Anatomie et Structure de la Bactérie Pr Makhtar CAMARA Laboratoire de Bactériologie Virologie CHNU Aristide Le Dantec Objectifs 1. Citer les différents moyens d’étude de la structure bactérienne 2. Lister les éléments constants et inconstants de l’anatomie d’une bactérie 3. Expliquer les différences entre les parois des bactéries à Gram (+) et celles à Gram (-) 4. Donner le principe et les différentes étapes de la coloration de Gram 5. Lister les propriétés des différents constituants des bactéries 2 Plan • Introduction • Moyens d’étude des bactéries • Eléments de structure • Applications • Conclusion 3 Plan • Introduction • Moyens d’étude des bactéries • Eléments de structure • Applications • Conclusion 4 Introduction : Définition • Bactérie = être vivant unicellulaire de petite • taille (1-10 µm) Domaine des Procaryotes – « pro » « Karyon » pas de noyau individualisé, – pas de membrane nucléaire, – juste un chromosome 5 Introduction : Intérêt • Diagnostique : diagnostic de certitude des • • • maladies infectieuses Thérapeutique : mise au point des antibiotiques Epidémiologique : typage des souches lors des épidémies ou en médecine légale Fondamentale : élaboration d’outils de diagnostic et de vaccin 6 Plan • Introduction • Moyens d’étude des bactéries • Eléments de structure • Applications • Conclusion 7 Moyens d’étude de la structure bactérienne (1/5) • • Bactérie = être vivant, unicellulaire, de petite taille (110 μm) Microscopie optique (G x 1000-1500 fois) – Examen à l’état frais : préparation vivante o o – Forme Mobilité éventuelle Examen après coloration : préparation tuée o Coloration simple : bleu de méthylène o Coloration différentielle : Gram, Zielh Nielsen Propriétés tinctoriales Morphologie Modes de groupement 8 Moyens d’étude de la structure bactérienne (2/5) Microscope optique Coloration au bleu de méthylène Coloration de Gram 9 Moyens d’étude de la structure bactérienne (3/5) • Microscopie électronique (G x > 10 000 fois) structure fine des bactéries – Microscope à balayage o o – Résolution : 1 nm Formes et structures externes (ex : fibrilles axiales), interactions cellulaires Microscope à transmission (coupes ultra-fines) : o o Résolution : 0,1 nm Organisation interne de la cellule (ex : chromosome, plasmide, ribosomes) 10 Moyens d’étude de la structure bactérienne (4/5) Microscope électronique à balayage Microscope électronique à transmission 11 Moyens d’étude de la structure bactérienne (5/5) • Fractionnement des bactéries – – Désintégrées par procédés o physiques (broyage avec des microbilles de verre, ultrasons) o chimiques (enzymes, antibiotiques, détergents) Constituants libérés, séparés, analysés (centrifugation, filtration, électrophorèse) o o ombrage, coloration négative : forme et structures superficielles (ex: flagelles) cryodécapage : lyophilisation à température voisine de 0 °C pour visualiser les différentes couches superficielles 12 Plan • Introduction • Moyens d’étude des bactéries • Eléments de structure • Applications • Conclusion 13 Anatomie de la bactérie 14 **Éléments constants La cellule bactérienne A: Pili* B: ribosomes** C: Capsule* D: Paroi** E : Flagelle F : Cytoplasme** G : Vacuoles de réserve* H : Plasmides * I : chromosome** *Éléments facultatifs 15 J : mb plasmique** Anatomie de la bactérie Eléments obligatoires : • • • • • • Paroi Membrane cytoplasmique Mésosome Cytoplasme Ribosomes Chromosome Eléments inconstamment présents : • Capsule • Pili (pilus commun et pilus sexuel) • Flagelles • Vacuoles, substances de réserve • Plasmides • Spores 16 1. Paroi bactérienne • C’est une structure constante des bactéries qui est mise en évidence par la microscopie – Composition chimique et organisation de la paroi différentes selon le type de coloration au Gram 17 Paroi bactérienne : Gram- vs Gram+ Gram négatif Gram positif 18 Schéma des enveloppes bactériennes 19 Paroi des bactéries • Gram positif – Structure homogène (sauf mycobactéries) o Peptidoglycane 20-80 nm o Acide teichoïques o Acide lipotéchoïque • Gram négatif – Structure complexe o Peptidoglycane 3 nm o Membrane externe Lipopolysaccharide (LPS) Porines o Espace périplasmique 20 Paroi des bactéries à Gram positif • Peptidoglycane ou Muréine ou mucopeptide, ou « mur bactérien » “cell wall” – – Constituant particulier des bactéries Maillage tridimensionnel, rigide, poreux 21 Schéma du peptidoglycane de Staphylococcus aureus (cocci à Gram +) • Chaînes polysaccharidiques constituées de N acétylglucosamine(NAG) et acide N-acétylmuramique (NAM) • Chaînes latérales peptidiques • Ponts interpeptidiques 22 Peptidoglycane • Propriétés biologiques d’intérêt médical – Sensible au lysozyme : moyen de défense non spécifique – Activation du complément : rôle dans l’immunité non spécifique – Antigénique => synthèse d’anticorps – Destruction par les enzymes des bactériophages 23 Peptidoglycane • Propriétés biologiques d’intérêt médical – Site d’action de désinfectants : phénol – Site d’action d’antibiotiques interférant avec diverses étapes de la synthèse de la paroi 24 Rôle de la paroi des Gram positif • Les acides teichoïques et lipoteichoïques ne sont retrouves que chez les Gram (+) – Rôle dans le maintien et régulation des cations près de la paroi – Rôle dans l’adhésion 25 Rôles de la paroi • Peptidoglycane est responsable de l’intégrité de la cellule bactérienne – Maintien de la forme de la bactérie, lui confère sa rigidité – Résistance de la bactérie à la lyse osmotique Bactéries sans paroi = protoplastes (Gr+), sphéroplastes (Gr-) Exception : Mollicutes (Mycoplasma)sont des bactéries sans paroi – Perméabilité sélective aux molécules – Intervient dans la coloration de Gram 26 Paroi des bactéries à Gram négatif • Gram négatif – Structure complexe avec • Peptidoglycane fin 3 nm • Membrane externe • Lipopolysaccharide LPS Porines Espace périplasmique 27 Paroi des Gram négatif Membrane externe des Gr-: les protéines Protéines majeures (porines = 70% pour la diffusion des petites molécules hydrophiles) et protéines mineures (transport spécifiques des molécules trop volumineuses pour passer à travers les pores)28 Paroi des Gram négatif Membrane externe des Gr-: le LPS • • Lipopolysaccharide LPS = endotoxine + AgO Composé de 3 parties : – Lipide A – Polysaccharide central ou core – Chaîne O 29 Paroi des Gram négatif Rôle de la membrane externe • LPS – – Activité biologique du lipide A o Bénéfique à faible dose o Délétère à forte dose : choc endotoxinique Chaîne O o Antigénique 30 Paroi des Gram négatif Membrane externe rôle dans la physiologie bactérienne • • Permet la diffusion des nutriments Empêche la pénétration de certaines grosses molécules (enzymes, antibiotiques) : barrière de perméabilité • • Empêche la sortie d’enzymes périplasmiques Résistance aux facteurs de défense de l’organisme – • Lysozyme et protéines leucocytaires toxiques Protège les entérobactéries du tube digestif contre les sels biliaires et les enzymes digestives 31 Paroi des Gram négatif Rôle de la membrane externe • Sensibilité – aux antiseptiques (par sa nature essentiellement lipidique) – aux antibiotiques polypeptidiques (action sur la partie phospholipidique) • Site d’action de certains bactériophages • Activation du complément : rôle dans l’immunité non spécifique 32 Paroi des Gram negatif Espace périplasmique • Chez les Gram (-) Périplasme interne = 4 nm (espace entre la mb cytoplasmique et le PG) – Périplasme externe = 1,5 nm (espace entre le PG et la mb externe) – • Composition – Contient le PG, polysaccharides, protéines de transport, nombreuses enzymes 33 Paroi bactérienne : coloration de Gram, morphologie • • Coloration de Gram inventée en 1884 Christian GRAM Donne une information rapide et médicalement importante – 1 - Cristal violet + lugol – 2 - Décoloration par l’alcool o o – la paroi des Gram + n’est pas traversée : reste violet la paroi des Gram – est traversée, l’alcool dissout le colorant, la bactérie est décolorée 3 - Fuschine : contre coloration en rose des bactéries précédemment décolorées 34 Coloration de Gram : Principe 35 2. Membrane cytoplasmique • Caractérisée par sa fluidité – Double couche phospholipidique + protéines et glycoprotéines • Lipides membranaires (30-40%) – – Phospholipides Glycolipides • Protéines (60-70%) – – Insérées dans les lipides = protéines intrinsèques Fixées en surfaces = protéines extrinsèques • Sucres (2-15%) 36 Schéma membrane cytoplasmique et phospholipides 37 Fonctions Membrane cytoplasmique • Barrière perméabilité sélective et transport de substances solubles (échanges entre la bactérie et le milieu extérieur = barrière osmotique) • Fonctions respiratoires – Enzymes de la chaîne respiratoire et de la phosphorylation oxydative (NAD, flavoprotéines, quinones, cytochromes) 38 Fonctions Membrane cytoplasmique • Rôle métabolique majeur (même rôle que la mitochondrie dans la cellule eucaryote) – Enzymes de la réplication de l’ADN… – Perméases, ATPases, phosphotransférases, enzymes impliquées dans la synthèse de la paroi et des pili • Exportation des protéines – Indispensable à la bactérie – Moyen d’obtenir les nutriments indispensables 39 Mésosomes • Structures membranaires intracytoplasmiques (invaginations multidigitées de la membrane cytoplasmique) – porte un site d’attachement du chromosome – Intervient dans la régulation de la division bactérienne par scissiparité – (ADN → 2 chromosomes puis septum de division) 40 3. Appareil nucléaire • • • • Pas de membrane nucléaire Chromosome unique, circulaire Double hélice ADN Support de l’information génétique 41 Appareil nucléaire • Chromosome bactérien – Filament unique d’ADN – Bicaténaire, circulaire, surenroulé – 1000 fois plus long que la bactérie (masse ~ 20003000 MDa) 42 Appareil nucléaire • Chromosome bactérien – ADN (80%), ARN (10%), protéines (10%) – 10% de protéines sont des enzymes – o ADN et ARN polymérases o Topoisomérases GC% dans ADN = critère taxonomique 43 Appareil nucléaire : intérêt médical • Diagnostic – Identification des bactéries par mise en évidence des gènes par les techniques de biologie moléculaire – o Amplification génique de l’ADN ou PCR o Révélation par hybridation avec sondes o Séquençage nucléotidique Épidémiologie : comparaison des génomes 44 4. Cytoplasme, ribosomes • Cytoplasme bactérien – Protéines – Sels minéraux – Ribosomes => synthèse des protéines – Inclusions de réserve 45 Ribosomes • Nombreux : ~ 18 000 / bactérie • Sont des complexes ribonucléoprotéiques – – constitués d'ARN ribosomiques qui portent l'activité catalytique (ARN 23S et ARN 16S) et de protéines ribosomiques Organisées en 2 sous-unités o o Petite sous-unité (30S) qui « lit » l'ARN messager Grosse sous-unité (50S) qui se charge de la synthèse de la protéine correspondante 46 Ribosomes • Fonction : synthèse protéique en décodant l'information contenue dans l'ARN messager – Se fait au niveau 2 sites essentiels o o Site aminoacyl : accueille l’acyl-tARN Site peptidyl : accueille la chaîne d’aminoacides en cours de constitution 47 Anatomie de la bactérie Eléments obligatoires : • • • • • • Paroi Membrane cytoplasmique Mésosome Cytoplasme Ribosomes Chromosome Eléments inconstamment présents : • Capsule • Pili (pilus commun et pilus sexuel) • Flagelles • Vacuoles, substances de réserve • Plasmides • Spores 48 5. Les flagelles • Sont responsable de la mobilité • Douées de propriété antigénique (AgH) • Morphologie – Longs et fins (20 nm x 6-15 nm) – Invisible en microscope optique (sauf colorations particulières) – Nombre et position variables selon les bactéries 49 Les flagelles • Position des flagelles et type de mobilité – A : un seul flagelle polaire = ciliature monotriche (déplacement fléchant; P. aeruginosa) – B : plusieurs flagelles polaires = ciliature lophotriche (déplacement fléchant + oscillant; certains spirochètes) – C : un seul flagelle à chaque pôle = ciliature amphitriche (déplacement oscillant; certains spirochètes) – D : des cils/flagelles entourant la cellule = ciliature péritriche (déplacement fléchant hélicoïdal; Proteus spp) 50 Les flagelles • Propriétés antigéniques – Représentent l’antigène H o Sérotypage = détection de l’AgH o Diagnostic sérologique = détection d’Ac – Facilitent la colonisation bactérienne – Induisent production cytokines pro-inflammatoires 51 6. Les pili ou fimbriae • Appendices périphériques courts et fins (3-10 nm x 1- 2 µm), surtout chez les Gram- • Implantés dans la membrane externe, voire membrane cytoplasmique • Constitués d’1 protéine = piline ou adhésine, arrangée de façon hélicoïdale • Droits, ne tournent pas, pas de corps basal 52 Pili ou fimbriae • Pili communs = fimbriae – Colonisation = attachement aux cellules de l’hôte et autres surfaces ++++ • – favorise la colonisation des muqueuses (E. coli et muqueuse vésicale, gonocoque et urètre) – protection contre la phagocytose (gonocoque) Sites de fixation pour bactériophages ou de l’ADN Rôle dans la transduction, transformation 53 Pili sexuels • • • • Peu nombreux (1 à 4) Longs - creux - extrémité distale renflée Codés par des gènes plasmidiques (facteur F) Rôle dans la conjugaison bactérienne – permettent le rapprochement des 2 bactéries et un contact cellulaire étroit – transfert de matériel génétique (plasmide) 54 Pili sexuels 55 7. Capsule et Slime • • De nature polysaccharidique – Capsule – – – • Épaisse, compacte Solidement attachée à la paroi Non colorée par le Gram, visible à l’encre de Chine + microscopie électronique Slime ou Glycocalix – • Colonies lisses +/- muqueuses – Couche plus diffuse Facilement détachable Synthèse – – intracellulaire puis exportation ou synthèse extracellulaire Fonction du milieu extérieur 56 Capsule 57 Capsule • Implications médicales : – Pouvoir pathogène => la résistance à la phagocytose (pneumocoque) – Diagnostic : antigènes solubles dans les liquides de l’organisme – Épidémiologie : typage sérologique (pneumocoque, Haemophilus) – Vaccins : à base de polymères capsulaires purifiés (pneumocoque, Haemophilus influenzae) 58 Slime ou couche glycocalix • Arrangement géométrique de sous-unités protéiques, situé sur la face externe de la paroi • • Gram + et Gram – Visible en microscopie électronique seulement 59 Slime ou Glycocalyx • • Rôle protecteur vis-à-vis de bactériophages, de la phagocytose, fixation du complément Facteur d’adhésion (biofilm), responsable de l’attachement : – des bactéries entre elles – entre bactéries et surfaces solides (biomatériaux, cathéters, prothèses) – entre bactéries et surfaces cellulaires (buccales, respiratoires) : facteur de colonisation – entre bactéries et supports inertes (ex : plaque dentaire) 60 Slime ou Glycocalyx Formation d’un biofilm - protège les bactéries de la dessiccation, - concentre ou modifie les nutriments exogènes, - protège contre les antiseptiques, désinfectants, antibiotiques 61 9- La spore Terminale déformante Sub-terminale Centrale 62 Propriétés des spores Forme de résistance caractérisée par : • • Thermorésistance varie d’une espèce à l’autre – En général survie après 10 mn à 70-80°C – Plectridium caloritolerans : 8h à 100° et 5 mn à 120°C Résistance aux agents physiques – • UV, rayons X, ultra-pressions Résistance aux agents chimiques – Spores beaucoup moins sensibles aux antiseptiques, désinfectants et antibiotiques que les cellules végétatives – Antibiotiques = sporostatiques 63 Propriétés des spores • • FORME DE RESISTANCE de certaines espèces quand les conditions deviennent défavorables La spore peut persister très longtemps dans l’environnement – paroi très épaisse – résiste au froid – à la chaleur – à la dessication – aux antibiotiques – à certains antiseptiques 64 Propriétés des spores • Conservation de toutes les aptitudes génétiquement déterminées – peuvent redonner des formes végétatives quand les conditions redeviennent favorables • Exemples de bactéries sporulées : – Aérobies : Bacillus anthracis, Bacillus subtilis – Anaérobies : Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Clostridium difficile 65 10- Eléments génétiques mobiles • Plasmides • Transposons • Intégrons 66 Plasmides • ADN extra chromosomique – présence d’un ou de plusieurs plasmides chez certaines bactéries, – ADN double brin, surenroulé – réplication autonome – 1-1000 kb (en moyenne 0,5-5% de la taille du chromosome) 67 Plasmides • Information génétique pour – Sa propre réplication – Synthèse de pili sexuels – Genès de résistance aux antibiotiques o – multirésistance possible Gènes intervenant dans le pouvoir pathogène (facteurs de colonisation, toxines) 68 Transposons • Définition – – – Un élément transposable est une séquence d'ADN capable de se déplacer et de se multiplier de manière autonome dans un génome, par un mécanisme appelé transposition. Présents chez tous les organismes vivants, y compris les eucaryotes Transposition ou recombinaison nécessite des enzymes spécialisées: o Transposase o Intégrase 69 Transposons • Séquence encadrée par deux IS (séquence d’insertion) qui déplaceront la séquence qu'elles encadrent – la transposase excise une séquence de l'ADN – Transposition simple ou transposition par « coupercoller » avec ligation du transposon dans le site cible 70 Intégrons • Les intégrons sont des éléments génétiques retrouvés exclusivement chez les bactéries et principalement les Gram négatives; association de : – – – • Gène intl codant une intégrase Site attl, adjacent du gène intl Promoteur Pc, orienté dans le sens inverse du gène intl Ils sont notamment impliqués dans la multi- résistance des bactéries aux antibiotiques 71 Plan • Introduction • Moyens d’étude des bactéries • Eléments de structure • Applications • Conclusion 72 Applications • Diagnostic des maladies infectieuses • Travaux pratiques • Epidémiologique : typage des souches • Vaccinologie : Ag spécifiques purifés • Utilisation des spores dans le bioterrorisme 73 Plan • Introduction • Moyens d’étude des bactéries • Eléments de structure • Applications • Conclusion 74 Conclusion • Etude de structure et anatomie fonctionnelle – meilleure connaissance des bactéries – rapport entre différents organes – rôle des différents organes => synthèse de molécules antibiotiques 75