– UE VII : –

2016-2017
Génétique bactérienne
Nom du cours
– UE VII : –
Généralités, mutations, échanges horizontaux (suite)
Pas d'annexe
Semaine : 12 (du 21/11/16 au
25/11/16)
Date : 22/11/2016
Heure : de 8h00 à
10h00
Binôme : n°26
Correcteur : n° 44
Remarques du professeur : Pas de remarques
PLAN DU COURS
I)
Conjugaison
A)
Expérience de Lederberg et Tatum
B)
Expérience de Dauris
C)
Sélection par antibiotiques
D)
Plasmide conjugatif
1)
Système classique F+/F-
2)
Système haute fréquence HFR
3)
Système d'erreur
4)
Résumé
E)
Plasmide non conjugatif
1)
Les phages
2)
Transduction généralisée
3)
Transduction restreinte
II)
Transformation
A)
Expérience de Griffith
B)
Conditions
C)
Fréquences
III)
Professeur : Pr. Romond
Transposition
A)
Séquences d'insertion
B)
Transposons complexes
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2016-2017
C)
Génétique bactérienne
Introns du groupe II
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2016-2017
I)
A)
Génétique bactérienne
Conjugaison
Expérience de Lederberg et Tatum
Nous allons envisager le mode de détermination qui ont permis aux premiers chercheurs de détecter un
transfert génétique différent de ce qu'ils connaissaient déjà, c'est à dire les mutations.
Il s'agit de l'expérience de Lederberg et Tatum, ces chercheurs ont sélectionné (et non induit) des mutants
auxotrophes (dépendance à des systèmes complexes pour trouver leur C et leur N), ils étaient de l'espèce
Escherichia Coli.
Ce qui caractérise une souche auxotrophe, c'est que sur un milieu minimum, dans lequel on apporte que
de l'azote (ammonium) et du carbone (carbonate), E. Coli sera incapable de se développer.
Ils ont séparé des sous classes, qu'on va appeler des clones d'E. Coli, qui en plus vont avoir des
spécificités particulières :
→ Un mutant A a des exigences par rapport à la biotine, à la méthionine (Bio Met -) : il faut apporter
dans le milieu Bio et Met sinon pas de croissance bactérienne, par contre ils sont Thréonine et leucine
indépendant (Thr Leu +) : en absence de Thr et Leu, ils trouveront les moyens nécessaires pour
synthétiser ces AA.
→ Un mutant B indépendant de la biotine et de la méthionine (Bio Met +) mais dépendant de la
thréonine et de la leucine (Thr Leu -).
Ils possède donc des bactéries qui sont dépendante de sources de carbone et d'azote complexe et ont un
niveau de sélections complexe : cherche a avoir une double dépendance
En terme de mutation, la fréquence est rare = 1/10^8, ce qui veut dire que lorsqu'on a besoin de bactéries
indépendantes de biotine et méthionine pour le mutant A ou de thréonine et leucine pour le mutant B, il
faut une double mutation car il faut 2 caractères qui vont muter.
Donc comme c'est indépendant, la fréquence est la même, 1/10^8 et on va atteindre pour les fréquences
les plus favorables 1/10^16 pour obtenir un mutant qui aurait une double mutation et donc population
gigantesque.
Lederberg et Tatum vont vérifier la probabilité de la double mutation réversible : ils vont prendre un
milieu minimum, sans Bio, sans Met, sans Thr, sans Leu.
Ils essayent en mettant une forte charge bactérienne,10^8 du mutant A, ils ensemencent sur leur milieu
minimum et ils vont vérifier si il y a une croissance. Au bout d'un certain temps d'incubation (24h),
à 37 °C, 0 colonies.
Ils reprennent le mutant B et refont la même expérience avec 10^8 ufc de mutant B, toujours le milieu
minimum, même résultat : 0 colonies
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Génétique bactérienne
Ensuite ils vont faire un complément d'expérience, ils vont mettre 10^8 de A et 10^8 de B dans un même
tube. Après 24 à 48h d'incubation, ils vont ensemencer 10^8 de A+B sur leur fameux milieu minimum.
Et la surprise, on a des colonies.
On a mit la même quantité de A et de B, au total ça fait 10^8, si on revient à la même quantité, ça veut
dire qu'on est à 5*10^7 dans les 2 cas, ce qui veut dire que la fréquence est en dessous de la fréquence
même d'une mutation unique et on a quand même une culture. Ca veut bien dire qu'on a des bactéries qui
ont acquis la capacité soit d'être soit Biotine + Met +, soit Thr+ Leu +.
Soit A devient A+B, soit B devient A+B
C'est incohérent par rapport à la fréquence, on a mit un tout petit peu moins de bactérie A, un tout petit
peu moins de bactéries B, donc c'est encore plus improbable mais cela existe quand même.
La mutation est un phénomène indépendant, donc il n'est pas possible d'avoir une double mutation , c'est
un autre phénomène.
De ce fait, on va calculer la fréquence du nombre de colonies, on répète plusieurs fois les expériences, on
calcule le nombre de colonies que l'on a par rapport au nombre de colonies déposées : on remarque que la
fréquence du phénomène est beaucoup plus élevée, elle est de 1/10^6. Mais pas possible, c'est irréalisable
en terme de mutation, la fréquence n'est pas cohérente avec 1/ 1million.
Dans 10 mL, on est à 10^9 bactéries, au bout de 18h ; La ça veut dire qu'on va avoir 10^3 possibilités de
colonies sur 1 milliard de bactéries.
Il doit y avoir des échange de message génétique.
B)
Expérience de Dauris
Avant même d'envisager le sens, la première question c'est est-ce qu'il y a
besoin d'un contact ?
Un deuxième chercheur Dauris, complexifie l'affaire avec un tube en U qui
sépare la population A de la population B.
Les bactéries ne peuvent pas passer, le filtre est suffisant pour bloquer les
tailles bactériennes (1 micromètre de diamètre), donc seuls les métabolites peuvent passer
Il met 10^8 de A, 10^8 de B, il refait l'expérience de Tatum : il incube pour avoir un temps total qui
permet les échanges et il va ensemencer 10^8 A+B.
Il incube et le lendemain, 0 colonies.
Conclusion : si pas de contact étroit entre deux bactéries, rien ne se passe.
2ème notion : il y a nécessité de contact (la 1è = la fréquence)
C)
Sélection par antibiotiques
3ème notion : est-ce qu'il y a un sens ?
Si je prends des mutants qui résistent aux antibiotiques, on pourra peut être connaître le sens :
donc sélection de mutants qui vont être sensibles à un antibiotique (utilise surtout la streptomycine)
je vais donc avoir mon A ( Bio- Met- / Thr+ Leu+ ) avec une sous classe résistante à la streptomycine et
une sous classe sensible. En B même chose ( Bio+ Met+ / Thr- Leu- ), je prend des mutants résistants et
des mutants sensibles.
On croise As et Bs, Ar et Bs, Ar et Br, Ar et Br, on croise ces différentes population et on regarde ce qui
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Génétique bactérienne
cultive en ayant un milieu minimum et un sélecteur qu'est la streptomycine (double sélection). Résultat :
As x Bs : pas de recombinant
As x Br : recombinant
Ar x Bs : pas de recombinaison
Ar x Br : recombinant
Que nous dit cette expérience ?
Ca nous confirme que ce n'est pas une mutation, car on a des chiffres trop bas pour sélectionner une
double mutation.
On a des solutions qui passent dans les deux sens, c'est a dire que :
Br était réceptif et a récupéré les gènes d'As (Thr+ Leu+)
et Br pour cultiver sur un milieu minimum il lui faut l'ensemble. Et comme c'est lui qui va être résistant à
la streptomycine, à ce moment la on peut voir les recombinants.
Si on avait l'inverse c'est à dire Bs envoyait les gènes vers Ar, j'obtenais une acquisition Biotine + Met +,
et comme j'avais Ar qui était résistant, on aurait pu voir un recombinant or ici on n'a qu'un des deux qui
va donner un transfert de gène avec acquisition de ces nouveaux gènes.
Il y a bien un sens, un système de transfert dirigé.
La conjugaison, c'est donc une fréquence qui augmente par rapport à la mutation, qui correspond à un
contact étroit entre 2 bactéries et un transfert dirigé d'ADN.
Il fallait trouver la présence de quelque chose de transférable, et quand on a fait l'extraction de l'ADN et
qu'on a fait un isolement de l'ADN de la bactérie (B), on s'est aperçu que contrairement à A on avait en
chlorure de césium après extraction et séparation, 2 structures d'ADN qui avaient migré plus ou moin,
alors que quand on compare à la bactérie qui ne transfère pas il n'y a que 1 chromosome et donc nous
avons retrouvé le plasmide.
La conjugaison entre bactéries consiste en un transfert partiel, à sens unique du matériel génétique d'une
bactérie donneuse vers une bactérie réceptrice .
On avait défini à partir du moment ou on a au sein d'une espèce une partie des bactéries qui ont acquis un
élément supérieur, on peut parler de sexualité chez les bactéries. On a des plasmides conjugatifs qui vont
être porteurs des mêmes éléments, qui vont leur permettre le transfert.
Voyons ce que nous a donné ce facteur IF en terme de conjugaison, ce qui en est ressorti.
Ce système de conjugaison a posé d'énormes soucis, ça explique en partie les politiques actuelles de
maîtrise des antibiotiques. On avait déjà compris avec les mutations qu'il faut aller très vite pour avoir
des petites populations et ne pas sélectionner des mutants. Il faut adapter la prise d'antibiothérapie à la
nécessité réelle. L'abus d'utilisation des antibiotiques a été une catastrophe à cause de ces éléments qu'on
va pouvoir faire transférer d'une bactérie à une autre.
D)
1)
Plasmide conjugatif
Système classique F+/F-
1 Système classique
Voyons d'abord le système classique F+/F- :
Si je prend l'exemple F+ vers F- , j'ai ma bactérie F+ caractérisée par la présence du chromosome et en
plus la présence de ce fameux plasmide.
1ère chose qu 'on voit apparaître au cour du temps, c'est l'émission d'une forme de pili, il faut un système
qui par rapport à la bactérie F- qui n'a pas de chromosome qui puisse créer un contact.
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Le pont est réalisé entre les deux bactéries. Le chromosome ne va pas bouger.
Sur le plasmide, il y a une origine de réplication différenciée et on a une réplication du plasmide en
même temps que la réplication du chromosome. Donc dans un système réplicatif, on n'a pas besoin de
mobiliser le chromosome.
Que fait le plasmide ?
2 systèmes possibles de réplication :
–
le système directionnel qui sert surtout pour la réplication des chromosomes
–
le cercle roulant (pas tapis roulant attention) : un des brins va s'ouvrir, cela tourne et pousse, on
va avoir une réplication, dès qu'on rentre dans la 2è bactérie, il y a réplication.
On à le transfert en même temps qu'on réplique, on réplique dans les deux corps microbiens
Une fois qu'on a fini l'ensemble, il va y avoir séparation, ça nous donne la bactérie F+ qui a toujours son
chromosome et comme on a répliqué avec le plasmide, on a une deuxième bactérie F+ , la population
devient de plus en plus porteuse de gène quelconque, ici le plasmide F.
Donc on se retrouve avec deux bactéries F+
On s'est aperçu que c'était plus compliqué qu'on l'avait pensé.
Dans certains cas, le fameux plasmide ne va pas rester extra-chromosomique, il va passer de forme
épisomique. Et on aura à ce moment la le système dit HFR (haute fréquence) qui va correspondre à un
système intéressant pour la population bactérienne, d'échange de gènes .
2)
Système haute fréquence HFR
Ici, la bactérie va faire une forme épisomique avec à la fois son chromosome et dessus une partie
plasmidique.
On a une bactérie F- qui n'a pas de plasmide et n'a rien dans son chromosome.
Il va venir se créer un pili, sauf que l'origine de réplication, au niveau du plasmide ne correspond pas aux
zones d'insertion. L'ouverture va bien se faire en cercle roulant on va avoir un morceau bleu qui va être
poussé par le morceau noir, puis on va dérouler tout le chromosome jusqu'au moment ou on va se
retrouver avec le reste du plasmide. Il faut transférer un deuxième chromosome.
On va se retrouver avec 2000 bases alors que les mégaplasmides c'est max le centième du nombre de
paires de bases nécessaires pour faire un chromosome.
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Donc pour faire passer tout le plasmide il faut d'abord faire passer tout le chromosome.
On a beau avoir superenroulé le chromosome c'est pas tout à fait efficace.
C'est improbable car il faut que les bactéries restent en contact pendant un temps incroyable. C'est là ou
la nature est fort surprenante, c'est possible car on a assez peu de bactéries qui cultivent dans un milieu,
très souvent elles vont adhérer sur une surface et donc on va avoir les bactéries les unes sur les autres et
donc elles ont quand même la possibilité d'être en contact.
Sur des surfaces qui ne sont pas régulièrement nettoyées, il faut combattre les mioffines pour éviter les
transferts de gène, on transfère tous les gènes antibiorésistants et on augmente la population porteuse des
gènes de résistance.
Donc on ne va pas obtenir de bactérie F+ à la fin et que c'est peu probable d'avoir un temps de contact
important, et donc la fréquence de transfert est faible, mais il y a une haute fréquence de recombinaison
génétique.
On reste avec HFR on aura F-' si ça se passe bien, on aura un reste qui ne sera pas du tout passé parce
que ça s'est arrêté, on aura un morceau du plasmide avec la zone d'insertion, on aura le complément du
chromosome, on a gardé le plasmide car on est double brin, donc quand on a inséré, on a recréé
l'ensemble du message plasmidique.
Donc ici on a bien le complément qu'on avait du morceau de plasmide, on est toujours HFR, on a
toujours l'ensemble du message qui va servir pour refaire éventuellement un transfert.
Donc ça nous fait une chromosome entier dans lequel on a bien un plasmide entier.
De l'autre côté, on a vu qu'il y avait un morceau bleu qui est passé, on avait commencé à le répliquer et
on a un morceau qui vient directement du chromosome et qui est +/- long et qui va porter des gènes qu'on
va appeler A.
Si on a une zone d'insertion parce qu'on va porter un gène, qui correspond à peu près à A, on pourra avoir
éventuellement une recombinaison lorsque le chromosome de la bactérie F- va commencer à rentrer en
réplication.
On peut effectivement avoir un transfert de gène via les chromosomes, ce qui manque c'est le point de
réplication du plasmide, on n'a pas acquis le plasmide complet donc en général on est défectif en matière
de conjugaison et on a acquis de nouveaux gènes mais on est toujours F- .
3)
Système d'erreur
Au moment où on passe de HFR (haute fréquence) et réverser vers F+, si le plasmide peut rentrer dans le
chromosome , il peut aussi en être excisé et c'est à ce moment là qu'il va y avoir les erreurs d'excision
ce qui va donner la possibilité de conserver un système conjugatif, c'est pas parce que on perd quelques
bases que pour autant il devient inefficace, mais surtout ce qui se passe c'est que dans le chromosome qui
était HFR, on peut conserver directement dans le chromosome une partie de ce qui constituait le génome
du plasmide. On va se retrouver avec des systèmes F' .
Si on est devant le chromosome et qu'on a le plasmide, au moment de l'excision on remarque que on peut
se tromper, en gardant une petite partie du plasmide, ou avec une zone de coupure qui emporte sur le
plasmide un peu de chromosome, donc on a plusieurs possibilités épisomiques.
Ce système donne un F' qui pourra entraîner une partie du chromosome et qui va renvoyer de nouveaux
messages bactériens, sans passer par le taux d'échecs qu'on avait au départ.
Il y a une gradation de transfert potentiel, quand on était sur F+, F-, on allait très vite, le plasmide est
petit donc on peut le transférer très rapidement, et s'il n'a pas acquis le gène particulier il n'a que le
message lié au plasmide.
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On a des plasmides critiques donc tout petits (2-3 kilobases), la il y a très peu de message, à ce moment
la on a des diffusions de plasmide mais on ne va pas plus loin. Sauf que ça passe par le système
épisomique et donc on a des excisions, donc on a des plasmides qui vont grossir en prenant des gènes en
plus, ils vont pouvoir transférer, repasser dans des systèmes d'insertion, rentrer dans le chromosome et au
moment d'une autre excision laisser le gène qu'ils ont transféré à la bactérie.c'est comme ça qu'on a des
systèmes évolutifs, adaptatifs, et on voit que comme la fréquence est beaucoup plus élevé, que c'est un
système très puissant pour qu'une population bactérienne puisse résister aux pressions
environnementales.
Donc on est bien dans des éléments transféré et non pas dans des adaptation purement physiologique.
4)
Résumé
En résumé, nous avons un transfert de gènes, lorsqu'une paroi du système F+ F- extra chromosomique,
on va avoir une réplication par mécanisme de cercle roulant, une copie seulement qui se dirige vers la
cellule receveuse et on va avoir une réplication de cette chaîne integré, donc on a bien in fine 2
plasmides dans les bactéries donc 2 F+ .
C'est une fréquence de recombinaison qui est faible car on transfert peu de gènes de la bactérie F+ vers
F- mais le système se faisant de façon très rapide (1h), on a une transmission du facteur à haute
fréquence, donc une très bonne conjugaison mais une très mauvaise recombinaison .
Ensuite on a le système HFR :
Ici on a la nécessité d'avoir des séquences d'insertion homologues, tous les plasmides ne seront pas
capables de transférer avec la même fréquence dans un chromosome puisqu'il faut avoir un système
d'insertion.
Et ensuite ce qui est important de retenir c'est qu'on a toujours l'opéron tra qui va permettre la synthèse
du pili , on va conserver la capacité d'effectuer la réplication par cercle roulant, dans le chromosome
normalement bidirectionnel sauf dans la zone du plasmide, donc il faut ouvrir simplement un monobrin à
cet endroit là. On va faire le transfert avec le système donc on n'a pas perdu la capacité de la 2ème
bactérie à débuter la réplication donc on réplique dans la bactérie HFR et on réplique dans la bactérie
receveuse.
Il nous faut un temps important pour transférer, on a une rupture du contact et on a seulement une partie
qui est transférée : transmission incomplète, transfert inefficace.
On a depuis 20 ans sélectionné toute une série de plasmides, on s'est aperçu que ces plasmides avaient
une certaine variabilité.
On a en fait 2 types de plasmide :
–
les plasmides conjugués qu'on vient d'analyser (deux formes épisomiques)
–
les plasmides non conjugatifs qui sont dits mobilisables
E)
Plasmide non conjugatif
Pourquoi ne sont-ils pas conjugatifs ?
A force d'être transférés, il peut y avoir de la perte d'information indispensable et on va retrouver une
absence de codes pour le contact spécifique c'est à dire la synthèse de pili.
Par contre le code pour l'ensemble de ce qui est nécessaire c'est à dire l'ouverture du cercle roulant,
l'insertion etc, continue d'être présent dans le plasmide donc ils ont la possibilité de s'ouvrir et transférés
à condition qu'il soient en présence d'un système conjugatif donc un deuxième plasmide qui sera à
l'origine de la synthèse.
Ce système non conjugatif représente un nombre important de plasmides qui sont en général de petits
plasmides.
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Génétique bactérienne
Ce système va s'agrandir avec d'autres formes de transfert mais le principe de base c'est qu'il faut un
contact.
Cette approche a été possible grâce au fait qu'on a commencé a avoir quelques soucis en production, on a
découvert qu'on avait parfois des bactéries qui se lysaient automatiquement.
On a découvert qu'on avait des virus capables d'infecter les bactéries.
1)
Les phages
Donc on a un phénomène de transfert, la transduction qui va s'appuyer sur des virus des bactéries appelés
des phages.
On estime qu'avec la résistance aux antibiotiques, si on utilisait des phages, on pourrait tuer des bactéries
(lyse bactérienne) et contrôler les infections. Certaines populations utilisent ce système car la spécificité
de ces virus est dédiée aux procaryotes : c'est un système de reconnaissance de la paroi, pas de paroi
chez les eucaryotes.
La définition d'un virus est double :
→ définition structurelle : virus à ADN constitués de l'ADN entouré d'une structure protéique appelée
capside.
→ défintion en terme structure : double brin d'ADN + capside protéique( important pour classification
)
Les phages ont une structure mixte avec une première structure dite icosahydrique suivie d'un système
tubulaire et les zones de reconnaissance.
Ces phages bactériens on en connaît 2 types :
–
on a les classico lytiques : ils infectent les cellules, (définition fonctionnelle), il n'y a pas de
possibilité de réplication et on à infection de la cellule hôte donc c'est un parasite.
Notre phage parasite obligatoire, une fois qu'il a réussi a faire le cycle viral (réplication de l'ADN,
constitution du capside) , il y a 2 solutions :
En règle générale, ce qui est transféré c'est les phage lytiques : au moment ou il va bourgeonner il va
induire la mort de la bactérie par lyse, pour se libérer il va être capable uniquement d'optimiser la lyse de
la paroi et donc on a une lyse bactérienne (la bactérie ne résiste plus au conditions environnementales)
–
on a un 2ème cycle, le cycle lysogénique
c'est beaucoup plus simple : le virus rentre dans une nouvelle cellule, celle qui n'a jamais vu de phage,
capable de réceptionner le virus par un système de reconnaissance de récepteur, car sur le phage on a des
codes particuliers qui vont permettre d’atterrir sur la paroi. A ce moment la, il y a injection de l'ADN. Si
je suis dans le cycle lysogénique, cet ADN va trouver une zone d'insertion et on peut avoir un prophage
= phage présent dans le chromosome. Si tout se passe bien on continue de multiplier le virus, ça tourne
jusqu'au moment ou ici j'ai un stress (choc thermique, stress acide etc) et la, on a l'ADN viral qui est
libéré et on rentre dans le cycle lytique. On a en fait des capsides qui sont formées, on une phase lyse :
on a libération de l'ADN viral, d'abord prise de contrôle de par le virus qui va dégrader l'ADN
chromosomique, produire l'ADN viral, encapsider et à ce moment là on a une lyse.
La bactérie va disparaître au profit de virions.
Les virions libérés vont repartir dans leur cycle, retrouver une bactérie et recommencer.
Le phénomène reprend la même approche. Possible de passer plusieurs génération en cycle lysogénique.
Comment peut-on expliquer qu'il y ait pour la bactérie un échange de gènes ?
2 systèmes :
–
transduction généralisée
–
transduction restreinte
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2)
Génétique bactérienne
Transduction généralisée
Au moment ou on a transduction possible qui serait généralisée : ça se produit soit quand on rentre
directement, soit quand le cycle lytique se met en place juste après cycle lysogénique.
Le problème de la transduction généralisée, c'est qu'il peut y avoir des erreur d'encapsidation, on peut
avoir un morceau de chromosome bactérien qui rentre par erreur dans une capside, auquel cas on se
retrouve non plus avec un système viral classique mais un système mixte avec des compétences de la
capside pour reconnaître de nouvelles bactéries, mais on a plus de système infection a l'intérieur qui
prend le contrôle de la bactérie.
Par contre on a de l'ADN qui peut être injecté dans la nouvelle bactérie donc au lieu d'avoir de l'ADN
viral, on a de l'ADN bactérien. On a une erreur d'encapsidation.
En général on n'a que une fraction du génome : 1 à2% du génome.
Au niveau de l'efficacité du système :
On peut avoir l'ADN bactérien qui peut être ajouté dans la nouvelle bactérie.
On a plusieurs possibilités :
–
on n'a pas de système d'insertion, lyse : pas très efficace, système abortif.
–
on a ce qui est nécessaire à la séquence d'insertion (hasard), on a un transfert stable de gènes, on a
une séquence d'insertion, et on peut acquérir des gènes
3)
Transduction restreinte
Transduction restreinte : dépendant du système lysogénique
On part du système prophage : on a inséré de l'ADN viral dans l'ADN bactérien puis à un moment il y a
un stress et on repart au système lytique, c'est à dire de l'excision de phage à partir du chromosome : la il
peut y avoir une erreur, l'excision est erronée et on a un virus qui a acquis un morceau de gène qui vient
du chromosome. Le reste du chromosome disparaît. Seul le morceau protégé car inclus dans l'ADN viral
va pouvoir être emporté dans les capsides.On se retrouve donc avec des virions composés d'ADN viral et
chromosomique.
Dans la nouvelle bactérie, celle qui réceptionne le prophage bactérien, on a plusieurs possibilités :
–
soit on a une zone d'insertion complète :
on peut repartir dans un système lysogénique et on va avoir l'acquisition d'un gène et le prophage en
amont. Ce gène va pouvoir s'exprimer pendant plusieurs générations.
–
soit on a un système de recombinaison :
normalement on a une zone classique d'insertion avec une zone homologue avec l'ADN phagique donc
on a des échanges entre les 2 systèmes : ce système peut être efficace pour transférer de l'ADN sans
intégrer complètement le prophage.
Le phage du gène doit être temporairement incapable d'entrer en phase lytique.
II)
A)
Transformation
Expérience de Griffith
Le monde bactérien échange des gènes par d'autres méthodes :
Ce dernier système est appelé la transformation. Ce système c'est Griffith qui l'a décrit. (ne correspond
ni au système de transduction ou conjugaison)
Il prend une source de streptococcus pneumoniae, et la question est de savoir comment ce pathogène
peut induire une pathologie.
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Génétique bactérienne
Il va vérifier que les souches venant de différents patients ont les mêmes types de colonies.
Il découvre qu'on a 2 types de souches :
–
souches L qui induisent la mort des souris quand elles leur sont injectées
–
souches R qui n'induisent pas la mort des souris
Il tue les souches L par la chaleur : les souris survivent.
Il fait un système conjugatif et prend la souche L tuée avec la souche R: on aura mort des souris alors que
si c'était une conjugaison classique, c'était pas possible. La souche R a en faite acquis le facteur de
virulence, qui donne la mort au souris, mais on avait tué les bactéries L.
Donc dans ce système la, il faut bien que le gène puisse s'exprimer, on n'avait pas de message génétique
dans la souche R qui permettait de tuer la souris. Si on avait un système de conjugaison on avait besoin
que la souche L vivante soit en contact avec la souche R pour que la souche R devienne virulente, or ici
on tue la souche L mais on arrive quand même à avoir une acquisition virulente par la souche R et une
expression de la virulence.
Donc il y a la capacité d'induire la transformation de la bactérie R qui va acquérir un gène à partir
d'une bactérie morte. On va s'apercevoir en allant plus loin qu'on peut même acquérir des morceaux
d'ADN non présentés par les bactéries, c'est à dire que la bactérie peut être complètement lysée, on peut
avoir extrait de l'ADN, mettre dans un milieu de culture en présence de la souche R et nous allons avoir
transformation de la souche S.
On peut transformer toute bactérie par mise en contact de morceaux d'ADN.
Dans les années 90, à force de manger des viandes contenant des bactéries sélectionnées, antibio
résistantes : on a toujours le même problème des entérocoques résistante a ventomycine, plus utiliser ua
niveau vétérinaire mais on a quand même transfert de gènes de résistance car chez les animaux on prend
un homologue de la ventomycine dont le système de résistance est commun. On a eu un transfert
essentiellement par transformation.
Si on cuit bien la viande on tue la bactérie mais on n'inactive pas l'ADN, les bactéries ont acquis ces
fameux gènes.
B)
Conditions
Si on regarde d'un point de vue efficacité, il faut une phase de pénétration qui est possible si le morceau
d'ADN n'est pas trop petit, au dessus de 500 kDa.
Le deuxième critère indispensable c'est qu'il faut que la bactérie exprime une protéine liant l'ADN à sa
surface, c'est pas le tout d'avoir un contact avec un morceau d'ADN suffisamment grand, il faut
également que la protéine soit présente. Une fois que cette protéine liée à l'ADN a reconnu ce brin
d'ADN. La 1ère étape va être une coupure par une nucléase membranaire, qui permet une ouverture du
double brin en monobrin et celui qui a été éliminé restera de l'autre côté de la membrane, celui qui est
intact va être associé à une protéine dite de compétence.
On a donc besoin de 3 protéines, la 1ère est la protéine liant l'ADN, la 2ème est une nucléase
membranaire (enzyme) et la troisième est la protéine de compétence.
Une fois que tous ces phénomènes ont été réalisés, le monobrin va être transloqué de l'extérieur vers
l'intérieur donc pénétration dans la cellule.
Est ce que le système va aller jusqu'au bout ?
Est ce que ces morceaux d'ADN sont recombinables avec une zone de l'ADN chromosomique ?
On aura la deuxième hypothèse de Griffith qui est qu'à ce moment la il y a intégration dans le
chromosome avec une recombinaison pas réciproque qui a permis d'acquérir une partie de ce gène .
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Génétique bactérienne
Nous étions devant une sélection efficace mais cette transformation qui paraît peu probable au départ va
pouvoir être optimisée par la présentation d'ADN.
C'est là qu'on va retrouver le système conjugatif car quand on a une ADN double brin enroulé à la façon
des ADN plasmidiques, la reconnaissance est beaucoup plus efficace donc la majorité des
transformations vont passer par un système de plasmide .
C)
Fréquences
Quelles sont les fréquences ?
Si on associe à un système plasmidique la transformation va être très facile à obtenir, de l'ordre de
1/1000, vu la quantité énorme de bactéries qu'on a la transformation est quelque chose de commun.
Il n'y a plus de barrière, c'est pour ça que la physiologie est importante.
Les conditions sont qu'il faut quand même qu'on ait ces 3 protéines, pour les avoir il faut que la bactérie
soit en phase de croissance, les bactéries dans notre biotope ne sont pas fréquemment en phase
exponentielle de croissance, (au moment de la naissance et dans les jours qui jour qui suive) mais ensuit ,
on a des systèmes de réplication lent et on est sur des phases stationnaires avec peu de bactéries en phase
de croissance : facteur limitant.
Il faut en plus une quantité non négligeable de bactérie. Ce n'est pas parce qu'il y a une fréquence
élevée (1 transformant sur 1000 bactéries) que pour autant il ne faut pas un certain nombre de bactéries
présentent pour que ce soit relativement efficace in vivo. Il faut en général,entre 17 et 18 bactéries/mL.
Enfin il faut la protéine de compétence sauf que pour qu'elle soit synthétisée, il faut d'abord activer la
synthèse de 8 à 10 protéines. Donc on ne va pas avoir une bactérie compétente à tous les moments de son
cycle de vie.
On utilise essentiellement la transformation en labo et ce qu'on peut faire c'est optimiser l'efficacité en
utilisant des ions de type chlorure de calcium.
III)
Transposition
Dépend d'éléments génétiques mobiles EGM, qui sont par définition des fragments d'ADN qui peuvent
codé pour des enzyme ou des protéines de types structural par exemple et qui vont permettre la mobilité
de l'ADN.
É possibilité, soit la mobilité est :
–
au sein des génomes : mobilité intracellulaire (important en régulation de facteur
pathogène/virulent)
–
soit entre les bactéries : mobilité inter-cellulaire
Actuellement avec le séquençage des génomes on parle de mobilome, c'est la totalité des éléments
transposables mobiles présents dans un génome donné.
La première fonction la plus importante pour le bactériologiste est la modulation d'onde par ce système
d'EGM d'un certain nombre de gène. C'est la présence ou l’absence (= insertion ou excision) qui vont
nous permettre d'observer des modulation.
Quelques exemples :
→ Virulence : Ex : gène stx codant une shigatoxine chez les souches vérotoxiques d'E. Coli.
= contrôle par l'insertion de/excision de l'IS1203V
Ex : IS6110 dans région promotrice du gène phoP
= modulation avec activation de la virulence de M. tuberculosis
→ Alternances antigéniques (variations de phase) : présentation d'antigène par une bactérie peut être
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Génétique bactérienne
moduler par insertion/excision de séquence d'insertion.
Ex : le gène siaA de N. meningitidis ( c'est la capsule qu'il est capable de céeer qui est importante pour
permettre a la bactérie d'envahir le liquide céphalorachidien, ce gène a une sequence d'insertion, il aura
en réponse une variation de phase (= présence de lipo-oligosaccharides de la capsule) = régulé par
l'insertion/excision de l'IS1301.
A)
Séquences d'insertion
-base de données internationale référençant les IS (ISFinder, www-is.biotoul.fr) : 2500 séquences
annotées
-Forme la pus frustre d'EGM : petit ADN (0,7Kpb à 2,5 Kb), cryptique, très efficace en matière
d 'insertion, multiple dans l'ADN cible.
Structure d'une séquence d'insertion (IS) :
on a ujne séquence (IR) répété inversé : longueur comprise entre 10 et 40 pb, possède é domaine :
–
Domaine 1 : clivage et transfert du brin permettant la transposition
–
Domaine 2 : domaine d'attachement de la transposase
En Amont on a IRL (séquence répétée left),et en aval : IRR (SR right/droite).
Il faut d'abord une ouverture, le site de reconnaissance et on doit toujours avoir une duplication de
quelques nucléotides des 2 côtés de la transposase.
Caractéristique de la transposase :
-Enzyme : codée par 1-3 cadres ouverts de lecture (ORF pour open reading farme) occupant presque la
totalité de la séquence d'insertion.
-Site catalytique (C terminal) : motif DDE (Asp Asp Glu, pas systématique) = permet la coordination
des cations divalents indispensable s à la catalyse de la réaction.
-N Term : séquence d'attachement avec l'ADN
Comment se font les différents systèmes d'insertion ? 2 grand types :
→ Le premier grand type est l'insertion simple :
On a le brin d'honneur qui héberge la zone d'insertion.
Dans ce cas la c'est assez agressif dans la mesure où on a excision au niveau des 2 brins, les 2 brins sont
ouverts, excision et à ce moment la l'ADN cible s'ouvre pour permettre la localisation du système de
transposase (fermeture éclaire), une ligase permet d'associé avec le premier brins qui doit être
complémenter, idem avec l'autre monobrin. In fine on a la zone de réparation, ce qui a permit la
réplication d'un certain nombre de bases.
→ On a une insertion réplicative plus efficace en matiere de multiplication :
ce n'est pas une coupure avec excision complète, on ne coupe qu'un seul brin. Le brin qui s'ouvre
permet que l'on vienne insérer un fragment. On a un brin donneur, un brin récepteur, et on a le
complément, on va répliquer la partie de la zone cible, l'autre partie et on se retrouve avec l'acquisition à
l'autre partie d'un fragment des base du brin donneur. On a un co-intégrat : on a conservé à la zone
initiale et on a donné à la zone finale, en conservant on a fait l'échange de gènes, on a un échange de
bases car la zone cible garde un fragment de la zone donneuse et idem pour la zone cible.
On a parfois un système de réparation avec la coupure du 2ème brin. Ce n'est pas toujours totalement
efficace, on peut avoir une zone de réparation qui élimine une partie et on va retrouver un système de
réparation proche de celui en insertion simple. Ici on n'a pas de double intégration, on perd au brin initial
et on acquiert au brin final.
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Génétique bactérienne
Résumé :
- Insertion simple : le brin donneur perd la zone d'insertion donc la transposase et quand on fait la
séquence on va simplement voire la duplication des bases : mode couper coller.
- Insertion réplicative : l'IS est répliquée et on obtient 2 co-intégrats avec au départ 1 seule structure
mobile : mode copier coller.
Ces système d'insertion ne sont pas les seule qui existe dans un génome.
B)
Transposons complexes
-Transposon unitaire : TnpR, on retrouve ce code pour la transposase, les zones IR, et un système de
résolvase, avec site d'action res, et un gène intégré dans l'ensemble de ce transposon éventuellement.
Déjà on a le transposon qui si l'ensemble de ses acquisition génique ne modifie pas l'efficacité de la
transposase va permettre d'augmenter le gène, qui va venir avec plusieurs copies au sein du même
génome.
-Transposon composite : ils vont apparaître au fur et a mesure qu'on aura des séquence d'insertion qui
vont faire des co-intégrât. Il suffit qu'on est un intégrât par très éloigné de ce transposon, et le même
transposon plus loin, et malgré les zone IR, le fait qu'on ait un raccrochement des transposons, fait que
ces l'ensemble de ces transposons composite qui peut se réinsérer à d'autre niveau dans le chromosome.
On peut acquérir plusieurs copies de plusieurs gènes
-Transposons conjugatifs et mobilisables : Très éloigné de la zone transposase, naissent deux gènes
codant pour des fonctions d'excisionase et d'intégrase, qui vont permettre associé au gène Tra, une
association de la transposition et de la conjugaisons en même temps.
On aura aussi des transposon mobilisable ; retrouve excisionase et intégrase avec un certain nombre de
gène qui complexifie l'ensemble. On a l'origine de transfert, une relaxase, on a plus la transposase, mais
on peut quand même grâce au séquence d'insertion IS reconnaître les zones et réussir la transposition.
Transposon composite : les composites apparaissent par collaboration des IS lors de leur transposition.
Cela permet de mobiliser une sequence d'adn plus complexe que celle des séquences d'insertion simple.
Tout ce qui va existé, toutes les séquences en insertion en orientation inverse ou directe (on peut
retrouver les genes inversés a l'autre bout de l'ADN) cette structure complexe est un transposons
composite.
Tout ce qui est excision, incision et phénomène catalytique provient des transposase des séquence
d'insertion.
Ce qui complique les chose, car ces système de transposition composite sont un grand vecteur de
dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques.
Rappel Transposons conjugatifs : très homogènes contrairement aux composites
On a des séquences inversées répétées aux extrémités de 20 a 30 bases, on peut localiser un transposon
conjugatif à l'intérieur d'un chromosome.
On y retrouve des gènes impliqués dans la mobilité : on aura des codes pour l'excision, pour le transfert
par conjugaison et pour l'intégration et toute une série de gène impliqué dans la résistance aux antibio.
En plus on retrouve une recombinase spécifique de sites qui appartient à une famille d'intégrases.
On a la fameuse fonction qui catalyse la conjugaison : tra
Classiquement la transposition est vécue comme un transfert de type vertical,on a aussi une propagation
verticale.
C)
Introns du groupe II
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Génétique bactérienne
On a des éléments mobilisable qui sont de type intron du groupe II. L transposition n'est plus dépendante
de transposon classique avce zone d'insertion, mais d'un ARNm qui fonctionne comme un ribozyme.
GM décrit en 1993 chez les bactéries
On a une transcription via des ARNm = ribozyme
le système d'introns de type 2n'est pas exclusif des bactéries.
Le ribozyme catalyse sa propre excision a partir du transcrit primaire par un procédé d'auto épissage.
Il y a plus de 200 introns identifiés. On a une régulation de l'ARNm .
Les introns du groupe II se replient en une structure secondaire conservée constituée de 6 domaines
arrangés autour d'une boule centrale
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