04 02 2016 9h00 10h00 paumelle
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2015-2016 Prolifération et apoptose Contrôle du cycle cellulaire Biologie cellulaire – UE 7: – Sciences biologiques Diapos à venir sur Moodle Semaine : n°2 (du 01/02/2016 au 05/02/2016) Date : 04/02/2016 Heure : de 9h00 à 10h00 Binôme : n°37 Professeur : Pr. Paumelle Correcteur : n°39 Remarques du professeur • • • • Le professeur s'étonne de ne pas avoir beaucoup d'étudiants en cours Elle hésite à mettre les diapos sur Moodle L'année dernière elle a refusé de donner une correction en amphi d'un sujet d'annales car il n'y avait pas assez d'étudiants en cours Elle ne sait pas si elle va le faire cette année, cela dépend du nombre d'étudiants qui viennent en cours prochainement PLAN DU COURS I. Destin cellulaire physiologique et pathologique II. Les protéines de régulation du cycle cellulaire A. Les complexes cyclines/CDK 1. Définition 2. Rôle B. Régulation des cyclines 1. Régulation de leur synthèse Régulation transcriptionnelle Rôle des facteurs de croissance / mitogènes 2. Régulation de leur dégradation Phosphorylation, Ubiquitinylation, Protéasome 3. Régulation de leur localisation cellulaire Cycline E et A nucléaires Cycline B cytoplasmique ou nucléaire 1/16 2015-2016 Prolifération et apoptose Contrôle du cycle cellulaire I. Destin cellulaire physiologique et pathologique Le devenir de toute cellule se résume à 3 possibilités : – Prolifération/croissance – Différenciation (adopter des fonctions spécialisées) – Apoptose Contrairement aux bactéries qui se multiplient seulement quand il y a des nutriments, les cellules de l'organisme vont se multiplier et se diviser seulement s'il y a besoin d'un apport de cellules dans l'organisme. Les facteurs de croissance et les facteurs mitogènes vont permettre d'induire la division cellulaire si nécessaire. Ces 3 processus sont très contrôlés, que ce soit lors de l'embryogenèse ou chez l'Homme adulte. Il y a une homéostasie entre ces différents processus jusque l'âge adulte. Chez l'adulte on observe moins de divisions cellulaires car les membres sont formés donc on n'a pas besoin de division cellulaire. On fabrique encore chez l'adulte plusieurs milliers de cellules, comme les cellules sanguines ou les cellules de l'épiderme par exemple qui doivent être renouvelées. Certaines cellules sont renouvelées dans l'organisme mais pas toutes (les cellules cardiaques et les cellules nerveuses ne se renouvellent pas). Il faut qu'il y ait un contrôle entre ces processus biologiques. Si ces contrôles sont perturbés, cela peut conduire à des pathologies comme des cancers, qui se développent suite à un défaut ou une augmentation de prolifération, d'apoptose ou de différenciation. Si l'on a un tissu qui se divise normalement et qui meurt normalement (quand c'est nécessaire) à ce moment là l'homéostasie est contrôlée et on a une croissance de l'organisme qui est normale. Si on a par contre une perturbation au niveau de la division des cellules suite à la mutation des gènes, et que les cellules se divisent constamment, même avec une apoptose normale, cela peut conduire à la prolifération d'un cancer. 2/16 2015-2016 Prolifération et apoptose Contrôle du cycle cellulaire Si on a une croissance et une division des cellules qui sont normalement contrôlées mais que l'on a un processus d'apoptose inactif, il y a un risque que ces cellules deviennent tumorales et cancéreuses. → Une cellule devient cancéreuse par altération d'au moins un de ces 3 processus. Ces 3 processus sont contrôlées par le cycle cellulaire. Le cycle cellulaire des cellules eucaryotes a 4 phases (G1, S, G2, M) et il y a des points de contrôles au niveau de ces phases : en phase G1, en phase G2 et en phase M. Les points de contrôle sont des endroits où la cellule vérifie son environnement et vérifie si tout son ADN est répliqué pour continuer de progresser dans le cycle cellulaire et de produire des cellules identiques à la cellule mère pour conserver l'information génétique. La cellule peut décider de s’arrêter dans son cycle pour essayer de réparer l'ADN si nécessaire, ou se différencier, surtout en phase G1 où la cellule vérifie l'environnement et la qualité de son gène. Si on n'a pas assez de facteurs mitogènes, la cellule rentre en phase G0 ou phase de quiescence, et attend de s'orienter vers un autre programme, rentre en apoptose, ou encore attend que d'autres facteurs mitogènes soient produits. En phase G2, une fois que la réplication est terminée, il y a vérification de l'intégrité de l'ADN, s'il y a des erreurs, la cellule les répare ou s'il y a impossibilité de réparation, les cellules vont mourir par apoptose. Le point de contrôle en phase M est le moment où la cellule vérifie que tous les chromosomes sont associés aux microtubules pour permettre la bonne séparation des chromosomes. A ce moment là les cellules peuvent aussi mourir par apoptose. Des signaux intracellulaires peuvent influencer la réponse de la cellule. II. Les protéines de régulation du cycle cellulaire On a identifié les cyclines et les CDK en utilisant génétiquement l'oeuf de Xénope et la levure. On a essayé ensuite de comprendre comment elles étaient capables de contrôler le cycle cellulaire. A. Les complexes cyclines/CDK 1. Définition KINASES-CDK Les kinases CDK (Cyclin dependant kinases) sont au nombre de 13 chez l'Homme. Ce sont des sérine/ thréonine kinases. Ce sont des protéines qui vont phosphoryler sur des résidus sérine et thréonine. Elles ont une activité dépendante de l'association aux cyclines via leur extrémité Nter. L'activité des CDK est également dépendante de la phosphorylation. Elles-mêmes sont phosphorylées sur des résidus tyrosines et thréonines. Elles phosphorylent et régulent l'activité de nombreuses protéines impliquées dans la progression du cycle cellulaire. 3/16 2015-2016 Prolifération et apoptose Contrôle du cycle cellulaire CYCLINES Les cyclines sont au nombre de 25 mais ne sont pas toutes impliquées dans le cycle cellulaire. Celles impliquées dans le cycle cellulaire possèdent toutes une région commune d'interaction avec les CDK que l'on appelle la cycline box. Ce sont des protéines régulatrices des CDK. Quand elles sont exprimées à un taux important elles permettent de former le complexe actif cycline/CDK. L'expression de ces protéines est cyclique : diminution ou augmentation de leur expression selon la phase du cycle cellulaires. Au niveau des différentes phases du cycle cellulaire, différents complexes cyclines/CDK se forment et permettent aux cellules de progresser dans le cycle : – Cycline de G1 : Cycline D couplée avec CDK4 ou CDK6 – Cycline de la transition G1/S : Cycline E couplée avec CDK2 – Cycline de S : Cycline A couplée à CDK2 – Cyclines mitotiques : Cycline A puis B couplées avec CDK1 Ces différentes cyclines donnent une spécificité d'action. On a également une cycline régulatrice : Cycline H couplée à CDK7. Cette cycline est importante car elle est responsable de la phosphorylation des CDK. Pour que les CDK soient actives, il ne faut pas seulement qu'elle se lient aux cyclines mais il faut également qu'elles soient phosphorylées. Le complexe cycline H/CDK7 est tout le temps formé dans la cellule. Il ne subit pas de régulation cyclique. Il a une activité constante contrairement aux autres cyclines qui agissent seulement transitoirement dans une phase du cycle et deviennent inactives après. Le complexe Cycline H/CDK7 est toujours actif. Résumé de l'intervention des complexes cyclines/CDK lors du cycle cellulaire : La fluctuation de l'activité des complexes cyclines/CDK est responsable de la progression du cycle cellulaire. 4/16 2015-2016 Prolifération et apoptose Contrôle du cycle cellulaire 2. Rôle Les cyclines de G1 ou G1/S jouent un rôle important dans le passage du point de restriction, qui est le point de contrôle en G1 et qui permet à la cellule de pouvoir effectuer un cycle cellulaire complet. Il faut que les cellules passent ce point de contrôle pour progresser dans le cycle cellulaire. Pour passer ce point de contrôle, la formation du complexe cycline D/CDK4 (qui est une cycline de G1) va aller phosphoryler la protéine du rétinoblastome (qui est un inhibiteur du cycle cellulaire, et qui va bloquer le cycle cellulaire) car cette protéine séquestre un facteur de transcription E2F. Lorsque le complexe cycline D/ CDK4 se forme, on a phosphorylation de la protéine du rétinoblastome par CDK4 ou CDK6. Cette phosphorylation va permettre à E2F d'être libéré et de se fixer sur l'ADN pour induire la transcription des gènes et notamment celle de PCNA (activateur de l'ADN polymérase delta). E2F peut également induire l'expression d'autres cyclines comme la cycline E ou la cycline A. La cycline E va se coupler à la CDK2 et va être également capable de phosphoryler la protéine du rétinoblastome pour avoir le temps d'induire la transcription de gène qui permet à la cellule de passer en phase S. Une fois la cellule en phase S, E2F induit l'expression de la cycline A qui est la cycline de la phase S. La cycline A se couple à la CDK2 et favorise au niveau de l'ADN le recrutement de PCNA qui permet d'induire la réplication de l'ADN par l'activation d'ADN polymérase. 5/16 2015-2016 Prolifération et apoptose Contrôle du cycle cellulaire Concernant la cycline B/CDK1, elle augmente au moment de la phase G2. Cette cycline B/CDK1 est le facteur promoteur de la mitose, et donc ce complexe va aller phosphoryler des protéines comme les lamines, les histones H1, et les protéines liées aux microtubules pour former le fuseau mitotique, fragmenter la lamina, et pour pouvoir passer de la fibre chromosomique en fibre chromatinienne en condensant la chromatine. Certains virus utilisent le fonctionnement du complexe cycline/CDK pour provoquer la prolifération des cellules qu'ils infectent, et cela peut ainsi induire la formation de cancer : – Le virus de l'herpès et le VIH vont exprimer dans leur génome des protéines qui sont analogues à la cycline D. Dès que le virus va infecter les cellules, il y aura expression d'une protéine qui va mimer la cycline D et on aura l'enclenchement du passage des cellules en phase S. Voila pourquoi certaines cellules se mettent à proliférer. – Le virus EBV (Epstein-Barr) va exprimer 2 protéines qui vont permettent la sur-expression de la cycline D (facteurs de transcriptions par exemple) – L e papillomavirus est un virus qui provoque la formation de certaines verrues et induit le développement du cancer du col de l'utérus. Il provoque lui l'expression de la protéine E7 qui se fixe sur le rétinoblastome et va libérer E2F. On aura donc prolifération des cellules infectées par ce virus. Sur ce schéma on a une protéine qui fonctionne normalement, puis pour les cellules infectées, le virus produit E7 basé sur des gène présents dans son génome. E7 ressemble à E2F, et la protéine du rétinoblastome va se fixer sur E7 plutôt que E2F, et cela induit la transcription de gènes. C'est comme cela que les cellules prolifèrent. Le virus SV40 et les adénovirus E1A fonctionnent également de cette façon. 6/16 2015-2016 Prolifération et apoptose Contrôle du cycle cellulaire B. Régulation des cyclines 1. Régulation de leur synthèse L'apparition des cyclines est périodique au cours du cycle cellulaire. Les cyclines cyclent au cours du cycle cellulaire. A un moment donné leur expression diminue. Moyen de pouvoir le démontrer : on utilise le Western-Blot. On mesure l'expression de ces cyclines au cours du cycle cellulaire. • On a l'exemple d'une expérience réalisée sur une culture de cellules synchronisées. On prend des cellules, on les traite avec de la colchicine qui dépolymérise le fuseau mitotique, ça bloque les cellules en métaphase, en mitose. Ensuite on lave le milieu de culture, on élimine la colchicine, on remet les cellules dans un milieu normal avec les éléments qu'il faut pour qu'elles puissent se diviser. A différents temps sur 24h on prend des cellules et on fait un extrait protéique total. On extrait les protéines, on les dépose sur un gel d'électrophorèse qui va les séparer en fonction de leur poids moléculaire. On incube avec des Ac spécifiques de ces cyclines : anti-cycline A / anti-cycline E et on va rajouter un substrat qui va révéler les Ac aux endroits où ils se sont fixés. On obtient des bandes, qui correspondent à l'endroit où l'Ac est venu se fixer sur la protéine, sur la membrane. • La cycline E augmente en fin de G1/ début de phase S. Puis elle diminue rapidement. • La cycline A : son augmentation est plus tardive et reste constante au cours de la phase S. • La cycline B est exprimée au cours de la phase G2. 7/16 2015-2016 Prolifération et apoptose Contrôle du cycle cellulaire Ce qu'il manque : un témoin de charge comme l'actine , pour savoir si on a déposé la même quantité de protéines dans tous les puits. Ça a permis de démontrer que les cyclines sont exprimées différentiellement au cours du cycle cellulaire. ○ Rôle des facteurs de croissance / mitogènes A quel moment doivent-ils être présents au cours du cycle cellulaire ? Tout le temps ? A un moment donné ? On va prendre des cellules, encore une fois synchronisées. On les synchronise en métaphase. On rajoute du milieu de culture avec du facteur mitogène dedans. On laisse le facteur mitogène pendant 2/3/8h jusqu'en phase S, M ou on les retire en phase G1, on les met en phase S.... on a essayé différentes combinaisons. On s'est rendu compte : - Lorsque les cellules sont en G1 et qu'on retire le facteur mitogène, elles ne sont pas capables d'avancer dans le cycle cellulaire. Elles restent en quiescence, en phase G0. - Si on rajoute le facteur mitogène, les cellules rentrent dans le cycle cellulaire en phase G1 pour passer ensuite le point de restriction. Si on met le facteur mitogène 2/3/5h ce n'est pas suffisant. Il faut au moins 8h pour que les cellules entrent dans le cycle cellulaire et passent le point de restriction. - Si on retire à nouveau ces facteurs mitogènes du milieu de culture, les cellules pourront progresser dans le cycle cellulaire jusqu'au bout. 8/16 2015-2016 Prolifération et apoptose Contrôle du cycle cellulaire => Après avoir passer le point de restriction, les cellules seront capables d'effectuer un cycle cellulaire complet. • Ensuite, si on met des facteurs mitogènes sur les cellules en G1 et qu'on rajoute un inhibiteur de synthèse protéique, les cellules ne vont pas être capables de passer le point de restriction et vont rester en G0. => Les facteurs mitogènes sont nécessaires car ils vont induire la synthèse de protéines qui vont ellesmême permettre aux cellules de passer ce point de restriction. Il faut que ces facteurs mitogènes puissent induire la synthèse de protéines qui sont les cyclines. Le retour dans le cycle cellulaire nécessite du temps (8h) et est inhibé par la cycloheximide. => Le retour dans le cycle cellulaire nécessite donc une synthèse protéique. • Liste des facteurs mitogènes Ces facteurs mitogènes vont aller se fixer sur différents types de récepteurs membranaires ou nucléaires. 9/16 2015-2016 Prolifération et apoptose Contrôle du cycle cellulaire Hormones lipophiles : Récepteurs nucléaires. Facteurs de croissance : Récepteurs membranaires. Cela va induire une cascade de transduction pour les récepteurs membranaires, ou l'information va directement au noyau pour les récepteurs nucléaires. On va voir environ une centaine de gènes activés. Au niveau de la signalisation, les gènes ne vont pas tous être activés en même temps pour permettre l'expression en décalé des cyclines par exemple qui ne sont pas toutes exprimées au même moment. => Ce schéma montre les premières étapes qui vont se passer dans la cellule quand elle est en présence d'un facteur mitogène. Un facteur mitogène se fixe sur son récepteur membranaire. Cela active la voie Ras / MAP kinase. La MAP kinase va aller activer un facteur de transcription dans le noyau qui permet la transcription de gènes. Dans ces gènes précoces, c'est un facteur tissulaire qui s'appelle Myc qui lui même va être transcrit, exprimé en protéine et va aller se fixer sur des gènes et permettre d'induire la transcription de la cycline D. La cycline D va s'associer à CDK4 ou CKK6 pour former un complexe actif. On a différentes étapes successives d'expression protéique qui vont aller réguler l'expression des gènes. Ces gènes vont être exprimés en protéines et vont aller à nouveau réguler l'expression des gènes, ce qui permet d'avoir une réaction en cascade. 10/16 2015-2016 Prolifération et apoptose Contrôle du cycle cellulaire Ici est symbolisé sur ce schéma ce qui va permettre d'induire au cours de G1 et S l'expression des cyclines. On retrouve la protéine du rétinoblastome qui à l'état actif va séquestrer le facteur de transcription E2F. Quand les cellules sont en présence de facteurs mitogènes on va avoir induction de l'expression de cycline D qui se couple à sa CDK (4 ou 6) et permet la phosphorylation de la protéine du rétinoblastome qui devient alors inactive et ne peut plus séquestrer le facteur de transcription E2F. E2F va pouvoir aller induire l'expression de gènes de la phase S, notamment induire l'expression de la cycline E et de la cycline A. La cycline E va se coupler à sa CDK et va aller elle même phosphoryler la protéine du rétinoblastome pour favoriser le passage des cellules en phase S. La cycline A elle va se coupler à sa CDK et va permettre d'activer ce complexe pour que la cellule passe de la phase G1 à la phase S. 2) Régulation de leur dégradation ○ Phosphorylation, Ubiquitinylation, Protéasome Régulation de leur dégradation : une fois qu'elles ont été actives au cours d'une phase du cycle, il faut que le complexe redevienne inactif. On va assister à la dégradation de la cycline. On avait vu ensemble que le facteur qui favorisait la dégradation de la cycline B (ou cycline M) est le complexe promoteur de l'anaphase. Il possède une activité ubiquitine ligase qui va permettre de greffer des résidus ubiquitine sur la cycline M pour permettre à cette cycline d'être adressée au protéasome et d'être dégradée. 11/16 2015-2016 Prolifération et apoptose Contrôle du cycle cellulaire Mécanisme : tout ceci va se déclencher suite à la séparation des chromatides sœurs de chaque chromosome. Quand il y a séparation de ces chromatides sœurs, une protéine Cdc20 va activer le complexe APC qui va, en se liant aux enzymes E1 et E2 (enzymes qui permettent de greffer les résidus ubiquitine sur la cycline M), permettre l'ajout de plusieurs résidus ubiquitine sous forme de chaîne => obtention d'une protéine ubiquitinylée qui va permettre à la protéine d'être adressée au protéasome pour être dégradée. Pour Cdc20, elle est active AVANT que les chromatides sœurs soient séparées. Ce qui est en rouge : elle n'est plus sûr, elle va vérifier l'information et rectifier au prochain cours (Activation avant que les chromatides sœurs soient séparées ou Activation après que les chromatides sœurs soient séparées?).Elle ne pense pas que c'est la séparation des chromatides sœurs qui fait que Cdc20 est active. Pour que ça puisse se faire, il faut que la cycline M soit phosphorylée au niveau d'un résidus thréonine par sa propre CDK. Si la cycline M n'est pas phosphorylée, il n'y aura pas reconnaissance par les enzymes et donc pas ubiquitinylation de la cycline. 12/16 2015-2016 Prolifération et apoptose Contrôle du cycle cellulaire Expérience : technique de Western Blot On regarde sur des cellules qui sont en différentes phases de la mitose. On prend des cellules qu'on a synchronisées, on les laisse aller en mitose et on prend des cellules aux différentes phases. On a fait un extrait protéique total. Cycline B : - En prophase elle est bien exprimée, - En métaphase aussi elle est bien exprimée, - Mais en anaphase son expression diminue. Diminution de cette expression : ubiquitinylation ? On va purifier la cycline B, on va ensuite déposer sur le gel de polyacrilamide uniquement la protéine. On a fait une immuno-précipitation. On utilise pour cela des anti-Cycline B. On purifie alors la protéine.. On dépose la protéine sur gel et on utilise des Ac anti-ubiquitine (qui détectent spécifiquement les résidus ubiquitine). On révèle, et là où il y a un marquage noir : permet de montrer qu'il y a de l'ubiquitine. On a donc bien ubiquitinylation de la cycline B en anaphase et en télophase qui suit la diminution de l'expression de la cycline B. => La diminution de l'expression de la cycline B en anaphase et en télophase est due à l'augmentation de son ubiquitinylation. 13/16 2015-2016 Prolifération et apoptose Contrôle du cycle cellulaire Le complexe APC va permettre de dégrader les cycline B et A pendant la mitose. Autre complexe qui agit de la même façon en utilisant l'ubiquitinylation des autres cyclines : le complexe SCF qui intervient plus (+) pour les cyclines D et E. Le complexe SCF contient également une activité ubiquitine ligase. 3) Régulation de leur localisation cellulaire Cyclines E et A : nucléaires. Elles sont exprimées, transportées directement dans le noyau et forment un complexe cycline / CDK dans le noyau. La protéine du rétinoblastome est présente dans le noyau. Il n'y a pas modification de leur localisation cellulaire en fonction de leur fonction propre. 14/16 2015-2016 Prolifération et apoptose Contrôle du cycle cellulaire Cycline B : cytoplasmique ou nucléaire. Va induire des événements différents, à la fois au niveau des microtubules présents dans le cytoplasme mais également au niveau des histones et des lamines présentes dans le noyau. Cette cycline va osciller entre le cytoplasme et le noyau. En interphase, la cycline B va être constamment importée dans le noyau via une importine (elle possède une séquence NLS) et est constamment rejetée, exportée dans le cytoplasme (par une exportine). Elle va être importée dans le noyau mais systématiquement exportée dans le cytoplasme par une exportine CRM1. La cycline B contient donc des séquences NLS et NES. Puis entrée en mitose : événement de phosphorylation sur la cycline B (phosphorylée sur 4 résidus sérine) qui va faire qu'elle ne sera plus reconnu par l'exportine. La séquence NES est phosphorylée et du coup l'exportine CRM1 ne reconnaît plus la cycline B. La cycline B va alors s'accumuler dans le noyau. Au moment de la mitose il y a phosphorylation des lamines et des histones, qui permet la rupture de l'enveloppe nucléaire et la condensation de la chromatine. 15/16 2015-2016 Prolifération et apoptose Contrôle du cycle cellulaire En phase G2 il y a un point de contrôle qui vérifie s'il y a intégrité de l'ADN ou non. Si l'intégrité n'est pas conservée, si on a une lésion à l'ADN, il n'y a pas de phosphorylation des résidus sérine de la cycline B et donc elle continuera à faire des allers retours entre cytoplasme et noyau. Il faut que tout soit conservé, correcte au niveau de ce point de contrôle de la phase G2. C'est un mécanisme qui va permettre de contrôler l'activité du complexe cycline B/ CDK pour éviter que les événements de la mitose se déclenchent alors que la cellule n'est pas forcément prête. 16/16
