Hémoglobinurie paroxystique nocturne: physiopathologie, diagnostique cytométrique Sofiane Pour Orianne Wagner-Ballon L’hémoglobinurie nocturne paroxystique – Ni paroxystique, même en l’absence de symptômes, la progression destructrice de l’hémolyse se poursuit – Ni nocturne…,l’hémolyse est subtile et constante, 24 heures sur 24 – Pas toujours associée à une hémoglobinurie perceptible (1/4 patient rapporte une hémoglobinurie au diagnostic) L’HPN c‘est quoi? PNH clones Maladie acquise clonale de la cellule souche, qui affecte toutes les lignées. Mutation somatique du gène PIG-A (phosphatidyl inositol glycan), lié au chromosome X. Cette mutation entraîne la diminution ou l’absence de synthèse de certaines glycoprotéines de surface qui protègent les GR de la lyse par le complément, rendant donc ceux ci très instables Protéines déficientes des cellules HPN CD55 CD58 CD59 PrPC AChE JMH Ag Dombroch HG Ag CD55 CD58 CD59 CD109 PrPC GP500 Gova/b B cells RBC Haematopoietic Stem Cell CD24 CD58 CD48 CD73 T cells CD59, CD90, CD109 CD55 CD59 PrPC CD108 CD55 CD58* CD59 CD48 CD52 CD87 CD108 PrPc ADP-RT CD73 CD90 CD109 CD16* Platelets NK cells CD55 CD59 CD16 CD48 CD66c CD109 LAPNB1 p50-80 ADP-RT CD58* CD14 CD24 CD66b CD87 CD157 PrPC GPI-80 NA1/NA2 Monocytes PMN CD14 CD59 CD87 Group 8 CD55 CD48 CD109 PrPC CD16 CD58* CD52 CD157 GPI-80 CD55 CD58 CD59 CD48 CD52 PrPc CD16 QuickTime™ and a GIF decompressor are needed to see this picture. Avantage de survie des clones HPN+ Normal stem cells GPI-linked antigen GPI-deficient (PNH) stem cells Immune attack via GPI-linked antigen (aplastic anaemia) Avantage de survie des clones HPN+ Avantage de survie des clones HPN+ Intense growth factor driven expansion Avantage de survie des clones HPN+ Expansion des clones HPN Le clone HPN est fréquent chez les patients avec bone marrow failure syndromes (BMF) 25–45% des patients avec une aplasie médullaire/anémie aplastique 10–23% des patients avec un MDS Maladie chronique invalidante et potentiellement mortelle Actuarial Survival From the Time of Diagnosis in 80 Patients With PNH Estimée à 1/80 000 en France Age median au diagnostique : 30ans Qualité de vie diminuée Maladie chronique et progressive Patients Surviving (%) Mortalité à 5ans: 35% 100 80 Age- and sexmatched controls 60 40 Patients with PNH 20 0 0 5 10 15 20 Years After Diagnosis 25 HPN – Triade Clinique Hémoglobinurie Syndrome de Budd-Chiari Hémolyse intravasculaire Symptômes invalidants - douleur abdominal - dysphagie - défaillance érectile Thrombose - Hépatique - Cérebrale - 50% des patients - Fatal pour 33% des patients Anémie aplastique Bone Marrow Failure - précède souvent le clone HPN L’HPN est une maladie chronique de l’hémolyse chronique Normal red blood cells are protected from complement attack by a shield of terminal complement inhibitors Without this protective complement inhibitor shield, PNH red blood cells are destroyed Thromboses IR Hypertension artérielle pulmonaire Complement Activation Impact significatif sur la survie Douleur abdominal Dyspnée Asthénie Intact RBC Free Haemoglobin in the Blood from Destroyed PNH RBCs Dysphagie Hémoglobinurie Anémie Dysfonction érectile Impact significatif sur la morbidité L'hémolyse chronique est la cause sous-jacente de la morbidité et de la mortalité progressives de l'HPN THROMBOSIS Venous Arterial PE/DVT Stroke/TIA Cerebral MI Dermal Hepatic/Portal Abdominal ischemia Chronic Kidney Disease Renal insufficiency Dialysis Anaemia End Organ Damage Brain Liver GI Pulmonary Hypertension Dyspnea Cardiac Dysfunction Anaemia Fatigue / Impaired Quality of Life Abdominal pain Dysphagia Poor physical functioning Erectile dysfunction Transfusions Haemosiderosis Hémolyse et oxyde nitrique L’hémolyse intravasculaire relargue de l’hémoglobine libre L’hémoglobine libre capture le NO La déplétion du NO est responsable de la dystonie des muscles lisses – douleur abdominale, dysphagie, severe léthargie sévère, défaillance érectile La déplétion du NO peut causer l’hypertension pulmonaire et artérielle – Vasoconstriction – Coagulation • Hyperactivation plaquettaire • Fibrinolyse • Hypercoagulabilité HPN et Rein L’hémolyse chronique et l’hémoglobine libre conduisent à une insuffisance rénale chronique Elle est causée par l’exposition répétée du tissu rénal à l’hémoglobine libre 64% des patients ont une IRC stade1-5 La défaillance rénale a été identifiée comme la cause du décès dans 8-10% des patients HPN 80 % des patients atteints d’HPN (âge médian : 31,5) ont des signes d’hémosidérose rénale importante observés par l’IRM HPN et Thrombose Principale cause de décès (40-67%) Sièges typiques et atypiques Non maîtrisée adéquatement par l’anticoagulothérapie Tous les patients atteints d’HPN sont à risque de thrombose HPN et Thrombose Pathogenèse multifactorielle : Hémolyse – Baisse du monoxyde d’azote • Hyperréactivité plaquettaire • Fibrinolyse déficiente • Hypercoagulabilité – Membranes prothrombotiques Activation plaquettaire excessive causée par un déficit en CD59 La fraction C5a du complément contribue aussi au risque thrombotique – Coagulation provoquée par le facteur tissulaire Hausse des marqueurs d’inflammation/de coagulation, y compris les Ddimères Diagnostique biologique • Recherche de clone HPN par cytométrie en flux • Méthode diagnostique de référence • Principe: mise en évidence du déficit en marqueurs GPI-liés sur au moins deux lignées sanguines distinctes. Présence du clone? OUI/NON Si OUI : déterminer la taille du clone Mise en évidence du déficit complet (cellules de type III) ou partiel (cellules de type II) en protéines GPI-ancrées Quelle stratégie d’analyse? QuellesBackground populations cibler? Nature de l’échantillon: sang périphérique, EDTA, examen à réaliser dans les 24h (cellules vivantes!). 1ère étape: recherche de cellules déficientes en marqueurs GPI-liés par les PNN, avec confirmation sur les monocytes. Si présence de clones déficients - si nombre de PNN insuffisants - pour confirmer la présence d’un clone si lignée monocytaire non informative, 2ème étape: recherche de cellules déficientes en marqueurs GPI-liés parmi les GR. L’analyse des globules rouges est affecté par les transfusions ou l’hémolyse. Quelles protéines GPI-liés cibler? Background Les globules blancs: FLAER + CD24(ou CD157) pour les PNN FLAER + CD14(ou CD157) pour les monocytes Les globules rouges: CD59 (+++) Taille totale du clone = % type III + % Type II Très grande variabilité de taille Stratégie de gating sur marqueurs non GPI-liées pour les globules blancs (CD45 CD15 CD33 ou CD64) Lumière sur le FLAER Background • • • • Toxine bactérienne: dérivé d’une lysine secrétée par Aeromonas hydrophila Couplé à un fluorochrome (Alexa 488) Liaison spontanée aux ancres GPI à la surface des globules blancs Pas de fixation à la surface des globules rouges Interprétation Background PRÉSENCE D’UN CLONE HPN SI ≥ 1% Avec taille du clone sur chaque type cellulaire testé (PNN et monocytes ± globules rouges) DOMAINE DE LA RECHERCHE SI <1% 0.1–1% : Clone HPN minoritaire 0.01-0.1% : Rares cellules avec déficit en protéines GPI-liés ABSENCE DE CLONES HPN Avec limite de sensibilité du test (en général sur les PNN) Perspectives Signification clinique des clones HPN ≥ 0,01% Signification clinique des clones HPN minoritaires < 1% Suivi de l’évolution Clones HPN ≥ 1% : Proportion et signification des types II et III Rôle de l’Observatoire national des clones HPN Pronostique et évolution des SMDs hypoplasique et clones minoritaires? Pronostique et évolution des aplasies médullaires et clones minoritaires? Impact pronostique et thérapeutique des profils moléculaires des clones HPN