La capacité du système immunitaire intestinal à tolérer les bactéries commensales et à les «utiliser» pour être plus réactif face aux pathogènes Synthèse bibliographique en Immunologie J. Poligné Université de Rennes 1 UFR SVE Master Biologie Gestion Justine Poligné Mme Céline RAGUENES-NICOL Maître de conférence à l’Université de Rennes 1 2011 REMERCIEMENTS A Mme RAGUENES-NICOL, Maître de conférence à l’Université de Rennes 1, pour ses corrections et ses précieux conseils, Ainsi qu’à Mme ESNAULT et Mr GUIRAUD, responsables du Master Biologie-Gestion pour leur encadrement. Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 2 La capacité du système immunitaire intestinal à tolérer les bactéries commensales et à les « utiliser » pour être plus réactif face aux pathogènes J. Poligné* Université de Rennes 1, Master Biologie gestion, Rennes, France Résumé Dans la plupart des compartiments de notre organisme, la présence de bactéries est néfaste et on observe rapidement la mise en place de mécanismes immunitaires pour les éliminer. Cependant, le compartiment intestinal va abriter un certain nombre d’espèces bactériennes résidentes qui vont subsister à la surface des muqueuses intestinales. En effet, l’organisme accepte leur présence et ne déploie pas de réponses immunitaires suppressives envers ces bactéries dites commensales. Les systèmes immunitaires inné et adaptatif interviennent alors pour limiter les réponses inflammatoires vis-à-vis de la flore commensale (notamment avec l’intervention de lymphocytes T régulateurs) mais également pour surveiller les surfaces intestinales dans le but de répondre rapidement et efficacement en cas d’invasion par des bactéries pathogènes. Ainsi, les cellules intestinales diffèrent considérablement de leurs homologues d'autres tissus, elles ont évolué pour faire face à l'environnement hautement antigénique, spécifique de l’intestin. Cette synthèse va apporter des pistes pour essayer de comprendre les différents mécanismes qui garantissent cette relation symbiotique hôte/flore commensale et qui permettent le maintien de l’homéostasie intestinale. Sommaire INTRODUCTION ................................................................................................................................................................6 I. L’intestin, un système immunitaire atypique ? ............................................................................................7 A. La composition du microbiote intestinal ...................................................................................................7 B. Les différentes contributions du microbiote pour la physiologie et la santé de l'hôte ..........8 C. L’organisation cellulaire optimise la protection de l’hôte ..................................................................9 II. 1. Les sites effecteurs ...................................................................................................................................... 10 2. Les sites inducteurs .................................................................................................................................... 11 Reconnaissance et déclenchement d’une réponse immunitaire innée ........................................... 11 A. B. Les réponses permettant une protection face aux pathogènes ..................................................... 11 1. Description des récepteurs PRR ............................................................................................................ 11 2. La signalisation PRR assure la protection de l’hôte ...................................................................... 14 3. La sécrétion des peptides antimicrobiens par les PRR ................................................................ 16 Limitation de l’activation immunitaire dans les muqueuses ......................................................... 16 Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 3 1. Les mécanismes permettant de contrôler les réponses immunitaires ................................. 16 2. Les bactéries commensales interviennent dans la protection de l’hôte par la modulation de la signalisation PRR ............................................................................................................... 18 III. L’immunité adaptative au service de l’homéostasie intestinale ................................................... 20 A. Les différentes cellules impliquées dans l’immunité adaptative .................................................. 20 1. Les cellules présentatrices d’antigènes .............................................................................................. 20 2. Les lymphocytes B ....................................................................................................................................... 20 3. Les lymphocytes T ....................................................................................................................................... 20 La mise en place de l’immunité adaptative ............................................................................................ 23 B. 1. L’échantillonnage de l’antigène par les cellules dendritiques .................................................. 23 2. La présentation de l’antigène : mise en place des fonctions de régulations ....................... 24 3. Les cellules dendritiques et l’homéostasie intestinale ................................................................ 25 4. Les cellules dendritiques et protection de l’hôte............................................................................ 27 Production et rôle des IgA ............................................................................................................................ 28 C. D. Différenciation des lymphocytes et régulation des réponses immunitaires intestinales des cellules T par la flore commensale ...................................................................................................................... 29 1. Rôle de la signalisation TLR dans la balance entre les cellules effectrices et les cellules régulatrices lors de l’immunité adaptative ................................................................................................. 30 2. La différenciation des Lymphocytes régulée par les bactéries commensales .................... 31 CONCLUSION.................................................................................................................................................................... 32 BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................................................................ 33 Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 4 ABREVIATIONS PRR : Pattern Recognition Receptors TLR : Toll-Like Receptor NOD : Nucleotide binding Oligomerisation Domain NLR : NOD-Like Receptor RLR : RIG-I-Like Receptor MAMP : Microbe Associated Molecular Patterns PAMP : Pathogen Associated Molecular Patterns IgA : Immunoglobulines A LPS : Lipopolysaccharides IE-DAP : Acide D-glutamyl-meso-diamino-pimélique MDP : Muramyl DiPeptide MBD-2 : Murine β-Défensine 2 GALT : Gut Associated Lymphoïd Tissue MLN : Mesenteric Lymphoïd Nodes Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 5 INTRODUCTION L'épithélium intestinal humain est représenté par 300m2 de muqueuse et correspond ainsi à la plus grande surface du corps constamment exposée à des substances environnementales, à des nutriments et des microorganismes (Lotz et al., 2007). Il s’agit donc d’une interface avec une communauté dense et diversifiée de micro-organismes, composée d’environ 500-1000 espèces différentes, des bactéries en majorité, même si des eucaryotes, des virus (Duerkop et al., 2009) et des archaea peuvent être présents (Eckburg et al., 2005). Le long du tractus intestinal, la densité de bactéries va augmenter au fur et à mesure : on observe 103 à 105 bactéries par ml de contenu luminal dans l'estomac et le duodénum et on passe à environ 109 à 1012 par ml dans l'iléon et le colon. On va ainsi appeler « microbiote » la population de micro-organismes vivant en accord avec l’hôte. Le génome du microbiote se nomme le microbiome (Artis, 2008). Chez les mammifères, ces relations hôte-microbes sont de nature mutualiste et symbiotique (Wells et al., 2010). Du point de vue de l’hôte, il va en tirer profit via la défense contre les infections, la mise à disposition d’énergie produite par la flore commensale, le métabolisme des nutriments, et la mise en place de tissus et leur réparation (Duerkop et al., 2009). En revanche, les agents pathogènes peuvent provoquer des dommages et se propager à partir de la muqueuse dans d’autres tissus du corps. Ainsi, en plus de leur capacité d’absorption des nutriments, les cellules épithéliales jouent un rôle de barrière physique en étant la première ligne de défense contre la pénétration des micro-organismes. En effet, face au nombre important de bactéries luminales et à la menace d’une invasion, il est important que les hôtes mammifères contrôlent les interactions microbiennes au niveau des surfaces épithéliales intestinales (Duerkop et al., 2009). De nombreux mécanismes ont été mis en place au cours de l’évolution afin de limiter le contact direct entre les bactéries et l’épithélium intestinal. Il faut donc que l’organisme trouve un compromis entre une relation symbiotique avec la flore commensale et une protection vis-à-vis des agents pathogènes afin de maintenir l'équilibre homéostatique (Wells et al., 2010). Pour cela deux systèmes interviennent : le système immunitaire inné qui engendre des réponses rapides et non spécifiques en utilisant des systèmes de reconnaissance primitifs, et le système immunitaire adaptatif qui engendre des réponses spécifiques à un agent pathogène et qui nécessite l’intervention de cellules spécifiques notamment les lymphocytes (Wells et al., 2010). La réponse adaptative apparaît donc dans un second temps. Elle permet également d’ajuster la réponse de l'hôte aux antigènes issus des bactéries commensales et aux attaques par des agents pathogènes. L'homéostasie intestinale existe grâce à l’interaction entre les systèmes inné et adaptatif qui vont permettre de contrôler activement les interactions bactériennes avec la muqueuse intestinale en activant d’une part la réponse immunitaire limitant le contact bactérien avec l’épithélium et d’autre part la mise en place des mécanismes garantissant l’homéostasie intestinale (Duerkop et al., 2009 ; Meresse et Cerf-Bensussan, 2009). L'intestin est dit « Tolérant » pour un nombre élevé de bactéries qui résident dans la lumière (Duerkop et al., 2009). Cependant, le terme « tolérance » a diverses significations et il est important de le redéfinir dans le contexte qui nous intéresse, afin de répondre à la problématique. Au sens général, le terme « tolérance » désigne un degré diminué de la réactivité face aux microbes intestinaux, ce qui constitue une caractéristique des tissus de la surface de la muqueuse par rapport à d'autres tissus internes. Cependant, une autre définition existe. Ainsi, une alimentation en protéines solubles, supprime spécifiquement les réponses immunitaires systémiques et locales envers cette même protéine (Coombes et Maloy, 2007 ; Duerkop et al., 2009). Ce phénomène est appelé « la tolérance orale ». Même si cette tolérance orale aux antigènes fait appel à des mécanismes proches de ceux intervenant pour la tolérance envers les bactéries symbiotiques, cette définition est moins applicable à la relation intestinale hôte/microbes. Cette synthèse va donc surtout s’intéresser à la tolérance vis-à-vis de le flore commensale. Les cellules de la surface de la muqueuse intestinale sont essentielles pour limiter l'invasion bactérienne des tissus intestinaux et préserver l'ignorance du système immunitaire systémique envers les symbiotes. De plus, les réponses immunitaires sous-épithéliales à la flore microbienne vont également être importantes car elles Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 6 ont notamment un impact sur les interactions bactéries-muqueuses du côté luminal de la barrière épithéliale (Duerkop et al., 2009). Ces divers mécanismes sont notamment mis en évidence lors de maladies inflammatoires de l’intestin. Dans ce cas, le contrôle des réponses immunitaires vis-à-vis des micro-organismes n’existe plus, on assiste alors à une inflammation chronique au niveau de l’intestin (Wells et al., 2010). Pour comprendre l’ensemble de ces mécanismes, cette synthèse va d’abord décrire de façon générale, la composition de la flore commensale et les structures intestinales impliquées. Ensuite, les mécanismes de l’immunité innée seront décrits à la fois dans leur rôle pour garantir la protection de l’hôte mais également dans leur rôle pour limiter les réponses inflammatoires envers les bactéries symbiotiques par l'atténuation de la signalisation TLR (Récepteurs Toll-Like) et des réponses NFκB par exemple. Enfin, dans une troisième partie, nous nous intéresserons aux mécanismes de l’immunité adaptative mis en place au sein des muqueuses intestinales. Ainsi, nous verrons notamment que la présence d’immunoglobulines A (IgA) et l'induction de lymphocytes T régulateurs dans les ganglions lymphatiques mésentériques, par la présentation de l’antigène, sont importantes dans l’induction de la tolérance (Coombes et Maloy, 2007, Duerkop et al., 2009 ; Kelly et al., 2005). I. L’intestin, un système immunitaire atypique ? A. La composition du microbiote intestinal La connaissance des compositions de communautés bactériennes a été longtemps basée sur la culture in vitro (Duerkop et al., 2009), ce qui était problématique car une grande partie de la microflore intestinale n'est pas cultivable par les méthodes microbiologiques classiques (Lotz et al., 2007). Aujourd’hui, le développement des méthodes de profilage moléculaire telle que l'analyse des séquence du gène de l’ARNr 16S, a permis d’obtenir de meilleures analyses de la composition des communautés bactériennes (Duerkop et al., 2009) et d’identifier de nouvelles colonisations d’espèces bactériennes et même d’archaebactéries dans l'intestin (Lotz et al., 2007) . Les résultats montrent une complexité des communautés bactériennes intestinales (Duerkop et al., 2009). Au niveau de l’intestin des vertébrés, les Firmicutes et les Bacteroidetes sont les phyla les plus courants et constituent près de 90 % de la population totale (Ley et al., 2008b). Les 10% de bactéries restantes appartiennent aux Proteobacteria, Fusobactéries, Actinobacteria, Verrucomicrobia, Spirochaetes, et aux cyanobactéries (Ley et al., 2008a ; Eckburg et al., 2005). Elles sont aérobies facultatives, ceci expliquerait leur faible présence l’intestin correspondant à un environnement strictement anaérobie peu propice à leur développement. Les Firmicutes se composent principalement de bactéries appartenant aux classes Clostridia, Mollicutes et Bacilles, comprenant les entérocoques, les lactobacilles et les Lactocoques (Hold et al., 2002). Le phylum des Bactéroidetes est, quant à lui, représenté par plusieurs espèces de Bacteroïdes, y compris B. thetaiotaomicron, B. fragilis, B. ovatus, et B. caccae. Ainsi, les bactéries prédominantes sont Bifidobacterium spp., Eubacterium spp., Clostridium spp., Lactobacillus spp., et Bacteroides spp. Des Enterococcus spp. ou des membres des Enterobacteriaceae sont trouvés mais en nombre relativement faible (<1%) (Lotz et al., 2007). La composition des communautés intestinales est en outre dynamique et peut varier en fonction de l'emplacement géographique de l’hôte, de sa nutrition, et de son statut immunologique. Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 7 B. Les différentes contributions du microbiote pour la physiologie et la santé de l'hôte La présence du microbiote bactérien va avoir plusieurs avantages pour l’hôte. Tout d’abord, la microflore améliore l’efficacité digestive des mammifères en maximisant l’extraction de l’énergie alimentaire (Duerkop et al., 2009). Par exemple, il est difficile pour les mammifères d’extraire efficacement l’énergie contenue dans une alimentation à base de plantes, ne possédant pas une gamme suffisante d’enzymes saccharolytiques. Ainsi, en recrutant une communauté diversifiée de bactéries, les mammifères acquièrent un certain nombre d’enzymes saccharolytiques. Les polysaccharides alimentaires normalement indigestes, vont alors être hydrolysés par les microbes intestinaux. Des études chez des rongeurs microbiologiquement stériles et donc sans microbiote, ont montré que ces derniers avaient besoin d'environ 30% de calories supplémentaires pour maintenir leur poids corporel par rapport à des animaux colonisés par une flore commensale. Le métabolisme de la microflore facilite la fermentation de substrats non-digestibles. Ainsi, une variété de vitamines essentielles telles que la vitamine K, la vitamine B12, l'acide folique et la biotine, sont produites (Lotz et al., 2007). La fermentation microbienne des sucres génère des acides gras à chaîne courte qui servent de nutriments pour les cellules épithéliales du côlon et contribuent à l'absorption ionique de calcium ou de magnésium. Le microbiote intestinal a donc une incidence positive sur la capacité de l'hôte à acquérir des nutriments essentiels. Les microbes intestinaux jouent également un rôle important dans la protection de leurs hôtes contre l'invasion par des bactéries pathogènes (Duerkop et al., 2009). En effet, la flore normale protège contre la colonisation et l'invasion de bactéries pathogènes en induisant la sécrétion de substances bactéricides. Par exemple, l'invasion de Salmonella typhimurium est limitée par la stimulation de récepteurs Toll-Like (TLR) par des bactéries symbiotiques. Cette stimulation déclenche l'expression de protéines antimicrobiennes par les cellules intestinales, limitant la pénétration de Salmonella typhimurium au niveau de la barrière épithéliale (Vaishnava et al., 2008). Ces mécanismes seront décrits plus en détail au niveau de la partie II.B.2. Les commensaux interviennent également dans le renforcement de la barrière épithéliale intestinale (Hooper et al., 2001 ; Madsen, 2001 ; Otte et Podolsky, 2004). In vitro, certaines souches (les Lactobacillus spp. ou les Bacteroides thetaiotaomicron par exemple) en stimulant les cellules épithéliales au niveau apical, protègent la barrière intestinale de dysfonctionnements causés par des pathogènes invasifs ou des cytokines proinflammatoires telles que TNF-α et IFN-γ (Wells et al., 2010 ; Resta-Lenert and Barrett, 2006 ; Ewaschuk et al., 2008). Les mécanismes exacts de ces effets protecteurs sont encore mal compris mais encore une fois, l’activation de récepteurs spécifiques (TLR2) par la flore commensale, serait importante dans l'amélioration de la fonction de la barrière épithéliale de l'intestin, avec une augmentation des jonctions serrées entre les cellules intestinales (Wells et al., 2010 ; Cario, 2005). Cependant, la perte de la fonction de ce récepteur TLR2 n’entrainerait pas d’augmentation de la perméabilité de l’épithélium intestinal. Des études supplémentaires sont nécessaires pour déterminer si l'absence de ligands de TLR2 dans l’intestin entraîne la dégradation de la barrière protective et facilite l'invasion par des bactéries pathogènes (Cario, 2005). La microflore contribue au développement des organes et à la différenciation cellulaire à la surface épithéliale intestinale (Lotz et al., 2007 ; Duerkop et al., 2009). Ainsi, les bactéries commensales sont capables de réprimer ou d’induire l'expression de gènes de l'hôte qui participent à d'importantes fonctions physiologiques, y compris la différenciation cellulaire et la maturation (Cario, 2005). Par exemple, des études ont montré que les cellules intestinales de souris sans microbiote ont un taux de prolifération faible et une altération du développement par rapport à des souris colonisées (Hooper et Gordon, 2001). D’autres études impliquent la flore commensale dans la réparation des lésions de la muqueuse intestinale (Lotz et al., 2007). Ces associations hôte/microbes correspondent à une symbiose mutuellement bénéfique. Ainsi, ces microorganismes résidents tirent également bénéfices de cette relation symbiotique par un environnement protégé et riche en éléments nutritifs. Cette symbiose existe grâce à une limitation contrôlée de la pénétration Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 8 bactérienne au niveau des tissus de l'hôte. Cela reste très complexe car la limite entre le mutualisme et la pathogénicité pour une espèce bactérienne donnée est parfois très mince (Duerkop et al., 2009). C. L’organisation cellulaire optimise la protection de l’hôte La muqueuse intestinale est constituée d’une population de cellules non homogènes, ainsi différents types cellulaires spécialisés vont permettre de façon spécifique de limiter la pénétration bactérienne à travers la barrière épithéliale et donc assurer l’homéostasie intestinale (Duerkop et al., 2009). Les cellules immunitaires intestinales se répartissent entre les sites inducteurs, représentés par les plaques de Peyer, les ganglions mésentériques, les follicules lymphoïdes isolés, et entre les sites effecteurs, représentés par l’épithélium intestinal et la lamina propria (Figure 1 ; Garett et al., 2010 ; Sonier et al., 2009 ; Meresse et Cerf-Bensussan, 2009). Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 9 Figure 1. L’organisation de l’épithélium intestinal (d’après Garrett et al., 2010 ; Lotz et al., 2007) : La muqueuse intestinale est caractérisée par la présence de cellules immunitaires réparties entre des sites inducteurs représentés par les plaques de Peyer et les ganglions mésentériques, et des sites effecteurs représentés par l’épithélium intestinal et la lamina propria. Les cryptes intestinales sont caractérisées par un environnement stérile. En effet, les cellules de Paneth vont sécréter des peptides antimicrobiens afin de protéger les cellules souches qui vont être nécessaires au renouvellement de l’épithélium intestinal. L’antigène peut entrer via les cellules M (a), puis transfert vers les cellules dendritiques (DC), qui peuvent directement présenter l’antigène aux cellules T des plaques de Peyer (b). L'antigène transporté par les cellules dendritiques peut également passer au niveau du circuit lymphatique (c) pour rejoindre les ganglions mésentériques où la reconnaissance par des lymphocytes T peut se faire (d). L’antigène peut également à travers l'épithélium (e), mais dans ce cas, les entérocytes agissent comme des cellules présentatrices d’antigènes locales (f). Dans tous les cas, l'antigène active des cellules T CD4+ qui vont quitter les ganglions mésentériques via la lymphe efférente (g). L’Antigène peut aussi avoir accès direct à la circulation sanguine de l'intestin (h) et d'interagir avec des cellules T présentes au niveau des tissus lymphoïdes périphériques (i). 1. Les sites effecteurs En ce qui concerne l’épithélium intestinal, le type cellulaire prédominant au niveau de la surface intestinale est l’entérocyte. La membrane des entérocytes présente des microvillosités au niveau de la surface apicale et ces cellules forment des jonctions serrées avec leurs cellules voisines. Cette organisation permet aux nutriments de se retrouver au niveau des tissus de l’hôte mais évite également la pénétration de bactéries (Duerkop et al., 2009 ). En plus de ce rôle de barrière physique, les entérocytes sécrètent des protéines antimicrobiennes. Cette sécrétion permet de limiter la présence des bactéries symbiotiques au compartiment luminal. Ces protéines anti-bactériennes appartiennent à plusieurs familles de protéines comme les défensines, les cathélicidines, les lectines de type C et attaquent les parois cellulaires des bactéries pour les éliminer. Les protéines antimicrobiennes sont produites par les entérocytes soit de manière constitutive ou sont induites par les bactéries. La muqueuse intestinale est renouvelée tous les 2 à 5 jours grâce à un mécanisme de prolifération et de différentiation continu des entérocytes à partir des cellules souches (Lotz et al., 2007). D'autres lignées épithéliales moins abondantes sont présentes au niveau de la muqueuse intestinale et vont également limiter la pénétration de bactéries dans les tissus : les cellules de Paneth et les cellules caliciformes (Duerkop et al., 2009 ; Lotz et al., 2007). Au niveau de l’épithélium, des invaginations forment des cryptes intestinales. Celles-ci maintiennent un environnement stérile côté luminal pour permettre une régénération permanente de l'épithélium via les cellules souches qui résident au niveau des cryptes (Figure 1) (Sansonetti, 2004 ; Duerkop et al., 2009). Elles sont donc particulièrement sensibles à la présence de des bactéries. Les cellules de Paneth sont situées à la base de ces petites cryptes intestinales et contiennent des granules de sécrétion portant un certain nombre de protéines antimicrobiennes dont les α-défensines, les lysozymes, les cryptidines et RegIIIγ (Duerkop et al., 2009 ; Kelly et al., 2005a). Après la détection des signaux bactériens, les cellules de Paneth vont décharger le contenu microbicide des granules dans la lumière intestinale (Duerkop et al., 2009). Les cellules de Paneth étant situées à proximité des cellules souches, la forte concentration de peptides antimicrobiens au niveau de la crypte va protéger ces cellules qui sont nécessaires au renouvellement de la muqueuse (Lotz et al., 2007). Des études génétiques in vivo montrent que les cellules de Paneth sont indispensables pour contrôler et limiter l’entrée des bactéries symbiotiques et également des bactéries pathogènes à travers la muqueuse (Vaishnava et al., 2008). Des souris génétiquement modifiées ne possédant pas de cellules de Paneth, sont caractérisées par une augmentation de la pénétration de bactéries dans les tissus. Ces cellules de Paneth sont limitées au petit intestin et donc absentes au niveau du côlon, cette distribution serait responsable d’un gradient de diversité et de densité bactérienne le long de l’intestin (Lotz et al., 2007 ; Kelly et al., 2005a). Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 10 Les cellules caliciformes sécrètent de la mucine composée de protéines glycosylées, pour former une couche protectrice de mucus qui peut s'étendre jusqu'à 150 µm à partir de la surface épithéliale (Duerkop et al., 2009 ; Lotz et al., 2007). La couche de mucus est constituée de deux compartiments distincts. La couche la plus externe est colonisée par des bactéries, alors que la couche la plus interne n’en contient quasiment pas pour former une zone protégée adjacente à la surface épithéliale. Au niveau de cette couche interne de mucus, les peptides antibactériens sécrétés par les cellules épithéliales ne diffusent pas vers la lumière du fait de la viscosité, ce qui explique la faible teneur en bactéries à cet endroit. Les souris dépourvues de la mucine MUC2 sont incapables de maintenir cette zone exempte de bactéries et souffrent d'inflammation intestinale chronique (Duerkop et al., 2009). 2. Les sites inducteurs Le terme lamina propria correspond à l’espace sous-épithélial qui comprend les cellules du stroma ainsi que des cellules du système immunitaire adaptatif formant le GALT (tissu lymphoïde associé à l’intestin) (représente 80% des cellules immunitaires du MALT). Celui-ci présente donc une grande variété de cellules (lymphocytes, cellules dendritiques, macrophages…) qui sont regroupées au niveau de structures organisées tels que les plaques de Peyer, les ganglions lymphoïdes intestinaux et les follicules lymphoïdes isolés (Lotz et al., 2007 ; Coombes et Maloy, 2007 ; Sanz et De Palma, 2010). L’absorption de l’antigène se fait via les plaques de Peyer (Lotz et al., 2007). En effet, elles sont plus perméables aux bactéries que les autres zones épithéliales car elles ne possèdent pas les caractéristiques normales d’un épithélium d'absorption (pas de bordure en brosse, ni de glycocalyx, ni d’enzymes d’hydrolyse). Mais elles contiennent des cellules spécialisées appelées cellules M qui vont avoir une activité d'endocytose. Elles se lient à l’antigène et le transportent à travers la couche de cellules épithéliales. L’antigène est ensuite transmis aux cellules dendritiques situées à proximité de l'épithélium, qui vont alors le présenter aux molécules du CMH II puis interagir avec les cellules T naïves présentes au niveau des plaques de Peyer (Coombes et Maloy, 2007) . Ainsi, des agrégats de cellules présentatrices d’antigène sont présents juste en dessous des cellules M, ce qui va faciliter la translocation des antigènes et leur présentation aux cellules immunitaires (Lotz et al., 2007). Enfin, les MLN (ganglions mésentériques lymphoïdes) sont des structures lymphoïdes intestinales qui représentent des sites inducteurs essentiels, notamment pour l’activation des cellules T et B naïves qui rencontreront des cellules présentatrices d’antigènes au niveau des ces structures. Ces mécanismes seront décrits plus en détail au niveau de la partie III. II. Reconnaissance et déclenchement d’une réponse immunitaire innée A. Les réponses permettant une protection face aux pathogènes 1. Description des récepteurs PRR Les microorganismes et bactéries résistants aux peptides antimicrobiens et à la couche de mucine peuvent potentiellement atteindre les cellules épithéliales qui tapissent l'intestin (Medzhitov, 2007). Dans ce cas, ces molécules du non-soi appelées PAMP (« Pathogen Associated Molecular Patterns ») qui sont des éléments communs aux microorganismes, qu’ils soient pathogènes ou non, vont interagir avec des récepteurs du soi appelés PRR (« Pattern Recognition Receptors »). Ces motifs PAMP sont d’origine très diverse (bactérie, virus, parasite) et de nature variée (protéines, sucres, acides nucléiques). L’interaction de ceux-ci avec ces récepteurs va induire des réponses immunitaires innée et adaptative qui élimineront les agents pathogènes et conserveront la microflore intestinale. Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 11 Les PRR peuvent être solubles (sécrétés), membranaires ou cytoplasmiques. Deux types de fonctions sont distinguées : Les PRR d’endocytose (solubles ou au niveau de la membrane plasmique) : reconnaissance et phagocytose du microorganisme notamment par les cellules phagocytaires (ex. complément, mannose récepteurs, pentraxins, lectines CLR, opsonines) Les PRR de signalisation (au niveau de la membrane plasmique, de la membrane des endosomes et du cytoplasme) : activation des cellules ayant rencontré le microorganisme (ex. TLR, NLR, RLR) Ainsi, les cellules épithéliales et les cellules immunitaires de la lamina propria reconnaissent les microbes à travers l’expression des récepteurs PRR. Comme ces structures moléculaires sont aussi présentes chez les organismes non pathogènes et commensaux, le terme MAMP c’est-à-dire les formes moléculaires associées aux microbes (« Microbe-Associated Molecular Patterns ») est de plus en plus utilisé (Sansonetti, 2009). Ces PRR jouent un rôle essentiel car ils permettent aux cellules de l’immunité innée de faire la différence entre le « soi » et le « non-soi » par la reconnaissance des formes moléculaires spécifiques (Cario, 2005). Les PRR de signalisation fournissent des signaux qui peuvent contrôler la différenciation des cellules présentatrices d’antigènes, comme les cellules dendritiques, ce qui va permettre d’influencer la nature de la réponse immunitaire (Sansonetti, 2004). La reconnaissance des produits de la flore commensale par les PRR est importante aussi dans la protection contre les lésions épithéliales, le maintien de l’homéostasie et donc dans la défense contre les agents pathogènes (Rakoff-Nahoum et al., 2004). Les récepteurs TLR (Toll-like receptors ou TLR1 à 11) jouent un rôle essentiel dans la reconnaissance des micro organismes, dans l’induction de gènes antimicrobiens, et dans le contrôle des réponses de l’immunité adaptative. Les récepteurs NOD (nucleotide oligomerisation domain : NOD1 et NOD2), structuralement différents, auront des fonctions similaires (Cario, 2005). Les PRR de signalisation membranaire : les récepteurs Toll-Like (TLR) Parmi les réponses immunitaires innées induites par les TLR (découverts en 1996), on retrouve la synthèse de peptides antimicrobiens, de cytokines pro-inflammatoires et de chimiokines jouant un rôle crucial dans la défense de l'hôte contre toute infection microbienne (Rakoff-Nahoum et al., 2004 ; Kelly et al., 2005), puis dans un second temps, des réponses anti-inflammatoires nécessaires à la résolution de l'inflammation. Ce sont des protéines transmembranaires comportant des caractéristiques structurales communes : Un domaine extracellulaire récepteur du signal et composé de nombreux motifs LRR (Leucin-Rich Repeats). Une hélice transmembranaire. Un domaine intracellulaire permettant la transduction du signal d’activation : TIR (Toll/interleukin 1 receptor) essentiel à l’initiation de la cascade de signalisation lors de la liaison ligand/récepteur. 11 TLRs (appelés simplement TLR1 à TLR11) ont été réellement décrits et identifiés chez l’Homme. Ces récepteurs TLR sont inductibles ou constitutivement exprimés sur de nombreux types cellulaires distincts, incluant les cellules épithéliales du petit intestin et du côlon, les monocytes/macrophages, les cellules endothéliales et les adipocytes sous-muqueux. Le tableau 1 répertorie les différents ligands et molécules adaptatrices spécifiques à chaque TLR. Aujourd’hui, une dizaine de TLR ont été séparés en deux groupes principaux suivants leur localisation (Wells et al., 2010) : Les TLR 1, 2, 4, 5, 6 sont situés au niveau de la membranaire plasmique et sont impliqués dans la reconnaissance des composants de la paroi des agents infectieux. On distingue notamment : Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 12 o TLR-4 qui reconnaît les LPS (Lipopolysaccharides), endotoxines présentes au niveau des bactéries à Gram négatif. o TLR-5 qui reconnaît la flagelline, protéine de structure des flagelles bactériens. o TLR-1, TLR-2 et TLR-6 qui reconnaissent les peptidoglycanes, les lipoprotéines et les glycophospholipides, présents en abondance dans la paroi cellulaire des bactéries à Gram positif; ces récepteurs forment des hétérodimères TLR-1/TLR-2 et TLR-2/TLR-6, constituant ainsi un mécanisme de diversification des réponses modulées par les TLR. Les TLR-3, 7, 8, 9 sont situés au niveau des endosomes et reconnaissent les composants viraux et bactériens, surtout les acides nucléiques (Medzhitov, 2007 ; Westendorf et al., 2009, Wells et al., 2010 ; Kelly et al., 2005). On distingue notamment : o TLR-3 qui reconnaît des ARN doubles brins viraux. o TLR-7 et 8 qui reconnaissent des ARN simples brins viraux. o TLR-9 qui reconnaît les ADN bactériens au niveau des dinucléotides CpG non méthylés. En résumé, les TLR 2, 4, 5 et 9 détectent les bactéries commensales et les structures fongiques alors que les TLR 3, 7 et 8 participent majoritairement à la détection des virus (Cario, 2005 ; Westendorf et al., 2009 ; Wells et al., 2010). Tableau 1. Les ligands et les molécules adaptatrices spécifiques pour chaque Récepteur Toll-Like (TLR) chez les Mammifères (Cario, 2005 ; Wells et al., 2010) Récepteurs TLR1 TLR2 TLR3 TLR4 TLR5 TLR 6 TLR 7 TLR 8 TLR 9 TLR 10 TLR 11 Ligand(s) naturel(s) triacyl des lipoprotéines lipoprotéines, peptidoglycanes des bactéries Gram+, acides lipotéichoïques, champignons, glycoprotéines virales ARN double brin d’origine virale ou parasitaire lipopolysaccharides, glycoprotéines virales flagelline diacyl des lipoprotéines ARN simple brin ARN simple brin ADN (dinucléotides CpG nonméthylés) Inconnu Profiline Molécules adaptatrices MyD88/MAL MyD88/MAL TRIF MyD88/MAL/TRIF/TRAM MyD88 MyD88/MAL MyD88 MyD88 MyD88 Inconnue MyD88 Les PRR de signalisation cytoplasmique : les récepteurs NLR et RLR Les récepteurs NLR (NOD-Like Receptor) et RLR (RIG-I-Like Receptor) constituent deux autres familles qui sont elles cytoplasmiques et qui sont impliqués dans la reconnaissance de composants bactériens et viraux intracellulaires (Medzhitov, 2007). Les récepteurs NLR sont une famille d’une vingtaine de protéines situées dans le cytoplasme et reconnaissant presque exclusivement des composants bactériens. Ils se subdivisent en 3 sous-familles : NOD, NALP et NAID. Les récepteurs RLR reconnaissent essentiellement des composant viraux, principalement des acides nucléiques viraux, et vont activer toutes les voies de signalisation : NFκB, MAP-kinases et interféron. Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 13 Les récepteurs NOD (nucleotide oligomerisation domain) se localisent dans le cytosol de la cellule, et sont également capables de déclencher à la fois des réponses immunitaires innée et acquise (Kelly et al., 2005). Ces récepteurs présentent 3 domaines fonctionnels distincts (Cario, 2005) : o Un domaine LRR, domaine de reconnaissance du ligand en C-term o Un domaine central NOD o Un domaine N-terminal permettant la transduction des signaux via des interactions protéineprotéines avec des molécules adaptatrices (CARD pour les familles NOD et iPAF, PYD pour la famille NALP et BIR pour la famille NAIP). Au niveau de l’intestin, NOD2 et NOD1 possèdent plusieurs similitudes mais NOD2 contient deux domaines CARD à son extrémité N terminal contrairement à NOD1 qui n’en possède qu’un seul (Cario, 2005). De plus, NOD2 serait exprimé de manière constitutive ou inductible, au niveau des monocytes, macrophages, lymphocytes T et B, cellules dendritiques, ainsi qu’au niveau des cellules épithéliales. NOD1 est exprimé de façon ubiquitaire dans de nombreux tissus et cellules. Enfin, un motif spécifique de peptidoglycane (PGN), le muramyl dipeptide (MDP), est le seul ligand de NOD2 identifié, alors que NOD1 détecte un dérivé de peptidoglycane (PGN) de bactéries à Gram négatif, l'acide D-glutamyl-meso-diamino-pimélique (iE-DAP) (Cario, 2005 ; Sansonetti, 2009). Il reste à comprendre comment les muramyl dipeptides (MDP) des bactéries non invasives arrivent à accéder au cytosol et donc aux NOD intracellulaires. Des enzymes présentes dans la lumière ou produites à partir des cellules phagocytaires dans la lamina propria, pourraient digérer la paroi cellulaire des bactéries, permettant ainsi la libération et l'absorption cellulaire des muropeptides (Cario, 2005). Des recherches récentes ont surtout porté sur deux récepteurs cytosoliques de cette famille, NOD1 (CARD4) et NOD2 (CARD15), qui jouent tous les deux un rôle majeur dans la régulation intestinale de la signalisation proinflammatoire par NFκB en réponse à des ligands bactériens distincts (Cario, 2005). 2. La signalisation PRR assure la protection de l’hôte Les différents PRR activent des mécanismes de signalisation distincts via divers cofacteurs et des protéines adaptatrices contrôlant des réponses immunitaires spécifiques. Quand un TLR est activé, il recrute une molécule adaptatrice pour propager le signal ; cinq protéines adaptatrices différentes sont d’ailleurs connues chez l'homme : MyD88, Mal / TIRAP, TRIF/TICAM-1, TRAM/Tirp/TICAM-2, et SARM (Medzhitov, 2007). Ces adaptateurs activent d’autres molécules au sein de la cellule, y compris certaines protéines kinases (IRAK1, IRAK4, TBK1 et IKKi) qui vont amplifier le signal. Au final, des facteurs de transcription vont être induits, y compris NFkB, AP-1, Elk-1, CREB, STATs et vont être responsables de l’activation de gènes codant pour des cytokines et chimiokines pro et/ou anti-inflammatoires. On aura donc l’induction ou la suppression de l’expression de gènes, ce qui va permettre de contrôler la réponse inflammatoire. Ainsi, des milliers de gènes peuvent être activés par la signalisation TLR. La spécificité des réponses immunitaires va dépendre du type de récepteur TLR activé mais également de la protéine adaptatrice recrutée (Wells et al., 2010). Comme précisé au niveau du tableau 1, les TLR 5, 7, 8 et 9 semblent utiliser exclusivement MyD88, alors que TLR 4 utilise 4 adaptateurs : MyD88, MAL/TIRAP, TRIF et TRAM. MyD88 est la protéine adaptatrice la plus utilisée et peut l’être par tous les TLR excepté TLR 3. La protéine adaptatrice TIRAP/MAL contrôle le recrutement de MyD88 dans la signalisation via TLR 2 et TLR 4 exprimés en surface. Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 14 Activation par les formes moléculaires associées aux pathogènes IE-DAP MDP NOD1 NOD2 TLR1/2 TLR2/6 TLR4 TLR5 TLR3 TLR9 TLR7/8 BICOUCHE LIPIDIQUE TRAM MyD88 TRIF TRIF TIRAP TRAF3 NFkB IRAKs Ub MyD88 Ub TRAF6 TRAF6 TBK1 CYTOSOL IRAKs IKKi Ub TRAF6 IKKα IKKβ TAK1 MAPKs P IRF3/7 NEMO/IKK P AP1 IkB P Dégradation protéasomes IRF3/7 P NFkB AP1 NOYAU Cytokines et chimiokines inflammatoires Interférons de type 1 Figure 2. Les voies de signalisation déclenchées suite à l’interaction entre les divers composants bactériens et les récepteurs situés au niveau des cellules épithéliales et des cellules dendritiques (d’après Wells et al., 2010 ; Sanz et De Palma, 2010) Les cellules épithéliales intestinales et les cellules présentatrices d’antigènes (macrophages, cellules dendritiques) expriment des récepteurs, parmi ceux-ci, on trouve des récepteurs de surface TLR 1, 2, 4, 5 et 6, et des récepteurs intracellulaires TLR 3, 7, 8 et 9. Suite à la liaison du ligand sur le récepteur, les TLRs déclenchent des voies de signalisation grâce à l’interaction avec diverses protéines adaptatrices (MyD88, TIRAP, TRIF et TRAM). Acide D-glutamyl-meso-diamino-pimélique (iE-DAP) ; Muramyl dipeptide (MDP). En ce qui concerne les voies de signalisation NOD1/2, elles restent encore aujourd’hui mal connues. Cependant, il apparaît que la fixation du ligand permet aux récepteurs NOD d’entrer en interaction CARD-CARD avec la sérine-thréonine kinase Rip2/RICK/CARDIAK qui conduit à l’activation de NFκB et à l'augmentation de caspases induisant des cascades apoptotiques (Cario, 2005). L'un des résultats de la mise en place de la signalisation des PRR est l'activation de NFκB et la transcription de cytokines et chimiokines pro-inflammatoires (Wells et al., 2010). Via l'activation des voies pro-inflammatoires, différents mécanismes de défense vont supprimer les bactéries luminales, notamment grâce à l'expression et à la libération de défensines antibactériennes et à l'attraction des phagocytes (Sansonetti, 2004), dont les neutrophiles, les macrophages et les cellules dendritiques, au niveau du site envahi par l'agent pathogène (Wells et al., 2010). L’activation des voies IRF3, NFκB et MAPK via la signalisation PRR, est une composante essentielle de l’immunité innée contre les pathogènes, mais l'induction de la réponse inflammatoire à la surface de la muqueuse suite au contact avec la microflore résidente deviendrait pathologique si aucunes régulations n’existaient (Wells et al., 2010). L'hôte possède donc des mécanismes qui permettent de faire la distinction entre les organismes commensaux et pathogènes afin de trouver un équilibre entre tolérance et immunité. Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 15 3. La sécrétion des peptides antimicrobiens par les PRR La présence de bactéries pathogènes ou non dans l’intestin déclenche l’expression de peptides antimicrobiens par les cellules de la muqueuse (Wells et al., 2010). Ainsi, les cellules de Paneth sécrètent diverses protéines antimicrobiennes notamment les α-défensines (Dann et al., 2007). Les défensines s’attaquent aux bactéries à Gram-positif et négatif, à certains champignons, aux protozoaires et virus enveloppés en interagissant avec la membrane externe (Ganz, 2003a ; Ouellette et Bevins, 2001; Salzman et al., 2007). Elles vont alors désorganiser la membrane, ce qui conduit à la formation de pores et à la mort cellulaire. Les entérocytes intestinaux expriment également des facteurs antimicrobiens, notamment les β-défensines. Par exemple, il a été démontré que la murine β-défensine 2 (MBD-2) peut directement agir comme un ligand endogène pour le TLR4, et ainsi augmenter l’activité bactéricide (boucle autocrine inverse) (Wells et al., 2010). La MBD-2 augmente la maturation des cellules dendritiques et l’expression de molécules de costimulation conduisant à une réponse immunitaire adaptative. Des études similaires ont démontré que la β-défensine humaine-3 (HBD-3) via l'interaction avec TLR 1 et 2, va jouer un rôle important dans l'activation des cellules présentatrices d'antigène. Ces résultats confirment un rôle supplémentaire de certaines défensines intestinales dans le déclenchement de réponses immunitaires adaptatives contre les pathogènes. Plusieurs facteurs antimicrobiens vont alors limiter la pénétration des bactéries pathogènes et commensales. Ces peptides naturels représentent donc un important mécanisme de défense de l'hôte dans l'immunité innée par la capacité à tuer les microbes phagocytés, aidant ainsi à prévenir le franchissement de la barrière intestinale par des bactéries pathogènes (Ganz, 2003b). B. Limitation de l’activation immunitaire dans les muqueuses 1. Les mécanismes permettant de contrôler les réponses immunitaires a) Présence d’une zone protégée : limitation du contact direct avec la flore commensale La réponse inflammatoire vis-à-vis des bactéries commensales serait réduite grâce à la compartimentation luminale de la microflore par l'épithélium de surface (Rakoff-Nahoum et al., 2004). En effet, la limitation du contact direct entre l’épithélium intestinal et la flore commensale pourrait expliquer l’absence d'inflammation chronique de la muqueuse (Duerkop et al., 2009). De nombreuses études ont montré que les surfaces apicales des cellules épithéliales sont protégées du grand nombre de bactéries luminales par la couche de mucus. Via la barrière formée par celle-ci, les récepteurs sur les cellules épithéliales ne sont pas exposés à de fortes densités de bactéries luminales et plus précisément aux fortes densités des MAMP. Ainsi, les cellules épithéliales détectent uniquement les bactéries présentes dans la « zone protégée ». De plus, la détection de bactéries dans la zone protégée permet de mettre en place un mécanisme de contrôle de l’homéostasie, qui va dépendre de la densité de la population bactérienne luminale. Ainsi, la muqueuse intestinale présenterait une tolérance vis-à-vis de la forte densité de bactéries intestinales, car elle est, en grande partie, protégée d’un contact direct avec celle-ci (Duerkop et al., 2009). b) Expression et compartimentation des PRR La suppression de l’expression des récepteurs TLR et NOD au niveau de l’épithélium intestinal diminue les réponses immunitaires mises en place contre les infections bactériennes (Wells et al., 2010). Cependant, une autre hypothèse serait que les récepteurs PRR tels que les TLR, ont une expression ou une localisation Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 16 restreinte sur les cellules épithéliales (Duerkop et al., 2009). Leur répartition spécifique à la surface des cellules ainsi que dans différents compartiments cellulaires serait stratégique et contrôlée par l'exposition au ligand (Cario, 2005). Les récepteurs TLR 3, 7, 8 et 9 sont localisés dans les compartiments intracellulaires, alors que TLR 5 est localisé, in vitro, à la surface basolatérale de la membrane (Iwasaki et Medzhitov, 2004) assurant l'activation des réponses immunitaires seulement lorsque les bactéries envahissent la muqueuse (Duerkop et al., 2009 ; Gewirtz et al., 2001). Cependant in vivo, il semble que TLR5 est exprimé sur les deux pôles des cellules épithéliales intestinales (Bambou et al., 2004). Il a également été démontré que la polarisation au niveau de l’épithélium intestinal joue un rôle dans le maintien de l'homéostasie intestinale (Lee et al., 2006). Par exemple, l’activation du récepteur TLR9 aura des conséquences différentes sur la transcription de gènes selon qu’il soit activé au niveau de la membrane apicale ou qu’il le soit au niveau de la membrane basolatérale de l’épithélium intestinal. Au niveau de la membrane apicale, l’activation de TLR9 favorise l’homéostasie et la tolérance, alors qu’au niveau de la membrane basale, l’activation de TLR9 engendre une dégradation de IkB et donc une activation de la voie canonique NFkB. Ainsi, l'absence de récepteurs TLR au niveau des surfaces apicales des cellules épithéliales, soit en raison de leur polarisation intrinsèque aux surfaces basolatérales ou à la suite d’une régulation négative induite par un ligand, permettrait une réduction des réponses immunitaires vis-à-vis de la microflore commensale (Kelly et al., 2005 ; Wells et al., 2010). De plus, à l’état stationnaire, l’épithélium intestinal est caractérisé par une faible détection des MAMP (à l'exception des cellules présentes au niveau des cryptes)(Sansonetti, 2004) car les récepteurs TLR 2 et TLR 4 sont soit absents ou atténués dans les cellules épithéliales intestinales (Kelly et al., 2005 ; Wells et al., 2010). Concernant les récepteurs NOD, l’expression de NOD1 se fait de manière constitutive au niveau des cellules intestinales alors que celle de NOD2 est restreinte aux cellules de Paneth dans l'intestin grêle (Wells et al., 2010). Certaines de ces études démontrent donc que le signal du TLR est atténué au niveau des cellules épithéliales matures et est perçu de façon plus importante au niveau de la lignée épithéliale de la crypte où les cellules souches intestinales sont situées (Wells et al., 2010). Cette hypothèse est cohérente avec la présence d’une tolérance vis-à-vis des bactéries inoffensives et avec la protection des cellules souches contre une invasion par des bactéries pathogènes qui coloniseraient l'épithélium et atteindraient les cryptes. Des immuno-marquages de tissus du côlon humain ont effectivement montré que TLR2 et 4 ont été exprimés principalement dans les cellules épithéliales des cryptes afin de garantir un environnement stérile (Furrie et al., 2005). Les récepteurs épithéliaux sont donc positionnés de manière à ne déclencher une réponse que dans le cas d’une violation de la barrière épithéliale par des bactéries (Duerkop et al., 2009). c) Atténuation de la signalisation PRR par l’expression de régulateurs Au niveau de l'intestin, la tolérance est indispensable pour garantir une réactivité réduite vis-à-vis des bactéries commensales inoffensives et de leurs produits. En effet, la mise en place de réponses inflammatoires en l'absence de bactéries pathogènes serait dangereuse pour l’organisme. C’est notamment le cas des personnes atteintes d’inflammations chroniques intestinales telle que la maladie de Crohn (Cario, 2005). Plusieurs mécanismes de limitation des réponses immunitaires existent au niveau de l’épithélium intestinal, notamment l’expression régulée d’inhibiteurs de la signalisation TLR (Wells et al., 2010; Cario, 2005). Ainsi, l'ampleur et la durée de la signalisation TLR est soigneusement réglementée au niveau de l'intestin en bonne santé (Kelly et al., 2005). On observe par exemple un haut niveau d'expression de régulateurs (comme Tollip Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 17 (Toll-interacting protein) ou PPARγ (peroxisome proliferator activated receptor γ) qui vont limiter ou supprimer les voies de signalisation médiées par les TLR (Shibolet et Podolsky, 2007 ; Cario, 2005). Par exemple, les souris déficientes TIR8 sont plus susceptibles de développer une inflammation intestinale, ce qui implique TIR8 dans la tolérance vis-à-vis de la flore commensale (Cario, 2005). L'ubiquitine ligase TRIAD3A augmente la dégradation protéolytique de TLR4 et TLR9. Les souris déficientes en protéine à doigt de zinc A20 développent de graves inflammations de l'intestin, ce qui suggère que A20 est indispensable pour contrôler le seuil d'activation immunitaire dans l'intestin (Duerkop et al., 2009). Ainsi, A20 régule négativement la voie TLR4 bloquant l’activation de NFkB ainsi que la voie TLR3 par l’inhibition de l’expression du gène de l'interféron IFN-β (Cario, 2005). Ces différents médiateurs peuvent donc contribuer à des mécanismes épithéliaux de contrôle de l'inflammation (Wells et al., 2010) . De plus, le seuil à partir duquel la signalisation PRR est déclenchée peut être modulé de façon tissu-spécifique par ces facteurs épithéliaux spécifiques (Duerkop et al., 2009). Par exemple, la phosphatase alcaline intestinale (IAP) située au niveau de la bordure en brosse épithéliale, modifie les LPS bactériens qu’elle rencontre et atténue leur potentiel pro-inflammatoire. De cette façon, l'IAP contrôle les concentrations de LPS nécessaires pour activer l’immunité innée au niveau des cellules épithéliales. En exprimant des facteurs tels que l'IAP et A20, l'épithélium intestinal est capable de moduler le seuil de densité bactérienne nécessaire pour déclencher une réponse immunitaire innée. Ces stratégies spécifiques d'un tissu peuvent contribuer à la tolérance relative des surfaces intestinales à la présence de forte concentration de bactéries luminales (Duerkop et al., 2009). Cependant, les souris ne possédant pas TLR 9, 4, 2 et MyD88 souffrent de maladies inflammatoires (Lee et al., 2006 ; Rakoff-Nahoum, 2004). De même, les souris traitées avec de multiples antibiotiques pour diminuer la teneur microbienne de l'intestin sont plus sensibles aux maladies inflammatoires, mais peuvent être protégées par l'administration d'agonistes de TLR 2 et 4 (Rakoff-Nahoum et al., 2004). Ainsi, il est devenu évident que la signalisation TLR maintenu à un niveau de base par la microflore luminale peut contribuer à l'homéostasie intestinale. L'expression, la distribution et la localisation cellulaire des PRR, semblent jouer un rôle dans la discrimination des commensaux et pathogènes par l’hôte, dans des conditions d'équilibre (Wells et al., 2010). Dans le cas où la barrière épithéliale est rompue, la réponse inflammatoire initiale augmente l’expression des PRR de façon à surmonter les mécanismes qui « amortissaient » la signalisation à l'état d'équilibre. 2. Les bactéries commensales interviennent dans la protection de l’hôte par la modulation de la signalisation PRR La voie inhibitrice de NFκB est utilisée par les pathogènes intestinaux pour éviter leur élimination par l’organisme (Wells et al., 2010). Ils ont développé des mécanismes pour maîtriser la reconnaissance par les récepteurs et ainsi d’éviter les défenses de l'immunité innée. Par exemple, le pathogène Yersinia inhibe la voie NFκB au niveau de la phosphorylation d’IkB alors que Salmonella spp. bloque l’ubiquitination et la dégradation d’IkB pour empêcher la translocation de NFκB dans le noyau. Ces mécanismes utilisés par les pathogènes limitent l’immunité innée et donc l'induction subséquente de réponses immunitaires adaptatives. Des bactéries commensales peuvent également posséder des mécanismes similaires mais les objectifs vont être différents. En effet, comme la relation entre les mammifères et le microbiote intestinal est symbiotique, de multiples adaptations se sont développées pour la maintenir. Ainsi, en plus des mécanismes de l’hôte qui contrôlent l'inflammation, des études confirment le rôle de la microflore commensale dans le maintien de l'homéostasie immunitaire de l'intestin (Kelly et al., 2005). Afin de maintenir l'homéostasie et d’éviter les lésions tissulaires provoquée par une inflammation, la flore commensale va contrôler les effets via la signalisation TLR et NOD (Cario, 2005). Une constante exposition de la surface intestinale à des produits dérivés de bactéries commensales est nécessaire pour maintenir un état basal d'activation des voies de signalisation, assurant ainsi une homéostasie intestinale et donc une limitation des réponses inflammatoires chroniques. Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 18 Les bactéries commensales peuvent donc avoir des effets sur les voies de signalisation des PPR et aider l'hôte à maintenir l’homéostasie de la muqueuse par la suppression des réponses inflammatoires et par l’inhibition des voies de transduction spécifiques du signal intracellulaire (Wells et al., 2010 ; Cario, 2005). Ainsi, il a été démontré que les membres du genre Bacteroides peuvent induire l’expression de PPARγ dans les lignées cellulaires, diminuant la réponse déclenchée par les récepteurs TLR via une boucle de rétroaction négative visà-vis des gènes cibles NFκB dépendants (Kelly et al., 2004 ; Cario, 2005). In vitro, des souches non pathogènes de Salmonella ainsi que des souches de Lactobacillus casei sont capables de supprimer les réponses inflammatoires en interférant avec l'activation de NFκB, le facteur de transcription pro-inflammatoire majeur (Neish et al., 2000). En revanche, les pathogènes Salmonella ne sont pas capables d'interférer avec l'activation de NFκB, et provoquent une réponse pro-inflammatoire. Cependant, ces mécanismes sont fondés sur des données in vitro utilisant des lignées cellulaires, ils doivent donc être confirmés in vivo (Wells et al., 2010). D’autres études in vitro suggèrent que les symbiotes échappent à la détection du système immunitaire inné en modifiant les motifs moléculaires qui déclenchent les voies de signalisation (Duerkop et al., 2009). Autre exemple, la bactérie commensale anaérobie, B. thetaiotaomicron exerce son activité anti-inflammatoire au niveau du noyau c’est-à-dire en aval de la cascade de signalisation des récepteurs TLR et de l’activation de NFκB (Neish et al., 2000 ; Kelly et al., 2004). En effet, elle provoque l'exportation nucléaire de RelA, une sousunité du complexe NFκB, ce qui empêche la réponse inflammatoire. De plus, B. thetaiotaomicron inciterait les cellules de Paneth à sécréter l’angiogenin qui correspond à une nouvelle classe de peptides antimicrobiens tuant sélectivement les micro-organismes pathogènes (Kelly et al., 2005). B. thetaiotaomicron aurait ainsi développé des stratégies qui protégeraient la «stérilité» des cryptes intestinales. Cependant, le mécanisme par lequel les signaux permettent l’induction de l'expression de peptides antimicrobiens par les cellules de Paneth reste inconnu. Pour contrôler les réponses immunitaires, les systèmes bactériens agissent via des transferts de molécules effectrices bactériennes, soit directement dans le cytosol des cellules eucaryotes cibles ou dans le milieu extracellulaire (Neish, 2004). Ce transfert se produit via un système de sécrétion de type III ou d'un système d'exportation flagellaire fonctionnelle (Kelly et al., 2005). Des études récentes ont démontré la présence de systèmes de sécrétion de types III chez les bactéries commensales, les systèmes de sécrétion de type IV pourraient également être importants. Ainsi, en utilisant à la fois des systèmes de sécrétion de type III et/ou de type IV, les bactéries commensales sont en mesure de transmettre des molécules effectrices bactériennes aux cellules intestinales, ce qui modifie le résultat de la signalisation. Ces molécules effectrices bactériennes sont des protéines riches en leucine. Les produits principaux de la fermentation de certaines espèces de bactéries commensales intestinales, comme les acides gras à chaîne courte, peuvent également jouer un rôle dans l’homéostasie intestinale (Wells et al., 2010). Par exemple, le butyrate est une source d'énergie importante pour l’épithélium intestinal, mais il joue également un rôle dans le maintien de l'homéostasie car il peut inhiber l'activation de NFκB probablement par désacétylation des histones et suppression de l'activité du protéasome cellulaire. Les effets anti-inflammatoires du butyrate comprennent également l'inhibition de la production et/ou la signalisation de l'interféron-γ et la régulation de PPARγ. La connaissance des différents modes d'action des bactéries intestinales induisant des réponses antiinflammatoires, reste à approfondir car d'autres processus cellulaires partagent des composants de la voie de signalisation NFκB, tels que l'intégrité cellulaire, la survie et la réparation (Rakoff-Nahoum et al., 2004). Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 19 III. L’immunité adaptative au service de l’homéostasie intestinale Les systèmes immunitaires inné et adaptatif collaborent pour détecter et réguler les populations bactériennes au niveau des surfaces de la muqueuse intestinale. Ainsi, l’échantillonnage des bactéries dans l'espace confiné créé entre la couche de mucus et la surface épithéliale intestinale et la reconnaissance par les PRR constituent les points de départ de la mise en place des réponses immunitaires en faveur de la tolérance. Ainsi, après l’activation du système immunitaire inné, on a la mise en place du système adaptatif grâce aux bactéries symbiotiques qui vont fournir des signaux (via l’échantillonnage ou via l’activation de récepteurs) pour le développement de sous-ensembles de lymphocytes clés (Duerkop et al., 2009). A. Les différentes cellules impliquées dans l’immunité adaptative En plus des différentes lignées de cellules épithéliales qui défendent les muqueuses de l'invasion bactérienne, il existe des cellules immunitaires sous-épithéliales adaptatives jouant un rôle essentiel à la fois dans la protection et dans le maintien de l’homéostasie intestinale (Duerkop et al., 2009). 1. Les cellules présentatrices d’antigènes Les acteurs principaux des réponses immunitaires adaptatives sont les lymphocytes qui vont reconnaitre les micro organismes de façon spécifique. Ce sont les cellules présentatrices d’antigènes qui vont présenter l’antigène aux lymphocytes pour que ceux-ci mettent en place une réponse immunitaire adaptée (Duerkop et al., 2009). Parmi les cellules présentatrices d’antigènes, on retrouve les monocytes, les lymphocytes B et les cellules dendritiques. Ces cellules sont donc indispensables à la mise en place de la tolérance car elles vont permettre, par la présentation des antigènes issus d’organismes commensaux, d’activer des réponses lymphocytaires en faveur de l’homéostasie intestinale. De plus, la libération des cytokines par ces cellules va être régulée en fonction de l’environnement. Par exemple, à l’état stationnaire, l'expression de l'IL-12, produite par les cellules présentatrices d’antigènes en réponse aux micro-organismes pathogènes va être régulée négativement, ce qui va être un élément important dans la mise en place de la tolérance (Sansonetti, 2004). 2. Les lymphocytes B Deux grandes catégories de lymphocytes existent. Parmi celles-ci les lymphocytes B (cellules mémoire et plasmocytes) qui ont la capacité à produire un récepteur de surface spécifique à un antigène particulier (Sanz et De Palma, 2009). Quand le lymphocyte B reconnaît l’antigène spécifique, il se différencie en plasmocyte sécréteur d’anticorps. Les lymphocytes B intestinaux produisent 70 à 90% d’ immunoglobulines de type A. On les retrouve principalement au niveau de la lamina propria et au niveau des plaques de Peyer. Ces cellules B productrices d'IgA sont donc parmi les plus abondantes et les mieux caractérisées des populations cellulaires de l’immunité adaptative dans la muqueuse intestinale (Duerkop et al., 2009). 3. Les lymphocytes T On trouve des lymphocytes T dits conventionnels et d’autres non conventionnels (Figure 3) (Duerkop et al., 2009) : Les lymphocytes T conventionnels (αβ) comprennent : o Les lymphocytes T CD8+ exerçant une activité cytotoxique envers le pathogène o Les lymphocytes T CD4 + principalement situés dans la lamina propria mais aussi au niveau des plaques de Peyer, et qui sont subdivisées en cellules T helper avec : Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 20 Les lymphocytes Th1, dont les réponses vont être caractérisées par une surproduction d'IFN-γ et d’IL-2 (Duerkop et al., 2009). Elles sont donc impliquées dans des réactions inflammatoires et dans l’élimination des pathogènes intracellulaires (on aura d’ailleurs dans le cas de maladies intestinales inflammatoires chroniques comme la maladie de Crohn, une activité Th1 excessive) (Sanz et De Palma, 2009 ; Rescigno et Di Sabatino, 2009). Les lymphocytes Th2 vont aider les lymphocytes B à se différencier en plasmocytes car ils libèrent des facteurs de croissance cellulaire comme l'IL-4 (Rescigno et Di Sabatino, 2009 ; Duerkop et al., 2009). Les lymphocytes Th17 qui sécrètent de l’IL-17, des facteurs de croissance et des chémokines, vont participer au recrutement de neutrophiles, à l’augmentation de l’inflammation et à l’hématopoïèse (Rescigno et Di Sabatino, 2009). Ainsi, les PAMP activent les macrophages et les cellules dendritiques, ce qui permet la sécrétion d’IL-23 stimulant les lymphocytes Th17 et permettant ainsi le recrutement des neutrophiles et l’augmentation de l’inflammation. Suite à l’élimination des pathogènes, on observe l’apoptose des neutrophiles et une diminution de l’IL-23. Les lymphocytes T régulateurs induits (iTreg) CD4+ CD25+ Foxp3+ empêchent l’activation des lymphocytes T naïfs par contact cellulaire via la sécrétion de cytokines IL-10 et TGF-β (Sanz et De Palma, 2009 ; Duerkop et al., 2009). Les cellules T régulatrices maintiennent l'homéostasie intestinale en réduisant les réponses immunitaires innée et adaptative inappropriées (Barnes et Powrie, 2009). D’autres lymphocytes T régulateurs CD25- Foxp3- interviennent. Ils sont représentés par les lymphocytes Tr1 et Th3 sécrétant respectivement des taux élevés d’IL-10 et de TGF-β (Sanz et De Palma, 2009). Les lymphocytes T non conventionnels comprennent notamment les lymphocytes T intra-épithéliaux γδ et CD8+. Leur activation est non classique car elle se fait sans l’intermédiaire du CMH. Ils permettent de capter des conditions locales dans les tissus et d’élargir les fonctions des lymphocytes T à cet endroit (Meresse et Cerf-Bensussan, 2009). Ainsi, les lymphocytes T γδ représentent une faible proportion des cellules T dans la plupart des compartiments lymphoïdes et sont plutôt associés à l'épithélium intestinal (Meresse et Cerf-Bensussan, 2009 ; Coombes et Maloy, 2007). Ces lymphocytes T γδ correspondent à une immunité adaptative précoce, plus proche de l’immunité innée, ainsi ils vont permettre de répondre rapidement à des signaux de danger et vont effectuer une immunosurveillance des lésions au niveau de l’épithélium (Meresse et Cerf-Bensussan, 2009). Ils permettent donc de limiter la pénétration de bactéries au niveau de surfaces muqueuses blessées (Ismail et al., 2009). Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 21 Figure 3. La différenciation des cellules T naîves en cellules T effectrices et en cellules T régulatrices (d’après Sanz et De Palma, 2009) : Les lymphocytes T conventionnels comprennent Les lymphocytes T CD8+ exerçant une activité cytotoxique envers le pathogène et les lymphocytes T CD4 + qui sont subdivisées en cellules T helper. Les lymphocytes T non conventionnels sont représentés notamment par les lymphocytes T intra-épithéliaux γδ et CD8+. L’importance de l'IL-10 ou le TGF-β dans le contrôle des réponses du système immunitaire intestinal a été démontré chez des souris dépourvues de cellules T régulatrices Foxp3+ ou qui n’expriment pas des cytokines de régulation spécifiques telles que l'IL-10 ou le TGF-β, qui ont développé des maladies inflammatoires déclenchées par la présence des bactéries de la flore commensale (Barnes et Powrie, 2009). Le rôle principal du TGF-β dans le système immunitaire reste le maintien de la tolérance aux antigènes du soi et aux antigènes nonpathogènes de l'environnement et ceci en influençant le développement et l'équilibre entre des cellules immunitaires effectrices et des cellules immunitaires régulatrices (Sonier et al., 2009). En l'absence d'inflammation, un équilibre entre les sous-populations lymphocytaires effectrices et régulatrices est maintenu grâce à un contrôle rigoureux par les cytokines (Sanz et De Palma, 2009). Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 22 B. La mise en place de l’immunité adaptative 1. L’échantillonnage de l’antigène par les cellules dendritiques Les cellules dendritiques interviennent dans le maintien de l’homéostasie intestinale car elles font le lien entre les deux systèmes immunitaires (inné et adaptatif). En effet, les cellules dendritiques jouent un rôle crucial dans l'induction des réponses immunitaires adaptatives via la présentation de l’antigène et l'activation des cellules T naïves dans le ganglions périphériques (Westendorf et al., 2010 ; Wells et al., 2010). Les antigènes luminaux peuvent atteindre la lamina propria via différentes voies (Figure 4) : Les cellules M situées au niveau des plaques de Peyer peuvent transférer les antigènes de la lumière intestinale vers les régions sous-épithéliales. Ces antigènes seront alors transmis aux cellules dendritiques (Westendorf et al., 2010). À la suite de la capture par les cellules dendritiques dans la région du dôme sous-épithélial, l’activation des réponses IgA est déclenchée localement et à distance des muqueuses (Corthésy et al., 2007), ce qui réduit la pénétration de bactéries et donc les occasions pour les bactéries commensales d'activer des réponses immunitaires au niveau des cellules de la lamina propria (Macpherson et Uhr, 2004 ; Wells et al., 2010). D’autres sous-ensembles de cellules dendritiques situés dans la lamina propria, envoient leurs dendrites à travers l’épithélium intestinal, sans en altérer l’intégrité, pour échantillonner activement les antigènes luminaux d’ espèces bactériennes non-invasives (Corthésy et al., 2007 ; Lotz et al., 2007 ; Coombes et Maloy, 2007). Récemment, il a été suggéré que cette méthode d'échantillonnage de l'antigène semblait dépendre du récepteur à chimiokines, CX3CR1 (Coombes et Maloy, 2007 ; Coombes et Powrie, 2008 ; Sansonetti, 2004). Les cellules dendritiques de la lamina propria échantillonnent ainsi un petit nombre de bactéries qui sont présentes à la surface apicale des cellules épithéliales, ce qui leur permet de surveiller les bactéries qui ont pénétré la couche interne de mucus et qui sont en étroite association avec la surface de la muqueuse (Duerkop et al., 2009). Des antigènes luminaux peuvent, enfin, entrer via des brèches dans la couche de cellules épithéliales ou par l’absorption d’antigène réalisée par des entérocytes (Pabst et al., 2007). Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 23 Figure 4. Les mécanismes d’échantillonnage des antigènes luminaux au niveau de la lamina propria (d’après Ng et al., 2010) : (1)Les cellules dendritiques peuvent acquérir l’antigène après que celui-ci ait été transporté au travers des cellules M ; (2)Les cellules dendritiques peuvent étendre leurs dendrites entre les cellules épithéliales pour directement capturer les antigènes, c’est le cas des cellules dendritiques CX3CR1+ qui ont ensuite présenter l’antigène aux cellules T CD4+, qui vont alors devenir des cellules T effectrices et qui vont produire des cytokines pro inflammatoires ; (3)L’antigène peut directement avoir accès à la lamina propria par des brèches au niveau de l’épithélium intestinal observées lors d’inflammations de l’intestin. 2. La présentation de l’antigène : mise en place des fonctions de régulations Les cellules dendritiques chargées de bactéries interagissent avec les cellules B et les cellules T dans les tissus lymphoïdes tels que les ganglions mésentériques et les plaques de Peyer afin d’initier des réponses immunitaires appropriées (Westendorf et al., 2010 ; Duerkop et al., 2009). La lymphe draine les plaques de Peyer et la lamina propria puis arrive dans les ganglions mésentériques (Coombes et Maloy, 2007). A l'état stationnaire, comme en l'absence d'inflammation ou d’infection, les cellules dendritiques immatures ou non activées migrent ainsi constitutivement de la lamina propria et/ou des plaques de Peyer vers les MLN afin de rencontrer les cellules B et T naïves (Ng et al., 2010 ; Coombes et Maloy, 2007 ; Coombes et Powrie, 2008). Les cellules dendritiques sont alors responsables du maintien de la tolérance aux antigènes inoffensifs grâce à leur interaction avec des cellules T (Coombes et Maloy, 2007). Les cellules Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 24 dendritiques qui n'ont pas reçu de stimulus inflammatoire vont entraîner la suppression ou l'inactivation des cellules T auto-réactives et l'activation des lymphocytes T régulateurs CD4 + CD25 +. L'induction de la tolérance ou de l'immunité active va dépendre des sous-populations de cellules dendritiques activées et des récepteurs de surface impliqués (Ng et al., 2010). Ces réponses tolérogènes sont donc la conséquence de l’interaction entre le microbiote et les cellules dendritiques (Westendorf et al., 2010). Ainsi, les réponses des cellules T régulatrices sont influencées par les cellules dendritiques qui ont été exposées à des micro-organismes commensaux (Corthésy et al., 2007). La tolérance vis-à-vis des bactéries intestinales est non systémique c’est-à-dire qu’elle se restreint au compartiment intestinal (Ng et al., 2010). En effet, chez des souris exemptes d'agents pathogènes, les cellules dendritiques portant les bactéries commensales ont été confinées au niveau du GALT par les MLN (Ng et al., 2010 ; Sanz et De Palma, 2009). Ainsi, la souris exempte d'agents pathogènes est restée ignorante vis-à-vis de son microbiote (Sanz et De Palma, 2009). Ce confinement au niveau des MLN permet de ne pas propager le signal au niveau des ganglions systémiques ou de la rate et d’éviter le déclenchement de réponses IgG systémiques contre le microbionte (Rescigno et al., 2008 ; Chung et Lee Kasper, 2010). L’objectif du système immunitaire est donc de générer la tolérance vis-à-vis des bactéries commensales, tout en préservant l'immunité face à des agents pathogènes. 3. Les cellules dendritiques et l’homéostasie intestinale Les cellules dendritiques semblent modifier leur état de maturation ou l'expression des récepteurs de surface en fonction des signaux de l'environnement, cela ayant, des conséquences sur l’activation des lymphocytes (Coombes et Maloy, 2007). La nature des réponses immunitaires générées par les cellules dendritiques varie donc en fonction des compartiments anatomiques où elles rencontrent les antigènes (Westendorf et al., 2010). Ainsi, les différents tissus génèreraient localement leurs propres cellules dendritiques et les cellules dendritiques capteraient et répondraient à des signaux de l'environnement par des modifications de leur différenciation ou de leur maturation (Ng et al., 2010). Elles vont alors permettre l’inactivation des lymphocytes T effecteurs ou de faibles niveaux de réponses de ceux-ci contre les antigènes issus de bactéries commensales, en l'absence d'infection (Westendorf et al., 2010), mais pouvant devenir immunogènes, en présence de signaux inflammatoires (Coombes et Maloy, 2007). En effet, lors de l'exposition à des agents pathogènes ou des cytokines comme l'IL-1 ou le TNF-α, les cellules dendritiques migrent vers les tissus lymphoïdes secondaires et activent les cellules T effectrices (Ng et al., 2010). Des études récentes suggèrent que les cellules de l’épithélium intestinal peuvent intervenir dans ce conditionnement des cellules dendritiques par l’expression de facteurs immuno modulateurs (Coombes et Maloy, 2007 ; Westendorf et al., 2010). En effet, en réponse à des stimuli bactériens via les PRR, les cellules épithéliales produisent des médiateurs (chémokines, cytokines) qui vont influencer les cellules dendritiques pour qu’elles régulent négativement les sécrétions de cytokines inflammatoires telles que l’IL-12 et l’IL-23 (Ng et al., 2010). D'autres médiateurs interviendraient dans le conditionnement des cellules dendritiques intestinales : notamment la cytokine anti-inflammatoire TGF-β et la prostaglandine E2 (PGE2) (Westendorf et al., 2010 ; Coombes et Maloy, 2007). La production de PGE2 par les cellules stromales de la lamina propria permet l’expression, au niveau des cellules dendritiques, d’une enzyme l’indoleamine 2,3 deoxygenase (IDO) qui réduit la prolifération des cellules T spécifiques de l'antigène (Westendorf et al., 2010 ; Coombes et Maloy, 2007 ; Ng et al., 2010). PGE2 favorise également la production d'IL-10 et la diminution de la sécrétion d’IL-12 par les cellules dendritiques, permettant ainsi de maintenir les autres cellules dendritiques dans un état immature et de favoriser le développement des cellules T régulatrices (Westendorf et al., 2010). La cytokine TGF-β, quant à elle, est produite par de nombreuses cellules de la muqueuse intestinale et peut induire la tolérance immunitaire (Westendorf et al., 2010; Coombes et Maloy, 2007 ; Coombes et al., 2007). En Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 25 effet, TGF-β est impliquée dans l’homéostasie intestinale par la limitation de l’activation des cellules dendritiques (Westendorf et al., 2010). Cette cytokine peut réguler négativement leur fonction en inhibant l’expression du CMH de classe II et des molécules de costimulation (Coombes et Maloy, 2007). Cependant, l'exposition des cellules dendritiques à TGF-β et IL-10 peut favoriser la production accrue d'IgA par les lymphocytes B, garantissant ainsi la protection contre les agents pathogènes (Coombes et Maloy, 2007 ; Westendorf et al., 2010). Figure 5. Interaction des cellules dendritiques intestinales avec les bactéries luminales à l'état stationnaire (d’après Ng et al., 2010) : A l'état d'équilibre et après l'échantillonnage des organismes commensaux, les cellules dendritiques de la lamina propria sont «conditionnées» par des facteurs dérivés des cellules épithéliales tel que le TGF-β, puis elles migrent vers les ganglions lymphatiques mésentériques où elles vont présenter l’antigène aux cellules T pour induire leur différenciation en cellules T régulatrices Foxp3+ via un processus dépendant de TGF-β et de l’acide rétinoïque. La sécrétion d'IL-10 et de TGF-β peut jouer un rôle dans la diminution de la sensibilité des cellules dendritiques aux bactéries et signaux d’activation. Les facteurs issus des cellules épithéliales peuvent agir sur les cellules dendritiques pour qu’elles régulent négativement les réponses Th1. Le conditionnement des cellules dendritiques intestinales permet de leur inférer des propriétés spécifiques que l’on ne retrouve pas chez les cellules dendritiques d’autres tissus (Westendorf et al., 2010) : - A l’état stationnaire, les cellules dendritiques intestinales favorisent la mise en place d’un environnement non-inflammatoire pour éviter les réponses inflammatoires envers les bactéries commensales luminales (Westendorf et al., 2010). En effet, elles sécrètent des cytokines anti-inflammatoires (TGF-β, IL-10, IL6, IFNγ et la production de métabolites tels que l’indoleamine 2,3 deoxygenase (IDO) (Ng et al., 2010), mais pas de cytokines pro-inflammatoires comme l'IL-12 ou le TNF-α afin d’éviter les dommages causés par des réactions inflammatoires dirigées contre des bactéries commensales (Westendorf et al., 2010). Ainsi, via la Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 26 libération de cytokines immunosuppressives, les cellules dendritiques peuvent induire la tolérance en contrôlant la prolifération des lymphocytes T (Ng et al., 2010). La sous-population de cellules dendritiques CD103+ (provenant probablement de la lamina propria (Rescigno et al., 2008 ; Chung et Lee Kasper, 2010 ; Ng et al., 2010 ; Coombes et Powrie, 2008) est responsable de la conversion de cellules T naïves en cellules T régulatrices CD4 + CD25 + Foxp3+ (Figure 5) et ceci grâce à TGF-β et à l'acide rétinoïque (Westendorf et al., 2010). - Elles induisent principalement la différenciation des cellules T en cellules Th2 ou en cellules T régulatrices tout en inhibant la différenciation des cellules Th1 (Westendorf et al., 2010). - Des études ont également démontré que les cellules dendritiques de la muqueuse intestinale, expriment de faibles niveaux de molécules CMH de classe II et de molécules de co-stimulation par rapport aux cellules dendritiques d'autres tissus (Westendorf et al., 2010). Ces molécules de co-stimulation sont nécessaires à la reconnaissance des cellules dendritiques présentatrices d’antigènes par les lymphocytes et permettent leur activation. Ainsi, l’induction de la tolérance par les cellules dendritiques peut être obtenue par la régulation négative des molécules de costimulation CD80 et CD86 (Ng et al., 2010). - Les cellules dendritiques intestinales produisent des cytokines permettant une commutation isotypique en IgA lorsque les lymphocytes B rencontrent les lymphocytes T (Westendorf et al., 2010 ; Rescigno et Di Sabatino, 2009) - Elles ont la capacité de guider des cellules T naïves vers la lamina propria en provoquant l'expression du récepteur de chimiokine 9 (CCR9) et de l'intégrine α4β7 au niveau de celles-ci (Westendorf et al., 2010). La plupart des réponses médiées par les cellules dendritiques sont donc influencées par l’exposition aux antigènes microbiens (Ng et al., 2010). L'interaction étroite entre les bactéries, les cellules épithéliales, et les cellules dendritiques contribue au maintien de l'homéostasie intestinale. 4. Les cellules dendritiques et protection de l’hôte Les cellules dendritiques intestinales doivent donc faire une distinction entre la flore commensale et les bactéries pathogènes. Comme expliqué précédemment et dans des conditions normales, les cellules dendritiques intestinales reconnaissent les antigènes commensaux, ceci provoque la production de cytokines non inflammatoires et la différenciation des cellules Th2 et des cellules T régulatrices. Cependant, elles doivent conserver la capacité à répondre à des organismes pathogènes, dans le but notamment de protéger l’organisme et de maintenir l’homéostasie. Contrairement aux bactéries commensales, les bactéries pathogènes présentent des marqueurs de pathogénicité tels que des facteurs d’adhésion, des toxines, des invasines, des mucinases, des hémolysines et des systèmes de sécrétion de type III et IV. Ces facteurs de virulence, étant reconnus par les cellules de l’épithélium intestinal, vont provoquer la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et de chimiokines telle que l’IL-8 (Rimoldi et al., 2005a). Des neutrophiles et monocytes vont alors intervenir pour phagocyter les agents pathogènes (Westendorf et al., 2010). Les monocytes recrutés sur le lieu de l’infection vont se différencier en cellules présentatrices d’antigènes qui n’ont initialement pas été conditionnées pour induire ultérieurement des réponses anti inflammatoires et régulatrices (Westendorf et al., 2010). La mise en place de réponses immunitaires protectrices contre les agents pathogènes, pourrait ainsi faire intervenir les cellules dendritiques situées habituellement dans les ganglions mésentériques telles que les cellules dendritiques CD103- (Figure 6). Ces dernières produiraient des quantités de cytokines pro-inflammatoires supérieures à leurs homologues dérivés CD103+ et permettraient Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 27 une production d’IFNγ par les cellules T CD4 + c’est-à-dire une activation de type Th1. Le recrutement de cellules dendritiques « naïves » et leur activation directe par des agents pathogènes qui ont franchi la barrière épithéliale, seraient donc des mécanismes qui permettraient l’induction de réponses immunitaires protectrices, en cas d’invasion par un pathogène. Figure 6. Interaction des cellules dendritiques intestinales avec les bactéries luminales au cours de l'inflammation ou infection (d’après Ng et al., 2010) : Contrairement aux bactéries commensales, les espèces pathogènes vont mettre en place des facteurs de virulence qui vont leur permettre d'envahir l'épithélium et d’améliorer leur réplication. Les lésions causées au niveau de la barrière épithéliale vont activer les PRR cytosoliques et augmenter la production de cytokines proinflammatoires et des chimiokines. Des monocytes, macrophages et neutrophiles sont ensuite recrutés au niveau du site inflammatoire. Les cellules dendritiques sont dans ce cas, activées par des signaux en provenance des agents pathogènes, et/ou par des cytokines pro-inflammatoires et des chimiokines, conduisant à des réponses Th1 ou Th17. Les cellules dendritiques intestinales préexistantes qui ont été conditionnées n’interviendraient pas. En effet, ces dernières seraient moins efficaces pour engendrer une réponse immunitaire protectrice (Westendorf et al., 2010). Il a été démontré que les cellules dendritiques, dérivées de monocytes conditionnés avec un surnageant de cellules épithéliales, ont des difficultés à sécréter l'IL-12 et à induire des réponses Th1 après une exposition au pathogène Salmonella spp (Rimoldi et al., 2005b). Au contraire, des cellules dendritiques qui rencontrent le pathogène, avant le conditionnement, sont capables d’engendrer des réponses Th1 (Westendorf et al., 2010). C. Production et rôle des IgA Par leur forte densité au niveau de l’intestin, et leur production via de nombreuses voies, les IgA (immunoglobulines A) sont des isotypes d’immunoglobulines spécifiques à l’intestin. Les IgA sont, en effet, les immunoglobulines les plus abondantes des muqueuses chez les mammifères. Elles contribuent à l’immunité spécifique contre l'invasion de micro-organismes pathogènes (Corthésy et al., 2007). Ainsi, l’homme sécrète plusieurs grammes par jour d’IgA dans la lumière intestinale créant également une pression immunitaire importante sur le microbiome luminal (Fagarasan et al., 2010). Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 28 Les cellules présentatrices d’antigènes apportent les antigènes aux lymphocytes B qui sont activés en présence de lymphocytes T CD4+. Les lymphocytes B se différencient alors en plasmocytes sécréteurs d’anticorps (Lotz et al., 2007). De multiples cytokines comme l'IL-4,TGF-β, IL-5, IL-6 et IL-10 sont nécessaires à la production d’immunoglobulines de type A (Corthésy et al., 2007). L'induction d'IgA contre les bactéries commensales se fait grâce à des lymphocytes B T-dépendants (au niveau des plaques de Peyer et des follicules lymphoïdes isolés) et T-indépendants (au niveau des follicules lymphoïdes isolés et de la lamina propria). L'induction d'IgA contre des stimuli nocifs est quant à elle hautement T-help dépendante, ce qui reflète l’utilisation de réponses immunitaires différentes face aux stimuli microbiens nocifs ou inoffensifs (Sanz et De Palma, 2009 ; Fagarasan et al., 2010). Les IgA ont des fonctions essentielles dans le maintien de l’homéostasie intestinale. En effet, chez des individus déficients en IgA, on observe une dérégulation de l'homéostasie intestinale avec une activation continue des cellules du système immunitaire et une induction des processus inflammatoires (Fagarasan et Honjo, 2004). Les IgA permettent notamment : Le maintien de la compartimentation luminale des bactéries intestinales (Duerkop et al., 2009), en effet, les IgA aident à la capture des bactéries dans la couche de mucus ou sont impliqués dans l’élimination des bactéries en facilitant la phagocytose par le mécanisme d’opsonisation. Ce mécanisme permet de maintenir l’homéostasie en limitant les possibilités pour la flore commensale d’activer les cellules immunitaires au niveau de la lamina propria (Coombes et Maloy, 2007 ; Sanz et De Palma, 2009). Une protection contre les bactéries, parasites et virus pathogènes (Suzuki et Fagarasan, 2008). En effet, de façon indirecte, le signal transmis par les bactéries commensales a permis d’induire des anticorps IgA qui vont être importants dans la neutralisation des pathogènes (Sanz et De Palma, 2009). Les bactéries commensales agissent donc comme un stimulus antigénique important dans l'induction de réponses immunitaires locales (Corthésy et al., 2007). Des études ont démontré que des souris sans germes, présentent des niveaux inférieurs de cellules immunitaires et d’immunoglobulines solubles dans les tissus intestinaux par rapport à des souris normales (Lotz et al., 2007). Le contrôle de la composition et de la densité des communautés microbiennes luminales (Duerkop et al., 2009). En effet, l’adaptation des réponses IgA à la flore intestinale permet à l'hôte de réagir aux modifications de composition de la population de bactéries commensales sans susciter de réponses inflammatoires nocives, contribuant ainsi au maintien de l'homéostasie (Corthésy et al., 2007 ; Tsuji et al., 2008). Ainsi, l'échantillonnage continue de faibles quantités d'antigènes qui auront formé des complexes immuns avec les IgA, est essentiel dans l’induction et le maintien de la tolérance vis-à-vis des bactéries intestinales car il va permettre une stimulation immunitaire « de base » dans les conditions normales. La formation de « biofilms bactériens » (assurant ainsi le maintien de l'homéostasie) (Corthésy et al., 2007). Le rôle des biofilms dans les complexes bactéries-bactéries ou dans les interactions bactérieshôtes qui se déroulent dans l'intestin, reste mal exploré mais les biofilms permettraient d'assurer une croissance facilitée du microbiote endogène, les bactéries se liant aux IgA ayant un avantage sélectif. D. Différenciation des lymphocytes et régulation des réponses immunitaires intestinales des cellules T par la flore commensale La tolérance et l'homéostasie de l'intestin sont maintenues par des sous-ensembles de lymphocytes spécialisés (Corthésy et al., 2007). Ainsi un équilibre doit exister entre l’activation des cellules T effectrices (Th1, Th2 et Th17) et cellules B sécrétrices d’IgA, nécessaires pour lutter contre les agents pathogènes d’une part, et l’activation des cellules T régulatrices (Foxp3, Tr1, Th3) nécessaires pour contrôler l'inflammation excessive d’autre part (Sanz et De Palma, 2009). Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 29 1. Rôle de la signalisation TLR dans la balance entre les cellules effectrices et les cellules régulatrices lors de l’immunité adaptative Comme vu précédemment, la signalisation via les récepteurs TLR stimule la maturation des cellules dendritiques qui vont alors pouvoir migrer vers les ganglions lymphoïdes intestinaux, où elles vont présenter les antigènes aux cellules T et aux cellules B naïves (Sanz et De Palma, 2009). La différenciation des cellules T en cellules Th1, Th2, ou cellules T régulatrices est également dépendante du type de TLR activé et de la production de cytokines. La plupart des cellules dendritiques activées par les TLR induisent la différenciation de cellules T CD4+ naïves en cellules Th1, grâce à des niveaux élevés de cytokines IL-12. Mais les cellules dendritiques activées par la signalisation TLR5 ou TLR2, vont induire une différenciation en cellules Th2 ou en cellules T régulatrices en produisant des niveaux élevés de cytokines anti-inflammatoires IL-10 et de faibles niveaux d'IL-2 (Lee et Kim, 2007). Des réponses effectrices différentes sont donc induites selon le type de récepteurs activé (Sanz et De Palma, 2009). De plus et comme vu précédemment, la signalisation TLR est soumise à une régulation négative dans l'intestin (Coombes et Maloy, 2007). Par exemple, la protéine Tollip induite par une exposition de l’épithélium intestinal à des MAMP inhibe la signalisation TLR (Zhang et Ghosh, 2002 ; Otte et al., 2004 ; Melmed et al., 2003). Cette régulation négative est alors nécessaire pour empêcher les cellules dendritiques de produire des cytokines proinflammatoires (Coombes et Maloy, 2007). Ainsi, on évite les réponses effectrices des cellules T vis-à-vis de la flore commensale qui mettraient en péril l’homéostasie intestinale. La signalisation NOD intervient également car lors de mutations des récepteurs NOD2, on observe une inflammation intestinale anormale avec une dérégulation de la libération des cytokines au niveau des cellules dendritiques intestinales, qui conduit à une augmentation des réponses Th1 et une diminution de l'IL-10 (Coombes et Maloy, 2007). La stimulation incontrôlée des cellules dendritiques par une sur-activation de la signalisation PRR augmente de façon anormale les réponses de type Th1, et inhibe les fonctions des lymphocytes T régulateurs soit en diminuant leur activité, soit en rendant les cellules T CD4+ résistantes à la répression (Pasare et Medzhitov, 2003). Cependant, des boucles de rétroaction existent (Coombes et Maloy, 2007). Ainsi, les cytokines telles que l’IL-10 et le TGF-β, vont jouer un rôle dans l'inhibition de la signalisation TLR. Par exemple, l'IL-10 inhibe les réponses pro-inflammatoires MyD88-dépendantes contre la flore commensale. La stimulation directe des cellules T régulatrices par la signalisation TLR existe et peut également intervenir dans l'homéostasie immunitaire intestinale. Les cellules T régulatrices CD4+CD25+ expriment un certain nombre de TLR, dont TLR2, TLR4, TLR5 et TLR8 (Coombes et Maloy, 2007). D’ailleurs, la stimulation de TLR8 ou de TLR2 temporairement, peut inverser leur fonction d’inhibition (Caramalho et al., 2003). Ainsi, lors d’une infection, l’effet suppresseur est mis de côté pour lutter contre le pathogène. Mais une fois celui-ci éliminé, les lymphocytes T régulateurs, qui avaient continuer à proliférer, retrouvent leur fonction suppressive afin de mettre fin à l’inflammation (Coombes et Maloy, 2007). Ainsi, en conclusion, la signalisation TLR doit être inhibée pour que le signal soit maintenu au-dessous d'un certain seuil et n’induise pas de réponses destructrices, ce qui maintient l’homéostasie intestinale (Coombes et Maloy, 2007). L’inhibition des signaux TLR dans l'intestin évite l’activation des réponses inflammatoires, mais lors d’une infection, ces réponses inflammatoires sont importantes pour l’élimination du pathogène, les signaux TLR vont alors activer les lymphocytes T effecteurs tout en continuant à garantir la prolifération des cellules T régulatrices. Ainsi, l’inflammation pourra être mise sous contrôle via les cellules T régulatrices, une fois l'infection terminée. La nature des signaux qui inhibent la signalisation TLR intestinale reste peu connue, mais ces mécanismes sont seulement déployés en présence de bactéries commensales, ce qui implique que les espèces pathogènes ne sont pas en mesure d’induire ces types de mécanismes. Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 30 2. La différenciation des Lymphocytes régulée par les bactéries commensales La différenciation des lymphocytes est influencée par certaines souches de probiotiques et bactéries commensales (Sanz et De Palma, 2009). a) Orientation Th1 vs Th2 par les bactéries Les bactéries commensales (Lactobacillus et Bifidobacterium) induisent la production de cytokines de régulation telle que IL-10 par les cellules dendritiques dérivées des ganglions mésentériques, alors que des bactéries pathogènes telle que Salmonella spp. induisent des cytokines de polarisation Th1 telles que IL-12 et TNF-α. L’expression d’IL-10 et de CD83 ont également été induites par des souches d’espèces B. bifidum, B. longum et B. pseudo-docatenulatum, cela permettant la polarisation de la réponse immunitaire vers un profil Th2 (Sanz et De Palma, 2009). Les souches probiotiques qui comprennent les lactobacilles, les streptocoques et les bifidobactéries, influenceraient donc la maturation des cellules dendritiques et donc l’activation des lymphocytes, ce sont d’ailleurs les souches de bifidobactéries qui ont les effets immunomodulateurs et anti-inflammatoires les plus marqués (Sanz et De Palma, 2009). En effet, elles régulent positivement la production d’IL-10 par les cellules dendritiques, diminuent l'expression des molécules de costimulation CD80 et CD40, et diminuent la production d'IFN-γ par les lymphocytes T. b) Induction de cellules T reg : maintien de l’homéostasie La tolérance périphérique ainsi que la tolérance locale à la flore commensale est notamment possible grâce à une suppression active médiée par les cellules T régulatrices (Kelly et al., 2005). Cependant, la contribution spécifique de chaque espèce de bactéries commensales à la tolérance et la différenciation des cellules T régulatrices reste difficile à expliquer dans le détail. L'induction de cellules T régulatrices (iTreg CD4+CD25+Foxp3+) par certaines bactéries commensales et probiotiques contribue au maintien de l'homéostasie immunitaire et de la tolérance vis-à-vis des antigènes exogènes inoffensifs (Sanz et De Palma, 2009). Ainsi, la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, la prolifération des cellules T et l’expression de molécules de co-stimulation par les cellules dendritiques sont considérablement réduites. La proportion des lymphocytes T CD4+ CD25+ Foxp3+ va d’ailleurs augmenter en présence de bactéries symbiotiques telle que B. infantis (Sanz et De Palma, 2009). Ces cellules T CD4+CD25+ sont responsables de l’activité inhibitrice NFκB (Sanz et De Palma, 2009). Par exemple, chez la souris, des traitements avec des probiotiques tels que Lactobacillus et/ou Bifidobacterium, permettent une réduction de la colite intestinale induite par des agents chimiques, mais également une suppression des réactions allergiques grâce à la sécrétion de TGF-β et à l'activation des lymphocytes T régulateurs (Hand et Belkaid, 2010) . Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 31 CONCLUSION Beaucoup de chercheurs se sont intéressés aux types de récepteurs impliqués dans la reconnaissance des bactéries commensales, ce qui a permis de mieux comprendre les divers mécanismes immunitaires inné et adaptatif au niveau des muqueuses intestinales (Kelly et Conway, 2005). De même, l'identification de facteurs régulateurs des voies de signalisation, apporte des informations sur les mécanismes impliqués dans le maintien d'une faible réactivité vis-à-vis de la flore non pathogène. L'absence de réponses inflammatoires vis-à-vis des bactéries commensales traduit donc une relation complexe entre les bactéries, l’épithélium intestinal et les cellules immunitaires intestinales. Celle-ci conduit à un équilibre qui régule de manière négative les mécanismes inflammatoires (Sansonetti, 2004). Les cellules épithéliales intestinales, les cellules dendritiques et les macrophages ont une activité non inflammatoire à l’état stationnaire et n’initient donc pas de réactions inflammatoires envers des bactéries intestinales non pathogènes (Rescigno et al., 2008). Cependant, ces cellules immunitaires intestinales ne sont pas inactives et les bactéries ne sont pas ignorées. En effet, divers mécanismes innés et adaptatifs sont mis en place comme le conditionnement des cellules dendritiques, la synthèse d’immunoglobulines IgA spécifiques et la différenciation de lymphocytes T régulateurs. L’ensemble de ces réponses assurent le maintien de l’homéostasie intestinale mais la surveillance et la réactivité des cellules effectrices doivent être garanties afin, notamment, de réagir rapidement en cas d’attaque par des bactéries pathogènes (qui vont libérer des facteurs de pathogénicité). Les dérégulations des mécanismes assurant la tolérance envers la flore commensale, provoquent des maladies inflammatoires de l'intestin, telles que la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse (Sansonetti, 2004). Les maladies intestinales qui s’accompagnent d’une perte de la tolérance vis-à-vis des bactéries commensales, peuvent servir à caractériser les mécanismes mis en place suite à l’interaction avec ces bactéries commensales pour garantir la tolérance et maintenir l’homéostasie intestinale (Corthésy et al., 2007). Certaines études abordent donc le rôle potentiel des probiotiques dans l'induction (ou la restauration) des régulations des réponses immunitaires de l'intestin. Ainsi, plusieurs études scientifiques démontrent le rôle majeur de la microflore et de certains probiotiques dans la régulation des réponses immunitaires intestinales en influant sur des mécanismes clés de la réponse immunitaire, par exemple la signalisation dépendante des récepteurs TollLike (TLR) et sur la différenciation des lymphocytes en cellules T régulatrices (Sanz et De Palma, 2009). Ces mécanismes contribuent encore une fois à améliorer les défenses de l'hôte contre les agents nuisibles et à maintenir l'homéostasie intestinale. Certaines souches de probiotiques sont capables d’augmenter les défenses contre les infections aiguës et d’induire une tolérance vis-à-vis d’antigènes inoffensifs de l'environnement. Lors de maladies métaboliques comme l'obésité et le diabète, des altérations dans la composition des communautés bactériennes sont observées. Cela démontre donc l'importance de la flore intestinale dans la santé métabolique de l'hôte (Duerkop et al., 2009). Ces découvertes récentes offrent des possibilités thérapeutiques pour les personnes souffrant d’inflammation chronique (Kelly et Conway, 2005). En effet, cibler et moduler certaines fonctions immunitaires des muqueuses pourrait être possible grâce à l'identification des voies de signalisation activées par les bactéries luminales, et à la compréhension des réponses effectrices qui peuvent, selon la situation, soit activer ou inhiber les réponses immunitaires. Les nouvelles découvertes sur la génomique microbienne mais également sur la génomique humaine vont sans doute permettre des progrès importants. Cependant des études complémentaires sur la compréhension des mécanismes par lesquels des composants spécifiques de la microflore intestinale induisent une tolérance seraient nécessaires (Sanz et De Palma, 2009). Synthèse Bibliographique – Justine Poligné – Version 2 – Mars 2011 32 BIBLIOGRAPHIE Artis D. 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