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Techniques d'exploration des anomalies génique INITIATION.pptx

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2019
1ère Année MED
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Technique de biologie
Moléculaire
2019
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Techniques d’exploration
I.
Les techniques d’extraction et de purification des acides nucléiques
II.
Techniques de quantification des acides nucléiques
III. Techniques de séparation des acides nucléiques
IV. Techniques d’amplification génique « PCR »
V.
Le séquençage
VI. NGS
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Les techniques d’extraction et purification des acides nucléiques:
• la purification des acides nucléiques est la première étape dans la plupart des techniques
de biologie moléculaire , c’est l’étape clé
• Selon le type d’acide nucléique à purifier (ADN ou ARN) et la nature du matériel de départ
(sang ,culture , organe, …) la première étape à pour objectif « l’extraction »
• L’objectif des méthodes d’extraction des acides nucléiques est d’obtenir des acides
nucléiques purifiés, tirés de diverses sources biologiques, afin de pouvoir mener une
analyse.
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Les techniques d’extraction et purification des acides nucléiques:
• plusieurs méthodes
• choix dépend du matériel à extraire
3 étapes principales
1. Lyse cellulaire
3. précipitation (concentration)
2. séparation de l’ADN des autres composantes cellulaires
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Processus:
Lyse des cellules nucléées
(mécanique ou enzymatique
Echantillon
Biologique
Dégradation des protéines
•Disperser les bicouches lipidiques des
membranes
•Dénaturer les protéines (celles
associées à l'ADN dans la chromatine)
Purification des acides nucléiques
Solvants
organique
Relargage
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Phénol
chloroforme
Méthode
de Salting-out
La silice
Précipitation des acides nucléiques
Alcool:
éthanol,
isopropanol
Billes magnétiques
Fixation non
covalente
Résine cationique
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Techniques d’extraction et de purification des acides nucléiques:
Critère de choix de la technique:
 L’acide nucléique cible (ADN, ARN, ADN circulant….)
 La nature du matériel de départ (sang, tissu, culture cellulaire, biopsie) et qui détermine
l’approche à suivre pour libérer les acides nucléiques.
 Les résultats escomptés (rendement, pureté, temps de purification requis, sensibilité.
 Application envisagées : compatibilité avec le test de biologie moléculaire à faire en aval.
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II. Techniques de quantification des acides nucléiques
Dosages ou quantification des
acides nucléiques
Fluorométrie
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Spectrophotométrie
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II. Techniques de quantification des acides nucléiques
Spectrophotométrie:
Principe:
• Le dosage des acides nucléiques par la spectrophotométrie est une méthode plus simple et plus rapide.
• Les acides nucléiques ont la propriété d’absorber les U.V à une longueur d’onde de 260 nm, une lecture de
l’absorbance à cette longueur d’onde permettra de déterminer la concentration d’un échantillon
• Les nucléotides ont une absorbance maximale vers 260 nm due aux bases azotées A,C,G,T, U.
• Les protéines ont un maximum d'absorption qui se situe vers 280 nm à cause des acides aminés aromatiques.
•
Le rapport R = A260nm/A280nm constitue alors un bon moyen pour apprécier une éventuelle contamination
de la préparation d'ADN ou ARN par les protéines
Qualité de l’ADN : Abs260/Abs280 nm
Qualité de l’ARN : Abs260/Abs280 nm
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II. Techniques de quantification des acides nucléiques
La concentration d’un acide nucléique donné est obtenue par la relation suivant :
Concentration (µg /ml) = DO (densités optiques) 260nm× 50×facteur de dilution
L’unité de densité optique à 260 nm correspond à :
1 unité de A260=50 µg /ml : une solution d’ADN double brin.
1 unité de A260=25 µg/ml : une solution d’ ADN simple brin
1unité de A260=25 µg/ml : une solution d’ARN
• Estimation de la concentration en acides nucléiques .
• Estimation de la pureté de l’échantillon
Échantillon d’ADN pur : Abs 260/Abs 280 compris entre 1,8 et 2
si le rapport est < 1,7 présence de protéines.
Si le rapport est > 2 présence d’ARN
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II. Techniques de quantification des acides nucléiques
- Fluorométrie:
• On utilise un fluorimètre pour mesurer l’intensité de la fluorescence d’une solution des acides
nucléiques en présence d’un excès de fluorochrome. Plus sensible
• Les fluorochromes (excitation à 365 et émission à 460), se fixent sur le ADN.
Le taux de fixation est directement lié à la quantité de ADN présente
La quantité de fluorescence qui sera proportionnelle à la quantité de ADN présente
Se fixant spécifiquement sur des paires de bases:
Bases A-T: DAPI
Bases G-C: mithramycine .
Intercalant:
Bromure d’éthidium
Acridine orange ( qui ont l'avantage d'être moins chers ).
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III. Techniques d’amplification génique « PCR »
La PCR:
• Le PCR est le sigle de l’expression anglaise Polymerase Chain Reaction.
• C’est une sorte de technique de copiage moléculaire ou d’amplification.
• Reproduire in vitro (dans des tubes) un processus similaire à la réplication, étape permettant de
recopier l’information génétique d’une cellule mère aux cellules filles à chaque division cellulaire.
• Cette méthode de Biologie Moléculaire a été mise au point en 1985 par Kary Mullis, qui obtint
pour ces travaux le prix Nobel de Chimie en 1993
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III. Techniques d’amplification génique « PCR »
Principe:
La PCR standard est basée sur :
• L’action d’une ADN polymérase thermostable : la Taq polymérase.
• La connaissance des séquences flanquant l’ADN cible, ce qui permet de synthétiser des amorces
de 15 à 25 paires de bases.
• Ces amorces (ou primers) seront, une fois hybridées à leurs séquences complémentaires
respectives, allongées dans les sens 5’ 3’.
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III. Techniques d’amplification génique « PCR »
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III. Techniques d’amplification génique « PCR »
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III. Techniques d’amplification génique « PCR »
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III. Techniques d’amplification génique « PCR »
PCR
Conventional PCR :
end point détection
Realtime PCR (qPCR)
realtime detection
• Simplex = recherche de l’altération d’un unique marqueur voire d’une unique mutation
• Multiplex = recherche en parallèle de plusieurs mutations sur plusieursmarqueurs
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IV. Techniques de séparation des acides nucléiques
Electrophorèse:
c’est une technique permettant la séparation des molécules chargées grâce à la migration
différentielle sous l’action d’un champ électrique .
• Les acides nucléiques sont des macromolécules poly anioniques chargés négativement à pH 8.
•
Sous un champ électrique, ils vont migrer vers l’anode (pôle +).
• L'électrophorèse est basée sur le principe du mouvement d’ions sous l’effet d’un champ électrique.
• La vitesse de migration des acides nucléiques sera en fonction de :
• 1- poids moléculaire: les petits fragments migrent rapidement
• 2- [ concentration]du gel de support : vitesse de migration
• 3- Forme tridimensionnelle
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IV. Techniques de séparation des acides nucléiques
Deux polymères sont utilisés: agarose et polyacrylamide
1- Gel d’agarose
• Pour les fragments d’ADN de taille (0,5-20kb)
• l'agarose est utilisé à des concentrations de 0,5 % à 2 %
(masse/volume) et permet de séparer des molécules de très grande
taille, principalement de l'ADN ou de l'ARN.
• Le réseau de mailles constituant le gel forme un tamis moléculaire à
l’intérieur duquel les molécules d’ADN migrent
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IV. Techniques de séparation des acides nucléiques
2- Gel de polyacrylamide
Les gels non dénaturants :
• Ne peuvent pas déterminer précisément la
taille d’un fragment
• Séparer des fragments d’ADN double brin
• Pour les fragments de moins
de 1000 paires de base
Les gels dénaturants
•Séparer des fragments d’ADN simple brin
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IV. Techniques de séparation des acides nucléiques
Migration et révélation:
Les échantillons d’ADN avant d’être déposés dans les puits sont mélangés avec une solution ou tampon de
charge.
Tampon de charge : bleu de bromophénol - xylène cyanol – glycérol (alourdisseur )- tampon TBE
• Le bleu de bromophénol (violet ) migre avec les fragments de petites tailles (donc plus vite )
• alors que le xylène cyanol (bleu turquoise ) migre avec les fragments de grande taille.
coloration de l'ADN : bromure d'éthidium (BET ou
EtBr) un intercalent de l’ADN qui devient cent fois plus
fluorescent sous illumination ultra-violette lorsqu'il est
lié à l'ADN.
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révélation sous UV/ transilluminateur
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IV. Techniques de séparation des acides nucléiques
Électrophorèse capillaire:
Tube capillaire de faible diamètre (50microns) remplie d’un gel séparateur.
Le capillaire est introduit dans le tube contenant l’échantillon
Sous l’influence d’une haute tension; pénétration et migration d’acides nucléiques dans le capillaire .
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V. Séquençage
• Le séquençage de l’ADN constitue une méthode dont le but est de déterminer la succession linéaire des
bases A, C, G et T prenant part à la structure de l’ADN.
• Le séquençage d’ADN est devenu un outil essentiel en biologie moléculaire en médecine.
• Le séquençage a été décrit il y a environ 30 ans et n’a cessé d’évoluer depuis cette période.
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V. Séquençage
Principe:
• La méthode, proposée par F. Sanger (prix Nobel de chimie en 1980), repose sur
l’utilisation de nucléotides particuliers appelés didésoxynucléotides qui bloquent la
synthèse de l’ADN par les ADN polymérases après leur incorporation.
• Cette méthode a considérablement évolué grâce à la mise au point de séquenceurs
automatiques et de marquages des nucléotides à l’aide de fluorochromes
• Le séquençage de l’ADN est devenu une technique rapide et fiable utilisée dans le
diagnostic des maladies héréditaires
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Méthode de Sanger
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Séquençage:
Du séquençage du Neandertal au séquençage dans l’espace
En 2001: ligne de production automatique pour le séquençage du génome humain au Whitehead Institute - Center
for Genome Research. Capacité de séquençage : environ 1500 nucléotides par poste en quelques jours.
Source : Nature 409, 860 - 921
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Séquençage
1977
Séquençage
Sanger
vers
NGS
1999
Séquençage par
électrophorèse capillaire
2009
Séquençage de
nouvelle génération
l’ère du séquençage industriel!
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Séquençage haut débit :
NGS : Next Generation Sequencing
Grands principes :
• Intégration (système combinant les avantages de la PCR et des
puces)
• Parallélisation (PCR multiplex)
• Miniaturisation
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Séquençage haut débit :
Le NGS ou séquençage nouvelle génération
• ADN : Whole Genome, Whole Exome ou ciblé
• ARN : RNAseq (expression, transcrits de fusion, découverte de nouveaux
transcrits…)
A partir de 2007 : les séquenceurs à haut débit ont envahi le marché mondial.
• Plusieurs technologies différentes
• Modèles de paillasses plus accessibles
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NGS: Principes généraux
Process général du NGS
Préparation de
librairie
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Amplification
Séquençage
Analyse des
données brutes
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NGS: Principes généraux
Génome ou ciblé ?
ADN
génomique
Limites du génome entier:
• Coût
• Taille des données générées
• Analyse complexe des données
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Régions
d’intérêt
But de l’enrichissement ciblé:
Séquencer majoritairement une/des régions d’intérêt
• Diminution du coût (pooling de plusieurs ADN)
• Analyse simplifiée
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Séquenceurs 3ème génération
Différence de :
Le Principe
La Quantité et la Qualité des données
Les Longueurs de Lectures (en kb)
• Une molécule unique
• Des séquences longues en un temps court de l’ordre du kb
• En temps réel de l'ADN, ARN et protéine
• Informations sur les variants structuraux et meilleur
assemblage de novo
• Coût plus faible
• Taux d’erreur élevé : ~15 %
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Séquenceurs 3ème génération
• Polymérase fixée dans un puit très étroit
• Fond du puit éclairé par un laser
• NT modifié avec marqueur fluorescent (4 différents) fixé sur
le Phosphate
• Détection de la fluorescence quand incorporation par la
polymérase par clivage de la chaîne Phosphate
Sequel system
-> polymérisation= succession de pics d'émission de
fluorescence de différentes couleurs GGATCAG, reconstruction
de la séquence de la molécule matrice
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Séquenceurs 3ème génération
• Nanopore protéique (~ protéine transmembranaire) couplé à une exonucléase
• Pores à travers une bicouche lipidique à laquelle on applique un champ électrique
• Exonucléase détache successivement les bases
• NT détachés attirés par le champ électrique et traversent un à un le nanopore protéique
• Résistance électrique à travers le nanopore varie de façon différente si A, C, G ou T à reconstitution de la
séquence de la molécule initiale
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Séquençage:
Du séquençage du Neandertal au séquençage dans l’espace
MinION
séquenceur ultra-portable MinION :
• Utilisé en temps réel sur le terrain lors de la crise Ebola
de 2015 et de la crise Zika en 2016 (Quick et al., 2016).
• En juillet 2016, il a été envoyé par la NASA dans la
station orbitale internationale pour les premier
séquençages effectués dans l'espace.
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