Cours et TD génétique des procaryotes (L3)

GENETIQUE DES PROCARYOTES
Cours proposés par Dr SAIDI
Niveau L3
Programme National
• - Structure, organisation et réplication du matériel génétique
bactérien :
• - chromosome
• - plasmides
• - bactériophages
• II- Mutations et Réparation de l’ADN
• III- Recombinaison génétique et éléments génétiques mobiles
• - Recombinaison homologue,
• - Recombinaison site spécifique,
• - Eléments génétiques mobiles et applications
• IV- Echanges génétiques entre bactéries. Cartographie, analyse et
constructions génétiques
• - Conjugaison
• - Transformation,
• - Génétique des bactériophages et transduction
• - Restriction et modification contrôlées par l’hôte
Génétique des procaryotes 2015-2016
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V- Expression et régulation de l’information génétique chez les bactéries et bactériophages
V.1. La transcription chez les procaryotes : Définition, l’ARN polymérase, les promoteurs bactériens,
déroulement de la transcription.
V.2. La traduction chez les procaryotes : Initiation, élongation, terminaison
V-3. Régulation de l’expression génétique
V.3.1. Au niveau transcriptionnel
- Notion de force du promoteur
- La reconnaissance du promoteur (rôle des facteurs sigma dans la régulation)
- Disponibilité du promoteur (modèle de variation de phase chez les bactéries)
Régulation par les facteurs de transcription : régulation positive et négative
Modes d’action des différentes classes de répresseurs et d’activateurs
Régulation négative inductible : opéron lactose
Régulation négative répressible : opéron tryptophane
Régulation positive par l’activateur CAP/AMPc, cas de l’opéron lactose
Régulation positive et négative : opéron arabinose
- Régulation par l’atténuation : opéron tryptophane
- Régulation par antiterminaison de la transcription : bactériophage lambda
V.3.2. Au niveau traductionnel
- Initiation de la traduction, atténuation de la traduction, terminaison de la traduction
Mode d’évaluation :
Contrôle continu et Examen semestriel
Génétique des procaryotes 2015-2016
Chapitre I
Structure, organisation et réplication du matériel
génétique bactérien
• Chromosome
• Plasmide
• bactériophage
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Le chromosome bactérien
L’ appareil nucléaire des bactéries (protistes procaryotes,) est constitué
d'acide désoxyribonucléique (ADN) ( support de l'information génétique)
• Le chromosome est une double hélice d'ADN circulaire- pelotonnée,
surenroulée dans le cytoplasme (action des topoisomérases, au nombre de
4 chez les bactéries).
• Déplié, le chromosome bactérien a près de 1 mm de long (1000 fois la
longueur de la bactérie) et 3 à 5 nanomètres de large.
• La réplication est selon le schéma de Watson et Crick, chaque chaîne
assure la réplication de la chaîne complémentaire selon un mode semiconservatif.
• L'analyse chimique du chromosome : 80 % d'ADN, à 10 % d’ARN (rôle de
structuration) et à 10 % de protéines ( ADN polymérases topoisomérases,
ADN gyrases, ARN polymérases)
• Les constituants de l'appareil nucléaire sont la cible d'action de plusieurs
antibiotiques : les quinolones inhibent les topoisomérases et les
rifamycines inhibent les ARN polymérases, tandis que les nitromidazoles
entraînent la fragmentation de l'ADN chez les anaérobies stricts.
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Structure de l’ADN Bactérien
• Structure primaire de
l’ADN
Structure primaire de l’ADN
résulte de la condensation de
nucléotides
monophosphates, par des
liaisons phosphodiésters
entre le carbone 3’ d’un
premier nucléotide et le
résidu phosphorylé porté par
le carbone5’ du nucléotide
suivant
La structure est formée de 2
chaînes de polynucléotides
orientées dans le sens 5’ 3’,
antiparallèles.
Génétique des procaryotes 2015-2016
La structure secondaire
Une Hélice formée de deux chaines hybridées deux à
deux. Caractéristiques
1/ antiparallèles : l’extrémité 5’ d’une chaine est du côté
de l’extrémité 3’ de l’autre chaine.
2/ complémentaires : les nucléotides d’une chaîne sont
complémentaires aux nucléotides de la 2ème chaine.
Les règles de complémentarité universelles : en face la
base A on trouve la base T, en face la base C on trouve la
base G. rapports A/T, C/G constants. Cette
complémentarité est due à la conjonction de deux
phénomènes :
Des contraintes sériques : la complémentarité purinepyrimidine fait que chaque paire de base ayant la même
dimension, la structure d’ADN est très régulière.
La création de liaisons d’hydrogènes: entre les bases
complémentaires., 2 liaisons entre A-T et de 3 entre C-G.
Ce nombre influe sur la stabilité de l’appariement.
Pour rompre l’appariement A-T, il faut une énergie de 21kj,
et 63kj pour rompre C-G.
3/ Chaines hélicoïdales : l’ADN s’enroule autour d’un axe
central imaginaire en formant une double hélice droite
(ADN A, ADNB) . Le pas de l’hélice est de 34Â (10pb), la
distance entre deux bases voisine est de 3.4Â et le
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diamètre de 20Â.
La Réplication
Définition: La réplication est un mécanisme de
synthèse de l’acide désoxyribonucléique
(reproduction exact du génome)
• mode semi-conservatif: l’ADN contient un brin
dérivée de la molécule mère (matrice) et un brin
néosynthétisé (expérience de Meselson et Stahl,
1958)
• sens de la synthèse: 5’ vers 3’.
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La réplication du chromosome bactérien
Le chromonème possède une
origine de réplication (oriC); à ce
niveau se fait la séparation des
deux brins:
Formation de fourches de
réplication (2 fourches qui
progressent dans les deux sens
opposés/ bidirectionnelle).
Les deux fourches fusionnent.
La réplication s’achève au point
(terC).
• Remarque : le chromonème
est un réplicon.
Un réplicon est toute molécule
d’ADN avec une origine de
réplication.
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Eléments impliqués dans la
réplication
1- ADN matrice,
2- désoxyribonucléotides (dATP, dGTP,dCTP, dTTP) ,
3- ions Mg2+
4-Topoisomérases (DnaA): élimine les contraintes de surenroulement
crées par l’hélicase (DnaB).
5 - Hélicase (DnaB) additionné de DnaC: sépare les brins d’ADN
6- SSB (Single Strand Binding) : protéines qui stabilise l’ADN
monocaténaire
7- ADN polymérase III : polymérise les désoxyribonucléotides dans le
sens 5’ 3’ (composé de sous unités α2 ε2 β4 γ δ δ’ χ et ψ)
8- Primase (DnaG) : synthétise les amorces d’ARN nécessaire à la
polymérase
9- ADN ligase : attache les fragments d’Okazaki sur le brin retardé.
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•
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Eléments du
mécanisme
de réplication
chez E.coli
1- Initiation de la
réplication
1)formation de la fourche de réplication :
au niveau d’une origine de réplication (ori
C).
a) oriC: composé de trois régions riche en
A-T (TTATCCACA) et de 4boites DnaA. De 10
à 12 molécule de protéines DnaA se lient
aux boites DnaA et forme le complexe.
Le déroulement se fait dans les deux sens
par ce complexe DnaA (topoisomérases)
(b)Le complexe dissocie la région riche en
A-T et ouvre la double hélice.
2) Séparation des deux brins : par l’action
d’une enzyme (hélicase/ DnaB), maintenus
séparés par des protéines, SSB (single
strand binding)
c) Une fois ouvert, DnaC se lie au DnaB
(hélicase) pour démêler encore ce
domaine.
d) Finalement DnaG primase initie
(commence) la synthèse par polymérisation
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d’un brin d’ARN.
2- Elongation
Après l’initiation, sur un fragment (matrice) de la fourche, l’élongation est continue (brin précose), sur l’autre matrice,
l’élongation est discontinue (fragments d’Okazaki). L’avancée de la réplication illustrée est de droite vers la gauche. Sur
le brin continu la synthèse se fait par DNA Pol III, liée à DnaQ qui fourni la fonction editing. Le domaine C-terminal de
DnaQ se lie à la DNApol III et le domaine N-terminal contient l’activité exonucléasique ( editing function). Le brin
retardé est synthétisé en fragments d’ADN (Okazaki) qui sont liés ensemble par la ligase après avoir enlevé le brin
d’ARN par la DNA Poly I.
Correction des paires de bases dépareillées: editing function
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3-terminaison
La terminaison de la
réplication se fait quand les
deux fourches de réplication
fusionne au point opposé à
OriC, le site (ter C)sous
l’action de la DNA de
terminaison de la réplication
(Dnat).
La séparation des deux
molécules filles d’ADN se fait
grâce à l’action de la DNA
gyrase (topoisomérase II)
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Mécanismes d’action des
topoisomérases
a)
Les topoisomérases
catalysent la conversion
interne des molécules d’ADN
circulaires. Les molécules
d’ADN peuvent être
relâchées ou superenroulées,
nouées ou dénouées,
caténaire ou non, par l’action
des topoisomérases.
b) b) Deux types de
topoisomérases classées en
fonction du nombre de
coupure faite sur l’ADN.
Topo I : une cassure sur une des
deux molécules.
Topo II : cassures faites sur les
deux molécules.
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ADN polymérase I et fragment de
Klenow
• L’enzyme est composé :
D’un petit domaine central avec une activité
exonucléasique orientée de 3'->5' qui constitue
l'activité de correction d'épreuves (édition). C'est
grâce à cette activité que l'enzyme effectue une
réplication fidèle, avec un taux d'erreurs
extrêmement faible.
Le gros domaine C-terminal possède l'activité de
polymérisation, orientée de 5'->3'.
Une protéolyse ménagée par la subtilisine permet
de détacher très spécifiquement le petit domaine
N-terminal.
Les deux autres domaines restent liés et constituent
le "fragment de Klenow" dépourvu d'activité exo 5'>3' (les nombres rouges indiquent les positions des
acides aminés).
Le fragment de Klenow est très largement utilisé au
laboratoire dans les expériences de réplication in
vitro.
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Plasmides naturels
Les plasmides:
éléments génétiques
extrachromosomiques
capables d’une
réplication autonome
(le terme plasmide est donné par
Lederberg, 1952).
A côté du chromosome, la
bactérie peut contenir des
plasmides de petite taille (0,5
à 5 % du chromosome
bactérien ou 5 à 4000 fois plus
petit que le chromosome).
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* Le plasmide peut s’intégrer dans un chromosome
bactérien (épisome).
• détecté lorsque les gènes qu'ils transportent
confèrent à la bactérie de nouvelles propriétés.
• Les plus connus de ces plasmides sont:
- Le facteur sexuel ou facteur F
Le facteur sexuel ou facteur F assure le transfert de
fragments de chromosome bactérien par
conjugaison.
- Les plasmides de résistance aux antibiotiques (ou
facteurs R)
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Classification des plasmides
1. Propriétés de transfert
a) Plasmides conjugatifs
- permettent la conjugaison.
- généralement grands (65Md)
- la réplication est de type strict : sa
réplication est synchronisée avec celle du
chromosome
- En petit nombre (1-3 copies/ cellule)
- Plasmides : R1, R6, EntP 307
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•
-
b) Plasmides non-conjugatifs
ne peuvent pas médier la conjugaison.
généralement petits (4 à 6 Md)
ils leur manquent un ou plusieurs gènes
nécessaires pour le transfert d’ADN.
- Un plasmide non-conjugatif peut être transféré
par conjugaison si la cellule porte aussi un
plasmide conjugatif.
- Le contrôle de la réplication est de type relâché
(en l’absence de protéine cellulaire)
Exemple de Plasmides conjugatifs: ColE1,
RSF1030, cloDF13
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2-Effets phénotypiques
a) Plasmide de fertilité (Facteur F)
b) Plasmides bactériocinogéniques [
gènes de bactériocines ou colicines]
c) Plasmides de résistance (facteurs
R) gènes de résistance aux
antibiotiques, confèrent aux
bactéries la résistance à divers
antibiotiques (RSF1030).
• Les gènes peuvent être organisés
dans le plasmide au sein de
transposons (Tn)
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RTF (Facteur de Résistance
Transfert)- porte les gènes de
transfert.
Déterminant R- porte les
gènes de résistance. Les gènes
de résistance sont souvent des
parties de transposons.
Exemples
Les staphylocoques portent un gène qui code
pour la production d'une pénicillinase qui inactive
la pénicilline G et les pénicillines du groupe A
(ampicilline) ce qui rend la bactérie résistante à
ces pénicillines (idem chez E.coli, gonocoque,...).
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Réplication des plasmides
La synthèse d’ADN plasmidique
se fait à partir de l’origine de
réplication est soit:
-a) unidirectionnelle (a): Pt181
synthétise un brin d’ADN dans
une direction à partir de
l’origine, puis son brin
complémentaire.
b)Bidirectionnelle (b) R1 initie
la synthèse d’un brin et juste
après le second brin.
pT181: Staphylococcus aureus
R1: Salmonella paratyphi
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Structure de l’ADN au niveau de l’origine de réplication des plasmides
• Deux exemples de
structure d’ADN au
niveau de l’origine
(ori):
a) Origine contiennant
une région riche en
A-T et des sites de
liaison de protéine
d’initiation ou RNA.
b) P1 code une
protéine initiatrice
RepA qui se conjugue
avec DnaA au niveau
de l’ADN pour ouvrir
la région A-T et
commencé la
réplication
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Plasmide RSF1010
• code toutes les
protéines
initiatrices
(RepA, RepB et
RepC) et
n’utilise pas les
protéines de
l’hôte pour
commencer sa
réplication.
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Plasmide ColE1
utilise une
molécule
d’ARN pour
ouvrir et
initier la
synthèse
d’ADN.
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Stratégies de répartition du nombre de
copies de plasmide
a) la Répartition
inégale d’un nombre
élevé de copies au
hasard dans les
cellules filles sera
résolu par la
réplication
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Stratégies de répartition du nombre de
copies de plasmide
• b)Certains plasmides à
nombre de copies élevé
contiennent un
mécanisme pour résoudre
les dimères de plasmide
en monomères qui seront
répartit indépendamment
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Stratégies de répartition du nombre de copies de
plasmide
c) système de répartition utilisé pour les plasmides à nombre de
copies faible
d) Chez P1 la région par code pour deux protéines Par A et Par B.
Le complexe ParA-ParB se lie en position cis, au niveau d’un site
appelé site S ceci va dirigé toutes les molécules du plasmide au
milieu de la cellules jusqu’à ce que les cellules filles soient bien
distinctes, ainsi les copies
seront répartit équitablement
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Plasmides incompatibles
• Deux plasmides
sont dits
incompatibles s’ils
portent la même
origine de
réplication et dans
ce cas la cellule fille
finira par n’en
gardé qu’un des
deux.
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LES BACTERIOPHAGES
• Un phage est une particule qui infecte une
bactérie.
• Le phage est composée essentiellement d’un
matériel génétique (ADN ou ARN) protégé par
une enveloppe appelé capside constituée de
protéines.
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Le phage lambda
• Le phage lambda
(λ) est un phage qui
infecte Ecoli
• La tête du phage
renferme l’ADN
viral.
• La queue renferme
des protéines. Elle
permet la fixation
du phage sur la
cellule-hôte
bactérienne
(protéine J).
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• L’ADN du phage est un DNA double brin, linéaire,
de longueur 48.5kb. Plusieurs dizaine de gènes.
Extrémité simple brin de 12 nucléotides,
complémentaires. Extrémités cohésives (bout
collant).
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Les cycles du phage λ
• Le phage se multiplie selon deux modes:
- multiplication lytique
- multiplication lysogénique.
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La multiplication lytique
1- Infection : liaison du phage à E.coli par la protéine J, qui se lie à une
porine à la membrane d’E.coli.
2- Adsorption et pénétration : injection de l’ADN phagique par diffusion
passive à travers la membrane. L’ADN virale se circularise
immédiatement par complémentarité des extrémités cohésives
(séquences cohésives) formant un site cos. Une ligase bactérienne scelle
les brins.
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3- La multiplication du
phage expression des
gènes codants divers
protéines pour la
réplication de l’ADN
phagique, pour la
synthèse des protéines
de la tête et la queue.
Formation d’un
concatémère.
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4-Empaquetage d’une
molécule d’ADN dans la
tête puis assemblage
tête et queue.
5-Libération des phages :
lyse bactérienne par
action de deux protéines
du phage (endolysine et
holine), 200 phages sont
produits par bactérie.
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La multiplication lysogénique
• L’ADN viral s’intègre à l’ADN bactérien par recombinaison
spécifique de site et sera répliqué en même temps que
lui.
• Les gènes qui codent les protéines de la tête et de la
queue ainsi que les gènes du cycle lytique sont réprimés
par un répresseur codé par le gène viral Ci.
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Le bactériophage M13
• Infecte E.coli
• Le matériel génétique du phage:
- un simple brin de DNA circulaire,
- de longueur 6.4kb appelé brin +.
- Il comprend 10 gènes et 2petites
régions « intergéniques ».
- Le DNA est recouvert de
protéines donnant un phage en
forme de batonnêt « filamenteux
».
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La transfection
• La transfection des bactéries par M13 et
l’expression du phage dépendent de la
présence d’un chromosome surnuméraire
bactérien (épisome F’): la présence de cet
épisome permet le cycle normal du phage :
synthèse d’un brin d’ADN complémentaire,
réplication et en fin de cycle synthèse
spécifique d’un seul des deux brins de l’ADN
(brin +) qui sera pourvu d’une membrane et
sécrété hors de la cellule.
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Le cycle lytique du phage M13
divisé en trois étapes :
1- Entrée dans l’hôte: Le phage M13 entre dans la bactérie
via le pilus F codé par un plasmide F (facteur de fertilité).
2- Multiplication: une fois dans le cytoplasme le brin+ est
répliqué en une forme double brin dite « RF » (replicative
form). Après 100 à 200 RF la synthèse de DNA devient
asymétrique. Seul le brin+ est produit.
3- Expulsion : à travers la membrane cytoplasmique (sans
produire de plage mais de petite dépression dans la couche
de milieu solide) les phages M13 sont expulsés revêtu de
protéines. Comme M13 n’est pas enfermé dans une tête
(comme λ), il n’y a pas de stricte limite à la longueur de
DNA expulsé.
Génétique des procaryotes 2015-2016
Cycle lytique du phage M13
Génétique des procaryotes 2015-2016
Cycle lysogénique
• Lorsque l’épisome ne contient pas les gènes
permettant le cycle lytique (épisome F’), l’ADN
du phage s’incorpore sous la forme d’un ADN
double brin capable d’exprimer les gènes qu’il
contient
Génétique des procaryotes 2015-2016
résumé
• Les procaryotes (bactéries) possèdent un matériel nucléaire
appelé le chromonème et des éléments génétiques
extrachrachromosomiques que sont les plasmides. Les
bactéries sont infectées par des bactériophages qui sont
des particules virales constituées d’ADN ou d’ARN protégés
par une enveloppe, la capside. Le chromonème, le
plasmide et le bactériophage, peuvent échanger des
fragments d’ADN par des mécanismes de transfert
attribuant à la bactérie de nouveaux phénotypes
contribuant à la diversité chez les procaryotes. Les
plasmides et les phages sont modifiés par les chercheurs
(géni génétique) et servent de vecteurs de transfert de
matériel génétique.
Génétique des procaryotes 2015-2016
UNIVERSITE DES SCIENCES ET DE LA TECHNOLOGIE MB. FACULTE SNV. DEPARTEMENT GMA
GENETIQUE DES PROCARYOTES
3ème année licence
SAIDI-OUAHRANI Nadjia
2015-2016
Matériel génétique- mutation réparation- transfert-régulation
USTO (MB). FSNV. Département GMA. L3. Matière : Génétique des procaryotes. 2015-2016
Exercice 1 : Que représente la figure ci-dessous ? Donner un maximum d’information.
Exercice 2 : Que peut représenter ce schéma, à condition de le compléter ?
Dr SAIDI
Page 1
USTO (MB). FSNV. Département GMA. L3. Matière : Génétique des procaryotes. 2015-2016
Exercice 3 :
J. Cairns (1963) a prouvé que l’’ADN d’E.coli est circulaire (fermé) et que le mode de réplication est semi
conservatif en utilisant la thymidine tritiée.
R Rodriguez a utilisé la méthode de Cairns et observa que la réplication est bidirectionnelle. Les bactéries
sont placées pendant un temps variable dans un milieu contenant de la thymidine tritiée à faible niveau de
radioactivité puis à fort niveau de radioactivité.
D’après vos connaissances, actuelles schématiser les chromosomes observés par les deux chercheurs.
Exercice 4 :Expérience de Meselson et Stahl (1958)
Des bactéries E.coli sont cultivées dans un milieu de culture contenant l’isotope lourd de
l’azote (N15). Après un grand nombre de division tout l’ADN de ces cellules est marqué par
l’isotope lourd. Les bactéries sont ensuite transférées dans un milieu normal à N14. Des
échantillons bactériens sont prélevés toutes les demi-heures. L’ADN des bactéries est extrait
des cellules et dissout dans une solution de chlorure de césium (CsCl) puis introduit dans une
centrifugeuse. Lorsque le CsCl est centrifugé à très haute vitesse (50000 rpm) pendant
plusieurs heures, les ions césium et chlorure migrent vers le font du tube sous l’effet de la
force centrifuge. Un gradient d’ions s’établit avec une concentration plus élevée dans le fond.
Les molécules d’ADN sont également poussées vers le fond mais les repoussent vers le haut
en raison de leur densité de flottaison. Le trajet de l’ADN s’arrête à l’endroit du gradient ou la
force centrifuge compense exactement la densité de flottaison qui dépend elle-même de sa
densité. L’isotope lourd augmente la densité de l’ADN. L’ADN normal peut être donc
distingué aisément de l’ADN marqué N15 grâce aux positions qu’ils occupent dans le gradient
de chlorure de césium. Les résultats expérimentaux sont schématisés dans la figure suivante.
Dr SAIDI
Page 2
USTO (MB). FSNV. Département GMA. L3. Matière : Génétique des procaryotes. 2015-2016
Analyser et interpréter les
résultats, que pouvez-vous
déduire ?
G : Génération
EXERCICE 5: compléter la légende du schéma suivant et que représente-il ?
Dr SAIDI
Page 3
USTO (MB). FSNV. Département GMA. L3. Matière : Génétique des procaryotes. 2015-2016
Exercice 6
La figure ci-dessous représente un mécanisme ayant lieu in vivo ou in vitro. De quel
mécanisme s’agit-il ? Compléter la légende en citant les éléments indispensables intervenant
dans ce mécanisme.
Exercice 7
Certaines souches bactériennes ont développé une résistance à un antibiotique (gentamycine).
Quel est le mécanisme classiquement évoqué pour expliquer cette résistance ? Un tel
mécanisme est-il envisageable dans le cas ou la résistance est très rapidement acquise d’une
part et d’autre part elle s’accompagne de résistance à trois autres types d’agent antibactériens
(le chloramphénicol, l’ampicilline et la sulfamide) ?
Exercice 8
Analyser les propriétés de certains plasmides résumés dans le tableau suivant. Que pouvezvous déduire ?
Dr SAIDI
Page 4
USTO (MB). FSNV. Département GMA. L3. Matière : Génétique des procaryotes. 2015-2016
plasmide
Taille
Intervient dans
Nombre de
(mégadaltons)
la conjugaison
copies de
ou non
plasmides
Phénotypes
/cellule
R1
65
+
1-3
Résistance à de
multiples drogues
R6
65
+
1-3
Résistance à de
multiples drogues
Ent P 307
65
+
1-3
Production
d’entérotoxines
Col E 1
4.2
-
10-15
Production de colicine
E1
RSF 1030
5.6
-
20-40
Résistance à
l’ampicilline
Clo DF 13
6
-
10
Production de
cloacine
Exercice 9 : Dans quel état topologique est chaque plasmide schématisé ci –dessous ? a quelle
bande, sur le gel d’agarose, correspondre chaque état ?
Dr SAIDI
Page 5
USTO (MB). FSNV. Département GMA. L3. Matière : Génétique des procaryotes. 2015-2016
Exercice 10 : donner la légende de la figure suivante montrant une représentation schématique
des deux cycles possibles de λ dans E.coli.
Dr SAIDI
Page 6