Diagnostic microbiologique des IOA du prélèvement
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Diagnostic microbiologique des IOA du prélèvement … aux techniques moléculaires Gérard LINA CNR des Staphylocoques Université Lyon 1- INSERM 851 Hospices Civils de Lyon IOA : un sujet d’actualités "Le CHU de Lyon : Centre de référence régional pour la prise en charge des Infections Ostéo-Articulaires complexes • annonce faite le 26/09/08 par Madame Roselyne BACHELOT-NARQUIN, Ministre de la Santé, de la Jeunesse, des Sports et de la Vie associative • avec les CHU de Lille, Lyon, Reims, Tours, Marseille, Toulouse, Paris Raymond Poincaré (Garches) associé Diaconesses-Croix Saint Simon Septembre 2009 REMIC Référentiel en Microbiologie Chapitre 23. DIAGNOSTIC MICROBIOLOGIQUE DES INFECTIONS OSSEUSES ET ARTICULAIRES Trois acteurs majeurs dans la prise en charge bactériologique des IOA Chirurgien orthopédiste / Pédiatre/ Rhumatologue Evacuer / Nettoyer Prélever Microbiologiste Détecter Identifier Mesurer la sensibilité aux antibiotiques Antibiothérapeute Interpréter Choisir de l’antibiothérapie optimale Diagnostic bactériologique • Indispensable pour • affirmer l’infection • pour traiter correctement ces infections: adaptation de l’ATBthérapie sur l’ATBgramme • Avant antibiothérapie ou après arrêt prolongé (variable en fonction des ATB) • Prélèvements multiples +++ • Souvent difficile • isolement souvent laborieux des bactéries • infections polymicrobiennes • plusieurs antibiogrammes • Résultats dépendent • qualité des prélèvements • rapidité du transport • techniques utilisées au laboratoire Infections ostéo-articulaires « PRESENTATION CLINIQUE AIGUË » « PRESENTATION CLINIQUE CHRONIQUE » Rien ne presse URGENCE (quoi que .. chgt 1 temps versus 2 temps) Septicémie Traitement empirique Bilan de l’infection Trouver le germe Points critiques pour le laboratoire Objectif : isoler et identifier les bactéries responsables • Gestion des prélèvements → avant, pendant, après • Conditions / Délais d’incubation des cultures • Détection et identification des variant et des souches différentes • Interprétation, rendu clair et cohérent de résultats qui puissent aider à la décision thérapeutique Difficultés rencontrées avec les IOA par le bactériologiste • Bactéries IOA = +/- bactéries de la flore cutanée • Infections plurimicrobiennes • Bactéries fragiles • Bactéries physiologiquement peu actives • Antibiothérapie préalable au prélèvement • Bactéries cachées – intracellulaires – biofilm Contamination ou pas ? Gestion des prélèvements +++ Cultures longues Milieux riches Multiplicité des milieux Traitement adéquat des prélèvements Expression phénotypique variée • Bactéries normale (IOA aiguë) vs bactéries stressées (IOA chronique) Les prélèvements bactériologiques Fistule = intérêt plus que discutable – écouvillonnage de surface : contestable, flore cutanée – aspiration profonde Prélèvements profonds : +++ – – – ponction articulaire + cytologie + biochimie ponction au trocart à biopsie (True-cut®) Prélèvements tissulaires per-opératoires Hémocultures dans les infections aiguës Liquides de drainage : surveillance du site infecté opéré. Gestion des prélèvements Eviter toute contamination Bactéries IOA = +/- bactéries de la flore cutanée . nature du prélèvement . Fistule, biopsies tissulaires, pus, tissus per-op, liquide articulaire, synoviale, … +++ . Matériel : prothèse, vis, plaques, fiches, … ça dépend comment cela est manipulé . Hémocultures : insister sur l’aseptie car problème récurrent des contaminations à SCN . post-prélèvement . Contenants de transport . Manipulations au laboratoire Gestion des prélèvements Eviter toute contamination Bactéries IOA = +/- bactéries de la flore cutanée . nature du prélèvement . Fistule, biopsies tissulaires, pus, tissus per-op, liquide articulaire, synoviale, … +++ . Matériel : prothèse, vis, plaques, fiches, … ça dépend comment cela est manipulé . Hémocultures : insister sur l’aseptie car problème récurrent des contaminations à SCN . post-prélèvement . Contenants de transport . Manipulations au laboratoire Ensemencer dans les meilleurs délais . Transport / Ensemencement au bloc ? . Gestion au sein du laboratoire Bactéries fragiles Septembre 2009 Prélèvements Fistule et trajet de fistule . qui dit fistule dit infection . prélèvement pré-opératoire - sur écouvillon = à refuser Se médiocre Sp médiocre - aspiration profonde . après préparation cutanée et rinçage fistule . à la seringue ou au cathlon souple . peu contributif sauf si isolement S. aureus Prélèvements Prélèvements osseux profond Sélectionner les prélèvements … pour IOA sur prothèse ni trop ... ni trop peu - ↑ risque contamination - pb gestion au laboratoire . 10 minutes/prélèvement/technicien . matériel pour broyage . identification/localisation - coût - Nbre de positifs = critère d’interprétation Specificté 1+ / 5 à 7 préllts 26% 2+ / 5 à 7 prélts 53% 3+ / 5 à 7 prélts 85% Altweg, JSJB, 2003 Prélèvements Prélèvements osseux profond Contenant stérile (voir plus loin) Recommandations: . minimum 3 prélèvements . optimum 5 – 7 1-2 sur os 1-2 sur articulation 1 liquide + 1-2 synoviales . sauf cas particuliers + identification du patient, du service, du prescripteur, du prélèvement mais aussi infectiologue référent qui devra recevoir le résultat en copie Prélèvements Liquide articulaire . pour bactériologie : flacon, tube sec stérile, portagerm ou équivalent, seringue sans aiguilles et closes, directement en flacon d’hémoculture . pour la cytologie: tube EDTA pour cytologie Biopsie sous scan (très petite biopsie) en tube avec un peu de sérum physio stérile Hémoculture en cas d’infection aigüe Liquide drainage surveillance du site opéré infecté : = si + risque accru de rechute et récidive Prélèvements Prélèvements multiples = identification précise et claire avec sites anatomiques Informations cliniques : . antibiothérapie préalable . antécédents infectieux . reprise d’une prothèse . corticothérapie, … Date/heure/Préleveur/infectiologue référent (pour réponse) Contexte et recherches spécifiques éventuelles de mycobactérie doivent être précisée sur la demande.. Transport par le . étape pré-analytique capitale . transport rapide (<4 heures) / Portagerm® ou équivalent . température ambiante . liquide : ensemencement au bloc en flacon d’hémoculture ? . prévenir si arrivée tardive au laboratoire . traçabilité : tout retard d’acheminement doit être mentionné laboratoire Ensemencer dans les meilleurs délais Bactéries fragiles Préparation des prélèvements au laboratoire • prélèvements ostéo-articulaires précieux avec conséquences cliniques thérapeutiques voire médico-légales . non renouvelables le plus souvent . impératif = éviter la contamination • manipulés sous hotte à flux laminaire type PSM 2 – par un technicien (portant une casaque à usage unique et) des gants stériles – matériel stérile La lecture des cultures doit aussi se faire dans les mêmes conditions. Préparation des prélèvements au laboratoire • • prélèvements liquides : homogénéiser prélèvements solides (fragments d’os ou de tissus) – impérativement broyés dans un mortier stérile ou – par toute autre méthode de broyage • Petit morceau : • Plus gros morceau : Ultra-Turax™ – limite les manipulations donc les risques de contaminations – libération des bactéries de matrice osseuse/biofilm – diluant de l’eau de "qualité biologie moléculaire" pour ne pas hypothéquer une éventuelle analyse par biologie moléculaire (notamment par PCR universelle) du prélèvement. Conservation des prélèvements • à température ambiante avant arrivée au laboratoire • au température ambiante / frigo (?) si traitement impossible immédiatement • par congélation (à - 80°C ou à défaut à - 20°C) pour surplus de prélèvements jusqu’au rendu définitif pour - des colorations spécifiques - d’éventuelles recherches complémentaires: mycobactéries, champignons,… - des techniques moléculaires Examen direct Permettre éventuellement une orientation diagnostic rapide Présence d’une réaction cellulaire? / Présence de bactéries ? doit comporter : • coloration de Gram : bactéries / morphologie – sensibilité faible (6 %) – spécificité élevée (99 %) • coloration adaptée pour l’appréciation semi-quantitative des leucocytes et de la formule leucocytaire Examen direct Liquide articulaire • • • • prélèvement recueilli avec citrate ou héparine quantification des leucocytes formule leucocytaire recherche de microcristaux (pour faire le diagnostic différentiel de chondrocalcinose et de goutte articulaire aiguë). sans prothèse < 1 000 GB 5 000 - 60 000 GB/mm3 sans prothèse < 20% PNN 50% PNN Arthrose PR Trauma Algodystrophie Mécanique 60-80% PNN 100 000 GB > 90%PNN > 90% PNN Réactionnelle Cristaux Infection Lupus Chlamydia, Yersinia, Salmonelle, Shigelle, Campylo, Neisseria, Lyme Infection Psoriasis ……… PCR Cristaux Inflammatoire +/- septique Mathews, Ann. Rheum Dis., 2007 Septique Examen direct Liquide articulaire • • • • prélèvement recueilli avec citrate ou héparine quantification des leucocytes formule leucocytaire recherche de microcristaux (pour faire le diagnostic différentiel de chondrocalcinose et de goutte articulaire aiguë) avec prothèse Infection sur PTG Sensibilité Spécificité GB > 1700 / mm3 94% 88% PNN > 65% 97% 98% ** Trampuz, Am J Med , 2004 sensibilité = vrais (+), spécificité = vrais (-) Mise en culture Bactéries IOA = biofilm / intracellulaire donc des bactéries cachées, engluées et adhérentes des bactéries stressées des bactéries physiologiquement peu actives Bactéries IOA = très diverses donc Donc : des bactéries aérobies des bactéries anaérobies des bactéries à croissance rapide / lente des bactéries classiques / des bactéries exigeantes/non cultivables - milieux riches variés, nombreux - incubation longue Mise en culture Recommandation Référentiel de Microbiologie REMIC 2010 • GS aérobie : J1, J2, J10 et/ou J14 • PVX C02 : J1, J2, J10 et/ou J14 • • GS ou Gélose Schaedler anaérobie : J2, J3, J10 et/ou J14 Bouillon Schaedler : – lecture régulière jusqu’à J14 – Gram systématique à J14 avant de déclarer neg (voire repiquage systématique ?) + utilisation des flacons d’hémoculture avec une incubation prolongée jusqu’à J14 dans un automate: . pour liquide articulaire : . directement au bloc ou au lit du malade . enfant +++ . pour broyat en remplacement milieu liquide . plus simple à suivre . milieu optimisé . repiquage systématique en fin d’incubation ? Mise en culture Recommandation Référentiel de Microbiologie REMIC 2010 • autres milieux peuvent être ajoutés en fonction de contextes cliniques particuliers et/ou de recherches spécifiques, notamment pour la recherche de mycobactéries • Limitation FP par contamination au cours des lectures : . doubler l’ensemencement des géloses anaérobies et au sang cuit . seconde boite ouverte que pour la lecture tardive • Lecture attentive : . recherche des différents aspects de colonies . recherche micro-colonies / SCV : présence de variants métaboliques • recherche de Mycobacterium spp. sur demande spécifique initiale ou secondairement en cas de culture négative avec cytologie et contexte clinique évocateur Mise en culture Recommandation Référentiel de Microbiologie REMIC 2010 • culture positive précoce en milieu solide ne dispense pas – des lectures suivantes – d’une incubation complète jusqu’à au moins 14 J …. à la recherche de bactéries à croissance plus lente, les infections polymicrobiennes représentant 10 % à 15 % des IOA, notamment sur prothèse • positivité du milieu liquide doit faire stopper l’incubation qui ne permettra plus la croissance d’autres bactéries Diagnostic microbiologique des IOA Proposition ? Gélose sang aérobie Gélose Chocolat CO2 Gélose sang anaérobie J1 J2 (J3) J1 J2 (J3) (J2) J3 Gélose Chocolat CO2 Gélose sang anaérobie Bouillon Schaedler /Hemoc J10 ou J14 J10 ou 14 jusqu’à J14 + Gram syst Diagnostic bactériologique Infections aiguës à espèces classiques Bactéries " normales " • facile • ED + • réaction cellulaire ++ • culture rapide Infections chroniques Bactéries "stressées" • ED – • Peu de PNN • culture lente >> 48 heures • populations d'aspects différents • perturbation de l'activité des ATB • antibiogrammes différents S. aureus J10 J2 Staphylocoques à coagulase négative Interprétatation des cultures J2 J10 Interprétation des cultures J2 J10 ou culture uniquement en bouillon liquide (sachant qu’un seul cocci ou un seul bacille suffit à positiver) Interprétation des cultures Polymorphisme Polymicrobisme Contamination ???? Aide : caractères biochimiques (galerie), génétique éventt Interprétation des cultures Infection polymicrobienne (>15% des cas) • Rare (1 colonie) Staphylococcus aureus culture positive en 24h • Quelques colonies de Staphylocoque à coagulase négative à J4 • Nombreuses petites colonies de P. acnes à J10 Interprétation des cultures Variation phénotypique de la morphologie et de la résistance Souches Témoin d ’un même S. aureus Péni R Genta S Genta R Peflo S Peflo R Peflo I Rif S Rif I Rif R Fosfo S Fosfo I Fosfo S 1 morphologie 2 morphologies 2 morphologies Electrophorèse Champs pulsés Interprétation des cultures Variants microcolonies ou SCV "Small Colony Variants" Faciles à méconnaître : • • • • • • • décrits pour beaucoup d’espèces bactériennes (os, mucoviscidose) croissance lente et culture retardée colonies de petite taille perte pigmentation, perte d’hémolyse auxotrophisme (hémine, thymidine, ménadione...) métabolisme de l ’ATP profondément perturbé forme de résistance/survie des bactéries ? Variants microcolonies ou SCV Même souche (génétiquement) En bas : normale En haut SCV SCV Particularités des micro-colonies in vitro: . adhérence +++ . tps de génération (doublement) x 10 . perte de l ’activité bactéricide de certains ATB . persistance des bactéries dans des niches cellulaires protectrices (cellules endothéliales des vaisseaux, ostéoblastes, …)…. . peu de réaction inflammatoire locale . à l’origine d’échec thérapeutique Infection polymicrobienne Infection chronique depuis 8 ans, PTH 4 fois changée Cotyle et synoviale gauche (4 prélèvements): • S. aureus : Péni R, S à tout • S. epidermidis multi R Fémur gauche (4 prélèvements) • S. aureus : Péni R, S à tout • S. epidermidis : 3 antibiogrammes différents (oxa S/R, Genta S/R, Ery S/R, Fosfo S/R, Pef S/R, Rif S/R) • S. warneri : 2 antibiogrammes différents Culture et identification • Isoler tous les aspects avec au moins: – identification et antibiogramme sur les colonies différentes – beaucoup de • S. aureus et SCN : galerie pas top/Maldi-tof +++ • Streptocoques : galerie pas top • Anaérobie : galerie pas top – sur au moins deux prélèvements différents (si possible) Staphylocoques : . recherche systématique β -lactamase si PeniG S . recherche systématique du gène mecA (meti-R) (reco CA-SFM) . E-test Vanco et Teico systématique si glycopeptides utilisés? Culture et identification • Interprétation des résultats fonction de : – contexte clinique (infection aiguë vs chronique, ostéomyélite vs arthrite primitive vs infection sur prothèse, antibiothérapie préalable) – la ou les espèces identifiées – la nature et le nombre des prélèvements positifs et éventuellement pour ces derniers le nombre de milieux positifs et de colonies observées Mais: pas de consensus définitif probabilité d’infection augmente avec le nombre de prélèvements positifs en culture avec la même bactérie. Specificté 1+ / 5 à 7 prelts 26% 2+ / 5 à 7 prelts 53% 3+ / 5 à 7 prelts 85% Altweg, JSJB, 2003 Culture et identification • Interprétation des résultats Retenir le diagnostic d’IOA quand 1. ≥ 3 prélèvements per-opératoires ou 2 prélèvements espacés dans le temps (1 per-op + 1 LAR ou 1 Hémoc) avec positifs à la même bactérie (même espèce et même antibiogramme) appartenant à la flore cutanée (SCN, P. acnes, corynebactérium, …) 2. ≥ 2 prélèvements positifs à une bactérie n’appartenant pas à la flore cutanée et pour laquelle la question d’une contamination ne se pose pas (Staphylococcus aureus, Entérobactéries, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae, Salmonella spp., Listeria spp., Neisseria gonorrhoeae, Campylobacter spp., Pasteurella, …). Certains auteurs proposent des critères moins stricts, un seul prélèvement positif pouvant suffire pour retenir le diagnostic d’IOA pour des espèces classiquement pathogènes (S. aureus, Entérobactéries, Pyo, …) Culture et identification • Interprétation des résultats arthrites sans prothèse: pb car 1 seul prélèvements (liquide articulaire) Diagnostic = combinaison - cytologie - nature de l’espèce bactérienne isolée - nombre de milieux positifs - nombre de colonies en milieu solide +/- positivité bouillon Antibiogrammes • Méthodes classiques • Pour Staphylococcus sp : – Recherche mecA en systématique ? CA-SFM 201 "il est recommandé de vérifier l’absence de gène mecA ou de la PLP2a devant toute infection sévère à staphylocoque à coagulase négative" – CMI Vanco teico en systématique ? • Pour streptocoques non groupables : – Vérification CMI β-lactamines • Pour Pseudomonas sp : – Vérification CMI des β-lactamines utilisées pour traitement • Pour SCV : faire ATBgramme en boite Diagnostic microbiologique des IOA Compte rendu et interprétation étape ultime mais très importante . positivité oui/non . délai positivité . nbre prélts +/. nbre de milieux et nature + . nbre de colonies/milieu . nbre prélts +/- par patient . synthèse type anapathomopathologie ? Conservation Conservation des prélèvements : congélation -80°C ou -20°C . au moins jusqu’à la fin des incubations . le mieux 1 mois, le temps que les cliniciens réagissent s’ils veulent plus (PCR) Conservation des souches : congélation -80°C ou -20°C pas de tubes de conservation . minimum 1 an . le mieux: le plus longtemps possible (étude rechutes, récidives, …) Que faire des prélèvements restés stériles ? 10 à 25% des IOA selon les séries et les contextes épidémio-cliniques • patient sous antibiotique (arrêt minimum 15 j) • prélèvement mal fait • transport trop long • culture inadéquate • bactérie trop fragile • espèce particulière et/ou méconnue ou non cultivable • mycobactérie Comment améliorer le diagnostic ? Un exemple : ostéo-arthrite de l’enfant 190 prélèvements 89 des 104 prélèvements culture négative Culture <4 ans Positif : 86 S. aureus 38 K. kingae 25 S. Pyogenes 4 S. Agalactiae 3 S. Pneumoniae 6 H. influenzae 2 Others 8 >4 ans Negatif : 104 1+ Gélose sang 12+ Flacon Hémoc ana 24+ Flacon Hémoc aéro Bilan Kingella kingae Culture gélose Culture gélose + flacon hémoculture Culture gélose + flacon hémoculture + PCR PCR spécifique PCR Universel K. kingae 16SrDNA 60 - 29 + 29 K. Kingae 1/190 25/190 54/190 8 + N. meningitidis W13 (1) S. pyogenes (1) S. constellatus (1) S. aureus (1) Streptococcus spp. (1) Enterobacteria (2) Pseudomonas spp. (1) 52 - Nouveaux outils travail encore possible pour l’optimisation de conditions de culture (flacon d’hémoculture) et délais de mise en culture biologie moléculaire rapidité, sensibilité potentielle à optimiser + pas de miracle mais prometteur encore en phase d’évaluation nécessité de coordonner des études prospectives d’évaluation . de la PCR universelle . des PCR spécifiques . des schémas diagnostiques optimisés stratifiés par groupe patients pour l’instant : à réserver quand culture – et suspicion ++ Attention Sonicateur spécifique Nouveaux outils travail encore possible pour l’optimisation de conditions de culture (flacon d’hémoculture) et délais de mise en culture biologie moléculaire rapidité, sensibilité potentielle à optimiser + pas de miracle mais prometteur encore en phase d’évaluation nécessité de coordonner des études prospectives d’évaluation . de la PCR universelle . des PCR spécifiques . des schémas diagnostiques optimisés stratifiés par groupe patients pour l’instant : à réserver quand culture – et suspicion ++ Méthodes Pus, liquides articulaires Vortex – 1 min Muscles, os, synoviales Broyage – 1 min Ecouvillonnage – 1 min Décharge de l’écouvillon dans le diluant - Vortex Résultats SA positif en culture Culture stérile ou autres germes Total SA positif en GeneXpert 68 dont 59 SASM + 9 SARM 3 71 SA négatif en GeneXpert 4 16 20 Total 72 19 91 Résultats concordants GeneXpert / culture = 84 prélèvements Prélèvements négatifs pour SA en culture, détectés positifs par le GeneXpert mais . autres prélèvements osseux + à SA pour ces trois patients . sensibilité > de GeneXpert . exclus du calcul de Se Prélèvements positifs à SASM en culture, non détectés par le GeneXpert mais étude rétrospective sur prélèvements avec congélation/décongélation Conclusion • Diagnostic en < 1H des IOA à SASM et SARM par le test GeneXpert MRSA-SA SSTI directement à partir des prélèvements ostéo-articulaires • Sensibilité et spécificité excellentes • Nécessité d’études complémentaires prospectives – VPP, VPN – Impacts clinique et économique dans le cadre des IOA • Futurs tests multi-espèces • Avenir : diagnostic bactériologique « extemporané » – adaptation + rapide de l’antibiothérapie – modification de la prise en charge chirurgicale des IOA – recherche rapide de facteurs de virulence bactériens particuliers Approches moléculaires • PCR universelle 16S Avantage : pas d’à priori Pb: manque de sensibilité extraction / inhibiteurs plurimicrobien ? délais et coûts • PCR ciblées : + sensible que PCR 16S – Kingella – Staphylococcus – Streptococcus – Propionibacterium • Genexpert et MSSA/MRSA Conclusion • Points clés – gestion des prélèvements – conditions de cultures – travail délicat et difficultés rencontrées – résultats échellonnés parfois longs à obtenir • Nouveaux outils – amélioration des cultures – outils moléculaires
