Cytométrie en flux et microbiologie: intérêts, limites, domaines d

Cytométrie en flux et microbiologie:
intérêts, limites, domaines
d’applications
Marielle BOUIX
AgroParisTech-INRA
Journée thématique Microbiologie et Cytométrie - IPP 23 mars 2015
Les attentes en microbiologie
- Combien ?
- Viable ?
-Quel état cellulaire ?
transcriptomique
protéomique
(puces & qPCR)
(2-DE)
- Quelles fonctionnalités ?
- Qui ?
- Rapidité
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Caractéristiques de la CMF
- Cellule par cellule
- Quantitative
-Multiparamétrique:
- taille, structure,
couleurs de fluorescence
- Rapidité
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Microbiologie
Cytométrie en flux
Microbiologie et CMF devaient se rencontrer !
- Cellule par cellule
- Combien ?
- Quantitative
- Viable ?
- Etat cellulaire
et fonctionnalités?
- Qui ?
- Rapidité
Marqueurs de
fonctionnalités
-Multiparamétrique
(fluorescences)
Anticorps
Sondes
nucléiques
- Rapidité
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Limitations du développement
- Taille des cellules microbiennes: 1 à 5-10 microns
- Les milieux de culture contiennent souvent des particules
=> bruit de fond proche des cellules
- Non adaptation des marqueurs pour Procaryotes
-> Disponibilité limitée d’Ac monoclonaux
- Diversité des formes microbiennes (cellules isolées,
chainettes, bourgeon, ….)
- Coût des appareils pour les laboratoires de microbiologie
(/Boite de pétri)
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Raisons du développement actuel
- Augmentation de la sensibilité des cytomètres
- Diminution des prix des cytomètres
- En industrie, augmentation de la taille des unités de
production, changement des mentalités
- Plus grande disponibilité de marqueurs pour Procaryotes
quels paramètres cellulaires?
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Cibles de marquage d’un microorganisme
Activité enzymatique
= Viabilité
ADN
Cycle
cellulaire
ARN
ribosomique
f(espèce)
Intégrité membranaire
= Viabilité
Fluidité membranaire
=f(état physiologique)
Antigènes pariétaux
f(espèce)
ATP
Potentiel de membrane
= f(état physiologique)
pH intracellulaire
=f(état physiologique)
ROS
Stress oxydatif
Auto
fluorescence
f(espèce)
Charge
énergétique
=f(vitalité)
=f(état physiologique)
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Intérêts de la cytométrie en flux
- Numération directe des microorganismes
- Délai de réponse court (quelques minutes)
- Possibilité d’évaluer plusieurs paramètres cellulaires,
simultanément
- Possibilité de détection de microorganismes viables non
cultivables et morts
- Possibilité d’analyser des populations en mélanges
- Possibilité de caractériser des fonctions cellulaires
- Possibilité de quantifier des gènes reporter
- -…….
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Domaines d’applications
- Génomique: détection de gènes
- Contrôle qualité: Détection de contaminants (aliments,
cosmétiques, urine…)
- Recherche: étude des effets des anti-microbiens:
antibiotiques, biocides,
- Caractérisation d’espèces dans un écosystème
- Biotechnologie blanche: Etude des fonctionnalités cellulaires
des microorganismes d’intérêts
- Hygiène des réseaux d’eau sanitaire
- Qualité de l’eau au cours de la potabilisation
- Environnement: eaux douces, marines, eaux usées….
- ……..
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CONCLUSION
L’utilisation de la cytométrie en flux en microbiologie =
gros progrès depuis qq. années avec:
- la simplification des machines (utilisation et coût)
- la disponibilité des marqueurs
- un enrichissement croisé entre les domaines
d’utilisation
=> Méthode performante
MAIS:
-Attention à la signification des marqueurs
-Attention à la préparation des échantillons
-Le microbiologiste (et le microscope) sont indispensables
pour les interprétations
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