Les Peptides

Les Peptides
Doc 1: La création de la liaison peptidique
Doc 2: Equilibre entre les 2 formes mésomères
Doc 3: Caractéristiques de la liaison peptidique dans l'espace
• 6 atomes coplanaires
• Les C alpha sont trans/liaison C-N
• L'axe de la molécule est une ligne brisée.
• Libre rotation autour des liaisons C-C et C
alpha -N.
Doc 4: Conventions d'écriture
Par convention :
- le groupement aminé s'écrit à gauche ;
– les acides aminés sont numérotés à partir de ce même groupement.
–
Doc 5: Démarche générale pour la détermination de la structure
primaire (= séquençage)
Préparation de la protéine
pour le séquençage:
Séquençage des chaînes
polypeptidiques:
Reconstitution de la
structure complexe:
a. Déterminer le nombre de
chaînes polypeptidiques
(sous-unités) différentes de
la protéine.
b. Rompre les ponts
disulfures de la protéine.
c. Séparer et purifier les
sous-unités individuelles.
d. Déterminer la composition
en acides aminés des sousunités.
a. Fragmenter les sousunités à des endroits
spécifiques pour obtenir des
peptides suffisamment petits
pour être séquences
directement.
b. Séparer et purifier les
fragments.
c. Déterminer la séquence en
acides aminés de chaque
fragment peptidique.
d. Répéter l'étape 2(a) avec
une méthode de
fractionnement de spécificité
différente afin que la sousunité soit hydrolysée au
niveau de liaisons
peptidiques différentes.
Séparer ces fragments
peptidiques comme dans
2(b) et déterminer leurs
séquences en acides aminés
comme dans 2(c).
a. Recouvrir les points
d'hydrolyse d'une série de
fragments peptidiques par
l'autre série. Par
comparaison, les séquences
de ces séries de polvpeptides
peuvent être mises dans
l'ordre qui correspond à celui
de la sous-unité, ce qui
donne sa séquence en acides
aminés.
b. Déterminer la position des
ponts disulfures, s'il y en a
entre et à l'intérieur des
sous-unités.
Doc 6: Détermination de la composition en AA: nature et proportion
des AA présents
Profil obtenu après fractionnement chromatographique d'un mélange d'amino-acides sur
colonne de polystyrène sulfoné et dosage colorimétrique à la ninhydrine. L'élution est
réalisée en utilisant successivement les tampons suivants: pH 3,25 - Na + 0,2N; pH 4,25 Na+0,2N; pH 5,9 - Na+ 1,4 N...
--> Hydrolyse acide totale
--> Séparation, identification et dosage par chromatographie d'échange d'ions automatisée
(colonne d'HPLC).
Doc 7: Dégradation d'Edman
Notez que la réaction se fait en trois étapes distinctes qui nécessitent chacune des
conditions tout à fait différentes. Les résidus d'acides aminés peuvent ainsi être enlevés de
l'extrémité N-terminale du polypeptide de façon séquentielle contrôlée.
Doc 8: Action des endo et exo peptidases
Doc 9: Spécificité d'action de certaines exopeptidases
Doc 10: Mode d'action des carboxypeptidases
Doc 11: Mode d'action du Bromure de Cyanogène (CNBr)
Doc 12: Spécificité de quelques endopeptidases
Enzvme
Origine
Spécificité
Remarques
Trypsine
Pancréas de bœuf
Côté C-terminal de résidus Très spécifique
chargés positivement: Arg,
Lys, lorsque le résidus après
n'est pas une Pro
Chymotrypsine
Pancréas de bœuf
Côté C-terminal de résidus Hydrolyse plus lente du
hydrophobes
encombrants: côté C-termmal des résidus
Phe, Tyr, lorsque le résidu Asn, Mis, Met, Leu
après n'est pas une Pro
Elastase
Pancréas de bœuf
Côté C-terminal de résidus
neutres de petite taille: Ala,
Gly, Ser, Val; lorsque le
résidu après n'est pas une Pro
Thermolvsine
Bacillus
thermoproteolyticus
Côté N-terminal de résidus: Hydrolyse parfois du côté
Ile, Met, Phe, Trp, Tyr, Val; N-terminal des résidus Ala,
lorsque le résidu avant n'est Asp, His, Thr; thermostable
pas une Pro
Pepsine
Muqueuse gastrique Côté N-termina de résidus:
Également avec d'autres
du bœuf
Leu, Phe, Trp, Tyr; lorsque le résidus;
vraiment
non
résidu avant n'est pas une Pro spécifique; pH optimum =
2
Endopeptidase
V8
Slaphylococcus
aureus
Côte C-terminal de Glu
Doc 13: Rupture des ponts disulfures
Par le Beta-Mercaptoéthanol
Par l'acide performique
Doc 14: Mise en ordre des fragments peptidiques
Les fragments peptidiques étant séquencés individuellement, reste à élucider l'ordre dans
lequel ils se trouvent dans le polypeptide original.
Ceci est obtenu en comparant les séquences en acides aminés d'une série de fragments
peptidiques avec celles d'une deuxième série dont les sites d'hydrolyse recouvrent ceux de
la première série.
Les segments peptidiques "recouvrants" doivent être suffisamment longs pour pouvoir
identifie chaque site d'hydrolyse sans ambiguïté
La séquence en acides aminés d'une chaîne polypeptidique est déterminée en comparant
les séquences de deux séries de fragments peptidiques se recouvrant mutuellement. Dans
cet exemple, les deux séries de fragments ont été obtenus en hydrolysant le peptide à
l'aide de la trypsine et dans une autre réaction, à l'aide du CNBr.
Doc 15: Réaction du Biuret
Exemple d'un octopeptide (8AA)
Le Cu2+ est chélaté, « pris » entre différentes liaisons peptidiques qui le « pincent ».