DRC

Dynamique et régulation cellulaire :
La culture cellulaire in vitro permet de créer, à partir d'un petit bout de plante, un
grand nombre de plantes du même
type.
Par exemple, sur une pomme de
terre qui bourgeonne à l'obscurité,
on peut récupérer les pousses, le
fragmenter, le mettre en culture et
récupérer un milliers d'individu
provenant d'une même pousse.
Les méthodes de culture cellulaire
sont multiples et dépendent des
espèces. On peut utiliser un
embryon de plantes, un organe, un
cal (cellule indifférencié) ou une
cellule par exemple.
Cultures cellulaires végétales : Historique et impact :
1. Totipotence des cellules végétales :
L'idée que le noyau d'une cellule était le site pouvant régénérer tout un organisme à
été émis par Haberlandt en 1902 : « Toute cellule végétale est capable de régénérer
un nouvel organisme identique à celui dont elle est issue.» (pas vraiment possible sur
toutes les cellules)
De nombreuses cellules végétales sont totipotentes tandis que seul le zygote est
totipotent chez les métazoaires.
En 1965, Vasil et Hildebrandt on pu prouver que l'idée de Haberlandt était juste en
régénérant un plant de tabac.
2. Historique de la culture in vitro :
En 1934, White réussit à créer une culture de tomates en milieu in vitro via une racine
de tomate. (Le milieu était composés d'eau, de sels minéraux, d'extrait de levure, du sucre et de
l'auxine, seul hormone végétale connue à l'époque.)
En 1939, Gautheret a permis le développement indéfini (On cultive aujourd'hui encore
des cellules du premier cal de Gautheret) d'un cal de cellules dédifférenciées à partir
d'un fragment de racine de carotte. Il s'agit de la première vrai culture in vitro
(Dans du verre). Les cellules ayant poussé à partir de la racine différencié sont des
cellules indifférenciés.
En 1962, Murashige et Skoog mettent au point le premier milieu de base pour la
culture in vitro :
- Sels minéraux (macro et micro-éléments en g/L et μg/L)
- Sucres (saccharose)
- Vitamines (B)
- Hormones (Auxine et cytokinines)
- pH acide à 5,5
La culture est faite à température, lumière et hygrométrie contrôlée.
Via cette technique, on a pu faire de la prolifération de méristème de tige, ce qui
n'avait jamais été fait auparavant, le méristème ayant toujours été réfractaire à la
multiplication végétative in vitro.
Des substances organiques sont ajoutés parfois pour tenter de booster la croissance de plante, les
espèces végétales ne répondant pas tous de la même façon à la culture in vitro (acides aminés, extrait
de banane, pomme de terre, etc. )
3. Activation de processus cellulaire programmés :
Le fragment sectionné, blessé, doit cicatrisé pour ensuite régénérer spécifiquement
le morceau endommagé.
•
•
•
1ère étape : Dédifférenciation cellulaire : Une fois un fragment coupé et retiré
de l'organisme mère, il perd les signaux de position, nutrition, dominance apical
de l'auxine, etc. qu'il avait auparavant. Il redevient une cellule dédifférencié
de cals.
2ème étape : Multiplication cellulaire
3ème étape : Redifférenciation cellulaires
Certains résultats sont meilleurs :
➢ Quand les tissus d'origine du tissus de départ sont des tissus jeunes
(embryons zygotiques immatures, hypocotyles (tissus en dessous du cotylédon)
et cotylédons (pseudo-feuille poussant au début du développement de la
plante) de germinations, méristèmes de plantes adultes).
➢ Quand les cellules sont diploïdes plutôt que polyploïdes.
➢ Chez certaines familles de plantes (Solanacées, Brassicacées (4 pétales
formant une fleur (A. Thaliana, Choux, Carotte))) et certains génotypes au sein
d'une famille (Tournesol)
4. Développement d'explants pluricellulaire :
•
1ère voie : L’organogenèse : Passer d'un cal (cellules indifférenciés) à une
plantule. En partant d'embryons immatures, on peut générer des pousses de
tiges ou des racines selon le milieu de culture dans lesquelles on les placent.
•
2ème voie : Embryogenèse somatique : On part d'un explant immatures pour
donner un 'organe' ayant une morphologie d'embryons végétales, appelés
embryons somatiques. Ces embryons permettent ensuite de donner des
individus. C'est le développement initial d'un tissu indifférencié de type
embryonnaire qui se développe en un individu complet.
5. Conditions de régénération de plantules :
Le milieu de culture se doit d'être :
1. Aseptisation du milieu ET de l'explant.
2. Milieu de culture solide (agarose)
•
•
AVANTAGES : Manipulation facile, action physique du maillage favorise les divisions et l'ancrage.
LIMITES : Diffusion des nutriments
Milieu de culture liquide
•
•
AVANTAGES : Absorption aisée des nutriments
LIMITES : Manque d'oxygénation (besoin d'agitation), sécrétion de produits toxiques dans le milieu
Les repiquages réguliers sont indispensables.
Les risques sont la perte de stérilité et la contamination par des bactéries ou levure.
Rôle des hormones dans la croissance :
L'auxine, de son vrai nom Acide indole-3-acétique (AIA) est synthétisé dans l'apex, le
méristème apical des pousses. Ces effets sont les suivants :
- élongation de la tige
- différenciation et croissance des racines (en grande quantité)
- maturation du fruit
- inhibition de croissance des bougeons latéraux
- phototropisme des feuilles et géotropisme des racines
La cytokinines, a d'abord été appelé zéatine puis fut synthétisé en laboratoire. Elle
est synthétisé dans les racines et les tissus à croissance rapide. Ses effets sont les
suivants :
- retard de la sénescence
- ramification et perte de domination apical (antagoniste de l'auxine)
- dépendant du taux d'auxine associé
Choix de la balance
hormonale :
Quand on a une
majorité d'auxine, la
croissance des racines
est privilégié. Quand on
a une majorité de
cytokinines, on a un
développement des
bourgeons végétatifs.
Enfin, si on a une
quantité faible d'auxine
et de cytokinines, on
obtient une floraison.
6. Applications de la culture in vitro :
Les applications de la
culture in vitro sont
nombreuses, on peut faire
du 'sauvetage
d'embryons', de
l'haplodiploïdisation,
l'obtention de
protoplastes, la
multiplication conforme ou
la culture de méristème.
Culture de méristèmes :
En 1952, Morel et Martin développe une technique pour protéger et sauver les plantes
malades, touchés par des virus.
On cultive le méristème car c'est la seule zone qui n'est jamais contaminé par un
virus. Il pousse plus vite que le virus n'infecte les cellules.
Sauvetage d'embryons :
Certains croisement interspécifiques ne permettent pas le développement de graines !
Un embryon crée en forçant un croisement entre deux plantes donne un hybride que
l'on n'aurait pas obtenu en croisant pollen et anthère.
La culture des embryons immatures permet l'obtention de plantes.
Les avantages sont que l'ont peut s'affranchir de l'étape de dormance des
semences, le développement des embryons est homogène et l'accélération du cycle
végétatif.
Haplodiploïdisation :
Mise en culture des organes reproducteurs afin de développer des individus à partir
des cellules reproductrices et gamètes. Ces cellules contiennent une seule copie de
l'information génétique.
Au cours de la régénération, on peut réussir à doubler à l'identique cette copie. Les
individus obtenus sont des lignées pures car ils ont la même information sur les deux
chromosomes, ils sont homozygotes.
Utilisation de protoplastes : Explants unicellulaires :
Digestion enzymatique de la paroi de parenchyme de jeunes feuilles pour isoler une
suspension de protoplastes (tissu obtenu quand la paroi d'un tissu végétale est
digérer).
Ces cellules peuvent grandir mais sans paroi, elles ne se développent pas. Au bout de
24h, en environ 10 minutes, une nouvelle paroi apparaît (si le milieu contient les
éléments nécessaire). On peut alors modifier les protoplastes, par hybridation
somatique par exemple.
On associe les protoplastes de deux plantes différentes et on obtient une nouvelle cellule hybride. On
fusionne ces cellules via un choc électrique ou un agent chimique. Après cela, on aura la formation d'une
population de cellules hybrides qu'on peut ensuite essayer de faire pousser. Le cytoplasme des deux
cellules se mélange tout le temps.
Pour le noyau, plusieurs schéma peuvent apparaître :
- Soit un des deux noyaux est gardé complètement
- Soit une proportion variable de chaque ADN est conservé
- Soit on se retrouve une cellule poli-nuclée.
Lorsque deux noyaux reste
présent dans le cytoplasme,
on parle d'hétérocaryons.
Lorsqu'un seul noyaux
reste, sans mixte avec
l'autre, on parle de
cybrides.
Lorsque qu'une proportion
de chaque noyau est
présent, on parle
d'hybrides somatiques.
Il faut ensuite sélectionnés dans cette population les éléments intéressantes via des
marqueurs morphologiques (pigments) ou des marques de résistance. Seul les
hybrides ayant acquis une résistance à un pathogène seront sélectionnés. On peut
ensuite caractérisés génétiquement ces individus.
L'avantage est notamment de pouvoir créer de nouvelles variétés de plantes.
➢ Pourquoi créer de nouvelles espèces par hybridation somatique plutôt que par
croisement ovule X pollen ?
On peut passer outre la volonté de Dieu et créer de nouvelles espèces ! (Et
accessoirement, on peut aussi créer des croisements qui n'aurait pas été
naturellement possible)
Des problèmes peuvent survenir suite à l'incompatibilité des génomes. De plus, les
mitochondries expriment également du matériel génétique et porte eux-mêmes
parfois les résistances. Il faut apprendre à les faire passer entre les espèces
également.
Cela permet de créer des plantes cultivés qui acquiert des capacités intéressantes.
Cours 2 : Carine Meignin :
L'apoptose a longtemps été considéré comme une conséquence de caractéristiques de
l'environnement qui affectait les cellules. Cependant, si ce mécanisme ne pouvait pas
être forcés et volontaires, les organismes aurait un déséquilibre dans leur balance
division cellulaire/mort cellulaire.
Les facteurs de croissance et récepteurs :
Un facteur de croissance est un
peptide. Dans un premier temps,
un signal extracellulaire de
nombreux types (facteurs de
croissance, de différenciation,
des hormones, l'environnement
proche … ).
Les cellules possèdent sur leurs
membranes des récepteurs
transmembranaires permettant
la signalisation et un transport
de l'information. On parle de
transduction du signal.
La réponse engendré peut être de plusieurs nature :
- Prolifération cellulaire (dans le cas d'un facteur de croissance)
- Différenciation (dans le cas d'un facteur de différenciation)
- Migration
- Apoptose
Perception du signal :
Les signaux peuvent être perçus par les cellules de différente façon :
•
La cellule émettrice peut être la cellule receveuse, on parle de boucle
autocrine. La molécule doit sortir de la cellule pour agir sur ces propres
récepteurs. (Ex : IL2)
•
La cellule émettrice produit un facteur qui est exporté dans le milieu
extracellulaire, qui se fixe sur une cellule récéptrice différente. On parle de
stimulation paracrine. (Ex : PDGF, VEGF, etc … )
•
Une cellule émet le signal dans le sang et permet le transport du signal dans
l'intégralité de l'organisme pour être délivrés au niveau des cellules
réceptrices. On parle de stimulation endocrine. (Ex : Facteurs de croissance
des chondrocytes)
•
Enfin, on peut avoir une cellule émettrice qui produit par exemple un facteur de
croissance qui reste ancrée dans la membrane, permettant de stimuler
uniquement les cellules proches. On parle de stimulation juxtacrine. On a
également l'intervention de certaines enzymes appelés Sheddases, ancré dans
la membrane, clivant le facteur de croissance dans la membrane pouvant le
libérer.
Dans cette famille des Sheddases, on trouve les protéines ADAM, qui possède un domaine enzymatique
métalo-protéases. On en trouve sur la membrane plasmique et suite à stimulus, elle peut cliver un
facteur de croissance proche ancrée dans la membrane.
Découverte des premiers facteurs de croissance NGF et EGF :
L'embryologiste Rita Levi-Montalchini et le biochimiste Stanley Cohen ont réalisés
des tests sur la régulation de la croissance des fibres nerveuses. Ils ont observés
qu'en amputant le bourgeon d'un membre de poulet, les cellules nerveuses du
membres vont mourir, ils ne sont plus irrigués par quelque chose dont ils ont besoin.
A l'inverse, en greffant ce bourgeon sur une partie de l'animal, on voit la progression
de cellule nerveuse.
On peut en déduire que le bourgeon est nécessaire et suffisant pour créer des nerfs.
Un signal devait en partir pour favoriser la croissance de fibres nerveuses.
Cohen a utilisé des phosphodiestérase produit à partir de venin de serpent pour
détruire des acides aminés sur les bourgeons de membres … et les nerfs continuent
de pousser !
En purifiant cette molécule, on récupère aussi toutes les molécules des glandes
salivaires ! En utilisant les glandes salivaires d'autres espèces, ils sont arrivés au
même résultat. Le facteur de croissance qui faisait pousser les nerfs se trouvait dans
les glandes salivaires. Ils l'ont appelés le NGF.
En testant in vivo ce NGF de ces glandes salivaires, on produit bien une croissance des
nerfs mais également une sur-croissance des yeux et des dents. C'était l'EGF.
Ils ont le prix Nobel en 1986 pour la découverte des facteurs de croissances.
Découverte du PDGF (Platelet Derived Growth Factor) :
En centrifugeant du sang
et en plaçant du plasma ou
du sang sur des
fibroblastes, on ne voit
aucune pousse. Cependant,
en prenant uniquement le
sérum, on provoque une
pousse des fibroblastes !
Qu'y a t-il dans le sérum
qui n'est pas présente
dans le sang ?
En fait, quand on fait coaguler le sang pour créer du sérum, les cellules sanguines vont
lyser et libérer leurs contenus. C'est la lyse de ces plaquettes sanguines qui libère le
PDGF et induit la pousse de fibroblaste.
Méthode d'étude des facteurs de croissance :
•
On peut simplement placer le facteur de croissance sur des cellules pendant un
certains temps pour compter les cellules avant et après et mesurer la
prolifération cellulaire.
•
On peut placer à t=0 le facteur de croissance avec différent produit (MTT,
XTT, Alamar Blue) puis on réalise un test colorimétrique pour mesurer
l'activité déshydrogénase mitochondriales.
On peut ainsi voir si les cellules peuvent réaliser correctement le cycle de
Krebs. Cela permet de mesure la viabilité cellulaire.
Cette technique est :
- Rapide
- Reproductible
- Automatisable
- Sans radioactivité
- Permettant de compter le nombre de cellule vivante.
•
On peut placer de la thymidine tritiée dans le milieu avec le facteur de
croissance. Elle va s'incorporer dans l'ADN uniquement au moment de la
réplication pour former de l'ADN et permet de mesurer la réplication
cellulaire.
•
On peut marquer la cellule au
CFSE, permettant, via un suivi
de la fluorescence, de suivre
étape par étape les divisions
cellulaire en fonction de la
quantité de fluorescence dans
chaque cellule-fille. Chaque pic
sur le profil de FACS définit le
nombre de division cellulaire
qui se sont réalisés. On peut
ainsi suivre les divisions
cellulaires.
Exemple de facteurs de croissance/différenciation :
Le NT1 correspond à une neurotrophine et agit sur la survie neuronale.
L'EPO est un précurseur des globules rouges. Il est notamment émit suite à un temps passé à de
hautes altitude, pour permettre au corps de s'accommoder au manque d'oxygène.
Le TNF (Tumor Necrosis Factor) induit l'apoptose et la mort cellulaire.
Les facteurs trophiques permettent la survie cellulaire.
Les facteurs chimiotactiques induisent la migration cellulaire. Il attire des cellules.
Notamment lors des infections virales, ces facteurs attirent les cellules immunitaires
sur le lieu d'infection.
Orchestration de la réponse immunitaire par les cytokines :
Les réponses cellulaire et humorale sont des réactions du corps pour lutter contre
une infection bactérienne ou virale.
Dans la réponse cellulaire, des lymphocytes TCD8+ (killer) tuent les bactéries et les
macrophages 'nettoient' le déchets cellulaires.
Les lymphocytes B produisent des anticorps lors de la réponse humorale.
Ces cellules ont les mêmes précurseurs !
Il s'agit de lymphocyte TH0 (CD4) qui via de l'IL-12 ou des INFg vont les transformer
en TH1 qui, ensuite, via de l'IL-2 ou des IFNy donneront les cellules de la réponse
cellulaire.
Dans la même idée, en partant d'un TH0, avec un autre cocktail de cytokine, on peut
produire les cellule de la réponse humorale.
Contrôle de l'angiogenèse par le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) :
1. Il induit la formation de capillaire sanguin. Les cellules endothéliales composant
les vaisseaux sanguins peuvent former un pseudopode en présence d'IL-8.
2. Le VEGF active la division cellulaire préalablement initié par la formation du
pseudopode.
3. On a ensuite formation de 2 vacuoles contiguës dans les cellules filles.
4. Ces vésicules fusionnent et on a le départ d'un nouveau capillaire sanguin.
VEGF stimule spécifiquement la prolifération des cellules endothéliales :
En utilisant une concentration croissante de VEGF sur des cellules endothéliales, on
peut mesurer la valeur nécessaire de VEGF pour induire la division efficace de
l'endothélium.
Sur des cellules endothéliales, on note une valeur efficace vers 10 3 pg.
Sur les fibroblastes, on ne peut induire de croissance via le VEGF. En fait, il n'y a pas
de récepteurs au VEGF sur les fibroblastes.
L'expression de VEGF est induite en réponse a une hypoxie :
Le Southern Blot permet de mesurer l'ADN.
Le Northern Blot permet de mesurer l'ARN.
Le Western Blot permet de mesurer les protéines.
Sur le Northern Blot ci-dessous, on note une absence de VEGF en condition normale.
Le gène n'est pas exprimé. Dans des conditions hypoxique, on note la présence d'ARN
* Les protéines Nodal ont un rôle dans la symétrie-gauche. On mesure la présence de
Nodal via une hybridation in situ (qui marque l'ARN et l'ADN via une sonde)