérêts.
Glycogénolyse
Néoglucogenèse
Alimentation
Néoglucogenèse
Rein
Glucose sanguin
Foie
Glycolyse
Néoglycogenèse
Glycolyse
Autres tissus (coeur,
cerveau, pancréas…)
Glycolyse
Glycolyse
Glycogenèse
Glycogénolyse
Muscles
5
1. INTRODUCTION – La recherche d’hier à aujourd’hui
L’approche
réductionniste
L’approche intégrée:
les sciences omiques
ADN
Génotype
(40,000 gènes)
Transcriptomique
ARN
(150,000 transcripts)
Protéomique
Protéines
Métabolites
Génomique
(106 protéines)
Phénotype
Métabolomique
(2500 métabolites)
6
1. INTRODUCTION – Les sciences omiques
Pharmacogénomique/Nutrigénomique
Étude de l’interaction gènes  médicaments/nutriments:
vers une médecine/nutrition personnalisée
Gènes
ADN
ARN
Protéines
(métabolisme)
Métabolites
Nutriments
Maladies chroniques
Diabète
Athérosclérose
Maladies cardiovaculaires
Cancer
7
1. INTRODUCTION – Génotype versus phénotype
Relation complexe entre le génotype et le phénotype
• 30,000 gènes codent 105 - 106 protéines
• Résultats d’expériences de génie génétique:
bactéries, souris trangéniques ou “knock-out”
incapacité de prédire le phénotype
• Maladies génétiques du métabolisme:
un même déficit enzymatique = plusieurs phénotypes cliniques
• Analyses génétiques de maladies polygéniques:
recherche infructueuse de gènes de susceptibilité
Le “phénotype (métabolique)” est une propriété
“émergeante” qui ne peut être prédite sur la base de
ses composantes “statiques”.
8
1. INTRODUCTION – Génotype versus phénotype
Les niveaux de régulations de la fonction cellulaire:
Relation complexe entre le génotype et le phénotype
La “dynamique du métabolisme”
Phénotype
FLUX
Environnement
Substrats
marqués
métabolome
protéome
transcriptome
Génotype
Adapted from Kelleher (2004) Metabol Eng. 6: 1-5
9
1. INTRODUCTION – Génotype versus phénotype
Le métabolisme est “dynamique” et non pas statique
http://blingee.com/blingee/view/74007301-patinage-artistique
10
1. INTRODUCTION – La dynamique du métabolisme
“Concentrations des métabolites” vs “flux métabolique”
” The difference between
metabolite concentrations and
fluxes is roughly equivalent to the
relationship between the number
of cars on a street versus their
traffic pattern. ”
(Zamboni & Sauer, 2009)
… “ In analogy to traffic, knowing
the number of parked cars at a
given location (=metabolite pools)
is not necessarily informative of
traffic speeds on the road (=
conversion rate or flux rate)”
(Hiller & Metallo, 2013)
11
1. INTRODUCTION – La dynamique du métabolisme
L’analyse de flux métaboliques
•
L’analyse de flux métaboliques:
- nous apporte de l’information sur le métabolisme qui n’est pas
disponible par les analyses statiques des niveaux d’ARN
(transcriptomique), protéines (protéomique) ou métabolites
(métabolomique);
- augmente le potentiel de découverte de la métabolomique.
•
Exemples d’applications (N.B. par une approche de type ciblé):
- Études mécanistiques
- Découverte de biomarqueurs ou voies métaboliques qui peuvent
représenter une nouvelle cible ou stratégie thérapeutique.
12
1. INTRODUCTION – La dynamique du métabolisme
De l’analyse de flux métaboliques vers la fluxomique
(“fluxomics” ou “dynamic metabolomics”)
# Publications (Pubmed):
“Metabolic flux analysis”:
“Metabolic flux analysis” & “Carbon 13”:
“Fluxomics”:
“Metabolomics”:
“Genomics”:
Total (% 5 ans)
3,824 (45%)
428 (53%)
90 (64%)
14,140 (72%)
161,576 (49%)
13
2. ISOTOPES: NOTIONS DE BASE
Analyses de flux métaboliques
Étape 1
Utilisation de substrats marqués
dans des modèles d’étude ex vivo
(cellules ou organes isolés) ou in vivo
Étape 2
Analyses: Données brutes
Étape 3
Interprétation des données:
Équations/modélisation mathématique
14
2. ISOTOPES: NOTIONS DE BASE
2.1 Isotopes: radioactifs versus stables
C
• Atome:
masse atomique (# protons + neutrons)
numéro atomique (# protons)
• Isotopes:
différentes formes d’un élément; # neutrons différent
• Isotopes
inconvénients: instables, émettent des rayonnements , , 
avantages: sensibilité d’analyse; peu d’interférences
radioactifs:
12
6
• Isotopes stables: naturels, n’émettent pas de rayonnements
avantages: sécuritaire, plus d’information métabolique
inconvénients: effets isotopiques, abondance naturelle,
sensibilité d’analyse, coût
Atome
1H
12C
14N
16O
Isotope stable
2H (0.02%)
13C (1.1%)
15N (0.37%)
18O (0.04%)
Isotope radioactif
3H ()
14C ()
13N*
11O*
*: émetteurs de positrons
15
2. ISOTOPES: NOTIONS DE BASE
Radioisotopes (14C/3H)
Isotopes stables
(13C/2H) CG- ou LC-SM
Développement et validation de modèles d’études
Identification de processus métaboliques altérés par la maladie
Utilité clinique
Investigations métaboliques in vivo (foie, cœur, cerveau)
Tomographie par émission de
positrons (11C/18F)
Isotopes stables
(13C/2H) RMN
16
Isotopes radioactifs vs. stables: Terminologie
• Isotope radioactif
Activité spécifique
• Isotope stable (ex.
dpm
mole
=
13C-lactate)
% Enrichissement molaire =
(MPE : Molar Percent Enrichment)
Rapport traceur/tracé =
(Tracer Tracee Ratio; TTR)
% Enrichissement isotopique =
(APE =Atom Percent Enrichment
or Atom Percent Excess)
mole 13C-lactate
mole 13C-lactate + mole 12C-lactate
mole 13C-lactate
mole 12C-lactate
nombre d’ atomes 13C
nombre d’ atomes [12C + 13C]
17
2.2 Les isotopes stables et l’analyse d’isotopomères
ISOTOPOMÈRES DE MASSE ET DE POSITION
12C
13C
MASSE
M
PYRUVATE
1 2 3
M + 1 (M1)
M + 2 (M2)
M + 3 (M3)
Pour un composé avec n atomes
Nombre d’isotopomères de masse (isotopologues): n + 1
Nombre total d’isotopomères: 2n
18
2.2 L’analyse d’isotopomères: SM versus NMR
Avantages, limites, et complémentarité
(CG)SM
Isotopomères
de masse
Molécules
marquées (13C) et
non-marquées (12C)
nmol (IE)
pmol (IC)
RMN
Information
métabolique
Isotopomères
de position
Molécules
marquées (13C)
seulement
Sensibilité
Préparation
d’échantillons
mol
19
2.2 L’analyse d’isotopomères: SM versus RMN
Glutamate
2-Cétoglutarate
GC Ion
Chromatograms
Signal Abundance (x 10-4)
5
4
3
2
1
0
5
4
3
2
1
0
5
4
3
2
1
0
5
4
3
2
1
0
5
4
3
2
1
0
5
4
3
2
1
0
Mass
Ion 446
M0
M1
D12
C1
(553989)
Ion 447
(609190)
M2
S
D12
175.4 ppm
176.0
(958083)
D S
T
Ion 449
(1122216)
28.4
M4
(1001364)
C4 Q
Q Q
35.0
Ion 451
M5
15.7 15.8 15.9 16.0 16.1 16.2
Time (min)
(797927)
Area
(%)
26
74
11
14
32
43
16
53
31
27.8 ppm
D45
Ion 450
S
D23
D21
Q
56.4
ppm
S
T D
D
T
T
D23 D23
D21
D21
S
Q Q
C2 Q
Q
C3
M3
D12
S
55.2
Ion 448
Labeling
1 2 3 4 5
NMR Spectra
Area
D54
S
C5
182.6
S
D45
Q
D43
Q
34.2 ppm
D45
D54
S
D54
0
48
0
52
6
94
182.0 ppm
Des Rosiers C et al. Metabolic Eng., 6, 44-58, 2004.
20
3. L’ANALYSE DE FLUX MÉTABOLIQUES
3.1 Considérations générales
Étape 1:
Devis expérimental
Étape 2:
Analyses par SM
Étape 3:
Interprétation des données
Utilisation de substrats marqués
dans des modèles d’étude ex vivo
(cellules ou organes isolés) ou in vivo
Données brutes:
enrichissement molaire (EM)
• Équations basées sur les EM
• Modélisation mathématique
Importance
de la précision des mesures d’EM: 0.5-1 mol%;
risque de propagation d’erreurs (Macek et al. Anal. Chem. 2007)
21
3.1 L’analyse de flux métaboliques: Considérations générales
• État stationnaire
MPE du produit
13C-Pyruvate
MPE=100%
Pyruvate
Marquage
Exemple: Administration d’un traceur
Temps
• Relation « précurseur – produit »
Contribution relative d’un précuseur à la formation d’un produit :
Fraction molaire du produit
Fraction molaire du précurseur
N.B.: MPE (ou PEM)/100 = Fraction molaire
22
3.2 L’analyse de flux métaboliques - Exemples
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
3.2 L’analyse de flux métaboliques - Exemples
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
Energy production:
Oxidative phosphorylation
NADH
Transport of energy to
and consumption by the
engine: ATP transfer and
utilization
ATP
PCr:ATP <1.6
↑ mortality
Fuel from food:
substrate utilization
24
3.2 L’analyse de flux métaboliques - Exemples
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
GLUCIDES
Glucotoxicité
Lipotoxicité
 Performance
Glucose Pyruvate
Lactate
ATP
Acides gras
Remodelage:
Hypertrophie

Insuffisance
cardiaque
Corps cétoniques
LIPIDES
MORBIDITÉ
MORTALITÉ
25
3.2 L’analyse de flux métaboliques - Exemples
*Glucose
Autres
voies
*Pyruvate
*Lactate
Triglycérides
Glycolyse
Pyruvate
*Acides gras
β-oxydation
peroxysomiale
Lactate
CPT-I
Carboxylation
*Acides
aminés
Décarboxylation
β-oxydation
Acétyl-CoA
Oxaloacétate
Mitochondrie
Citrate
Cycle de
Krebs
*Corps
cétoniques
Isocitrate
déshydrogénase (NADP)
Isocitrate + NADP+
2-cétoglutarate + NADPH
Cytosol
* Glutamate (Glutamine)
26
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
Modèle d’étude:
Phénotypage fonctionnel et métabolique du cœur:
Perfusion ex vivo de cœurs de rats et souris au travail
avec des substrats marqués au carbone 13 (isotopes
stables) et analyses par chromatographie gazeuse
couplée à la spectrométrie de masse.
27
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
Phénotypage fonctionnel et métabolique du cœur:
Modèle d’étude: Le cœur perfusé ex vivo
275 g RAT: 1.8 ± 0.1 g coeur
30 g SOURIS: 0.23 ± 0.01 g coeur
28
Modèle d’étude: Le coeur travaillant perfusé ex vivo
en mode semi-recirculant
Pré-charge: 12.5mmHg
Post-charge: 50mmHg
Débitmètre
Chambre de
compliance
Paramètres
physiologiques
Débit cardiaque
Rythme cardiaque
Pressions systolique et
diastolique
Contractilité (dP/dtmax)
Consommation d’oxygène
Intégrité membranaire
Oxygénateur
Transducteur
de pression
Consommation d’O2
Débitmètre
Filtre
Transducteur
de pression
Pompe
Influent
Effluent
Trop plein
29
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
Phénotypage métabolique et fonctionnelle du coeur
1. Cœur travaillant de souris ou rat perfusé ex vivo
2. Substrats marqués au carbone 13
*Glucose 11mM
*Lactate 1.5mM
*Pyruvate 0.2mM
*Oléate-Albumine
Insuline 0.8nM
Epinéphrine 5nM
Carnitine 50µM
0.4mM
Analyse par GCMS (mode SIM) des intermédiaires du cycle de
Krebs et métabolites associés et de leur enrichissement en 13C
Comte B, et al., Des Rosiers C (1997) J. Biol. Chem. 272: 26117 & 26125
Vincent G et al., Des Rosiers C (2003) Mol Cell Biochem 242: 89
Khairallah M et al., Des Rosiers C (2004) Am. J. Physiol. 286: H1461; Ruiz et al. Methods Enzymol. 2015)
30
FLUX - Métabolisme du palmitate: β-oxydation mitochondriale
Palmitate endogène
[U-13C16]palmitate
13C
12C
Β-oxydation
26 = 64 isotopomères
Acétyl-CoA (Ac-CoA)
M
OAA
Malate
M2 M2 M2 M4 M4
CS
Citrate
CO2
Isocitrate
α-Cétoglutarate
CO2
Fumarate
Succinate
Comte & al. JBC 272; 26126 (1997); Ruiz & al. Methods in Enzymol. (2015)
4
5
3
6
2
1
Portion acétyle:
C4+5
Portion OAA:
C1+2+3+6
Contribution du palmitate à
la formation d’Ac-CoA (AC)
pour la synthèse du citrate
(CIT): PAL/CS
FCPAL AC(CIT)=
M2 AC(CIT)/M16 PAL
31
Flux - Métabolisme du pyruvate: Décarboxylation vs. carboxylation
Glucose
Pyruvate
Carboxylation:
Anaplérose
ME
PC
PDC
13C
Lactate
12C
Décarboxylation: Oxydation
4
5
3
6
2
1
26 = 64 isotopomères
Acétyl-CoA
M
OAA
Malate
M2
M3
M5
CS
Citrate
CO2
Isocitrate
α-Cétoglutarate
CO2
Fumarate
Succinate
Comte & al. JBC 272; 26126 (1997); Ruiz & al. Methods in Enzymol. (2015).
Portion acétyle:
C4+5
Portion OAA:
C1+2+3+6
Contribution du pyruvate à
la formation d’Ac-CoA (AC)
pour la synthèse du citrate
(CIT): PDC/CS
FCPYRi AC(CIT)=
M2 AC(CIT)/M3 PYRi
32
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
Importance des mesures de flux métaboliques - 2 exemples
2 modèles de souris de cardiomyopathie:
(Ex. 1) Déficit d’une enzyme de la β-oxydation et (Ex. 2) diabète
Études impliquant des mesures de:
- Flux métabolique relié à la β-oxydation du palmitate mesuré
dans le coeur travaillant perfusé ex vivo;
- Mesures statiques: Niveaux de (A) métabolites considérés
comme un reflet de l’activité de la β-oxydation et/ou
(B) d’ARN de gènes codant pour des enzymes impliquées dans
cette voie métabolique
33
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
Les acylcarnitines: Un reflet de l’activité de la β-oxydation
Cytosol
LC fatty acids + CoA
LC-acyl-CoA
CPT-I
VLCAD
LCAD
MCAD
-Oxidation
Carnitine
CAT
CPT-II
X
LC-acylcarnitine
LC-acyl-CoA
MC-acyl-CoA
SC-acyl-CoA
Acetyl-CoA
Krebs Cycle
(Energy)
MC-acylcarnitine
SC-acylcarnitine
Acetylcarnitine
Mitochondria
[Abbreviations: LC: Long chain; MC: Medium chain; SC: Short chain]
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
Les acylcarnitines: Marqueurs ou acteurs ?
LC fatty acids + CoA
Cytosol
Arrhythmias
(hERG channel;
calcium handling)
LC-acyl-CoA
CPT-I
-Oxidation
Carnitine
CAT
CPT-II
LC-acylcarnitine
LC-acyl-CoA
MC-acyl-CoA
SC-acyl-CoA
Acetyl-CoA
Krebs Cycle
(Energy)
TLR/NF-κB
Insulin resistance
MC-acylcarnitine
SC-acylcarnitine
Acetylcarnitine
Mitochondria
1999: Bonnet et al; 2004: He et al.; 2005: Sabatine et al.; 2008: Koves et al, Maures et al.; 2009: Adams et al,
Newgard et al, Turer et al.; 2010: Shah et al, Fiehn et al, Mihalik et al.; 2011: Wang et al.; Griffith et al.; 2012:
Shah et al.; Rhee & Gerstzen; Ferrer et al. ; 2103: Turer et al.; 2015: Roussel et al.
[Abbreviations: LC: Long chain; MC: Medium chain; SC: Short chain]
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
Modèle d’étude
Souris invalidée pour une enzyme
de la β-oxydation des acides gras
(AG) à très longue chaîne (VLCAD)
Activité (%)
Importance des mesures de flux métaboliques. Exemple 1
VLCAD
Longueur de la chaîne de carbone
(Adaptée de : Wanders et al. J Inher Metab Dis . 1999)))
36
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
Déficit en VLCAD – Mise en contexte
• Désordre de l’oxydation des AG à chaine longue le plus commun chez l’humain.
Incidence de 1/50 000 à 1/120 000 (Liebig et al. 2006)
• Transmission autosomique récessive
• Chromosome 17p; 58 mutations: 55 patients;
hétérogénéité moléculaire (Gobin-Limballe et al. 2007)
• Pas de relation génotype-phénotype
•
Symptômes cliniques incluent:
mort subite
très
grande
cardiomyopathies, troubles du rythme et
Thérapie actuelle inefficace pour le contrôle ou la prévention
des différents symptômes.
Saudubray et al., J Inherit Metab Dis 1999 & Inborn Metabolic Diseases 2012; Labarthe et al. Cardiovasc Drug Ther 2008; Spiekerkoetter
J Inherit Metab Dis 2010; Houten & Wanders J Inherit Metab Dis 2010; Brunengraber & Roe J Inher Metab Dis 2006
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
Déficit en VLCAD – Mise en contexte
Impact et traitement: les hypothèses
LC-Acylcarnitines
(↑C14:1; C16; C18…)
LC-Acyl-CoA
AGCL
CPT-I
CPT-II
Troubles du
rythme
LC-Acylcarnitines
LC-Acyl-CoA (toxicité)
VLCAD
LCAD
MCAD
SCAD
Faiblesses
musculaires
TRANS
AGCMs C8 C7
• Restreindre
l’apport en AGCL
• Supplémentation
en carnitine
• Diète enrichie en
glucides
MC-Acyl-CoA
SC-Acyl-CoA
Acétyl-CoA
Cycle de Krebs
(Énergie)
Mitochondrie
• Éviter le jeûne
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
Déficit en VLCAD – Modèle de souris
• Phénotype métabolique et cardiaque similaire (bien que moins sévère) à l’humain:
 Acylcarnitines plasmatiques, hypertrophie et troubles du rythme
LC-Acylcarnitines (↑~2x : C14:1; C16; C18…)*
AGCL
Marqueurs classiques d’un déficit de VLCAD
LC-Acyl-CoA
CPT-I
TRANS
CPT-II
LC-Acyl-Carnitine
Mitochondrie
LC-Acyl-CoA (toxicité)
VLCAD
LCAD
MCAD
SCAD
MC-Acyl-CoA
SC-Acyl-CoA
Acétyl-CoA
Cycle de Krebs (Énergie)
*Spiekerkoetter et al. (2004)
Gélinas et al. (2011)
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
Déficit en VLCAD – Modèle de souris
VLCAD-/-
VLCAD+/+
Basal
Exercice
8h au froid
40
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
Déficit en VLCAD chez la souris
Mesures de flux métaboliques  des résultats inattendus ...
AGCL: 13C-Palmitate (16C)
13C
12C
Fonction: Contractilité
LC-Acyl-CoA
CPT-I
TRANS
CPT-II
LC-Acyl-CoA
VLCAD
Métabolisme: Palmitate → acétyl-CoA
##
Autres
sources
(Glucides)
Acétyl-CoA
(citrate)
Cycle de Krebs
(Énergie)
Palmitate
(mM)
Basal
0.4
Basal Stress
1.0
Jeûne
Basal
0.4
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomypathies
Déficit en VLCAD chez la souris
Des résultats inattendus ... suggèrent la présence d’un mécanisme
compensatoire: Le rôle de LCAD
Hypertrophie cardiaque
VLCAD
Longueur de la chaîne de carbone
Poids du coeurt / poids total
Activité (%)
LCAD
LCAD-/VLCAD-/WT
Cox et al., 2009
(Adaptée de : Wanders et al. J Inher Metab Dis, 1999)))
• Le phénotype est plus sévère chez la souris LCAD-/- vs. VLCAD -/-.
• Le rôle de la LCAD semble plus important chez la souris que chez l’humain
(Aoyama et al 1993; Vianey-Saban et al. 1998; Chegary et al. 2009; Houten et al. ).
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomypathies
Importance des mesures de flux métaboliques. Exemple 1
Déficit en VLCAD chez la souris – Conclusion et perspectives
 Les résultats obtenus par les analyses de flux métaboliques dans le
cœur de souris VLCAD-/- ont mis en évidence un mécanisme
compensatoire sur la souris pour oxyder les acides gras à chaîne
longue.
 Les résultats obtenus soulèvent aussi la question quant à l’existence
de perturbations métaboliques non identifiées à ce jour, attribuées à
l’absence de VLCAD et qui expliqueraient le phénotype des souris
VLCAD-/-.
 Des analyses additionnelles (résultats publiés; et en cours) visent à
préciser le rôle métabolique de VLCAD en utilisant des approches
métabolomiques pour caractériser les perturbations métaboliques.
43
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
Importance des mesures de flux métaboliques. Exemple 2
Signalisation par la voie MK2 et cardiomyopathie diabétique
44
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
MK2 et diabète - Mise en contexte
Type 2 diabetes – A metabolic disorder
Pancreas (β cells)
MOST CURRENT
DRUG THERAPIES
 Insulin production
 Glucose production
Chronic
Hyperglycemia
Liver
MICROVASCULAR &
MACROVASCULAR
COMPLICATIONS
Adipose tissues
Insulin resistance
Skeletal muscle
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
Type 2 diabetes – Glucose and/or lipids?
Pancreas (β cells)
 Circulating fatty
acids
Adipose tissues
 Lipolysis
Insulin resistance
 Glucose production
Chronic
Hyperglycemia
Liver
DIABETIC
CARDIOMYOPATHY
Skeletal muscle
 Insulin production
Additional players: Inflammation, oxidative stress, etc.
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
Why target MK2 in diabetes?
p38 MAPK
Inhibitors
Benefits in animal
models of diabetes:
- Hepatic insulin
resistance
- Cardiomyopathy
BUT
- Not approved for
medical use due to
side effects
Wang et al. (2016) Int. J. Mol. Sci. 17: 1037.
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
Hypothesis: MK2 inactivation
cardiomyopathy (DCM).
will
be
beneficial
in
diabetic
Goal: To document the role of MK2 on diabetes-induced metabolic
alterations and cardiac dysfunction using a pan MK2 null mouse model
5 week-old on standard diet:
Control (vehicle) or diabetic (induced by STZ injection)
(4 groups; n=6-8/gr.)
MK2+/+
MK2-/Various measurements
In vivo cardiac function (Millar catheter)
Plasma: Insulin, glucose & metabolites
Tissue mRNA, proteins & metabolites
Ex vivo working heart perfused
with 13C-labeled substrates:
Glucose and palmitate oxidation
Statistics: 2-Way Anova and Bonferroni selected comparison tests (p<0.05)
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
5 week-old on standard diet:
Control (vehicle) or diabetic (induced by STZ injection)
(4 groups; n=6-8/gr.)
MK2+/+
MK2-/-
Summary of salient findings
Impact of diabetes
Systemic:
Cardiac:
Controls
MK2 deletion
Insulin resistance
Hyperglycemia
Hyperlipidemia
Sustained (small improvement)
Sustained (slightly improved)
Abrogated
Contractile (diastolic)
dysfunction
Fatty acid metabolic alterations
Abrogated
Abrogated
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
MK2 deletion abrogates diabetes-induced systemic lipid perturbations,
including an increased in circulating acylcarnitines
Acylcarnitines (ACs)
FFA
ACs<14 C: NS
between groups
*MK2+/+ Veh.
vs. STZ;
$MK2+/+ -STZ-MK2-/- -STZ:
*,$P<0.05;
**’
$$P<0.01
50
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
Benefits of MK2 deletion on function and palmitate oxidation in
ex vivo working diabetic hearts
AGCL: 13C-Palmitate (16C)
Cardiac function
LC-Acyl-CoA
CPT-I
MVO2: NS
between groups
TRANS
CPT-II
LC-Acyl-CoA
Palmitate oxidation
Glucose oxidation
Autres
sources
(Glucose)
Acétyl-CoA
(citrate)
13C
12C
Cycle de Krebs
(Énergie)
*MK2+/+ Veh. vs. STZ; $MK2+/+ -STZ-MK2-/- -STZ: *,$P<0.05
51
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
Impact of MK2 deletion on metabolic gene expression is
consistent with flux data
LCFA
CD36
LC-Acyl-CoA
CPT-I
TRANS
CPT-II
LCFA
Uptake
LC-Acyl-CoA
VLCAD
LCAD
MCAD
Acétyl-CoA
LCFA
Β-oxidation
Cycle de Krebs
(Énergie)
52
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
MK2 deletion protects against diabetes-induced accumulation of
cardiac triglycerides
Triglycerides
(TG)
Protein expression levels - Enzymes involved in TG metabolism
Hydrolysis
Hydrolysis
Synthesis
53
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
Benefits of MK2 inhibition on systemic and cardiac lipid metabolism in
diabetes - Metabolic flux data provide unique information.
MK2+/+ mice
MK2-/- mice
Hyperglycemia
Circulating lipids
LCFA
Acyl-Carnitines
(>C14)
TG
Acyl-Carnitines
(>C14)
CD36
Acyl-CoA
CACT
TG
CPT1
CPT2
Acyl-CoA
β-oxidation
Contractile
function
Acetyl-CoA
Krebs cycle (Energy)
Contractile
function
54
3.2.1 Métabolisme cardiaque et cardiomyopathies
Importance des mesures de flux métaboliques. Exemples 1& 2
Conclusions
L’investigation du métabolisme cardiaque à l’aide des isotopes stables
et l’analyse d’isotopomères révèle:
- des informations uniques pertinentes sur la dynamique du métabolisme
des substrats qui ne sont pas accessibles par le biais des analyses de
type statique, soit les niveaux d’ARN et/ou de métabolites (dans ces
exemples, les acylcarnitines).
La combinaison de toutes ces données - flux et statiques - permettent
une meilleure compréhension des altérations métaboliques qui prévalent
dans une condition donnée.
Pris ensemble, les résultats de ces 2 études suggèrent d’être prudent
dans l’interprétation des données sur la concentration plasmatique
d’acylcarnitines.
55
3.3 Exemple: A la recherche du traceur idéal
3.3.1 Études ex vivo avec le glucose et/ou la glutamine
marqué au carbone 13
3.3.2 Études in vivo avec l’eau deutérée
56
3.3.1 Exemple: Études ex vivo
Objectifs
Évaluer plusieurs traceurs
(11 de glucose et 7 de glutamine)
marqués au carbone 13 dans des
cellules cancéreuses pour leur
capacité d’évaluer avec
exactitude et précision
(répétabilité /reproducibilité =
écart-type/moyenne) le
métabolisme des substrats par:
- La glycolyse,
- la voie des pentoses phosphates;
- et le cycle de Krebs
- Analyses des métabolites par MS
57
3.3.1 Exemple: Études ex vivo
Glycolyse
Glucose
Voie des pentoses phosphates
Glucose
Glucose
Glucose
Glutamine
Cycle de Krebs
Glucose
Glutamine
Global
Glutamine
58
3.3 Exemple: A la recherche du traceur idéal
3.3.2 Études in vivo avec l’eau deutérée
Avantages:
- Distribution homogène entre les divers pools, donc la relation
“précurseur - produit s’applique.
- Facilité d’administration sur de longues périodes et d’application,
peu coûteux.
Tube GI
2H O
2
Plasma
2H O
2
LEC
Cytosol
Mitochondrie
2H O
2
2H O
2
2H O
2
• Synthèse des lipides (3H2O): Wadke et al. 1973; Brunengraber et al. 1972
• Dépense énergétique: “doubly-labeled water” 2H2O + H218O; Lifson et al. 1955
59
3.3.2 Exemple: Utilisation de l’eau deutérée
Voies de biosynthèses diverses
Tiré de: Hellerstein MK, Met Eng 6:85, 2004
Hellerstein MK, Met Eng 6:85, 2004; Ann Rev Nutr 23: 379, 2004;
McCabe BJ & Previs SF Met Eng 6: 25, 2004
60
3.3.2 Exemple: Utilisation de l’eau deutérée
Synthèse des acides nucléiques et prolifération cellulaire
61
4. CONCLUSION
•
L’analyse de flux métaboliques:
- apporte de l’information sur le métabolisme qui n’est pas
disponible par les analyses statiques des niveaux d’ARN
(transriptomique), protéines (protéomique) ou métabolites
(métabolomique);
- augmente le potentiel de découverte de la métabolomique.
•
Exemples d’applications:
- Études mécanistiques
- Découverte de biomarqueurs ou voies métaboliques qui peuvent
représenter une nouvelle cible ou stratégie thérapeutique.
62
4. CONCLUSION
Flux métaboliques:
considérations méthododologiques
Étape 1
Utilisation de substrats marqués
dans des modèles d’étude ex vivo
(cellules ou organes isolés) ou in vivo
Étape 2
Analyses – données brutes
Étape 3
Interprétation des données:
Équations/modélisation mathématique
63
Flux métaboliques: Perspectives futures
Vers une approche non ciblée et intégrée
Offre un potentiel remarquable dans une perspective de recherche
orientée vers la biologie des systèmes
64
1. INTRODUCTION – La dynamique du métabolisme
L’analyse de flux métaboliques vs. la “fluxomique”,
ciblée vs. non ciblée: Qu’en est-il aujourd’hui ?
65