Telechargé par Mathieu Zallio

Rapport de stage BTS Biotechnologies 2ème année : Le Glioblastomes

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Le
Glioblastomes :
Caractérisation du mode
d’action d’une nouvelle
molécule (DVXXX) ciblant
les propriétés souches et
tumorigéniques des cellules
souches cancéreuses de
gliome
DU 13 JANVIER AU 13 MARS 2020
Stage effectué à l’iBV de Nice Université NiceSophia Antipolis
28 avenue de Valrose, 06103 Nice
Sous la direction de Brenda Queron dans
l’équipe de Thierry Virolle
Créé par : Mathieu Zallio BTK2
1
Remerciements
En premier lieu, je tiens à remercier Brenda Queron (étudiante en thèse) ma tutrice pendant toute la
durée du stage. Merci à elle d’avoir pris le temps, durant la totalité de cette expérience professionnelle,
de m’expliquer le plus possible les manipulations et les attentes des résultats afin que je puisse l’aider
un maximum dans son projet de thèse. De plus, ses conseils très utiles m’ont permis d’améliorer mes
méthodes de travail en manipulation afin de pouvoir manipuler de manière plus précise et moins risquée.
Enfin, je la remercie de m’avoir impliqué complètement dans son projet de recherche très intéressant
qui m’a permis d’enrichir mes connaissances.
Je remercie également Thierry Virolle, le directeur de recherche, qui m’a une nouvelle fois permis
d’intégrer son équipe durant ce stage, qui a su m’aider un maximum et m’impliquer dans la totalité de
la recherche en discutant avec lui ou en participant aux LabMeetings de l’équipe de recherche où des
membres de l’équipe pouvaient présenter leurs résultats afin de faire constater l’avancement des travaux,
les problèmes rencontrés, les aboutissements, chercher des solutions ensemble... Ainsi, ceci m’a permis
de voir l’entraide présente dans une équipe.
Enfin, je remercie tous les membres de l’équipe de recherche avec qui j’ai pu discuter de diverses choses
et qui ont su m’intégrer durant toute la durée du stage.
2
Table des matières
Remerciements .............................................................................................................. 2
Glossaire........................................................................................................................ 4
Abréviations .................................................................................................................. 5
I. Introduction générale ............................................................................................... 6
Manipulations du stage ....................................................................................... 10
II.
a)
Test différenciation ................................................................................. 10
b)
PLA (Proximity Ligation Assay) ............................................................. 18
III.
Résultats et discussion ........................................................................................ 23
a)
Test différenciation ................................................................................. 23
b)
PLA ......................................................................................................... 26
IV.
Conclusion Scientifique...................................................................................... 27
V.
Conclusion Personnelle ...................................................................................... 27
ANNEXES : ................................................................................................................ 28
3
Glossaire
Agent alkylant : composé capable d'ajouter des groupements alkyles à divers groupes
électronégatifs dans des conditions présentes au sein des cellules. Ici l’agent alkylant est utilisé pour
stopper la tumeur puisqu’il empêche la division cellulaire.
Apoptose cellulaire : Processus par lequel les cellules déclenchent leur autodestruction en réponse
à un signal. C’est une forme de mort cellulaire génétiquement programmée.
Cellules souches : En biologie cellulaire, une cellule souche est une cellule indifférenciée capable,
à la fois, de générer des cellules spécialisées par différenciation cellulaire et de se maintenir dans
l’organisme par prolifération ou division asymétrique. Les cellules souches sont présentes chez
tous les êtres vivants multicellulaires. Elles jouent un rôle central dans le développement des
organismes ainsi que dans le maintien de leur intégrité au cours de la vie.
Marqueurs de pluripotence : La pluripotence est la faculté de certaines cellules à se différencier
en : cellules d'un des trois feuillets embryonnaires (ectoderme, mésoderme et endoderme), ou
cellules germinales (tissus adultes).
Nécrose : Forme de dégât cellulaire qui mène à la mort prématurée et non programmée des cellules
dans le tissu vivant.
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Abréviations
CIG : Cellules initiatrices de gliomes
CSC : Cellules souches cancéreuses
CSG : Cellules souches de gliomes
GBM : Glioblastomes
IF : Immunofluorescence
T°C : Température
TMZ : Témozolomide
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I.
Introduction générale
L’institut de Biologie de Valrose (iBV) a été fondé en 2012 de par la fusion entre l’unité CNRS UMR6543 et
l’unité Inserm. Constitué de 28 équipes de recherche, rassemblant environ 300 personnes de plusieurs
nationalités différentes, l’institut est situé à Nice sur le Campus Valrose et la tour Pasteur (faculté de
Médecine).
Les études menées à l’iBV étudient les questions fondamentales en sciences de la vie et de la santé telles que
la pathologie moléculaire du cancer ou du diabète ou même la biologie du développement des organes, et tout
cela par des approches pluridisciplinaires de biologie moléculaire, cellulaire, génétique… L’iBV se base sur
un large éventail de modèles biologiques tels que la drosophile, des lignées cellulaires, la souris, l’oursin et
d’autres encore et donne accès aux appareils les plus performants des plates-formes technologiques de
microscopie, cytométrie, purification biochimique…
Lors du stage effectué, j’ai été accueilli dans l’équipe du Dr Thierry Virolle, nommée « Plasticité des cellules
souches cancéreuses et hétérogénéité fonctionnelle intra-tumorale ». Durant toute la période du stage, j’ai été
encadré par Brenda Queron. L’équipe Virolle effectue ses études principalement sur le Glioblastome et les
solutions pour aider à la thérapie contre ce cancer.
Tumeur cérébrale la plus courante, le GBM forme une masse tumorale compacte très vascularisée au sein
même du système nerveux central et un front invasif extrêmement infiltrant qui finit par coloniser le
parenchyme cérébral.
Lorsque la tumeur est accessible, elle est prise en charge en effectuant une résection chirurgicale. Par la suite,
le protocole de Stupp est appliqué visant à éliminer les cellules tumorales infiltrantes non réséquées. Ce dernier
est une radio-chimiothérapie au témozolomide. C’est un agent alkylant qui provoque des dommages à l’ADN
entraînant à l’apoptose cellulaire.
Au fil des années, de nouvelles thérapies anti- cancéreuses ainsi que de nouvelles techniques chirurgicales
permettant la résection d’une plus grande étendue tumorale, a aidé à la lutte contre ce cancer. Cependant, les
GBM restent des tumeurs incurables, systématiquement récidivantes et beaucoup plus agressives donnant aux
patients une médiane de survie estimée à 14 mois.
Les recherches menées au fil des années par de nombreux laboratoires au monde incluant mon laboratoire
d’accueil, ont pu montrer que cet échec thérapeutique serait dû en grande partie à l’hétérogénéité inter et intratumorale des GBM. D’une façon intéressante, l’hétérogénéité intra-tumorale peut être illustrée notamment par
la coexistence de compartiments cellulaires tumoraux fonctionnellement divergents, entremêlés ou organisés
en territoires cellulaires, enrichis en cellules différenciées, associées à de larges plages de nécroses ou au
contraire enrichis en cellules souches/progénitrices cancéreuses de GBM (CSG), responsable de l’initiation
tumorale. Les CSG, également appelées cellules initiatrices de gliome (CiG), sont positives pour des marqueurs
de cellules souches tels que CD133, A2B5, CD44, mais aussi des marqueurs de pluripotence comme OCT4,
NANOG et SOX2. Ces cellules peuvent être mitotiques ou quiescentes mais sont très fortement résistantes aux
traitements.
De par leurs propriétés, les CSG sont le centre de la progression tumorale et sont responsables des récidives
agressives.
La formation et la stabilité de ces différents compartiments cellulaires sont principalement dus à la plasticité
des cellules souches cancéreuses de GBM, et le contrôle de cette plasticité constitue la thématique de recherche
principale de mon laboratoire d’accueil. Les cellules souches de GBM, aussi connues sous le nom de CSG ou
CIG illustrent donc très bien l’appellation « Cellules souches cancéreuses ».
Les propriétés plastiques des cellules de GBM sont tout à fait étonnantes et régulent très finement
l’homéostasie tumorale. En effet, selon le microenvironnement tumoral, les cellules tumorales pourront se
différencier en ou au contraire se dédifférencier et retrouver le phénotype et les fonctions des CSG, soit sous
la pression d’un stress (dû à l’hypoxie ou à la radiothérapie) soit spontanément en réponse à des facteurs de
croissances comme l’EGF et le PDGF (publié récemment par mon laboratoire d’accueil).
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Les effets du protocole de Stupp sont basés sur une cytotoxicité cellulaire visant à éradiquer le plus de cellules
tumorales possible. Cependant, ce traitement conventionnel épargne une partie des CSG qui développent
systématiquement des résistances et qui de par leurs propriétés clonale et de différenciation reforment une
tumeur très souvent encore plus agressive que la tumeur primaire. Ce traitement qui pourtant permet de limiter
le volume tumoral offrant ainsi quelques mois de survie aux patients, sélectionne des cellules résistantes encore
plus agressives et responsables de la rechute du patient.
D’une façon intéressante en termes de perspective thérapeutique, mon laboratoire d’accueil à démontrer et
publié que les CSG, une fois différenciées, perdent leur tumorigénicité et sont beaucoup plus sensibles
aux traitements conventionnels. Ainsi, contrairement aux CSG, sous un phénotype différencié, les
cellules tumorales de GBM deviennent incompétentes à reformer et progresser une tumeur. Cette
découverte, a évolué en stratégie thérapeutique expérimentale, non plus basée sur la cytotoxicité cellulaire
mais sur l’induction de la différenciation. L’objectif étant de forcer les CSG à quitter le phénotype souche pour
adopter un phénotype différencier, indolent, incapable de reformer une tumeur et sensible aux traitements.
Cette stratégie thérapeutique est en cours de développement dans mon laboratoire d’accueil, elle est basée sur
l’expression de facteurs cellulaire pro-différenciant ou l’invalidation de facteurs essentiels aux maintiens des
propriétés souches ou l’utilisation de composés chimiques régulant la plasticité des CSG. Cette stratégie
thérapeutique innovante est très prometteuse aux vus des très bons résultats in vivo obtenus par mon laboratoire
d’accueil (plusieurs brevets et publications).
Les manipulations du laboratoire sont effectuées sur des cultures primaires de CSG dérivées de patients. Ces
cultures ont été établies de part une étroite collaboration avec le service de neurochirurgie et le service
d’anatomopathologie du CHU de Nice. Ainsi le laboratoire a pu valider cette stratégie différenciante
directement sur les cellules des patients qu’il faut nécessairement cibler pour lutter contre cette pathologie.
Pour répondre à ce nouveau paradigme, le laboratoire a initié une collaboration avec le Dr Maria Duca de
l’institut de chimie de Nice pour identifier des composés pharmacologiques capables d’induire la
différenciation des CSG et de bloquer leur tumorigénèse. Le laboratoire a identifié le DVXXX et a démontré
que ce composé chimique a la capacité de réprimer l’expansion clonale des CSG, de bloquer la formation de
tumeur in vivo et sensibilise les CSG à la chimiothérapie conventionnelle. Le laboratoire a également démontré
que le mode d’action de cette nouvelle molécule passe par l’inhibition de la translocation nucléaire de
NANOG, OCT4 et SOX 2, des facteurs de transcription de la pluripotence nécessaires au maintien des
propriétés souches des CSG.
.
7
Les différents résultats obtenus par l’équipe Virolle sont retranscrits dans l’annexe 1 qui suit :
ANNEXE 1 : Effets du DVXXX sur les propritétés
souches/tumorigènes des CSG
EXPLICATION :
A) Expression du marqueur de cellule souche neurale SOX2 dans des CSG traitées ou non avec 10 uM de
DVXXX : On constate que grâce au traitement le marqueur souche ne se situe plus dans le noyau de la cellule.
Les cellules sont donc dans un état différencié.
B) Evaluation de la capacité d’expansion clonale des CSG traitées ou non (NT) par des doses croissantes de
DVXXX : On constate que plus on augmente la quantité de DVXXX plus la prolifération clonale va diminuer.
Ainsi on peut dire que cette molécule empêche les cellules cancéreuses de proliférer et donc d’aggraver la
situation des patients.
C) Effet du traitement au DVXXX sur la progression tumorale de CSG greffées dans le cerveau de
souris : On constate qu’au fil des semaines les souris non traitées sont victimes d’une croissance
tumorale importante et assez exponentielle au bout de 7 semaines. A contrario, les souris traitées au
DVXXX n’ont quasiment aucune croissance tumorale même au bout de 10 semaines après la greffe.
La molécule DVXXX empêche la tumeur de se développer dans le cerveau des souris. Ce résultat est
très encourageant en termes de perspectives thérapeutiques.
D) Analyse de la survie des souris traitées (DVXXX) ou non (CTL) par du DVXXX : On constate que la
probabilité de survie, après apparition des tumeurs, des souris non traitées diminue au bout de 5 semaines.
Passé ce temps, la probabilité ne cesse de diminuer encore et encore jusqu’à atteindre 0 au bout de 11 semaines.
A contrario, si les souris sont traitées au DVXXX, la probabilité de survie ne diminue pratiquement jamais.
On peut donc dire que la molécule DVXXX est efficace pour prolonger la survie des patients.
En plus de ces découvertes, le laboratoire a montré que le traitement par cette molécule permet de sensibiliser
les CSG à la chimiothérapie. En effet, plus de 80% des cellules deviennent sensibles après un co-traitement
par le DVXXX. De plus, les cellules traitées obtiennent un phénotype cellulaire adhérent qui est semblable à
celui des GBM différenciées. In vivo, les découvertes ne sont autres que celles en Annexe 1 (C et D). D’autre
part, la protéine KPNB1, qui est une protéine impliquée dans le transport de facteurs nucléaire dans le noyau
des cellules, tel que des marqueurs souches, interagit avec la molécule DVXXX. Une autre découverte du
laboratoire montre que si l’on utilise des inhibiteurs spécifiques de KPNB1, on constate que la translocation et
l’expression de NANOG, OCT4 et SOX2 sont bloqués. Cet effet est la reproduction exacte de l’effet du
DVXXX. Ainsi, on peut dire qu’une partie du mode d’action du DVXXX n’est autre que l’inhibition de
KPNB1 (aussi appelée importine-B1). De manière intéressante, le DVXXX possède un avantage dans
l’inhibition de KPNB1 : Par rapport aux inhibiteurs chimiques déjà connus aujourd’hui, il n’induit pas de
cytotoxicité cellulaire, ainsi les CSG ont l’impossibilité de développer des clones de cellules survivantes et
résistantes à la mort.
La poursuite de l’étude pré-clinique de cette molécule DVXXX est l’objectif du projet de thèse de Brenda
Queron. Son but est de caractériser de manière plus poussée le mode d’action de la molécule mais également
de déterminer in vivo le bénéfice d’une combinaison d’un traitement combiné avec le TMZ.
Le projet a donc été subdivisé en trois parties bien distinctes :
1. Caractériser la liaison du DVXXX à KPNB1 : Ceci se fera grâce à des réactions de liaison In vitro afin
de déterminer l’affinité de liaison du DVXXX pour KPNB1 mais également déterminer les domaines
de KPNB1 qui permettent la liaison du DVXXX à la protéine.
2. Caractériser le rôle de KPNB1 dans le maintien des propriétés souches des CSG : L’objectif ici est de
confirmer l’interaction physique entre KPNB1 et des facteurs de pluripotence (NANOG, OCT4 et
SOX2). De plus, la confirmation du rôle majeur de KPNB1 dans le maintien des propriétés souches
sera un autre objectif du projet. Ceci sera mis en évidence en invalidant la protéine KPNB1 (en la
rendant donc inefficace) chez les CSG pour ensuite observer si des différences apparaissent avec des
cellules normales.
3. Démontrer le bénéfice d’une combinaison TMZ/DVXXX sur la progression tumorale : On a vu
auparavant que le DVXXX bloque efficacement les tumeurs in vivo. Il est donc très important de
mettre en place un traitement pouvant réduire le volume tumoral et bloquer sa progression. Comme
vu auparavant, in vitro, le DVXXX sensibilise les CSG au TMZ. L’objectif sera donc de voir si in
vivo un co-traitement DVXXX/TMZ est plus efficace qu’un traitement avec une seule des 2 molécules.
Ainsi les résultats de ce projet pourront permettre, tout d’abord, de caractériser plus spécifiquement le
mécanisme du maintien des propriétés des CSG avec la protéine KPNB1 et les marqueurs souches NANOG,
OCT4 et SOX2. En effet, cela confirmerait que l’expression de ces facteurs nucléaires est nécessaire au
maintien des CSG à l’état de cellule souche et donc avec des propriétés tumorigènes. Enfin, ces résultats
permettront de confirmer le potentiel thérapeutique du DVXXX puisque ceci prouverait que la molécule est
une molécule suppressive de tumeur en ciblant les propriétés des CSG. Ainsi, une nouvelle perspective de
traitement (qui est déjà efficace sur les souris) pourrait être envisagée. Cette dernière ne serait plus basée sur
la cytotoxicité cellulaire, mais elle ciblerait directement les propriétés souches des cellules de gliomes pour
pouvoir les faire évoluer en cellules différenciées sensibles au traitement. De plus, le DVXXX possède une
spécificité d’action qui est basée dans le profil d’expression des facteurs de pluripotence. Ainsi, ce profil est
restreint aux CSG ce qui permettra de diminuer les dommages sur les cellules normales puisque le DVXXX
ciblera uniquement les cellules souches cancéreuses.
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OBJECTIFS DU STAGE :
Les objectifs de mon stage sont en concordance avec certains de la thèse. Faute de temps et de matériel les
objectifs vus juste au-dessus ne pouvaient pas tous être traités mais les résultats seront tout de même utiles
pour la suite du projet.
Les objectifs seront donc :
 Vérifier la capacité de différenciation des cellules TG6 et GB5 dans un milieu sérum
 Vérifier si le DVXXX est capable de bloquer la liaison KPNB1/NANOG
Bien sûr il n’y a pas que des manipulations concernant ces objectifs qui ont été faite durant mon stage mais les
manipulations centrales du stage sont celles citées auparavant.
Ces objectifs ont déjà été atteint par le passé lors de la création de la molécule d’intérêt DVXXX comme on a
pu le voir en début de rapport. L’idéal serait donc de retrouver ces résultats pour en confirmer un maximum et
ainsi conforter les intérêts de cette molécule dans la lutte contre le Glioblastomes.
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II.
Manipulations du stage
Lors de mon stage, la plupart des manipulations que j’ai pu effectuer sont des manipulations de « mise au
point ». En effet, ce projet dans lequel j’ai été intégré n’est qu’à son début, même si les expériences futures
sont déjà prévues, il est primordial d’effectuer des manipulations qui pourront permettre de déterminer les
meilleures conditions d’expérimentation pour avoir les meilleures résultats (Par exemple, une quantité de
produit ou de cellules, un temps d’incubation, une dilution, etc…). Ainsi, cela pourra faciliter les plus grosses
manipulations du projet qui suivent. Les points dont j’ai pu parler en introduction lors du développement du
projet n’ont donc pas tous été développé lors du stage, faute de matériel et de temps.
J’ai donc effectué les manipulations sur 2 types de cellules différentes :
 TG6
 GB5
Les termes TG et GB et les chiffres derrières correspondent à un patient. C’est-à-dire que toutes les cellules
TG6 proviennent d’un seul patient et ainsi de suite.
La plupart des manipulations de mon stage se basaient sur la différenciation cellulaire. De plus, une PLA avec
traitement à la molécule d’intérêt a été effectuée lors du stage (qui sera développée par la suite). Les résultats
de ces manipulations sont mis en évidence grâce à une Immunofluorescence (la PLA étant très similaire à une
IF mais cela sera développé plus tard).
La suite du rapport va donc retranscrire les protocoles suivis au long du stage.
a) Test différenciation
La manipulation sur la différenciation cellulaire a pour but de retrouver les résultats que l’équipe a obtenu. Il
faudra donc déterminer si, lorsque les cellules se différencient, les marqueurs souches ne se situent plus dans
le noyau mais dans le cytoplasme. Il faudra donc observer les cellules morphologiquement et
fonctionnellement car une corrélation doit se produire. De plus cette manipulation vise également à mettre en
évidence l’interaction KPNB1 et facteurs de pluripotence en observant sa localisation dans la cellule. Nous
devrons donc viser différentes molécules lors de l’IF : Tout d’abord, les marqueurs souches qui sont NANOG,
SOX2 et OCT4 mais également l’importine KPNB1.
Cette manipulation va se dérouler en 2 étapes bien distinctes : Tout d’abord, l’incubation des cellules, qui
pourra nous donner un aspect morphologique des cellules, et ensuite la révélation de l’emplacement des
marqueurs souches et KPNB1 grâce à une Immunofluorescence (IF). Ainsi, ceci pourra révéler l’aspect
fonctionnel des cellules par la localisation des molécules.
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INCUBATION DES CELLULES :
Cette étape va nous permettre de créer différentes conditions de culture. Ainsi, les cellules réagiront
différemment selon la condition. Si tout se passe bien, on pourra peut-être noter certaines différences entre les
cellules.
Nous allons donc mettre à incuber les cellules sous 3 conditions différentes : une non traitée, une constituée
de 1% de SVF et enfin une dernière constituée de 5% SVF. Le SVF va agir comme un ajout de nutriments ce
qui potentiellement va accélérer le processus de différenciation cellulaire.
MATERIEL :
SECURITE :








Plaques 6 puits
SVF
NS34+ et NS34Cellules TG6/ GB5 en flasks
P 1000
Cellule de Malassez
Bleu Trypan
Pipettes 5 mL



Manipuler sous hotte à flux laminaire
Port de gants
Bleu Trypan à manipuler avec précaution !
PROTOCOLE :
Déterminer les concentrations cellulaires :
Ceci servira à prélever un nombre exact de cellules afin de les mettre à incuber durant une durée déterminée
(pouvant aller de quelques heures à plusieurs jours).




Prélever 1 mL de culture (TG6 ou GB5). Penser à bien flusher pour éclater les amas de
cellules (50 à 100 Flushs selon l’état des cellules) grâce à la pipette 5 mL et non la P1000
Parmi ce prélèvement, on reprend 50uL que l’on mélange à 50uL de Bleu Trypan. Bien
homogénéiser pour obtenir une solution bleutée.
Monter la cellule de Malassez : humidifier le doigt et le passer sur les 2 rebords indiqués
à la suite, déposer la lamelle de verre par-dessus (l’eau agit en ventouse et « colle » la
lamelle sur la cellule de Malassez)
Prélever 20 uL du mélange culture cellulaire / Bleu Trypan. Déposer le maximum sous la
lamelle placée au préalable. Le résultat final doit être que le liquide déposé doit se
retrouver entre la lamelle collée et la cellule de Malassez.
11

Observer la cellule au microscope et compter les cellules grâce au compteur dans le
cadrillage de la cellule montrée ci-dessous :
Les cellules foncées sont dites mortes et ne doivent pas être comptées.

Calculer la concentration cellulaire grâce au comptage de la manière suivante : nous avons
donc la concentration cellulaire du flask
Concentration cel = [nbr de cellules vivantes/ (nbr de
rectangles x 0.01)] x facteur de dilution x 10^3
Avec :
Concentration cellulaire : en cellules/mL
0,01 : volume en uL de 1 rectangle
Facteur de dilution : ici facteur est de 2
10^3 : passer de uL à mL
Il faut donc par la suite remettre en suspension des cellules dans les plaques 6 puits pour qu’ensuite on puisse
enchaîner sur la suite de la manipulation. Il faut également faire cela pour toutes les autres cellules que l’on
veut étudier.
Remarques avant de continuer : Avant cela, il faut savoir que cette incubation va servir pour effectuer
des lamelles IF. Or pour cette manipulation, il ne faut pas non plus mettre trop de cellules à incuber car sinon
les résultats seraient difficilement exploitables. En effet, plus il y aura de cellules moins il sera simple de
trouver des cellules isolées qui nous permettraient d’avoir de beaux résultats.
Un nombre idéal de cellules serait de 20 000 cellules par lamelles. De plus, l’incubation sur lamelles
s’effectuera sur une plaque 24 puits. Or, 1 puit sera rempli par 1mL de suspension cellulaire. Nous devons
donc faire en sorte de mettre à incuber sur les plaques 6 puits le volume idéal pour obtenir une concentration
cellulaire de 20 000 cellules/mL. Et ce tout en sachant que l’on ne fera pas qu’une seule lamelle !
12
Remise en suspension :
 Calculer le volume à prélever pour avoir le nombre de cellules voulues dans la suspension.
Nous allons montrer cela grâce à un exemple concret pour cette manipulation :
Exemple : On part d’une culture cellulaire de GB5 à 5 x 10^5 cellules/mL d’un volume de
20 mL et on cherche à incuber dans 1 puit 20 000 cellules /mL avec un volume total de 3 mL.
On fait donc :
Ci x Vi = Cf x Vf
== 5 x 10^5 x X = 20 000 x 3
== X= 60 000 / (5x10^5)
== X = 0.12 mL
Il faudra donc prélever 0,12 mL (120uL) de la culture de GB5 que l’on mettra dans chaque
puit de la plaque 6 puits.

Remplir les puits de la plaque 6 puits de la manière suivante :
Puits 1A et 1B : Vol calculé de culture + compléter
avec milieu NS34+
Puits 2A et 2B : Vol calculé de culture + compléter
avec milieu NS34- + 1% SVF
Puits 3A et 3B : Vol calculé de culture + compléter
avec milieu NS34- + 5% SVF
Calcul volume SVF :
Pour 1% :
Vsvf = Vt voulu du mélange x 1/100
Pour 5% :
Vsvf = Vt voulu du mélange x 5/100


Bien annoter les puits pour pouvoir différencier les différentes cultures.
Mettre à incuber la (les) plaque(s) à 37°C pendant le temps voulu.
La culture est donc lancée pour une durée déterminée (cette durée peut aller de 24h à plusieurs jours). Les
résultats de ces incubations seront traités plus tard dans le rapport. On arrive donc à la suite de l’expérience
avec l’IF.
13
IMMUNOFLUORESCENCE :
SECURITE :






Porter des gants et une blouse
Pour toute la partie numération et Incubation des cellules, manipuler sous la hotte à flux
laminaire pour éviter toute contamination
Manipuler les lamelles rondes avec précaution TRES FRAGILES et FACILEMENT
CASSABLES
Bien manipuler avec du matériels stériles (les lamelles rondes également)
Paraformaldéhyde 4% à manipuler sous HOTTE CHIMIQUE car VAPEURS
TOXIQUES Manipuler avec précaution ce produit car très dangereux.
Manipuler avec soin le microscope à immunofluorescence.
C’est une technique très précise mais qui emploi des moyens plutôt conséquents puisque on utilise une quantité
de produits importante. De plus, rien que l’achat du microscope est un investissement énorme et à cela on
rajoute les filtres, la note s’élève à un prix très élevé. Enfin, lorsque l’on utilise la plaque à 24 puits, il est
préférable de la réutiliser pour faire 2 séries de lamelles sinon on gaspillera énormément de plaques !
Cette manipulation doit s’effectuer 24h avant la fin de l’incubation totale voulue. Par exemple, si l’on veut
incuber les cellules 48h, il faudra les laisser 24h dans la plaque 6 puits et, ensuite, lancer cette manipulation.
Petite précision, si par hasard l’incubation voulue est de 24h alors l’étape d’avant ne dois pas être faites,
l’incubation sera directement sur lamelles comme retranscrit ci-dessous.
Pour cette manipulation, il faut donc :



















Plaque à 24 puits
Lamelles rondes en verres de diamètre 12 ou 14 mm
P100, P200, P20
Cultures GB5/ TG6/GB1 incubées avant grâce au protocole ci-dessus
Pipetman automatique
Pipettes graduées 10 mL
PBS
Polylysine à 200 ug/mL
Paraformaldéhyde 4%
NH4Cl
Tampon de saturation (DMEM 10% sérum + Triton 100X 0.2%)
Aiguille
Anticorps primaires Nanog, Sox 2, Oct 4 et KPNB1
Anticorps secondaires en adéquation avec les primaires
Réactif de Hoescht
Lamelle pour microscope
Milieu Permafluor
Pince inversée
Eau distillée
14
PROTOCOLE A SUIVRE : Le protocole va se diviser en plusieurs parties bien distinctes :




Incubation des cellules
Fixation au formaldéhyde
Hybridations
Montage des lamelles
Incubation des cellules :








Prendre la plaque à 24 puits et déposer dans un nombre de puits adéquat
selon le nombre de molécules à tester 1 lamelle ronde en verre. Pour que
ce soit plus simple et qu’il y ait moins de risque de casser les lamelles, on
peut utiliser l’aspiration automatique.
Marquer la plaque de manière à bien identifier chaque incubation qui sera
faite dans chaque puit pour ne pas faire d’erreurs par la suite.
Rajouter dans chaque puit avec une lamelle, 400 uL de Polylysine à 200
ug/mL. Faire en sorte de bien recouvrir la lamelle en entier, pour que la
polylysine fasse effet.
Refermer la plaque et incuber 30 min (minimum) à 37°C
Ce temps écoulé, ressortir la plaque de l’incubateur
Vider les puits de la polylysine et rincer les lamelles au PBS 3 fois. Bien
laisser les lamelles dans les puits tout le temps de la manipulation.
Mettre dans chaque puit 1 mL de cultures provenant de la plaque 6 puits
de l’incubation précédente. Faire attention à bien mettre les bonnes
cellules dans les bons puits. (Par exemple, GB1 CSG avec GB1 CSG, GB1
1% avec GB1 1%) et faire en sorte de ne pas créer de bulle sous la lamelle.
Vérifier s’il y a plus ou moins la même quantité de cellules dans chaque
puit, refermer la plaque et incuber 24h à 37°C.
Cette étape va permettre aux cellules de se « coller » sur les lamelles de verre. Ainsi on pourra les observer
plus tard au microscope.
Fixation au formaldéhyde : Ayant pour rôle de fixer les cellules par des liaisons covalentes entre les
protéines

Après l’incubation, observer les cellules au microscope inversé pour
voir si les cellules sont bien fixées. Le résultat à obtenir est montré
ici


Si les cellules sont bien fixées, retirer le milieu des puits
Sous la hotte chimique, ajouter 500 uL de paraformaldhehyde dans
chaque puit avec une lamelle.
Refermer la plaque et laisser incuber 15 min à température ambiante.

15



Retirer la paraformaldhehyde et rincer 3 fois au PBS toujours sous
la hotte chimique.
Rajouter 500 uL de NH4Cl dans chaque puit et laisser incuber 5 min
à température ambiante. La manipulation ne se fait plus sous hotte
chimique.
Retirer le NH4Cl et rincer 3 fois au PBS
Remarque : Il est possible de stopper la manipulation juste après cette étape et conserver les cellules pour
plus tard. Il suffit juste de laisser du PBS dans les puits avec les lamelles (et donc les cellules) et mettre la
plaque au frigo.
J’ai eu l’occasion de stopper cette manipulation ici car j’ai dû tester différents temps d’incubation pour avoir
plus ou moins une idée du déroulement de la « disparition » des marqueurs souches du noyau. Partant de cet
objectif-là, Brenda m’a spécifié qu’il était très important de pouvoir comparer les différentes cellules entre
elles. Et pour cela il faut que les conditions d’expérimentation dans la suite de la manipulation soient LES
MÊMES. C’est-à-dire que les temps d’incubation avec les anticorps, qu’ils soient primaires ou secondaires,
soient pareils entre les différentes conditions (24h ,48h, 72h…). Or si par exemple, je ne stoppais pas
l’expérience et que je continuais sur les hybridations, trop de facteurs extérieurs devraient être pris en
considération pour qu’ensuite on puisse comparer les cellules à la fin. Il est donc PRIMORDIAL de conserver
les lamelles pour poursuivre la manipulation plus tard avec toutes les conditions réunies pour pouvoir par la
suite effectuer une comparaison. Certes la quantité de lamelles à faire peut devenir importante selon le test
effectué mais les résultats seront beaucoup plus fiables avec ce déroulement.
Hybridations :
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









Ajouter 500 uL de tampon de saturation dans chaque puit pour saturer
et perméabiliser les cellules. Laisser incuber 30 min à température
ambiante.
Prendre les anticorps « primaires » pour les molécules à tester et les
diluer au 1/100 dans le tampon de saturation.
Voir en Annexe 2 comment on va « imprégner » les lamelles en verre
des anticorps des 2 types.
Déposer une feuille de parafilm assez grande sur le verre pour
pouvoir déposer le nombre de gouttes nécessaire pour imprégner
toutes les lamelles.
Grâce à une pipette automatique, déposer des gouttes de l’anticorps
« primaire » dilué toutes espacées entre elles.
A l’aide d’une aiguille et d’une pince inversée, retirer les lamelles des
puits et les déposer sur les gouttes. ATTENTION : bien déposer la
lamelle sur la goutte côté où les cellules se sont fixées ! Et aussi
garder la même disposition qui a été faites sur la plaque ne
surtout pas mélanger les lamelles.
Laisser incuber les lamelles 2 à 3h à température ambiante.
Prendre une autre feuille de parafilm, la poser à côté du socle et
disposer des gouttes de PBS de la même manière que les gouttes
d’anticorps.
Prendre les lamelles et les déposer de la même manière sur les gouttes
de PBS
Répéter l’action 3 fois. Ceci constitue le rinçage des lamelles au PBS.
Prendre les anticorps « secondaires » correspondant aux
« primaires », les diluer au 1/400 dans le tampon saturé. Dans le
même mélange, diluer le Hoescht au 1/2 000.
16



Disposer les gouttes de la même manière que l’anticorps « primaire ».
Déposer également les lamelles. Laisser Incuber 1h à température
ambiante.
Rincer 3 fois au PBS. (Même technique qu’avant)
Rincer 1 fois à l’eau distillée.
Remarque : Les anticorps secondaires sont ceux qui vont permettre de voir la localisation des molécules
visées. En effet, les anticorps secondaires, qui viennent se fixer sur l’anticorps primaire cible, possèdent un
fluorochrome qui va émettre une longueur d’onde correspondant à une couleur. Ainsi, on essaye d’associer
une couleur à une seule molécule pour pouvoir les différencier entre elles.
De plus, il faut savoir que les anticorps que possède le laboratoire proviennent de souris, de lapin et de chèvre.
C’est pour cela que chaque anticorps primaire aura une lettre juste après : M pour mouse (souris), G pour goat
(chèvre) et R pour rabbit (lapin). Ainsi les anticorps secondaires se choisissent en fonction de quel animal
provient le primaire.
Montage de la lamelle :





Prendre une lamelle à microscope. Déposer une goutte de milieu
Permafluor. Faire en sorte de laisser de l’espace pour encore 2 ou
même 3 gouttes à côté selon le nombre de conditions effectuées (ici
on aura un total de 3 gouttes par lamelle).
Prendre la lamelle ronde et la déposer sur la goutte de Permafluor
face avec les cellules fixées vers la goutte.
Faire une lamelle à microscope pour 1 type de cellule avec les 3
conditions citées au début (Ex : TG6 NT, 1% et 5%).
Laisser sécher soit 24h à température ambiante soit dans un
incubateur à 37°C.
Observer les cellules au microscope à immunofluorescence. Voir
Annexe 3 pour le microscope utilisé.
Ce protocole ne donne aucun chiffre mais il faut savoir qu’il est possible de tester 1 comme 2 anticorps
« primaires » en même temps. Il suffit juste de bien doser les anticorps pour ainsi faire des gouttes constituées
des 2 anticorps et aussi de rajouter les bons anticorps « secondaires » après qui pourront faire ressortir les
molécules à l’observation.
L’utilisation du microscope à immunofluorescence est plutôt simple puisque presque tout se fait grâce à un
ordinateur. En effet, le microscope est relié à l’ordinateur qui fait office d’objectif pour regarder les cellules.
De plus, le microscope est relié à une source lumineuse à différentes longueurs d’ondes. Elles vont du visible
vers le rouge lointain qui est invisible à l’œil nu mais visible grâce à l’ordinateur. Ainsi les recherches sont
plus poussées et même plus précises ce qui facilite le travail des chercheurs
17
b)
PLA (Proximity Ligation Assay)
Cette manipulation se base sur un principe semblable à l’IF. En effet, la finalité va être de détecter un signal
fluorescent dans la cellule. Cependant cette fois ce ne sera pas pour situer une protéine en particulier mais
plutôt situer une LIAISON entre 2 protéines.
C’est une technique qui va permettre de mettre en évidence les interactions protéiques par le biais d’anticorps
(primaires et secondaires comme l’IF). Le principe est expliqué ci-dessous :
Principe PLA illustré :
La PLA débute par la liaison d’anticorps de
différentes espèces à 2 protéines d’intérêt, dans
ce cas protéine * et protéines #
Par la suite, on incube avec des anticorps secondaires appelés
aussi sondes PLA qui sont dirigés contre les régions constantes
des Ac primaires. Ces sondes se lient aux Ac primaires. La
particularité de ces dernières est qu’elles possèdent chacune une
courte séquence spécifique d’ADN sur sa partie constante. Ces
brins d’ADN sont essentiels puisque c’est grâce à ces brins que
l’on pourra détecter la liaison protéique.
Si ces sondes sont à proximités l’une de l’autre (c’est-à-dire si
les 2 protéines d’intérêt visées sont liées entre elles), les 2 brins
d’ADN vont participer à la synthèse de l’ADN en cercle. Ceci
signifie donc que les 2 brins sont liés entre eux.
Cependant le processus ne s’arrête pas là ! La réaction de synthèse
de l’ADN entraîne une amplification de plusieurs centaines de
cercles d’ADN.
Enfin des sondes d’oligonucléotides complémentaires
fluorescentes sont ajoutées et se lient à l’ADN amplifié. Ainsi lors
de l’observation au microscope, un signal fluorescent devrait
apparaître. Si c’est le cas, cela signifie que la liaison des sondes
s’est produite et que les 2 protéines d’intérêt sont donc liées entre
elles.
18
Des résultats seront montrés à la
suite du rapport
Ainsi le principe de la PLA vu, le protocole peut être aborder. On retrouve le protocole que l’on a pu me donner
lors de mon stage en Annexe 4 en anglais. Pour plus de compréhension, ce protocole va être retranscris à la
suite pour apporter plus d’informations et l’appliquer à notre étude entreprise.
Comme on a pu le voir en introduction, l’importine KPNB1 est un facteur primordial dans le transport de
marqueurs souches vers le noyau cellulaire. C’est donc cette protéine qui permet aux cellules de retourner à
l’état souche et donc d’être résistante au traitement. Or nous avons également dit que la molécule DVXXX
inhiberai KPNB1. Nous allons donc essayer de le montrer à travers cette expérience.
Nous allons donc chercher avec cette manipulation à voir si les liaisons entre KPNB1 et le marqueur souche
NANOG sont maintenues lorsque les cellules sont traitées au DVXXX.
Cette expérience se fait grâce au kit décrit en Annexe. Nous avons donc :
MATERIEL :





Réactifs kit Duolink PLA :
 Sondes PLA 5x PLUS et MINUS de différentes espèces (pour nous le PLUS sera
rabbit et le MINUS sera mouse)
 Solution de blocage (permet de figer les échantillons avant l’incubation avec les
anticorps)
 Diluant anticorps (pour diluer les sondes PLA et, éventuellement, les anticorps
primaires)
 Solution mère de ligation 5x (à diluer à 1x)
 Ligase 1U/uL (ajouté afin de faire la solution de ligation)
 Solution mère d’Amplification 5x (à diluer à 1x)
 Polymérase 1U/uL (ajouté pour faire la solution d’amplification)
 Tampon de rinçage A et B 1X
 Liquide de montage Duolink avec DAPI
Anticorps primaires au choix selon la protéine cible à détecter. L’espèce d’où provient
l’anticorps doit être en accord avec les sondes du kit (mouse, rabbit ou goat). Pour notre
manipulation, nous prendrons NANOG rabbit, KPNB1 mouse et SHH rabbit (témoin de la
manipulation sera développé dans les résultats)
Eau Mili Q
Cellules à tester (ici on utilise des TG6 non traitées et traitées au DVXXX et des GB5 dans
les mêmes conditions. Les cellules sont laissées à incuber pendant 48h)
Equipement de laboratoire :
 Microscope à fluorescence
 Plaque 24 puits
 Lamelles IF
A faire avant le début de la manipulation :



Préparer les tampons de rinçage A et B dans 1L d’eau Mili Q. Ces tampons peuvent être conservés
pour plusieurs PLA (plus ou moins 2 semaines à T° ambiante ou plusieurs mois à 4°C). Faire en sorte
que les tampons soient à T° ambiante lors de l’utilisation.
Préparer le tampon de rinçage B à 0.01X en partant de 1X dans de l’eau Mili Q.
Diluer les réactifs du Kit PLA cités auparavant. Note importante : Ne jamais prendre des réactifs déjà
dilués. Les risques de mauvaise conservation sont trop élevés.
19
PROTOCOLE A SUIVRE :
Le protocole donné en Annexe doit être ajusté afin d’avoir un volume idéal pour le nombre d’échantillons à
tester. Ici nous aurons donc 8 échantillons : TG6 NT avec SHH / KPNB1, TG6 NT avec NANOG/ KPNB1,
TG6 DVXXX avec SHH/ KPNB1, TG6 DVXXX avec NANOG/ KPNB1 et 4 autres avec les mêmes
conditions mais les cellules sont les GB5. Il faut savoir que pour 1 échantillon le volume idéal pour recouvrir
la lamelle est de plus ou moins 40 uL.
Toutes les incubations devront être faites en chambre humide (en fait la même que celle que l’on voit en
Annexe 2) et toutes les étapes de lavage seront faites à T° ambiante.
Avant de commencer à proprement parler le protocole de PLA, les cellules doivent être traitées et incubées
24h en plaque 6 puits et puit sur lamelles dans une plaque 24 puit pendant encore 24h.
Ensuite le pré-traitement des cellules doit également être fait afin de fixer et perméabiliser les cellules.
Ces étapes sont en fait exactement les mêmes que l’IF vue auparavant (pages 14 à 16 sans l’hybridation) et
que le début du test de différenciation (qui correspond à l’incubation même des cellules) mais il y a une
différence : au lieu d’utiliser du SVF, on utilise la molécule d’intérêt qui est le DVXXX.
Ainsi, le protocole vu de la page 11 à 13 reste le même pour cette manipulation mais à un point près : au lieu
d’avoir 3 conditions par cellules nous en auront 2, une non traitée (NT) et une traitée avec 10uM de DVXXX
(cette concentration est la plus idéale dans le traitement puisque comme on l’a vu en Annexe 1 la molécule
agit). De plus nous devrons faire suffisamment de volume afin encore une fois d’avoir 20 000 cellules/mL.
Les calculs vus sur le protocole Test différenciation restent donc les mêmes.
Lorsque tout cela est fait, le protocole peut être engagé.
Le protocole se divise en plusieurs parties pour pouvoir mieux comprendre la manipulation que l’on effectue :
 Blocage des cellules
 Incubation anticorps primaire
 Incubation avec sondes PLA
 Ligation
 Amplification
 Derniers rinçages
 Préparation pour imagerie future
Blocage :



Vortexer la solution de blocage Duolink du kit
Ajouter dans les 8 puits de la plaque, plus ou moins 40 uL de cette
solution en faisant attention que la lamelle soit bien recouverte.
Laisser incuber 1h à 37°C
Incubation anticorps primaire : (Ne laisser pas sécher les lamelles avant l’incubation. Sinon cela
comporte un risque que lors de l’observation un bruit de fond apparaisse)
 Vortexer le diluant pour anticorps du Kit
 Diluer les anticorps primaires utilisés avec le diluant. Pour notre cas
présent, nous aurons donc 2 mélanges : SHH + KPNB1 et NANOG +
KPNB1. En sachant que, la dilution idéale pour nos anticorps est de 1/100
et que pour chaque mélange il faut un volume suffisant pour 4 lamelles,
1 mélange aura donc un volume total de 200 uL (40 X 4= 160 mais
toujours prendre au-dessus) et les volumes d’anticorps seront de 2 uL
chacun + 194 uL de diluant.
 Retirer la solution de blocage des puits
 Disposer des gouttes de plus ou moins 40 uL de la même manière que
celle vue en IF (Annexe 2). Faire attention à bien faire correspondre le
puit et la goutte pour ne pas se tromper.
 Incuber pendant au moins 2h les lamelles en chambre humide (Annexe 2)
à T° ambiante.
20
Incubation avec sondes PLA :
 Vortexer les solutions PLUS et MINUS
 Diluer les 2 solutions au 1/5 dans le diluant d’anticorps du Kit. Faire un
volume suffisant pour tous les échantillons. Pour notre cas, nous avons 8
échantillons, soit 8 x 40 = 320 uL il faudra donc faire 350 uL de solution
pour en avoir suffisamment. Il faudra donc mettre 350/5 = 8uL de solution
PLUS et 8 aussi de MINUS + 334 uL de diluant d’anticorps.
 Déposer 8 gouttes de solution de rinçage A toujours de la même manière
que l’Annexe 2. Bien garder la même disposition des lamelles pour ne
pas se tromper.
 Rincer donc les lamelles dans la solution de rinçage A 2 x 5 min à T°
ambiante.
 Déposer les 8 gouttes de mélanges de sondes toujours comme en Annexe
2 et déposer les lamelles par-dessus.
 Laisser incuber en chambre humide pendant 1h à 37°C
Ligation : Bien attendre la dernière seconde pour rajouter la ligase dans le tampon de ligation. Bien
s’assurer également que le tampon de ligation est complètement décongelé et bien mélangé.






Diluer le tampon de ligation 5X du kit au 1/5 dans de l’eau Mili Q. Faire
suffisamment pour tous les échantillons. Pour notre cas, nous avons
toujours 8 échantillons soit à faire 350 uL de solution avec 70uL de
tampon + 280uL d’eau Mili Q.
Rincer les lamelles comme en Annexe 2 avec la solution de rinçage A 2
x 5 min.
Pendant les rinçages, sortir la Ligase du congélateur et la laisser
décongeler. ATTENTION : Pour décongeler la Ligase, poser le tube
de Ligase sur la glace pour ne pas avoir de choc thermique.
Rajouter la Ligase dans le tampon dilué qui a été fait auparavant en le
diluant au 1/40. Il faudra donc : + ou – 9uL de Ligase + 341uL de tampon
dilué.
Déposer les 8 gouttes et déposer les lamelles dessus avec la technique
habituelle.
Laisser incuber 30 min en chambre humide et à 37°C
Amplification : Comme la ligation, bien attendre la dernière seconde pour rajoute la polymérase. De
plus, le tampon d’amplification est sensible à la lumière il est donc primordial de protéger toutes les
solutions de la lumière ; Il est donc si possible recommandé de manipuler la lumière éteinte.
 Diluer le tampon d’Amplification 5X du kit au 1/5 dans de l’eau Mili Q.
Faire suffisamment pour tous les échantillons. Pour notre cas, nous avons
toujours 8 échantillons soit à faire 350 uL de solution avec 70uL de
tampon + 280uL d’eau Mili Q.
 Rincer les lamelles comme en Annexe 2 avec la solution de rinçage A 2
x 5 min.
 Pendant les rinçages, sortir la Polymérase du congélateur et la laisser
décongeler. ATTENTION : Pour décongeler la Polymérase, poser le
tube de Ligase sur la glace pour ne pas avoir de choc thermique.
 Rajouter la Polymérase dans le tampon dilué qui a été fait auparavant en
le diluant au 1/80. Il faudra donc : + ou – 4.5uL de Polymérase + 345.5uL
de tampon dilué.
 Déposer les 8 gouttes et déposer les lamelles dessus avec la technique
habituelle.
 Laisser incuber 100 min en chambre humide et à 37°C
21
Derniers rinçages : Les réactifs sont toujours sensibles à la lumière. Garder donc les lamelles à l’abri
de la lumière (si possible donc en lumière éteinte).
 Rincer les lamelles 2 x 10 min avec la solution de rinçage B 1X à T°C
ambiante.
 Rincer une dernière fois avec la solution de rinçage B à 0.01X pendant 1
min.
Préparation pour imagerie future : Le liquide de montage du kit est très liquide et ne se solidifie pas.
Du vernis à ongles clair peut être utilisé pour sceller les bords de la lamelle. Faire attention de ne pas
avoir de bulles d’air sous la lamelle.
 Prendre une lame à microscope. Déposer une goutte du liquide de
montage du kit. Il est préférable de mettre 2 lamelles par lame (Une
lamelle NT et une autre DV) Nous devrons donc faire 4 lames avec
chacune une condition NT et l’autre condition DV. Bien sûr, les lamelles
devront être IDENTIQUES c’est-à-dire que par exemple il faudra mettre
TG6 SHH/KPNB1 NT avec TG6 SHH/KPNB1 traité au DVXXX.
 Prendre la lamelle ronde et la déposer sur la goutte de face avec les
cellules fixées vers la goutte.
 Laisser reposer 15 min avant d’observer les lames au microscope à
immunofluorescence. Voir Annexe 3 pour le microscope utilisé.
 Après avoir finis l’observation, il est possible de conserver les lames à
l’obscurité à 4°C pour 4 jours ou sinon à -20°C pour au moins 6 mois.
Les résultats de l’expérience seront traités plus tard mais on garde le même principe que l’immunofluorescence
c’est-à-dire qu’il faut voir un signal sous forme de couleurs. Pour la PLA et dans notre cas les couleurs à voir
sont Bleues (pour le noyau) et rouge (pour la liaison).
22
Annexe 5
Test Différenciation cellulaire GB5
CSG
Incubation
préliminaire
Grossissement
x10
NANOG
KPNB1
OCT4
SOX 2
1%
5%
III. Résultats et discussion
Les résultats seront traités au cas par cas selon la manipulation effectuée. Nous garderons le même ordre que
les expériences décrites auparavant.
a) Test différenciation
Pour cette manipulation, plusieurs résultats sont à traiter. En effet, il y a tout d’abord les résultats de
l’incubation et ensuite les résultats de l’IF. Nous traiterons les résultats par type cellulaire. Il est donc possible
de voir les résultats en Annexe.
Rappelons qu’un des objectifs du laboratoire est de caractériser l’inhibition du transport nucléaire de NANOG
au cours de la différenciation des CSG induite par du sérum. L’objectif des expériences suivantes a été de
vérifier que les cellules actuellement en culture aux laboratoires ont gardé leur capacité à se différencier dans
des conditions de culture en sérum.
Nous débutons d’abord avec les cellules GB5. Annexe 5
Résultats : Après 4 jours d’incubation, on constate des différences de morphologie entre les
différentes conditions de culture. En effet, on constate que sur les images incubation préliminaire de l’Annexe,
pour la condition CSG (donc sans ajout de sérum) les cellules sont en forme de sphères et en amas entre elles,
tandis que, les conditions 1% et 5% sérum ont une morphologie bien différente que la première condition. Il
est facile de constater cette différence morphologique sur l’annexe : les conditions sérum montrent une
morphologie cellulaire typique de cellules différenciées avec un cytoplasme plus étalé et un novau plus petit.
Ces cellules sont adhérentes et forment dans la boite de culture un réseau en « toile d’araignée ». Il est
également possible de voir qu’entre les conditions 1% et 5% une différence est également présente. En effet,
la condition 1% montre des cellules en toile d’araignée mais également des cellules sphériques probablement
pas différenciées amassées un peu partout tandis qu’à 5% de sérum toutes les cellules sont adhérentes étalées
sans amas de cellules rondes.
Quand on passe aux résultats de l’IF, on constate également certaines différences entre les conditions
et les protéines cibles.
Concernant NANOG, on peut voir que, tout d’abord, un signal est présent pour toutes les conditions.
Cependant, le signal est situé à différents endroits selon l’incubation qui a été faite. En effet, sur la condition
CSG, le signal de NANOG est un peu diffus dans la totalité des cellules, on ne le retrouve pas uniquement sur
une zone, tandis que, pour la condition 1% sérum on arrive à discerner que NANOG se situe principalement
dans le noyau cellulaire. Enfin, lorsque l’on passe à 5% sérum on retrouve la même disposition que pour les
CSG : NANOG se situe un peu partout dans la cellule.
Pour KPNB1, on retrouve un peu les mêmes résultats que NANOG. Pour les conditions CSG et 5%,
le signal est un peu partout dans la cellule tandis que pour 1% le signal est plus nucléaire. On peut également
noter que le résultat à 5% est un peu flou, cependant, ce résultat est le meilleur que l’on ait pu trouver.
Pour OCT4, les résultats sont différents. En effet, on constate que pour la condition CSG, le signal se
situe au niveau du noyau et uniquement du noyau. Le léger signal vert que l’on peut voir autour n’est autre
que du bruit de fond. Pour 1% et 5%, le signal englobe la cellule entière c’est-à-dire noyau plus cytoplasme.
Enfin pour SOX2, on peut constater que pour les 3 conditions le résultat est similaire : le signal reste
ciblé dans le noyau. Cependant, on peut voir que le signal est beaucoup moins intense lorsque l’incubation est
à 5% sérum comparé aux 2 autres conditions, le noyau est moins marqué.
23
Discussion :
Tout d’abord, l’aspect morphologique. On a constaté qu’il y avait 2 morphologies différentes entre les
cellules : en forme de sphères dans les conditions CSG et en « toile » pour les conditions avec du sérum. Or
ces 2 formes caractérisent chacune 1 état cellulaire. Lorsque les cellules à l’état souches elles seront
sphériques et en amas tandis que lorsque les cellules sont différenciées elles auront un aspect de « toile ». On
peut donc dire que les conditions sans ajout de sérum sur notre manipulation nous maintiennent les GB5 à
l’état de cellule souche. Néanmoins, si on ajoute du SVF les cellules vont adopter une morphologie de
cellules différenciées. L’ajout de sérum induit bien une morphologie de cellules différenciées cependant la
différenciation cellulaire nécessite la répression de l’expression des marqueurs souches ou à minima leur
exclusion du noyau des cellules. Les résultats des immunofluorescences montrent à contrario dans certaines
conditions le maintien de l’expression de NANOG, OCT4 et SOX2. En effet nos résultats nous montrent des
localisations parfois étranges et qui ne sont pas vraiment en adéquation avec un cas de différenciation
cellulaire. Ces étrangetés sont notamment visibles concernant NANOG et KPNB1. En effet, la présence du
marqueur souche et l’importine dans la totalité de la cellule pour les conditions CSG et 5% nous montrerais
que les cellules entament leur processus de différenciation. En revanche à 1% de sérum, on retrouve du
signal uniquement dans les noyaux : donc bien qu’adhérentes, les cellules maintiennent dans ces conditions
un phénotype souche.
Contrairement à NANOG et KPNB1, les résultats des marqueurs souches OCT4 et SOX2 sont un peu plus
prometteurs. En effet, de manière intéressante le marqueur OCT4 nous montre que la différenciation s’est
produite puisque le signal passe du noyau au cytoplasme lorsque l’on ajoute du SVF ce qui, comme nous
l’avons dit, est caractéristique d’une différenciation : les marqueurs souches changent de localisation dans la
cellule ou bien disparaissent. C’est pour cela que l’on peut également introduire le résultat de SOX2. En
effet, les résultats nous montrent que plus on ajoute du SVF plus le signal de SOX2 va diminuer. Cette «
disparition » progressive est un facteur montrant également le phénomène de différenciation. Ainsi, grâce
aux résultats de SOX2 et d’OCT4, on peut cette fois-ci supposer que la différenciation a bien fonctionné et
sont en adéquation avec les l’aspect morphologique adhérent des cellules.
En conclusion les résultats de ces expériences montrent que les cellules subissent un début de différenciation
plus marqué dans des conditions 5% sérum mais dont le temps d’incubation en sérum, nécessite d’être
prolongé pour engager les CSG vers une différenciation terminale. Cet état de différenciation terminal est
atteint lorsque tous les marqueurs souches sont réprimés. Des temps d’incubation plus long devront donc être
testés.
24
Annexe 6
Test Différenciation cellulaire TG6
1%
CSG
Incubation
préliminaire
Grossissement
x10
NANOG
KPNB1
OCT 4
SOX 2
5%
Passons maintenant aux TG6 : Annexe 6
Résultats : Après 4 jours d’incubation, on constate des différences de morphologie entre les différentes
conditions de culture. On retrouve les mêmes différences constatées avec les GB5 mis à part que la toile qu’on
retrouve est moins importante mais c’est aussi car il y a moins de cellules.
Quand on passe aux résultats de l’IF, on constate également certaines différences entre les conditions et les
protéines cibles.
Concernant NANOG, on peut voir que, tout d’abord, un signal est présent pour toutes les conditions comme
pour les GB5. Cependant les résultats entre ces 2 types de cellules ne sont pareils. En effet, sur la condition
CSG, le signal de NANOG est situé principalement dans le noyau des cellules (on peut voir la superposition
noyau en bleu et NANOG en vert sur la photo). Lorsque l’on rajoute 1% de SVF, le signal s’étend dans le
cytoplasme (il est plus difficile de discerner le noyau) et quand on ajoute 5% on ne discerne même plus les
noyaux, le signal est dans la totalité de la cellule.
Pour KPNB1, on constate une ressemblance parmi les 3 résultats. En effet, on peut voir que le signal se situe
principalement tout autour du noyau cellulaire. On constate bien des espaces obscurs correspondant aux
noyaux. On peut tout de même voir que sur le résultat 5%, le signal est un petit peu plus diffus dans la cellule.
Pour OCT4, les résultats sont un peu plus flous. Sur la condition CSG, on peut voir que le signal est diffus
dans la cellule mais un peu différent de tout les autres que l’on a pu voir. On n’arrive pas spécialement à
déterminer noyau et cytoplasme. Pour 1% SVF, le signal est présent de partout mais on peut constater que la
forme du noyau peut être discernée : le signal est un petit peu plus sombre. Enfin pour 5% de SVF, le signal
est beaucoup plus intense dans toute la cellule et noyau et cytoplasme ne sont pas discernables.
Enfin pour SOX2, on peut constater que les résultats sont similaires à ceux de NANOG. C’est-à-dire que,
lorsque l’on n’ajoute pas de SVF, le signal est nucléaire. Et plus on rajoute du SVF, plus le signal se situe dans
le cytoplasme. Même si dans la condition 5%, il reste du signal dans certains noyaux.
Discussion : Grâce aux résultats, il est encore possible d’hypothéquer et interpréter pour ainsi les
expliquer au mieux.
Les remarques sur l’aspect morphologique restent les mêmes que les GB5 faites auparavant :
Morphologiquement parlant les cellules sont différenciées puisque leur aspect est significatif de l’état
différencié.
Quand on passe à l’aspect fonctionnel, les résultats des cellules TG6 sont plus prometteurs que les GB5. En
effet, on constate que tout les marqueurs souches (NANOG, OCT4 et SOX2) passent du noyau au cytoplasme
quand on ajoute du SVF. Ce qui nous met sur la piste que les cellules sont entièrement différenciées.
Concernant KPNB1, on constate que cette localisation tout autour du noyau pourrait également caractériser
l’état différencié des cellules. En effet, KPNB1 dans une cellule, qu’elle soit souche ou différenciée, peut se
situer dans le cytoplasme (et dans le noyau lorsque la cellule est souche). Etant un transporteur de marqueurs
souches, il est logique de retrouver l’importine dans le cytoplasme puisqu’elle traverse la paroi nucléaire pour
rentrer dans le noyau. Ainsi, ces résultats sur l’aspect fonctionnel sont bien meilleurs que ceux des GB5 où
l’on retrouvait des incohérences sur les localisations. Ici, les résultats morphologiques et fonctionnels sont
donc en adéquation et peuvent prouver un phénomène de différenciation.
En définitive, la manipulation sur les TG6 est assez fiable, les cellules sont potentiellement différenciées
morphologiquement et fonctionnellement.
25
Annexe 7
b) PLA
Pour cette manipulation, nous avons 1 résultat à analyser qui sont ceux des TG6 au bout de 48h de traitement
au DVXXX.
Rappelons que cette expérience nous sert à voir si les liaisons entre KPNB1 et le marqueur souche NANOG
sont maintenues lorsque les cellules sont traitées au DVXXX.
On peut voir les résultats en Annexe 7
Résultats : Après les 48h d’incubation, on constate des différences selon la condition observée.
Commençons par la liaison SHH/KPNB1, on constate qu’il n’y a aucun signal présent. Pourtant comme l’on
voit sur le filtre DAPI les cellules sont bien présentes.
Concernant NANOG/KPNB1, au bout de 48h d’incubation non traitées, des liaisons sont présentes sur la
totalité des cellules. Le signal est plutôt clair et net donc les résultats sont d’autant plus exploitables.
Cependant, lorsque les cellules sont traitées au DVXXX, on constate une différence qui est plutôt discernable.
En effet, quand on traite les cellules à la molécule d’intérêt, on constate 2 choses. Tout d’abord, on constate
que l’intensité du signal est beaucoup plus faible que sur la condition non traitée. De plus, on constate qu’il y
a moins de « points rouges » et donc de liaisons entre NANOG et KPNB1.
Discussion :
Même si ces résultats sont en nombre moins important que ceux du test de différenciation, ils n’en sont pas
moins prometteurs bien au contraire.
Tout d’abord parlons de nos témoins. Nous avons le témoin positif avec la liaison NANOG / KPNB1 et notre
témoin négatif SHH / KPNB1. Or il faut savoir que la protéine SHH et l’importine KPNB1 ne peuvent pas se
lier entre elles. Notre résultat nous montre donc qu’il n’y a pas de signal, ainsi cela est logique car ces 2
éléments ne peuvent pas se lier entre eux. Notre témoin négatif est donc confirmé par notre résultat.
Concernant le témoin positif, comme nous en avons parlé en introduction, l’importine KPNB1 se lie à NANOG
pour la transporter vers le noyau cellulaire. Pour valider notre résultat, il faudrait donc que la liaison NANOG/
KPNB1 se produise et cela est le cas. Nos résultats nous montrent un signal très clair. Nous pouvons donc
valider notre témoin positif également. Nous pouvons donc voir un résultat où les liaisons s’effectuent et un
résultat où il n’y a aucune liaison. Il sera donc plus simple de pouvoir effectuer une comparaison entre les
cellules non traitées et traitées au DVXXX.
Ainsi lorsque l’on regarde notre résultat traité, on constate que le signal est beaucoup plus faible que notre
témoin positif, montrant clairement une large diminution de la liaison entre NANOG et KPNB1. On peut donc
conclure que le DVXXX est très efficace pour bloquer la liaison entre KPNB1 et NANOG. Ces résultats
confirment très bien ceux de Brenda Queron qui a pu montrer au cours de son master, que l’utilisation du
DVXXX induit une exclusion nucléaire de NANOG dans les GSC. La molécule inactive donc le transport
médié par KPNB1, des marqueurs souches tel que NANOG vers le noyau des cellules. Ce mode d’action du
DVXXX force les cellules à maintenir un état différencié et donc plus sensible aux traitements conventionnels.
KPNB1 est une molécule exprimée dans toutes les cellules d’un organisme et assure le transport nucléaire de
la majorité des protéines nucléaires. Par conséquent le ciblage de ce transporteur nucléaire n’apparait pas
spécifique des cellules tumorales. Le fait que l’utilisation du DVXXX ne soit pas léthal pour les cellules,
montre que l’inhibition de KPNB1 par le DVXXX ne concerne pas les facteurs de survie cellulaire,
contrairement aux effets des inhibiteurs chimiques commerciaux qui deviennent très rapidement toxiques. Il
apparait alors que l’inhibition de KPNB1 par le DVXXX soit sélective de certaines protéines nucléaires comme
NANOG présent dans les CSG, mais absent dans toutes les cellules somatiques adultes de l’organisme, Cette
observation est très importante car elle montre très clairement une spécificité d’action du DVXXX résidant
dans l’inhibition du transport nucléaire de facteurs uniquement présent dans les cellules souches de
glioblastome tout en épargnant le transport de facteurs de survie. Ce mode d’action spécifique des cellules
souches cancéreuses permettra d’éviter les dommages collatéraux trop souvent rencontrés lors de l’utilisation
de radio et chimiothérapies.
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IV. Conclusion Scientifique
On peut donc conclure sur nos manipulations qui sont dans la globalité un succès. En effet, nos résultats sont
en adéquation avec ceux trouvés par l’équipe et sont mêmes positifs pour la suite de la recherche. Notre test
de différenciation nous a prouvé que les marqueurs souches ont des localisations bien distinctes selon l’état
cellulaire observé (soit cellules souches soit cellules différenciées). Cette molécule DVXXX est une voie très
prometteuse pour aider à combattre ce cancer. De manière très intéressante, le DVXXX « affaiblit » les cellules
en les maintenant à l’état de cellules différenciées en empêchant le transport des marqueurs souches vers le
noyau. Sous cet état, comme nous l’avons dit au long de ce rapport, les cellules sont beaucoup plus sensibles
aux traitements conventionnels comme le Témozolomide. Ainsi, le DVXXX est un complément qui pourrait
rendre beaucoup plus efficace le combat contre ce cancer
V.
Conclusion Personnelle
Ce stage, effectué encore une fois dans l’équipe Virolle, est mon 2ème lors de mon BTS. Il m’a une nouvelle
fois permis de constater l’importance de chaque membre dans une équipe de recherche et de chaque
manipulation dans le laboratoire. De plus, ce stage m’a appris à être prévoyant lorsque les manipulations sont
lourdes en matériel et longues à mettre en place. Ainsi, il m’a également permis de devenir plus indépendant
et constant dans mon travail.
En parallèle, il m’a rappelé qu’une recherche scientifique est un processus long et qui prend beaucoup de
temps, de matériel, d’argent et de conditions pour la mener à bien jusqu’au bout et aboutir à des résultats
positifs et utiles. Ainsi, il est primordial de savoir se gérer soit même pour éviter une perte conséquente de
moyens qui pourrait devenir un désavantage dans l’avancement de la recherche.
Enfin, il m’a appris que la communication et l’entente au sein de l’équipe est l’atout le plus important dans un
laboratoire puisque la recherche est un projet commun qui a plus de chances d’aboutir grâce à chaque membre.
Bien que mon stage de 1ère année ait été enrichissant, celui-ci m’a apporté beaucoup plus de connaissances et
de motivation que j’avais un peu perdu au fil du temps.
Certes je ne sais toujours pas exactement vers quelle suite je pourrais aboutir après mes études mais ce stage
reste néanmoins une expérience des plus intéressantes et formatrices pour l’avenir.
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ANNEXES :
Annexe 2
Socle constitué d’une plaque en verre où l’on dépose une feuille de
parafilm où l’on déposera les gouttes d’anticorps (primaires et
secondaires) et les lamelles en verre
Annexe 3
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Annexe 4
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30
Lay Audience Summary :
My internship this year was again with the Virolle Team leaded by Thierry Virolle at the iBV in Nice again.
This team still working on the Glioblastomas which is the most common brain tumor in the world. The team
is searching how this cancer can be so violent and how it is possible to fight this disease and find a cure for
that.
I worked especially with the student Brenda Queron who’s working with the team for her thesis. Her central
thesis is based on a new molecule called DVXXX which can permite to improve the cure. In fact, when
cancer cells come into contact with this molecule, stem cells become differenciated cells. In this form, cells
are a lotmore sensitive to conventional treatments. So the goal of this thesis is to prove that the co treatment
DV with the molecule of the conventionnal treatment is more effective.
So my job was to help in this research, even if they were only at the beginning. In fact, my work constited in
to see if the cellular differenciation change something in the composition of the cells and also see what is the
target of the new molecule. So i did a Differenciation Test to see the changements in the cellular composition
and a LPA (Proximity Ligation Assay) to determine the target og the molecule.
After these manipulations, i can told you that the target of the DV is a protein called KPNB1 which is a
carrier that carries other proteins characteristic of stem cells. If thecells are treated, the stem cells proteins are
not in the core of the cell. So the DV inactivate KPNB1.
Contrary to my first internship, i think in this one i was more implicated in the research because it’s only the
beggining of the project. So my work was more important and useful than last year. Also this year i was
more integrated in the team. In fact, every week i assisted to all the labmeeting of the team whereas last year
i only assisted to one labmeeting. So I really prefer this internship even if the atmosphere was the same as
last year. Even if, i always don’t really know what i want to do later, this internship permite to me to realized
the importance of any one in the team and the organisation in the work.
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