THEME 3A TP2 VARIATION GENETIQUE ET RESISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES Mise en situation et recherche à mener : Un jeune garçon de 2 ans est admis à l’hôpital avec les symptômes d’une méningite sévère. L’analyse du liquide céphalo-rachidien (LCR) révèle la présence d’une bactérie : Haemophilus influenzae. L’enfant est immédiatement traité par un antibiotique couramment utilisé dans ce cas : le cefotaxime. On met parallèlement en culture un peu de LCR de l’enfant et l’on teste la sensibilité du germe à 4 antibiotiques. L’infection régresse dès le lendemain, mais au bout de 6 jours, des symptômes graves réapparaissent. Un traitement nouveau est aussitôt mis en place, avec succès cette fois. Vous êtes le médecin et vous expliquez aux parents de l’enfant ce qui a justifié le premier traitement mais pourquoi il a été un échec, et devez expliquer quel nouvel antibiotique vous avez administré. Ressources : Point scientifique sur les antibiogrammes: Un antibiogramme est une technique de laboratoire visant à tester la sensibilité d'une bactérie vis à vis de plusieurs antibiotiques. Le principe consiste à placer la culture de bactéries en présence de pastilles imbibées d'antibiotiques. Dans cet exemple, les bactéries ne sont pas sensibles aux antibiotiques 1 et 3. Mais elles sont un peu sensibles à l'antibiotique 2 et très sensibles à l'antibiotique 4 (zone d’inhibition de la croissance des bactéries plus grande). A propos de différentes familles d’ antibiotiques: Il existe 2 types de bêta-lactamines: les Pénicillines et les Céphalosporines. Ils agissent en inhibant la synthèse de la paroi bactérienne par blocage de la synthèse de peptidoglycane, polymère majeur de la paroi bactérienne. Certaines Pénicillines comme l’ampicilline, ou des Céphalosporines, comme le céfotaxime, sont fréquemment indiquées dans le traitement des méningites à germes sensibles, type Haemophilus influenzae. A propos de la résistance des bactéries aux antibiotiques Certaines souches de bactéries, lorsqu’elles sont en contact prolongé avec un antibiotique, peuvent être rotégées de l’action de cet antibiotique car elles se mettent à fabriquer une enzyme qui hydrolyse et inactive l’antibiotique (par exemple, la beta lactamase hydrolyse les beta lactamines). Ces enzymes sont, à l’état « sauvage », peu efficaces vis-à-vis de l’hydrolyse de l’antibiotique, mais des mutations du gène codant l’enzyme peuvent les rendre très actives. L’antibiotique ne provoque pas la mutation, mais sélectionne les bactéries qui ont naturellement muté et sont devenues résistantes Matériel disponible : Boite de culture n°1 de bactéries du LCR de l’enfant à l’arrivée (produits de substitution) Boite de culture n°2 des bactéries du LCR de l’enfant au bout de 6 jours (produits de substitution) Tubes avec antibiotiques (produits de substitution): 1B et 1B ampicilline (famille des pénicillines, bêta-lactamines), 2A et 2B cafaletine (famille des macrolides), 3A et 3B cefotaxime, (famille des céphalosporines, beta-lactamines) 4A et 4B ciprofloxamine (famille des fluoroquinones), Pince fine, pastilles de papier filtre, marqueur, modèle de positionnement des pastilles. Logiciel de comparaison de séquences, séquences d’allèles du gène codant l’enzyme bêta lactamase Logiciel de visualisation moléculaire, modèle moléculaire d’une beta lactamase modifiée avec le cefotaxime. Etape 1 : concevoir une stratégie pour résoudre une situation A l’aide des ressources et du matériel, proposez une stratégie réaliste permettant de comprendre l’échec du premier traitement et de trouver le traitement adapté en 2e intention. (protocole simplifié, résultats attendus). Etape 2 : mettre en œuvre un protocole expérimental pour obtenir des résultats exploitables Appliquez la fiche protocole jointe «efficacité des antibiotiques sur l’enfant». Etape 3 : présenter les résultats pour les communiquer Traiter les résultats obtenus dans le sens de la réponse au problème, par exemple : dessin d’antibiogrammes (sur énoncé fiche protocole) effectué sur les bactéries du LCR de départ, puis sur celui de 6 jours. Captures d’écran (fournies après validation écran pour gagner du temps) des séquences d’allèles comparées du gène bêta lactamase fournies, et du modèle de beta lactamase fixée sur le cefotaxime. Etape 4 : exploiter les résultats obtenus pour répondre au problème Pour l’échec du premier traitement, commenter l’antibiogramme n°1, et les comparaisons de séquence ainsi que la visualisation moléculaire. Pour le 2e traitement, le trouver grâce au 2e antibiogramme et citer le traitement approprié (justifiez). Protocole expérimental : « efficacité des antibiotiques sur l’enfant» : Partie 1 : antibiogrammes Sur le LCR de l’enfant au 1e jour : - Déposer, sur la gélose de la boite de culture n°1, aux emplacements prévus à cet effet une pastille de papier filtre préalablement trempée dans chacun des 4 antibiotiques (tubes 1 à 4 A). Il faut avoir au préalable écrit sous la boite le n° de l’antibiotique qui sera déposé à chaque emplacement ! - Attendre 5 minutes, puis représenter par un schéma les résultats observés - Identifier les antibiotiques auxquels la souche bactérienne de l’enfant est résistante et ceux auxquels elle est sensible Sur le LCR de l’enfant au bout de 6 jours : - Déposer, sur la gélose de la boite de culture n°1, aux emplacements prévus à cet effet une pastille de papier filtre préalablement trempée chacun des antibiotiques appropriés attention utilisez les tubes 1 à 4 B (contamination possible des tubes 1 à 4 par les prélèvements) - Attendre 5 minutes, puis représenter par un schéma les résultats observés - Identifier les antibiotiques auxquels la souche bactérienne de l’enfant est devenue résistante et ceux auxquels elle est restée sensible ampicilline ciprofloxamine cafalétine mine cefotaxime 1ej 6ej Partie 2 : A propos de la bêta lactamase : Logiciel anagène Ouvrir EC_lactamase.edi La séquence SHV1 code pour une enzyme presque inactive. C’est celle des bactéries de l’enfant au jour 1. La séquence SHV2, modifiée, code pour une enzyme très active. C’est celle des bactéries de l’enfant au jour 6. Logiciel Libmol en ligne Ouvrir betalactamase_cefotaxime.pdb Il s’agit de la beta lactamase codée par SHV2 en présence de cefotaxime Colorer par chaine Colorer spécifiquemt le cefotaxime Colorer spécifiquement l’acide aminé changé dans SHV2 par rapport à SHV1. TH 3A TP2 ANTIBIOTIQUES correction Etape 1 : 1. -on cherche à savoir pourquoi le traitement initial de l’enfant au cefotaxime est devenu inefficace à 6 jours et à trouver l’antibiotique à administrer à 6 jours. 2. -on va placer sur la boite avec les bactéries du LCR de l’enfant à J0, 4 pastilles d’antibiotiques : Ampicilline, cafaletine, cefotaxime, ciprofloxamine. -On va faire la même chose sur la boite avec les bactéries du LCR de l’enfant à J6. -On va également comparer l’allèle de la bêta lactamase des bactéries à J6 à celui des initiales, et visualiser sur Libmol le modèle moléculaire de la beta lactamase fixée au cefotaxime habituellement, en effectuant des colorations adaptées. 3. -on s’attend à ce que les bactéries initiales soient sensibles au cefotaxime qui a fonctionné pendant t6 j, càd qu’il y ait une plage claire autour de la pastille avec le cefotaxime (on ne sait pas pour les autres). En effet « les pénicillines comme l’ampicilline ou les céphalosporines comme le cefotaxime sont indiquées dans le traitement de H influenzae » (on peut supposer d’ailleurs que les bactéries initiales seront aussi sensibles à l’amicilline). -On donnera à l’enfant à J6 le (ou l’un des) antibiotiques auquel(s) les bactéries de l’enfant à J6 sont restées sensibles. -On s’attend aussi à ce que le gène de la beta lactamase à J6 soit muté par rapport à l’allèle initial ce qui provoque un changement d’acide aminé dans l’enzyme beta lactamase, et que cet AA « muté »soit visualisé sur Libmol comme crucial pour la fixation et le découpage du cefotaxime. ampicilline ampicilline cafalétine ciprofloxamine mine ciprofloxamine mine cefotaxime Antibiogramme à J0 cefotaxime Antibiogramme à J6 Comparaison des allèles et des protéines codées par ces allèles du gène de la beta lactamase Beta lactamase SHV2 cefotaxime AA 234 de la beta lactamase SHV2 Modèle moléculaire de la beta lactamase codée par l’allèle SHV2 muté fixé au cefotaxime Conclusion : 1ej : résistance naturelle à la cafalétine (un macrolide cette résistance est connue) +sensibilité à la ciprofloxamine et aux beta lactamines, dont le cefotaxime, donné en 1e intention. L’échec est du à une mutation dans le gène de la beta lactamase des bactéries initiales, elle est devenue capable de se fixer plus fortement à cet antibiotique et donc de la détruire. Il en est de même pour l’ampicilline qui est aussi une beta lactamine. Les bactéries mutées deviennent majoritaires dans le corps de l’enfant par sélection naturelle. 6ej : inutile de tester la cafalétine (les bactéries de départ y sont insensibles) résistance acquise aux beta lactamines : cefotaxime , ampicilline On prescrit de la ciprofloxamine, une fluoroquinolone.
