120702 RENVOISE 2593035580K TH

AIX-MARSEILLE UNIVERSITE
FACULTE DE MEDECINE DE MARSEILLE
ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE
THESE DE DOCTORAT
Présentée et publiquement soutenue devant
LA FACULTÉ DE MÉDECINE DE MARSEILLE
Le lundi 2 juillet 2012, par
Aurélie RENVOISÉ
Née le 13 Décembre 1982 à La Seyne sur Mer
Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme
outil d’identification et de détection bactérienne en
laboratoire hospitalier de bactériologie.
En vue d’obtention du grade de DOCTORAT d’AIX-MARSEILLE UNIVERSITÉ
Spécialité: Maladies Infectieuses
Composition du Jury:
Pr Jean-Louis MEGE
Pr Florence DOUCET-POPULAIRE
Pr Guillaume ARLET
Pr Vincent JARLIER
Président du Jury
Rapporteur
Rapporteur
Directeur de thèse
Directeur du Laboratoire
ER5 (UPRES EA 1541) « recherche expérimentale, épidémiologique et moléculaire sur
la résistance aux antibiotiques » (Directeur : Pr Vincent Jarlier). Faculté de médecine
Pitié-Salpêtrière, Université Pierre et Marie Curie (Paris VI). Cette structure est intégrée
à l’IFR 113 « immunité – cancer - infection », Faculté de médecine Pitié-Salpêtrière
(Directeurs : Pr Brigitte Autran et Pr David Klatzmann)
1
Avant propos:
Le format de présentation de cette thèse correspond à une recommandation de la
spécialité Maladies Infectieuses et Microbiologie, à l’intérieur du Master des
Sciences de la Vie et de la Santé qui dépend de l’Ecole Doctorale des Sciences
de la Vie de Marseille.
Le candidat est amené à respecter des règles qui lui sont imposées et qui
comportent un format de thèse utilisé dans le Nord de l’Europe et qui permet un
meilleur rangement que les thèses traditionnelles. Par ailleurs, la partie
introduction et bibliographie est remplacée par une revue envoyée dans un
journal afin de permettre une évaluation extérieure de la qualité de la revue et de
permettre à l’étudiant de commencer le plus tôt possible une bibliographie
exhaustive sur le domaine de cette thèse. Par ailleurs, la thèse est présentée sur
article publié, accepté ou soumis associé d’un bref commentaire donnant le sens
général du travail. Cette forme de présentation a paru plus en adéquation avec
les exigences de la compétition internationale et permet de se concentrer sur des
travaux qui bénéficieront d’une diffusion internationale.
Professeur Didier RAOULT
2
SOMMAIRE
Résumé
5
Abstract
7
Abréviations
9
Introduction
10
Le ribosome bactérien
10
L’ARNr 16S : définition, origines et utilisation
12
Définition d’une espèce bactérienne
21
Place de la PCR universelle 16S dans l’identification bactérienne
24
Place de la PCR universelle 16S dans la détection de bactéries à partir de
prélèvements
27
Objectifs du travail personnel
30
1 - Identification de souches de diagnostic phénotypique impossible ou difficile par
PCR universelle 16S.
• Gordonia sputi bacteremia.
Renvoise A, Harle J-R, Roux V, Raoult D.
Emerg Infect Dis. 2009 Sep;15(9):1535-7.
Commentaire 32
Article 34
• Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacteremia in homeless woman.
Rebaudet S, Genot S, Renvoise A, Fournier P-E, Stein A.
Emerg Infect Dis. 2009 Jun;15(6):985-7.
Commentaire 38
Article 40
2 - Détection bactérienne dans les prélèvements humains par PCR universelle 16S.
• Kytococcus schroeteri, a rare agent of endocarditis.
Renvoise A, Roux V, Thuny F, Riberi A, Casalta JP.
Int J Infect Dis. 2008 Mar;12(2):223-7.
Commentaire 44
Article 46
3
SOMMAIRE (suite)
3 - Description de nouvelles espèces pour des souches isolées de prélèvements
biologiques humains grâce à la PCR universelle 16S.
• Actinomyces massiliensis sp. nov., isolated from a patient blood culture.
Renvoise A, Roux V, Raoult D.
Commentaire 52
Int J Syst Evol Microbiol. 2009 Mar;59(Pt 3):540-4.
Article 53
• Helcobacillus massiliensis gen. nov., sp. nov., a novel representative of the family
Dermabacteraceae isolated from a patient with a cutaneous discharge.
Commentaire 59
Renvoise A, Aldrovandi N, Raoult D, Roux V.
Int J Syst Evol Microbiol. 2009 Sep;59(Pt 9):2346-51.
Article 60
• Actinomyces timonensis sp. nov., isolated from a patient osteo-articular sample.
Renvoise A, Roux V, Raoult D.
Commentaire 67
Int J Syst Evol Microbiol. 2010 Jul;60(Pt 7):1516-21.
Article 69
Conclusions générales et perspectives
Conclusions générales
75
Limites générales de la PCR universelle 16S
76
Limites de la PCR universelle 16S en tant qu’outil d’identification bactérienne
77
Limites de la PCR universelle 16S en tant qu’outil de définition de nouvelles
espèces bactériennes. Débats autour de la définition de nouvelles espèces.
81
Limites de la PCR universelle 16S comme outil de détection moléculaire à partir
des prélèvements biologiques
83
Conclusion
87
Annexes
Annexe 1
Annexe 2
88
90
Bibliographie
93
Remerciements
106
4
RESUME
La PCR universelle ciblant le gène codant pour l’ARNr 16S à l’aide
d’amorces universelles, a d’abord été développée pour des études phylogénétiques.
En effet ce gène est universellement retrouvé chez les bactéries et sa fonction est
conservée. Ainsi, il peut servir d’« horloge moléculaire » pour mesurer les
distances phylogénétiques entre les différentes espèces bactériennes. La PCR
universelle a ensuite été appliquée en microbiologie clinique dans deux domaines
distincts : la détection et l’identification bactériennes. Dans ce travail, nous avons
évalué l’applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil diagnostique dans
un centre hospitalier universitaire (hôpital la Timone, Marseille, France).
Tout d’abord, nous avons décrit comment la PCR universelle permet
l’identification de souches bactériennes mal identifiées par les techniques
phénotypiques conventionnelles. Puis, nous avons montré que la PCR universelle
peut être utilisée pour détecter l’ADN bactérien dans des prélèvements à culture
négative, soit parce que le patient a reçu une antibiothérapie préalable, soit parce
que le microorganisme responsable est de croissance difficile. Enfin, nous avons
montré que la PCR 16S utilisée pour l’identification permet de mettre en évidence
des souches susceptibles de représenter de nouvelles espèces et/ou de nouveaux
genres bactériens.
5
Ainsi, la PCR universelle est applicable dans un laboratoire de bactériologie
de routine dans les trois objectifs ci-dessus. Elle permet une identification précise
des souches bactériennes et l’amélioration du diagnostic des infections associées à
des cultures négatives et, par là-même, l’amélioration de la prise en charge des
patients. La PCR universelle permet aussi d’étendre nos connaissances des
maladies infectieuses et de la phylogénie bactérienne. Bien que la PCR universelle
présente certaines limites (discutées dans ce travail), elle reste aujourd’hui le goldstandard incontournable de l’identification et de la détection moléculaires dans les
laboratoires de bactériologie.
Mots clés: PCR universelle, 16S rRNA gene, diagnostic moléculaire,
identification, détection, taxonomie, nouvelles espèces
6
ABSTRACT
Broad-range 16S rDNA PCR using universal primers was first
developed for phylogenetic purpose since 16S rRNA gene is found in every
bacterial species with a conserved function; consequently 16S rRNA gene can
be used as a molecular clock for assessing bacterial phylogeny. Broad-range
PCR was then applied to medical microbiological diagnosis in two distinct
fields: molecular detection and bacteria identification. In the present work, we
evaluated the applicability of broad-range PCR as a diagnostic tool in a
teaching hospital (Timone Hospital, Marseilles, France).
First, we showed that broad-range PCR allows identification of bacteria
obtained in culture but misidentified by conventional phenotypic methods.
Second, we showed that universal PCR permits bacterial detection in culturenegative infection. Third, we exemplified that using broad-range PCR is a
valuable tool to identify new bacterial species and/or genera.
Consequently, universal PCR is applicable in routine laboratories in the
three above fields; it allows a more accurate identification of bacterial strains
and permits to diagnose culture-negative bacterial infections, thus improving
patient’s management. It also improves our knowledge of infectious diseases
together with bacterial diversity and phylogeny. Although universal PCR
7
presents certain limitations (discussed in this work), it remains today the goldstandard for molecular identification and detection in routine laboratories.
Keywords: broad-range PCR, 16S rRNA gene, molecular diagnosis,
identification, detection, taxonomy, new species.
8
ABREVIATIONS
ADN……………………
ARN…………………
ARNr ou rRNA………
ARNr 16S ou 16S rRNA
16S rRNA gene ………
PCR …………………
rpoB …………………
maldi-tof ………………
S………………………
acide désoxyribonucléique
acide ribonucléique
acide ribonucléique ribosomique
constituant ARN de la petite sous-unité
ribosomale du 30S des procaryotes
le gène codant les ARN ribosomaux 16S
réaction en chaîne par polymérase (de l'anglais
polymerase chain reaction)
gène codant pour la sous-unité béta de l'ARN
matrix-assisted laser desorption ionization-time-offlight
Le Svedberg, de symbole S, est une unité de
mesure du taux de sédimentation.
9
INTRODUCTION
1. Le ribosome bactérien
Le ribosome est un complexe ribonucléoprotéique (c’est-à-dire composé
de protéines et d’ARN) ; il permet la synthèse des protéines en utilisant l’ARN
messager comme source d’information et les ARN de transfert associés aux
acides aminés comme substrats. Cette synthèse protéique, encore appelée
traduction est divisée en cinq phases principales : la liaison de l'ARN messager
au ribosome, l'initiation, l'élongation, la terminaison et le recyclage des sous
unités ribosomales. Chez les bactéries, le ribosome est composé d’une grande
sous-unité (50S) et d’une petite sous-unité (30S) (cf Figure 1 page 10).
Figure 1 : L’ARN ribosomique 16S : un constituant de la petite sous-unité ribosomale
des procaryotes.
10
Au total, le ribosome fonctionnel (composé des deux sous-unités réunies)
a une masse moléculaire de 2,5-megadalton et un coefficient de sédimentation
de 70S (Schmeing and Ramakrishnan, 2009). La petite sous-unité est composée
de l’ARN ribosomal 16S (cf Figure 1 page 10) (codé par un gène d’environ
1500 nucléotides) et d’environ 20 protéines ; elle permet la « lecture de l’ARN
messager ». La grande sous-unité est composée de l’ARN ribosomal 23S (codé
par un gène d’environ 2900 nucléotides), de l’ARN ribosomal 5S (codé par un
gène d’environ 120 nucléotides) et d’environ 30 protéines ; elle permet la
synthèse de la protéine correspondant à l’ARN messager « lu » par la petite
sous-unité. De plus, divers facteurs protéiques agissent sur le ribosome aux
différentes étapes de la traduction (Schmeing and Ramakrishnan, 2009).
11
2. L’ARNr 16S : définition, origines et utilisation
L'ARN ribosomal (ARNr) 16S est le constituant ARN de la petite sousunité ribosomale du 30S des procaryotes (cf Figure 1 page 10). Le gène codant
pour cet ARNr est le « 16S rRNA gene » (Clarridge, III, 2004), présent dans
l’ensemble des espèces bactériennes en un nombre variable de copies (cf Figure
2 page 13) (Petti, 2007; Woese, 1987). Il est composé d’environ 1500
nucléotides et est constitué de sept régions conservées et de neuf régions
hypervariables (cf Figure 3 page 14) (Chakravorty et al. 2007). L’ensemble
permet donc théoriquement d’utiliser ce gène pour identifier et détecter toute
espèce bactérienne.
12
Figure 2 : Structure secondaire de l’ARN ribosomique 16S d’Escherichia coli.
Source : http://rna.ucsc.edu/rnacenter/ribosome_images.html
13
16S long réalisé au CHU la Timone (amorces fD1 et rP2) et amorces
de séquençage :
16S court réalisé au CHU la Timone
(amorces 536F et rP2) et amorces de
séquençage :
16S court commercialisé par
MicroSeq 500 (amorces 5F et 531R)
Figure 3 : Représentation schématique du gène codant pour l’ARNr 16S. Les cercles
représentent les régions conservées utilisées pour le design d’amorces nécessaires à
l’amplification et au séquençage.
Quelques exemples de choix d’amorces sont donnés.
Source : Petti, 2007
14
Dans les années 1980, il a été montré que les relations phylogéniques
entre les êtres vivants pouvaient être déterminées en comparant leurs séquences
nucléiques (Clarridge, III, 2004). Des travaux préliminaires ont pu montrer que
le 16S rRNA gene code pour un ARN ribosomal de fonction constante dans
l’évolution ; ce gène peut donc servir d’horloge moléculaire pour suivre les
changements dans l’évolution bactérienne. Les séquences du gène 16S ont ainsi
joué un rôle majeur dans l’étude de la phylogénie et de la taxonomie bactérienne
(Janda and Abbott, 2007; Olsen and Woese, 1993). Ce gène a d’abord été utilisé
à la fin des années 1980 par Carl Woese comme outil d’étude de l’évolution
bactérienne (Woese, 1987). En 1991, Weisburg et al. ont décrit des amorces
dites « universelles » permettant d’amplifier l’intégralité du gène codant pour
l’ARNr 16S de la plupart des bactéries (cf Figure 3 page 14) (Weisburg et al.
1991). Actuellement de multiples amorces universelles ont été décrites dans la
littérature. Il n’existe malheureusement aucune revue ni aucune base de données
qui répertorierait les dizaines d’amorces décrites depuis 20 ans. Dans le domaine
de la détection bactérienne, Sontakke et al. ont proposé en 2009 une synthèse
des diverses amorces utilisées (cf Tableau 2 page 19). De plus la nomenclature
des amorces reste non consensuelle ; souvent les auteurs nomment une amorce
avec un nombre faisant référence à la position de la première base sur l’ADNr
16S d’Escherichia coli, suivi de F ou R pour forward ou reverse. Mais cela n’est
pas toujours le cas, comme on peut noter pour les amorces fréquemment
utilisées fD1 et rP2 (décrites par Weisburg et al). Les amorces utilisées au
15
laboratoire du CHU la Timone pendant la durée de ce travail ainsi que les
conditions de réaction sont données dans le Tableau 1 page 18.
Le terme de « PCR universelle » ou « PCR 16S » sera utilisé par abus de
langage dans les décennies suivantes pour nommer l’amplification du gène
codant pour l’ARNr 16S. Les termes de « 16S court » et « 16S long » feront
également leur apparition dans le langage courant des microbiologistes pour
faire référence à différentes longueur de séquences amplifiées (cf Figure 3 page
10 et Tableau 1 page 18). « 16S court » fait référence à l’amplification d’une
partie du gène codant pour l’ARNr 16S, le plus souvent les 500 premiers
nucléotides mais ce n’est pas toujours le cas (Petti, 2007). Pour la plupart des
souches, le pouvoir discriminant de ces courtes séquences semble suffisant pour
discriminer les espèces entre elles (Clarridge, III, 2004). Pour différentier
certains genres ou pour décrire une nouvelle espèce, l’amplification « 16S
long » reste nécessaire (Clarridge, III, 2004).
En partant de la caractéristique d’universalité dans le monde bactérien,
l’amplification suivie du séquençage du 16S rRNA gene a été utilisée pour
identifier
des
souches
bactériennes
mal
identifiées
par
techniques
conventionnelles, mais également pour détecter l’ADN bactérien directement à
16
partir des prélèvements (Petti, 2007). Ces applications, qui ont ouvert une
nouvelle voie dans la pratique de la microbiologie clinique, sont décrites cidessous.
17
Tableau 1 : Amorces et conditions de réaction utilisées au CHU la Timone
Amorces d'amplification pour le 16S long * (5' => 3')
fD1 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
rP2 ACGGCTACCTTGTTACGACTT
Amorces de séquençage pour le 16S long (5' => 3')
536F CAGCAGCCGCGGTAATAC
536R GTATTACCGCGGCTGCTG
800f ATTAGATACCCTGGTAG
800r CTACCAGGGTATCTAAT
1050f TGTCGTCAGCTCGTG
1050r CACGAGCTGACGACA
Amorces d'amplification pour le 16S court † (5' => 3')
536F CAGCAGCCGCGGTAATAC
rP2 ACGGCTACCTTGTTACGACTT
Amorces de séquençage pour le 16S court (5' => 3')
536F CAGCAGCCGCGGTAATAC
800f ATTAGATACCCTGGTAG
800r CTACCAGGGTATCTAAT
1050f TGTCGTCAGCTCGTG
Conditions de réaction
16S long
16S court
température
durée
température
durée
‡
95°C
5' ou 15'
95°C
5' ou 15'
95°C
30''
95°C
30''
52°C
30''
62°C
30''
72°C
1'30''
72°C
1'30''
4°C
4°C
∝
∝
40 cycles
*
utilisé pour l’identification et la détection jusqu’en 2005, puis à partir de 2005
seulement pour l’identification.
†
utilisé pour la détection à partir de 2005.
‡
en fonction de la polymérase utilisée.
18
Tableau 2 : Résumé des différentes amorces utilisées pour la PCR 16S dans un contexte
de détection bactérienne à partir des prélèvements cliniques.
Source : Sontakke et al., 2009
19
20
3. Définition d’une espèce bactérienne
La définition du concept d’espèce bactérienne est un point délicat ; la
correspondance entre une souche et une espèce déjà décrite est basée sur une
similarité phénotypique et génétique (Gevers et al.
2005). Les méthodes
actuelles utilisées pour définir les espèces procaryotes ne permettent pas de
couvrir la diversité trouvée dans la nature et la taxonomie bactérienne est
influencée par les avancées dans la génétique des populations, l’écologie, la
génomique et par la facilité avec laquelle les données peuvent être obtenues
(Gevers et al. 2005).
Traditionnellement, une espèce bactérienne est définie à partir de
l’hybridation ADN-ADN, qui est une technique lourde, complexe, onéreuse et
de moins en moins utilisée (cf Figure 4 page 22) (Stackebrandt et al. 2002). Si
on se base sur la cinétique de réassociation ADN-ADN, la définition génétique
d’une espèce est quantifiable. Une espèce est alors définie génétiquement
comme le rassemblement de souches qui ont des relations ADN-ADN se
traduisant par (i) un pourcentage d’hybridation ADN-ADN
stabilité thermique des hybrides
70% et (ii) une
5°C (Janda and Abbott, 2007).
21
Figure 4 : Principe de l’hybridation ADN-ADN entre deux espèces bactériennes. Plus les
espèces sont proches, moins de mésappariements surviennent pendant l’hybridation.
Source : “Understanding evolution”, université de Berkeley, Californie.
http://evolution.berkeley.edu/evosite/history/genetsims2.shtml
22
Le comité Stackebrandt a établi que toute description de nouvelle espèce
devait comporter une séquence complète du 16S rRNA gene (Stackebrandt et al.
2002). Toutefois, pour les pourcentages de similarité, il n’y a pas de valeur seuil
clairement établie au-delà de laquelle la communauté scientifique s’accorde
pour définir le rang d’espèce (Janda and Abbott, 2002; Janda and Abbott, 2007).
En effet, si une similarité proche (≥ 97%) entre deux séquences de 16S ne
permet pas systématiquement d’affirmer que deux souches appartiennent à la
même espèce, l’inverse est vrai : une similarité entre deux séquences de 16S
inférieure à 97% permet d’affirmer que les souches correspondantes
appartiennent à des espèces différentes (Drancourt et al. 2004; Gevers et al.
2005; Janda and Abbott, 2007). Lorsque les séquences des ARNr 16S des
souches présentent plus de 97% d'homologie, le comité Stackebrandt
recommande que l'étude des pourcentages d'hybridation ADN-ADN ainsi que la
stabilité thermique des hybrides demeurent la référence pour définir une
genomospecies bactérienne (Stackebrandt et al. 2002).
23
4. Place de la PCR universelle 16S dans l’identification bactérienne
L’identification bactérienne se fait traditionnellement à partir des
caractères phénotypiques de la bactérie : coloration (de Gram par exemple),
morphologie, aptitude à croitre sur certains milieux de culture, caractères
biochimiques détectés par diverses techniques commerciales (galeries API,
systèmes Vitek, Phoenix, Biolog…). Toutefois certaines bactéries sont mal
identifiées phénotypiquement pour diverses raisons. En effet, certaines bactéries
expriment peu de caractères phénotypiques. Pour d’autres espèces, une situation
de stress peut avoir altéré les caractères phénotypiques. Une identification basée
exclusivement sur des caractères phénotypiques peut donc mener à un résultat
erroné. Par ailleurs, les bactéries rares ne sont pas répertoriées dans les bases de
données des systèmes commercialisés et en conséquence, les techniques basées
sur les caractères phénotypiques ne permettront pas de les identifier. Enfin, pour
certaines bactéries à croissance difficile les caractères phénotypiques sont
difficiles à déceler ; la biologie moléculaire simplifie dans ce cas l’identification
(Petti et al. 2005). Dans ces situations, l’amplification et le séquençage du 16S
rRNA gene suivi de la comparaison de la séquence obtenue à des bases de
données ont démontré leur efficacité pour l’identification bactérienne. Il s’agit
d’une méthode universelle, précise et objective, dont la variabilité interopérateur est limitée par rapport aux techniques conventionnelles (Petti, 2007).
24
Deux études importantes ont mesuré la performance de la PCR 16S pour
l’identification des isolats cliniques non identifiés par méthode traditionnelle.
Kiratisin et al. ont rapporté que dans leur laboratoire 5% des isolats n’avaient
pas été identifiés par techniques conventionnelles, mais l’avaient été par la PCR
16S au niveau de l’espèce pour 74% d’entre elles, au niveau du genre pour 21%
autres, alors que les 5% restants n’avaient pas pu l’être malgré l’approche
moléculaire (Kiratisin et al.
2003). Les chiffres correspondant trouvés par
Mignard et al. ont rapporté que 83,1% des isolats étaient identifiés au niveau de
l’espèce, 15,8% au niveau du genre, et pas d’identification pour seulement 1%
(Mignard and Flandrois, 2006).
L’utilisation de la PCR 16S pour l’identification bactérienne en
laboratoire de routine a permis de découvrir de nouvelles espèces ou de
nouveaux genres bactériens. Avec la généralisation et la diffusion de l’outil
moléculaire, de nombreuses souches présentant un pourcentage de similarité
génétique inférieur à 97% ont été ainsi découvertes. La PCR universelle s’est
imposée comme un moyen de découverte de nouveaux taxons. Par exemple,
Drancourt et al. ont rapporté la découverte de 11 nouvelles espèces bactériennes
parmi 1404 isolats pour lesquels les techniques conventionnelles n’avaient pas
été contributives et analysées par PCR 16S (Drancourt et al. 2004). Dans ce
travail, des pourcentages de similarité supérieurs à 99% avaient été choisis pour
assimiler une souche à une espèce déjà décrite ; de 97 à 99% pour l’assimiler au
25
niveau du genre ; et inférieurs à 97% pour décrire une nouvelle espèce. La PCR
16S est donc un outil majeur d’exploration de la diversité bactérienne
(Drancourt et al. 2004; Janda and Abbott, 2007).
26
5. Place de la PCR universelle 16S dans la détection de bactéries à
partir de prélèvements
La PCR 16S a aussi été utilisée comme un outil de détection moléculaire
directement à partir de prélèvements cliniques. Il s’agit donc d’une méthode
alternative, indépendante de la culture pour la détection bactérienne (Petti,
2007). Rampini et al. ont montré dans une étude publiée en 2011 que la PCR
universelle avait permis d’identifier un agent pathogène dans 42,9% des
prélèvements négatifs en culture provenant de patients ayant une infection
documentée (Rampini et al. 2011). L’utilisation de la PCR 16S « diagnostique »
a notamment été proposée dans certains cadres nosologiques (Petti, 2007;
Sontakke et al. 2009) : dans les endocardites où la PCR universelle peut être
réalisée sur le sang total et les valves cardiaques (Fournier et al. 2010; Rovery
et al. 2005) ; dans les abcès cérébraux ou les méningites à culture négative (Al
Masalma et al. 2009; Sontakke et al. 2009) ; ou dans les infections ostéoarticulaires (Fenollar et al. 2006). D’autres applications moins fréquentes ont
été proposées : infections du liquide amniotique, empyèmes, pleurésies,
neutropénies fébriles ou encore péricardites (Sontakke et al. 2009).
L’exemple des endocardites à hémocultures négatives illustre l’intérêt de
la PCR 16S pour la prise en charge diagnostique et thérapeutique des patients.
En effet pour les endocardites, la positivité des hémocultures fait partie des
27
critères de Duke pour le diagnostic des endocardites infectieuses (Habib et al.
2009) ; mais dans 2,5 à 31% des cas, les hémocultures restent négatives
(Fournier et al. 2010). Depuis plus de 10 ans, l’apport de la PCR 16S réalisée
sur les valves cardiaques de patients opérés pour une endocardite infectieuse a
été largement décrit dans la littérature (Gauduchon et al. 2003; Goldenberger et
al. 1997; Greub et al. 2005; Lang et al. 2004; Podglajen et al. 2003;
Vondracek et al. 2011). Ces travaux ont montré que la PCR 16S présentait un
intérêt particulier dans les situations où les patients avaient reçu une
antibiothérapie préalable (Podglajen et al.
2003) ou lorsque l’endocardite
infectieuse était due à un agent fastidieux (Fournier et al. 2010). Cela permet
ainsi d’améliorer la prise en charge thérapeutique post-chirurgicale des patients
(Gauduchon et al.
2003; Lang et al.
2004; Podglajen et al.
2003).
Comparativement, la culture traditionnelle des valves cardiaques présente un
intérêt limité (Greub et al. 2005; Vondracek et al. 2011). D’autres travaux ont
également évalué l’intérêt de la PCR 16S réalisée sur sang total pour améliorer
la prise en charge diagnostique chez les patients non opérés et donc sans tissu
cardiaque analysable. Mais on retrouve une faible sensibilité de la PCR 16S sur
sang total pour le diagnostic étiologique des endocardites infectieuses (Fournier
et al. 2010). Enfin, il a été proposé que l’approche moléculaire soit intégrée aux
critères de Duke pour le diagnostic des endocardites infectieuses (Millar et al.
2001), mais cela n’a jamais été pris en compte (Habib et al. 2009).
28
Théoriquement, le champ de la PCR 16S ne se limite pas aux infections
monomicrobiennes, car les techniques de clonage et de pyroséquençage
permettent d’identifier différents microorganismes à partir d’un même
prélèvement (Al Masalma et al. 2009; Armougom et al. 2009). Une telle
stratégie, longue et onéreuse, est toutefois difficilement applicable dans le cadre
de l’activité de routine d’un laboratoire. En pratique, la technique permet la
détection de certaines bactéries de croissance difficile (mycobactéries, bactéries
contenant des acides mycoliques, bactéries intra-cellulaires telles que Coxiella
burnetii, Bartonella spp., Ehrlichia spp., Anaplasma spp., Francisella
tularensis, Mycoplasma spp.) ou dont la détection par culture conventionnelle
est rendue impossible en raison d’un traitement antibiotique préalable (Rampini
et al. 2011). En revanche, la PCR universelle appliquée en parallèle de la mise
en culture de prélèvements, pour des patients infectés et n’ayant jamais reçu
d’antibiotiques ne semble pas contributive (Rampini et al. 2011).
29
6. Objectifs du travail personnel
Dans le cadre de ce travail, nous avons voulu évaluer l’applicabilité de la
PCR 16S comme outil d’identification (articles 1, 2 et 3), de détection
moléculaire (article 3) et de découverte de nouvelles espèces (articles 4, 5 et 6)
au sein d’un laboratoire hospitalier de bactériologie. Les résultats de cette
évaluation sont rapportés ci-après.
30
ARTICLE 1
Gordonia sputi bacteremia.
Renvoise A1, Harle J-R2, Roux V1, Raoult D1.
Emerg Infect Dis. 2009 Sep;15(9):1535-7.
1
URMITE UMR CNRS 6236, IRD 198, Université de la Méditerranée, Faculté de Médecine,
27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille cedex 05, France
2
Service de médecine interne, centre Hospitalier Universitaire La Conception, Marseille,
France.
Contribution de AR: récueil des données clinico-biologiques, analyse des données
moléculaires, travail bibliographique, écriture du manuscrit.
31
Commentaire
Dans ce travail nous avons rapporté l’identification d’une souche
bactérienne d’origine clinique par séquençage du 16S rRNA gene, suivi de la
comparaison de la séquence de 1464 nucléotides obtenue sur la base de données
Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Nous avons pu ainsi décrire
une bactériémie à Gordonia sputi.
Ce travail souligne que les bacilles à Gram positif cultivés dans les
flacons d’hémocultures ne doivent pas être systématiquement considérés comme
des contaminants ; lorsque les critères cliniques et microbiologiques sont
compatibles avec l’imputabilité de tels microorganismes dans un tableau
infectieux, ils doivent bénéficier de techniques d’identification plus fines que les
techniques biochimiques classiques. En effet les profils biochimiques peuvent
conduire à des résultats erronés ; ainsi dans le cas des Gordonia spp. identifiées
par biologie moléculaire et rapportées dans la littérature, les souches avaient été
initialement identifiées comme Rhodococcus spp., Corynebacterium spp., ou
Nocardia spp. (Blanc et al. 2007; Blaschke et al. 2007; Lesens et al. 2000;
Sng et al. 2004). On sait que la PCR 16S permet une meilleure identification
des bacilles à Gram positif aérobies que les méthodes phénotypiques
conventionnelles. Bosshard et al. avaient rapporté que sur 136 souches cliniques
de bacilles à Gram positif mal identifiées par techniques conventionnelles
32
(seulement 52,2% des souches avaient été identifiées au niveau du genre par
technique conventionnelle), la PCR 16S avait identifié 65,4% des souches au
niveau de l’espèce (définie par une similarité
99%) et 31,6% supplémentaires
au niveau du genre (défini par une similarité entre 95 et 99%) (Bosshard et al.
2003). Enfin, une série rapportant l’identification moléculaire systématique
d’isolats non identifiés par techniques conventionnelles avait retrouvé que les
bacilles à Gram positif étaient surreprésentés parmi les isolats rarement décrits
en pathogénicité humaine (Drancourt et al. 2004).
La revue de la littérature réalisée à l’occasion de ce travail a permis de
montrer que les espèces du genre Gordonia spp. causent un large spectre de
pathologies humaines dont la connaissance a pu être développée grâce à l’apport
de la PCR universelle 16S (Blanc et al. 2007; Blaschke et al. 2007; Gil-Sande
et al. 2006; Iida et al. 2005; Jannat-Khah et al. 2009; Lesens et al. 2000; Sng
et al. 2004; Verma et al. 2006; Werno et al. 2005). Ce travail illustre donc
l’apport de l’identification bactérienne par PCR 16S dans la description de
maladies infectieuses, qu’on peut qualifier d’émergentes dans le sens où le
diagnostic microbiologique ne pouvait être réalisé avant l’ère moléculaire
(Drancourt et al. 2004).
33
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ARTICLE 2
Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacteremia in
homeless woman.
Rebaudet S2, Genot S2, Renvoise A1, Fournier P-E1, Stein
A2.
Emerg Infect Dis. 2009 Jun;15(6):985-7.
1
URMITE UMR CNRS 6236, IRD 198, Université de la Méditerranée, Faculté de Médecine,
27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille cedex 05, France
2
Service de maladies infectieuses, centre Hospitalier Universitaire La Conception, Marseille,
France.
Contribution de AR: recueil des données de biologie moléculaire et bactériologiques, analyse
des données moléculaires, participation à l’écriture du manuscrit pour la partie biologique et
au travail bibliographique.
37
Commentaire
Ce deuxième travail rapporte l’identification d’une souche de bacille à
Gram négatif isolée d’une hémoculture pour laquelle aucune identification
phénotypique n’avait pu être obtenue. Seul le séquençage du 16S rRNA gene
avait permis l’identification d’une souche de Wohlfahrtiimonas chitiniclastica.
La description de ce nouveau genre associé à cette nouvelle espèce avait été
publiée de façon concomitante au cas hospitalier décrit ici (Toth et al. 2008) (cf
Annexe 1 page 88). Ce travail souligne donc l’applicabilité de la PCR
universelle dans la description de maladies infectieuses émergentes, ici au sens
d’une pathologie humaine inconnue jusqu’alors. Il est à noter que, depuis, un
autre cas de sepsis associé à cette espèce a été décrit (Almuzara et al. 2011). Ce
travail se place dans la continuité d’une étude qui avait rapporté 16 isolats (sur
1404 identifiés par biologie moléculaire) correspondant à des espèces
bactériennes décrites, mais encore jamais associées à une pathogénicité humaine
(Drancourt et al. 2004).
Certains auteurs proposent que lorsque des souches inhabituelles sont
identifiées par biologie moléculaire, les laboratoires apportent des informations
additionnelles aux cliniciens pour les aider à replacer ces espèces rares dans un
cadre microbiologique plus familier (Petti, 2007). Ainsi, il est recommandé de
donner au clinicien le nom de l’espèce la plus proche, le pourcentage de
38
similarité ainsi que la base de données sur laquelle la comparaison a été
effectuée (Clarridge, III, 2004). Dans le cas présent, nous avions répondu au
clinicien que pour la souche isolée chez son patient, nous obtenions un
pourcentage de similarité de 99,5% avec la souche E43 appartenant au genre
Ignatzchineria spp. (numéro d’accession Genbank AJ517825). Quelques jours
plus tard, la description de W. chitiniclastica a été publiée (Toth et al. 2008) et
on pourrait rendre aujourd’hui pour la même souche, un pourcentage de
similarité de 100% avec la souche H100 de l’espèce W. chitiniclastica (numéro
d’accession Genbank HQ407275).
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ARTICLE 3
Kytococcus schroeteri, a rare agent of endocarditis.
Renvoise A1, Roux V1, Thuny F2, Riberi A3, Casalta JP1.
Int J Infect Dis. 2008 Mar;12(2):223-7.
1
URMITE UMR CNRS 6236, IRD 198, Université de la Méditerranée, Faculté de Médecine,
27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille cedex 05, France
2
Service de cardiologie, centre Hospitalier Universitaire La Timone, Marseille, France.
3
Service de chirurgie cardiaque, centre Hospitalier Universitaire La Timone, Marseille,
France.
Contribution de AR: récueil des données clinico-biologiques, analyse des données, travail
bibliographique, écriture du manuscrit.
43
Commentaire
Cet article illustre l’applicabilité de la PCR universelle comme outil de
détection moléculaire. Ce travail fait suite à une stratégie établie dans le
laboratoire de bactériologie du CHU la Timone (Marseille), où la détection
moléculaire est systématiquement réalisée pour les valves cardiaques de patients
atteints d’endocardite infectieuse sans documentation microbiologique (Fournier
et al. 2010). Cette détection moléculaire comprend, entre autres, la PCR 16S et
a permis dans ce cas de détecter puis d’identifier Kytococcus schroeteri comme
agent d’endocardite infectieuse sur une valve cardiaque restée négative en
culture. Cela souligne l’intérêt de la PCR universelle pour la détection
moléculaire de produits biologiques négatifs en culture, comme cela a pu être
montré pour les endocardites à hémoculture négatives sur le sang et les valves
cardiaques (Fournier et al. 2010), pour les infections ostéo-articulaires (Fenollar
et al. 2006) ou encore les infections neuro-méningées (Al Masalma et al.
2009).
Nous avons montré dans ce travail (a) la présence d’ADN de K. schroeteri
dans une bioprothèse valvulaire retirée pour endocardite à hémoculture négative
et (b) rétrospectivement qu’une souche de cocci à Gram positif isolée d’une
hémoculture quelques mois avant chez le même patient et identifiée alors
comme Micrococcus luteus (et donc considérée comme contaminant) était en
44
fait aussi un K. schroeteri. Ainsi la PCR 16S peut dans certaines circonstances
permettre de rectifier une erreur d’identification et améliorer le diagnostic et la
prise en charge des patients (Petti et al.
2005), et permet une meilleure
connaissance des pathologies liées à des agents jusqu’alors considérés comme
contaminants ou pathogènes opportunistes (Schlaberg et al. 2012).
Depuis ce travail, la description de K. schroeteri comme pathogène
humain a été rapportée à diverses reprises dans différents cadres nosologiques
(Chan et al. 2012).
45
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ARTICLE 4
Actinomyces massiliensis sp. nov., isolated from a
patient blood culture.
Renvoise A, Roux V, Raoult D.
Int J Syst Evol Microbiol. 2009 Mar;59(Pt 3):540-4.
URMITE UMR CNRS 6236, IRD 198, Université de la Méditerranée, Faculté de Médecine,
27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille cedex 05, France
Contribution de AR: réalisation des expérimentations, travail bibliographique, analyse des
données, écriture du manuscrit.
51
Commentaire
Dans ce travail, nous avons démontré l’applicabilité de la PCR universelle
pour identifier une souche d’actinomycète isolée d’un prélèvement clinique. La
PCR 16S a d’abord identifié la souche 4401292 isolée d’une hémoculture
comme un membre du genre Actinomyces spp. Les pourcentages de similarité
obtenus par comparaison avec les séquences 16S des diverses espèces
d’Actinomyces décrites trouvaient des valeurs inférieures à 97%, seuil endessous duquel on peut parler de nouvelle espèce bactérienne (Stackebrandt et
al.
2002). Nous avons pu ainsi décrire une nouvelle espèce bactérienne :
Actinomyces massiliensis sp. nov. La description a été basée sur des caractères
morphologiques et biochimiques, le profil des acides gras et une séquence de
1481 nucléotides du 16S rRNA gene.
Ce travail souligne que l’utilisation de la PCR 16S dans un laboratoire de
bactériologie permet d’améliorer la connaissance de la diversité bactérienne et
des pathogènes émergents (Drancourt et al. 2004).
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ARTICLE 5
Helcobacillus massiliensis gen. nov., sp. nov., a novel
representative of the family Dermabacteraceae
isolated from a patient with a cutaneous discharge.
Renvoise A, Aldrovandi N, Raoult D, Roux V.
Int J Syst Evol Microbiol. 2009 Sep;59(Pt 9):2346-51.
URMITE UMR CNRS 6236, IRD 198, Université de la Méditerranée, Faculté de Médecine,
27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille cedex 05, France
Contribution de AR: réalisation des expérimentations, travail bibliographique, analyse des
données, écriture du manuscrit.
58
Commentaire
Dans ce travail, nous avons isolé au cours de notre activité de routine
hospitalière une souche de bacille à Gram positif cultivée à partir du
prélèvement cutané d’un erythrasma. Cette souche avait été mal identifiée sur
ses caractères biochimiques par galerie API Coryne (bioMérieux), et avait donc
été soumise à identification moléculaire. La séquence 16S de 1337 nucléotides
avait trouvé une similarité de 95,1% avec celle de l’espèce Dermabacter
hominis, ce qui faisait de la souche 6401990 une candidate pour une nouvelle
espèce (Stackebrandt et al.
2002). Cependant certaines caractéristiques
phénotypiques différaient de celles communes au genre Dermabacter spp., et la
souche a donc été classifiée dans un nouveau genre.
La PCR 16S permet donc d’élargir notre connaissance du monde
bactérien aussi bien au niveau des espèces que des genres (Schlaberg et al.
2012).
59
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ARTICLE 6
Actinomyces timonensis sp. nov., isolated from a
patient osteo-articular sample.
Renvoise A, Roux V, Raoult D.
Int J Syst Evol Microbiol. 2010 Jul;60(Pt 7):1516-21.
URMITE UMR CNRS 6236, IRD 198, Université de la Méditerranée, Faculté de Médecine,
27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille cedex 05, France
Contribution de AR: réalisation des expérimentations, travail bibliographique, analyse des
données, écriture du manuscrit.
66
Commentaire
Dans ce travail, nous avons utilisé la PCR universelle pour identifier une
souche provenant d’un prélèvement de sacro-iléite. Dans ce cas, la comparaison
des 1360 nucléotides obtenus pour le gène 16S avait trouvé une similarité de
96,9% avec celle de l’espèce Actinomyces denticolens, ce qui faisait de notre
souche une nouvelle espèce si on considère le seuil de 97% proposé par le
comité Stackebrandt pour la ré-évaluation de la définition des espèces en
bactériologie (Stackebrandt et al. 2002).
La particularité de ce travail par rapport aux précédents réside d’abord
dans l’origine de la souche. En effet, nous avions reçu un prélèvement ostéoarticulaire fait chez une enfant de 13 ans et pour lequel nous avions observé des
bacilles à Gram positif et à coloration acido-alcoolo résistante à l’examen
microscopique mais dont la culture était restée négative et pour laquelle la
détection moléculaire a aussi été négative. Le prélèvement avait par ailleurs été
mis en culture cellulaire (Gouriet et al. 2005), ce qui avait permis d’isoler la
souche ayant fait l’objet du travail.
La deuxième particularité est d’avoir pu intégrer à la description de cette
nouvelle souche des données protéiques. En effet le développement de la
spectrométrie de masse pour l’identification bactérienne a été concomitant à la
67
réalisation de ce travail (Seng et al. 2009), ce qui a permis d’associer cette
nouvelle technologie pour décrire cette nouvelle espèce.
68
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2-
CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES
Conclusions générales
Au total, l’utilisation de la PCR dite « universelle » par amplification du
16S rRNA gene a révolutionné l’identification et la détection bactérienne dans
les laboratoires de bactériologie. Comme nous l’avons illustré dans ce travail,
cette découverte scientifique a permis la description de maladies infectieuses
« émergentes » (articles 1, 2, 3), mais aussi l’expansion de la connaissance du
monde bactérien par la description de nouvelles espèces et de nouveaux genres
(article 4, 5, 6). Enfin la détection bactérienne moléculaire pourrait apporter une
amélioration de la prise en charge des patients, car elle peut permettre de poser
des diagnostics microbiologiques là où les techniques conventionnelles auraient
apporté un diagnostic plus lent voire n’auraient pu apporter le diagnostic (article
1). Cependant il faut préciser quelles sont les limites et les écueils de la PCR
« universelle » basée sur l’amplification et le séquençage de l’ARNr 16S.
75
1. Limites générales de la PCR universelle 16S
L’outil moléculaire 16S a certaines limites. Celles-ci sont tout d’abord
d’ordre général : le coût reste élevé, bien qu’il ait pu être réduit depuis la
description de la technique (Kiratisin et al. 2003). Certains auteurs proposent
également de ne séquencer que partiellement le gène 16S (environ 500
nucléotides soit le tiers du gène dans sa partie 5’) afin de limiter le coût tout en
conservant une bonne valeur taxonomique (Clarridge, III, 2004; Schlaberg et al.
2012). L’apport de cette stratégie associée à l’utilisation d’un système
commercialisé (MicroSeq 500) a été rapporté dans la littérature ; la principale
limitation du « MicroSeq 500 16S ribosomal DNA-based bacterial identification
system » résiderait dans la qualité de la base de donnée qui lui est associée, base
qui serait constituée d’un nombre insuffisant de séquences (Woo et al. 2003).
Par ailleurs, la PCR 16S nécessite des techniciens formés à la biologie
moléculaire, mais également des microbiologistes formés à l’utilisation des
outils bioinformatiques de base ainsi qu’à l’interprétation des résultats
moléculaires (cf ci-dessous) (Altschul et al. 1990; Sontakke et al. 2009).
Enfin bien que des systèmes commerciaux tels que MicroSeq aient été
développés (Woo et al. 2003), l’absence d’évolution vers une automatisation de
76
la technique est un facteur limitant pour sa généralisation. Toutefois avec le
développement des techniques de séquençage à haut débit, les étapes de la PCR
universelle 16S pourraient être incorporées dans un système robotisé (Woo et al.
2008).
2. Limites de la PCR universelle 16S en tant qu’outil d’identification
bactérienne
La PCR 16S reste peu performante comme outil d’identification pour
certains genres au sein desquels les variations de séquences sont trop minimes
entre espèces pour permettre de les distinguer. C’est le cas par exemple pour :
Mycobacterium spp., les streptocoques (Streptococcus mitis, S. oralis et S.
pneumoniae), les entérobactéries (Escherichia coli et Shigella) ou encore
Bacillus spp. (Bacillus cereus et B. anthracis) (Janda and Abbott, 2007; Mignard
and Flandrois, 2006; Petti, 2007). Dans ces cas où les séquences de 16S varient
peu entre espèces, on ne peut distinguer les espèces proches. D’autres gènes ont
alors été proposés pour distinguer ces espèces ; par exemple le gène rpoB qui
code pour la sous-unité béta de l’ARN polymérase, est présent en une seule
copie dans les génomes bactériens et a démontré son utilité chez les
mycobactéries (Adekambi et al. 2009; Petti, 2007).
77
Certains organismes ont plusieurs copies du 16S rRNA gene, qui peuvent
présenter des variations entre elles, ce qui a pour conséquence de générer des
séquences contenant des ambigüités (Petti, 2007). De plus un certain degré de
« microhétérogénéité » au sein des espèces a été rapporté, ce qui correspond à
des variations inférieures à 0,5% intra-espèces et aux différents génotypes des
sous-espèces (Clarridge, III, 2004). L’impact en routine hospitalière de ces
petites variations semblerait être minime (Mignard and Flandrois, 2006). Bien
sûr, si la souche soumise à identification 16S n’est pas pure, on obtient une
séquence avec des ambigüités. Si une séquence présente plus de 1% de positions
ambigües, le résultat peut être erroné (Mignard and Flandrois, 2006).
Par ailleurs, les bases de données auxquelles on compare la séquence de la
souche à identifier ont chacune leurs qualités et leurs défauts (Janda and Abbott,
2007; Kiratisin et al. 2003) et peuvent être « polluées » par des séquences peu
ou mal identifiées ce qui peut entraîner des erreurs d’interprétation (Mignard
and Flandrois, 2006; Woo et al. 2008). Par exemple, la qualité des séquences
déposées dans Genbank, base de données publique qui réunit un très grand
nombre
de
séquences,
n’est
pas
contrôlée
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) (cf Annexe 2 page 90). Beaucoup de
séquences proviennent de microorganismes nouveaux et inhabituels, isolés de
l’environnement ; on y retrouve aussi beaucoup de séquences provenant de
microorganismes n’ayant jamais été cultivés. A l’inverse, le nombre limité de
78
séquences déposées dans certaines bases de données (telle que MicroSeq) peut
être un facteur limitant (Boudewijns et al. 2006). Enfin, l’évolution de la
taxonomie peut être source de discordances. Par exemple, certaines espèces ont
été définies avant l’ère du 16S et on peut trouver plus d’un genomovar au sein
d’une espèce (c’est le cas pour Acinetobacter spp., Enterobacter cloacae,
Pseudomonas stutzeri). Dans ces cas, les souches de référence ne reflètent pas
nécessairement la composition génomique de tous les membres de l’espèce
(Janda and Abbott, 2007). C’est pourquoi il faut toujours vérifier comment ont
été validées les séquences des espèces auxquelles correspond la séquence
étudiée. Il faut en particulier se méfier des séquences obtenues par des études
métagénomiques sans références taxonomiques (Schlaberg et al. 2012).
Les algorithmes bioinformatiques de calcul utilisés pour la comparaison
des séquences doivent être utilisés avec précaution et il convient de maitriser les
paramètres de l’outil utilisé pour ne pas générer des résultats erronés (cf Annexe
2 page 90). Par exemple, l’algorithme proposé pour utiliser la base de données
Genbank, appelé BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), fonctionne par
défaut sur des paramètres qui ne sont pas adaptés à toutes les applications
(Altschul et al. 1990). Une fois les résultats du calcul d’alignement obtenus, il
faut vérifier si la longueur de l’alignement est suffisante pour que le résultat soit
interprétable.
79
Enfin, le problème majeur est que le seuil à partir duquel un pourcentage
de similarité permettrait d’assimiler la séquence étudiée à une espèce, voire à un
genre, n’est pas clairement établi. Plusieurs seuils ont été proposés. La plupart
des taxonomistes acceptent des seuils de 97% pour le genre et de 99% pour
l’espèce (Janda and Abbott, 2002; Petti, 2007). Cependant certains auteurs
suggèrent d’utiliser un seuil de 99,5% pour l’espèce (Woo et al. 2008). Il
apparaît impossible de déterminer un seuil unique pour l’ensemble du monde
bactérien (Schlaberg et al.
2012). Récemment des recommandations pour
l’interprétation ont été proposées par le CLSI (Clinical and Laboratory Standard
Institute), mais leur tarif prohibitif en limite la diffusion aux laboratoires de
routine (Petti et al. 2008).
Il faut noter que les pourcentages de similarité obtenus varient selon qu’on
utilise un « 16S court » ou un « 16S long », mais également selon le programme
utilisé et selon les paramètres utilisés pour un même programme (Clarridge, III,
2004). Il faut de plus garder à l’esprit que l’interprétation finale d’un résultat
d’identification bactérienne basé sur l’ARNr 16S, doit aussi, avec bon sens, tenir
compte des caractères phénotypiques (Woo et al. 2008).
Depuis quelques années un nouvel outil d’identification bactérienne à visé
« universelle » est mis à la disposition des microbiologistes (Mellmann et al.
2008). Il s’agit de l’identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF
80
(matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight), qui a montré sa
capacité à identifier rapidement, à faible coût et de manière universelle les
souches cultivées dans un laboratoire de bactériologie (Bizzini and Greub, 2010;
Seng et al. 2009). La spectrométrie de masse permet de réduire le recours à la
biologie moléculaire. Cependant la biologie moléculaire reste le gold standard
pour l’identification bactérienne (Cherkaoui et al. 2010), ce qui a bien été
montré par un travail récent qui trouve que seulement 45,9% des souches
identifiées par PCR 16S auraient pu l’être par spectrométrie de masse MALDITOF (Bizzini et al. 2011).
3. Limites de la PCR universelle 16S en tant qu’outil de définition de
nouvelles espèces bactériennes. Débats autour de la définition de
nouvelles espèces.
Depuis les recommandations émises en 2002 par le comité Stackebrandt
pour la description de nouvelles espèces (Stackebrandt et al. 2002), il n’y a plus
eu de recommandations pour la définition taxonomique des nouvelles espèces.
Après avoir corrélé chez de nouvelles espèces décrites les pourcentages
d’hybridation ADN-ADN aux pourcentages de similarité, d’autres auteurs ont
proposé qu’une souche présentant un seuil de similarité inférieur à 99% avec
l’espèce la plus proche (et non plus 97%) soit une souche candidate pour une
81
nouvelle espèce (Stackebrandt and Ebers, 2006), mais il n’y a pas de consensus
sur ce point. Si le 16S reste un outil de découverte majeur de nouvelles espèces,
sa place dans la description de ces nouveaux taxons est débattue. En effet les
auteurs s’accordent sur la nécessité d’inclure une séquence de 16S d’au moins
1500 nucléotides dans la description d’une nouvelle espèce (Stackebrandt et al.
2002), mais certains pensent que la description des nouvelles espèces et la
taxonomie bactérienne doivent se baser sur une séquence génomique complète
(Coenye et al. 2005).
Le nombre minimum de souches à étudier pour décrire une nouvelle
espèce reste débattu. Si certains proposent qu’un minimum de cinq souches
distinctes soient étudiées pour décrire une nouvelle espèce (Janda and Abbott,
2002), d’autres auteurs émettent des réserves sur cette règle. En effet, pour des
espèces émergentes encore très rares, il faudrait des années pour isoler cinq
souches distinctes, ce qui retarderait d’autant la description de ces nouvelles
espèces (Drancourt et al. 2004; Drancourt and Raoult, 2005).
82
4. Limites de la PCR universelle 16S comme outil de détection
moléculaire à partir des prélèvements biologiques
L’utilisation de la PCR universelle 16S comme outil de détection
moléculaire présente également certaines limites, essentiellement liées au fait
que l’on ne peut l’utiliser que pour les prélèvements provenant de sites
normalement stériles et sièges d’infections monomicrobiennes (Petti, 2007).
Bien que les techniques de clonage et de pyroséquençage permettent d’utiliser
théoriquement la PCR 16S pour les prélèvements polymicrobiens (Al Masalma
et al. 2009; Armougom et al. 2009), une telle application n’a pas sa place en
pratique quotidienne au laboratoire.
Les contaminations lors des amplifications géniques sont fréquentes et
rendent l’interprétation des résultats délicate. Le problème des faux positifs peut
être limité par l’utilisation de réactifs « DNA free », de pipettes dédiées,
d’embouts de pipettes cotonnés, de trois pièces séparées dédiées à chaque étape
(préparation des mix réactionnels, extraction de l’ADN, amplification) et par
l’expertise d’un microbiologiste expérimenté. L’utilisation d’un témoin négatif
pour chaque étape du protocole est un élément indispensable pour dépister ces
faux positifs (Sontakke et al. 2009)
83
La sensibilité de la PCR universelle 16S peut être insuffisante. Une équipe
a proposé pour améliorer la sensibilité de réaliser un « 16S court » en première
intention puis un « 16S long » en seconde intention dans les situations où il est
nécessaire d’obtenir une identification bactérienne plus discriminante (Jenkins et
al.
2012). Ce manque sensibilité du « 16S long » avait été observé au
laboratoire du CHU la Timone et a amené après 2005 (donc a posteriori de
l’article 1) au choix d’un nouveau système d’amorces amplifiant les 2/3 du 16S
dans sa partie 3’ (cf Figure 3 page 14 et Tableau 1 page 18). Des tests de
sensibilité entre différents jeux avaient retrouvé une meilleure sensibilité pour le
couple 536F/rP2 (Dr V. Roux, personal data). On mentionnait en introduction à
ce travail l’absence de liste exhaustive d’amorces existant pour la PCR 16S.
Parallèlement à cela, il existe peu de travaux évaluant la sensibilité et le
caractère « universel » de ces amorces. Cela concerne peu l’identification
bactérienne, mais le problème reste entier pour la détection bactérienne à partir
de prélèvements cliniques. De plus, les bases de données de séquences (telle que
ribosomal database project : http://rdp.cme.msu.edu/) sont régulièrement
incrémentées, et on constate que la diversité des séquences amplifiées par un jeu
d’amorces donné doit être réévaluée avec le temps (Baker et al. 2003; Frank et
al. 2008). Le choix des amorces est donc un élément essentiel à la qualité du
travail de détection bactérienne et des revues de référence font défaut sur ce
sujet.
84
La sensibilité de l’amplification du 16S, comme pour celle de toute PCR
standard, est inférieure à celle de techniques récemment développées, telles que
la PCR en temps réel, la PCR-hybridation ou la loop-mediated isothermal
amplification (Mori and Notomi, 2009; Weile and Knabbe, 2009). Ces
techniques permettent de coupler détection bactérienne et identification, avec
une sensibilité améliorée, un risque de contamination diminué, un coût et une
rapidité ayant permis leur développement dans des structures diagnostiques de
type « point-of-care », dont l’objectif est de permettre la prise de décisions (une
hospitalisation, mise en isolement, traitement anti-infectieux) dans le temps de la
prise en charge initiale (Cohen-Bacrie et al. 2011). Cependant ces nouvelles
techniques reposent sur la désignation « à l’avance » des microorganismes
recherchés.
La détection moléculaire dans les cas atypiques et sans orientation
microbiologique préalable reste donc aujourd’hui l’apanage de la PCR
universelle 16S. Ainsi la PCR 16S a permis d’associer Bartonella henselae ou
Tropheryma whipplei à l’angiomatose bacillaire et la maladie de Whipple,
respectivement (Petti, 2007). L’association entre la détection d’une séquence
bactérienne et une maladie infectieuse était dans ce cas orientée par des données
histopathologiques. Quand ce n’est pas le cas, le lien de cause à effet entre la
détection d’un ADN bactérien dans un prélèvement humain et une maladie
85
infectieuse peut être plus difficile à établir (Petti, 2007). Il a été montré pour les
endocardites infectieuses que l’ADN bactérien pouvait persister de manière
prolongée après traitement antibiotique, notamment pour Bartonella spp. et
Streptococcus spp. ce qui rend délicate l’interprétation des résultats moléculaires
(Rovery et al. 2005). A l’extrême, l’utilisation de la PCR en paléomicrobiologie
est la démonstration ultime de la persistance de l’ADN bactérien dans
l’organisme humain (Tran-Hung et al.
2007). Les faibles quantités de
prélèvements testés en biologie moléculaire, les inhibiteurs de PCR et
l’interférence entre l’ADN bactérien et l’ADN humain sont des éléments
limitant l’intérêt de la PCR universelle dans cette application (Petti, 2007).
La PCR 16S ne constitue plus aujourd’hui un outil diagnostique isolé,
mais rentre dans le cadre d’une stratégie diagnostique moléculaire plus globale.
Devant un cadre nosologique précis tel qu’une endocardite à hémocultures
négatives, une stratégie combinant des approches sérologiques, histologiques et
moléculaires a démontré son efficacité (Fournier et al. 2010). Dans ce cas, la
PCR 16S est réalisée parallèlement à diverses PCR en temps réel ciblées et à une
autre PCR standard ciblant les champignons. Il a été montré dans ce contexte
que la PCR 16S sur sang total manquait de sensibilité et que les PCR temps-réel
ciblées sur sang total sont d’un plus grand intérêt car plus sensibles ; a contrario
la PCR 16S sur valve cardiaque a une meilleure sensibilité et reste le test à
réaliser en première intention sur ce type d’échantillons (Fournier et al. 2010).
86
5. Conclusion
Au total, nous avons montré au cours des travaux réunis dans ce document
que la PCR universelle 16S était applicable dans un laboratoire hospitalier de
bactériologie pour identifier des souches mal identifiées par techniques
conventionnelles, pour détecter l’ADN bactérien à partir de prélèvements
biologiques négatifs en culture, mais aussi pour mettre en évidence de nouvelles
espèces et de nouveaux genres bactériens à partir de souches cliniques. Bien que
la PCR 16S ait des limitations qui doivent faire réserver son usage à des
situations bien déterminées et doivent souvent être associées à d’autres
techniques moléculaires, elle est à l’heure actuelle une technique incontournable
pour le diagnostic bactériologique médical.
87
Annexe 1 : Wohlfahrtiimonas chitiniclastica, une bactérie isolée du stade
larvaire 3 de Wohlfahrtia magnifica.
(a) Wohlfahrtia magnifica est une mouche présente en Europe, en Asie et en
Afrique du Nord et qui est à l'origine de myiases décrites chez de nombreuses
espèces animales (bovins, camélidés, caprins, carnivores, équidés, oies, ovins,
porcins...) et plus rarement chez l'homme.
Le mot myase désigne l’ensemble des troubles provoqués par la présence dans
un corps humain ou animal de larves de diptères parasites des familles
Calliphoridae, Sarcophagidae, Cuterebridae, Muscidae.
Source : http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/ww/wohlfahrtiimonas.html
88
(b) Myases humaines.
Sources : Wikipédia, the diptera site
89
Annexe 2 : utiliser l’outil BLAST pour trouver des similarités de séquences
sur la base de données Genbank.
(a) page d’accueil BLASTn
1- savoir entrer une séquence appropriée et
corrigée
2- savoir choisir la bonne base de données
3- savoir choisir le bon programme
4- savoir modifier les paramètres par défaut
en fonction de la requête
90
(b) résultats bruts ou « hit list » : chaque ligne contient
- le numéro d’accession de la séquence et son nom,
- la description associée à l’annotation de la séquence,
- le score qui est une mesure de la signification statistique de l’alignement ; plus
il est élevé, plus les séquences sont similaires,
- le pourcentage de couverture entre les deux séquences,
- la « E-value » ou « expectation value » qui donne la meilleure mesure de la
signification statistique de l’alignement, en estimant le nombre de fois où on
aurait pu obtenir un si bon alignement par le seul fruit du hasard ; plus cette
valeur est basse, plus les séquences sont similaires,
- le pourcentage de similarité arrondi à l’unité,
- et les liens vers d’éventuels génomes.
91
(c) résultats détaillés, ie alignements, séquence par séquence ; ils sont rendus par
le serveur sous la « hit-list »
Plusieurs informations sont fournies :
- le numéro d’accession, le nom et la longueur de la séquence « subject » ; on
peut en avoir plusieurs si plusieurs séquences ont été alignées de manière
identique à notre séquence « query » (cf exemple ci-dessous),
- le score mentionné plus haut,
- la « E-value » ou Expect pour Expectation value,
- le nombre de nucléotides identiques et le nombre d’indels,
- puis l’alignement tel quel avec l’orientation des brins des séquences
« query » et « subject ».
Séquences « subject »
92
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identification system for identification of clinically significant bacterial
isolates with ambiguous biochemical profiles.
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1996-2001.
105
REMERCIEMENTS
Je souhaite tout d’abord remercier Monsieur le Professeur Jean-Louis
Mege, sans lequel la soutenance de cette thèse n’aurait pas été possible. Je le
remercie de m’avoir fait l’honneur de m’accorder sa confiance dans une
situation particulière et d’avoir accepté de présider ce jury. Je le remercie
également de la sympathie dont il a bien voulu faire preuve à mon égard tout au
long de mon cursus marseillais et après mon départ de Marseille.
Je remercie Monsieur le Professeur Vincent Jarlier, qui m’a fait l’honneur
de me nommer assistante hospitalo-universitaire dans son service. Je le remercie
de m’avoir fait assez confiance pour recruter un élément extérieur au milieu des
microbiologistes parisiens. Je le remercie enfin pour tout le soutien dont il a fait
preuve au cours de l’élaboration de cette thèse.
Je remercie Madame le Professeur Florence Doucet-Populaire, qui a
accepté d’être rapporteur dans mon jury de thèse.
Je remercie Monsieur le Professeur Guillaume Arlet, qui a, lui aussi, bien
voulu être rapporteur dans ce jury de thèse.
106
Je remercie Monsieur le Professeur Didier Raoult pour tout ce qu’il a bien
voulu me transmettre pendant les six années de mon cursus marseillais.
Je remercie tout particulièrement le Docteur Véronique Roux, qui m’a
initiée puis guidée dans la voie de la biologie moléculaire. Je la remercie pour
son encadrement et sa pédagogie qui ont permis d’aboutir aux publications dont
est constituée cette thèse. Je la remercie enfin pour son amitié et son soutien
pendant mon cursus marseillais.
Je remercie tous les Marseillais, séniors, internes, secrétaires, ingénieurs,
techniciens, qui ont été mes collègues pendant 6 ans. Je vous remercie pour tout
ce que vous m’avez donné et je ne vous oublie pas.
Je remercie mes collègues de la Pitié Salpétrière pour m’avoir accueillie
au sein de leur équipe, pour leur gentillesse et leur disponibilité constante. Je
remercie tout particulièrement le Dr Alexandra Aubry pour avoir bien voulu
relire ce mémoire de thèse et les corrections et remarques critiques qui en ont
découlé. Je remercie également les Drs Florence Brossier, Laurence Drieux et
Stéphanie Petrella pour leurs encouragements constants pendant la période de
rédaction de cette thèse.
107
Je remercie mes amis les plus proches pour leur soutien et leur amitié
indéfectible : la communauté de l’anneau (Marie, Elisabeth, Jean-Christophe,
Stéphan, Mickaël, Samir, Isa, Yassina), les rickettsiens extérieurs à la
communauté (Oleg, Annick, Catherine, Quentin, Iza, Cristina, Gilles, Fred), les
non rickettsiens (Joëlle, Daniel, Séb, Olivier, Christophe, Nicole, Max,
Laurence, Laurent, Patrick, Diane, Elise, Bernard, Christine, Carole, Aurore) et
tous les autres…
Je remercie et embrasse des milliers de fois ma merveilleuse famille pour
son soutien, son amour et son indéfectible confiance. Mille baisers aux clans
Demari, Ropion, Andrau, Jego, Mugnier, Renvoisé-Marié. E ringraziù tutta a mo
famiglia di Corsica.
Un grand merci à Dell pour le support technique et à Gmail pour les
sauvegardes sans fautes de cette thèse.
Pour Marcelline, ma minette chérie dont les ronrons et l’affection féline
ont accompagné de longues heures de travail.
108
Pour mes grands-parents Renvoisé et Mamie Papa,
pour Papy, Mamie et Mémé Nénette qui me manquent tous les jours,
à mes parents adorés, toujours présents, aimants, dévoués, je dédie cette
deuxième thèse.
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