Entérobactérie
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Entérobactérie GELOSE EMB Milieu sélectif des Gram – COMPOSITION : (pour 1L) Peptone 10,0g Lactose 10,0g Eosine 0,4g Bleu de méthylène 0,0625g Hydrogénophosphate de potassium 2,0g Agar 15,0g LECTURE : La dégradation du lactose se traduit par une coloration rose ou un aspect métallique des colonies, dans le cas contraire, les colonies sont incolores. L’aspect des colonies permet donc d’orienter le diagnostic : - Colonies de 2 à 3 mm de diamètre, plates, violet très foncé, avec très souvent un reflet métallique en dos de scarabée : colonies d’Escherichia coli probable. - Colonies de 4 à 6 mm de diamètre, convexes, rosées avec un centre violet (aspect en œil de poisson), muqueuses : colonies de Klebsiella (parfois Enterobacter probable) - Colonies violet pâle avec un centre et un reflet métallique peu marqué : colonies de Citrobacter probables - Petites colonies grises : autres bacilles à Gram - Très petites colonies transparentes : Bactéries à Gram + Ces conclusions sont que des présomptions, il faut les confirmer. Entérobactérie GELOSE DRIGALSKI Milieu sélectif des Gram – COMPOSITION : (pour 1L) Peptone Lactose Eosine BBT Désoxycholate et cristal violet LECTURE : Observation Colonies vertes Colonies jaunes Interprétation Le BBT n’a pas viré. Il n’y a pas d’acidification du milieu. La bactérie ne dégrade pas le lactose. Le BBT a viré. Le milieu a été acidifié. Le lactose a été dégradé. Conclusion Présomption de bactérie Gram –, ne dégradant pas le lactose. Lactose – Présomption de bactérie Gram –, dégradant le lactose. Lactose + Entérobactérie GELOSE MAC CONKEY Milieu d’isolement sélectif et de différentiation destiné à la recherche des entérobactéries. COMPOSITION : (pour 1L) Peptones Chlorure de sodium Lactose Cristal violet Sels biliaires Rouge neutre LECTURE : Observation Colonies roses ou rouges Interprétation Acidification du milieu Colonies incolores Il n’y a pas acidification du milieu Conclusion La bactérie fermente le lactose Lactose + La bactérie ne fermente pas le lactose Lactose – Entérobactérie GELOSE SS (SALMONELLA-SHIGELLA) Milieu inhibiteur des Gram + commensaux COMPOSITION : (pour 1L) Extrait de viande de bœuf Bio-polytone Lactose Sels biliaires Citrate de sodium Thiosulfate de sodium Citrate ferrique Vert brillant Rouge neutre Agar LECTURE : Observation Colonie incolore avec ou sans centre noir Colonie rose/rouge avec ou sans centre noir Interprétation Pas d’acidification due à l’absence de dégradation du lactose Acidification due à la de dégradation du lactose Conclusion Lactose – H2S + ou – Lactose – H2S + ou – REMARQUE : Les colonies suspectent de Salmonella sont incolore avec ou sans centre noir. Les colonies suspectent de Shigella sont incolore sans centre noir. Entérobactérie GELOSE HEKTOEN Milieu d’isolement sélectif des entérobactéries COMPOSITION : (pour 1L) Extrait de levure Bio-thione Lactose Saccharose Salicine Chlorure de sodium Sels biliaires Citrate de fer ammoniacal Hyposulfite de sodium BBT Fuschine acide Agar LECTURE : Observation Colonie jaune saumon Interprétation Acidification du milieu Colonie verte ou bleue pH inchangé ou alcalin Centre noir Présence de sulfure de fer Conclusion Dégradation d’au moins un des trois glucides Dégradation d’aucuns glucides ou dégradation des peptones Production d’H2S REMARQUE : Salmonella -> Colonies vertes ou bleues à centre noir. Shigella -> Colonies vertes ou bleues sans centre noir. Proteus mirabilis -> Colonies vertes ou bleues à centre noir. Entérobactérie MILIEU UREE TRYPTOPHANE REACTIFS : TDA : Perchlorure de fer Indole : Kovacs (James) COMPOSITION : (pour 1L) Urée Tryptophane Ethanol Rouge de phénol Chlorure de sodium LECTURE : PENSEZ A SEPARER LE MILIEU DANS DEUX TUBES Uréase Observation Interprétation Conclusion Milieu orange Pas d’alcalinisation du milieu -> absence de carbonate d’ammonium dans le milieu La bactérie ne possède pas d’uréase -> Uréase – Milieu rose fushia Alcalinisation du milieu due à la présence de carbonate d’ammonium dans le milieu La bactérie possède une uréase -> Uréase + Entérobactérie TDA Observation Interprétation Conclusion Coloration marron foncé Présence d’acide indole pyruvique dans le milieu. La bactérie a désaminé le tryptophane La bactérie possède une tryptophane désaminase. TDA+ Absence de coloration marron foncé Absence d’acide indole pyruvique dans le milieu. La bactérie n’a pas désaminé le tryptophane. La bactérie ne possède pas de tryptophane désaminase. TDA – Observation Interprétation Conclusion Anneau rouge après addition de réactif de Kovacs Présence d’indole dans le milieu. La bactérie a hydrolysé le tryptophane. La bactérie possède une tryptophanase. Indole + Anneau jaune après addition de réactif de Kovacs Absence d’indole dans le milieu. La bactérie n’a pas hydrolysé le tryptophane. La bactérie ne possède pas de tryptophanase. Indole – Indole Entérobactérie KLIGLER-HAJNA COMPOSITION : (pour 1L) Gélose nutritive Rouge de phénol Glucose Lactose Peptones Thiosulfate de sodium Citrate ferrique LECTURE : Observation Culot jaune Pente rouge Décollement de la gélose Absence de précipité noir Culot jaune Pente jaune Absence de décollement de la gélose Précipité noir Interprétation Fermentation du glucose Absence de dégradation du lactose Production de gaz Conclusion Glucose+ Lactose – Absence de sulfure de fer Fermentation du glucose Dégradation du lactose Absence de production de gaz Présence de sulfure de fer H2S – Gaz+ Glucose+ Lactose+ Gaz – H2S+ Entérobactérie TEST ONPG PROTOCOLE : -Réaliser une suspension bactérienne dense dans 0,5mL d’eau stérile. Les bactéries doivent provenir d’une culture sur un milieu lactose (KH). -Introduire aseptiquement un disque de papier imprégné du substrat ONPG. -Mettre à 37°C, observer toutes les 15 min pendant 1h. LECTURE : Observation Coloration jaune stable Pas de coloration jaune Interprétation Présence d’ONP dans le milieu résultant de l’hydrolyse de l’ONPG Pas d’ONP dans le milieu ; l’ONPG n’a pas été hydrolysé Conclusion La bactérie possède l’ONPG hydrolase β-galactosidase + La bactérie ne possède pas l’ONPG hydrolase β-galactosidase – PRECAUTION : Suspension assez dense En absence de coloration jaune, la lecture est à poursuivre 24h Entérobactérie MANNITOL MOBILITE NITRATE (MMN) COMPOSITION : (pour 1L) Hydrolysat trypsique de caséine Nitrate de potassium Mannitol Rouge de phénol Agar LECTURE : Observation Milieu rouge Interprétation Pas d’acidification du milieu Milieu jaune Acidification du milieu Milieu trouble Trouble du à la diffusion des bactéries mobiles à partir de la piqûre d’ensemencement Conclusion La bactérie ne dégrade pas le mannitol Mannitol – La bactérie dégrade le mannitol Mannitol+ La bactérie est mobile Mobilité + TEST : Recherche de la Nitrate Reductase avec le réactif de Griess (+ éventuellement du zinc) Entérobactérie MILIEU CITRATE DE SIMMONS COMPOSITION : (pour 1L) Phosphate Chlorure de sodium Citrate de sodium Sulfate de magnésium BBT Agar ATTENTION : Ne JAMAIS se servir d’une culture en bouillon nutritif ou en EPO qui apporterait des éléments nutritifs (faussant les résultats …) LECTURE : Observation Milieu vert Sans culture Milieu bleu Culture Interprétation Le pH du milieu n’a pas changé. La bactérie n’est pas capable d’utiliser le citrate comme seule source de carbone Alcalinisation du milieu suite à l’utilisation du citrate comme seule source de carbone Conclusion Citrate – Citrate + Entérobactérie MILIEU CLARK ET LUBS REACTIFS : RM : Rouge de méthyle VP : Solution d’alpha-naphtol + KOH COMPOSITION : (pour 1L) Peptone trypsique Glucose Phosphate bipotassique LECTURE : PENSEZ A SEPARER LE MILIEU DANS DEUX TUBES RM Observation Interprétation Conclusion Milieu rouge Fermentation du glucose par la voie des acides mixtes RM + Milieu jaune Absence de fermentation du glucose RM – Entérobactérie VP Observation Interprétation Conclusion Coloration rouge cerise ou rose vif Présence d’acétoïne Fermentation du glucose par la voie du butane diol VP+ Coloration jaune ou verdâtre ou rose très pâle Absence d’acétoïne Absence de fermentation du glucose par la voie du butane diol VP – Entérobactérie GELOSE A LA GELATINE REACTIFS : Solution de chlorure de mercure II : réactif précipitant les protéines LECTURE : Observation Absence de précipité autour de la strie centrale Présence d’un précipité autour de la strie centrale Interprétation Absence de gélatine qui a été hydrolysée Présence de gélatine qui n’a pas été hydrolysée Conclusion La bactérie possède la gélatinase Gélatinase + La bactérie ne possède pas la gélatinase Gélatinase – Entérobactérie GELOSE AU VERT BRILLANT = GELOSE DE KRISTENSEN-KAUFFMAN Milieu sélectif de Salmonella COMPOSITION : (pour 1L) Extrait de levure Extrait de viande Peptones Lactose Saccharose Rouge de phénol Vert brillant LECTURE : Observation Colonie jaune Colonie rouge Interprétation Dégradation Conclusion Dégradation d’au moins au des deux glucides Dégradation d’aucun des glucides Entérobactérie MILIEU LYSINE-FER COMPOSITION : (pour 1L) Extrait de levure Thiosulfate de sodium Peptones de gélatine Lysine Glucose Bromocrésol pourpre Citrate de fer Agar LECTURE : LDA Observation Pente rouge Pente non rouge Interprétation Présence d’acide cétonique provenant de la désamination de la lysine Absence d’acide cétonique Conclusion La bactérie possède une lysine désaminase. LDA+ La bactérie ne possède pas de lysine désaminase. LDA – Entérobactérie LDA Observation Culot violet Culot jaune Interprétation Si la bactérie fermente le glucose, le milieu a été réalcalinisation suite à la décarboxylation de la lysine Acidification du milieu par fermentation du glucose Conclusion La bactérie possède une lysine décarboxylase. LDC+ La bactérie ne possède pas de lysine décarboxylase. LDC – Entérobactérie MILIEU DE FALKOW COMPOSITION : (pour 1L) Extrait de levure L-acide aminé Ethanol Chlorure de sodium Glucose Bromocrésol pourpre LECTURE : Observation Tube témoin jaune Tube essai jaune Interprétation Acidification du milieu dans les deux tubes sans réalcalinisation Tube témoin jaune Tube essai violet Acidification des milieux et réalcalinisation de l’essai Conclusion Glucose fermenté, acide aminé non décarboxylé LDC ou ODC ou ADH – Glucose fermenté, acide aminé décarboxylé LDC ou ODC ou ADH+ Entérobactérie GELOSE CIN Milieu d’isolement riche sélectif de Yersinia COMPOSITION : (pour 1L) Extrait de levure Peptones Mannitol Pyruvate de sodium Rouge neutre Sels biliaires Irgasan Cefsulodine Agar LECTURE : Observation Colonie rouge Interprétation Acidification du milieu Colonie incolore Absence d’acidification du milieu Conclusion Le mannitol est dégradé Mannitol+ Le mannitol n’est pas dégradé Mannitol – Entérobactérie GELOSE A L’ESCULINE COMPOSITION : (pour 1L) Esculine Peptones Citrate de fer ammoniacal Agar LECTURE : Observation Absence de coloration noire Interprétation Absence d’esculétine, donc l’esculine n’a pas été dégradée Coloration noire Présence d’esculétine, donc l’esculine a été dégradée Conclusion La bactérie ne possède pas d’esculinase, donc elle ne dégrade pas l’esculine Esculine – La bactérie possède une esculinase, donc elle dégrade l’esculine Esculine – Entérobactérie GELOSE RAMBACH AGAR COMPOSITION : (pour 1L) Propylène glycol Peptone Extrait de levure Désoxycholate de sodium Rouge neutre X-Gal Agar LECTURE : Souche Salmonella Enteritidis Escherichia coli Proteus Couleur des colonies Rouge Propylène glycol + βGalactosidase – Bleues violacées Incolores – – + – Entérobactérie Bacilles, Gram –, Mobile, AAF, Oxydase –, Fermentatif du glucose Salmonella Citrobacter Klebsiella Proteus Enterobacter Morganella Escherichia Shigella Yersinia Serratia TDA – VP – Lact – Uré – Man + H2S + Cit + TDA – VP – Uré – Cit – H2S – ONPG + Ind + TDA – VP + Man + H2S – Cit + ONPG + Ind + Providencia TDA + VP – Lact – ONPG – LDC – Uré – Man + Ind + TDA – VP – Lact – ONPG + Ind – H2S – Man + Entérobactérie
