Mémoire pour l’obtention du diplôme d’études spécialisées d’oncologie médicale Caractéristiques et implications cliniques de la détection des mutations circulantes du gène ESR1 chez des patientes traitées pour un cancer du sein métastatique en progression sous anti-aromatase Présenté par Laëtitia Augusto, le 24 Juin 2017 Sous la direction de Monsieur le Professeur Frédéric DI FIORE et Monsieur le Docteur Florian CLATOT Unité de Formation et de Recherche de médecine pharmacie Université de ROUEN Rapporteur : Pr Antoine Adenis, université de Lille 1 Table des matières I. GLOSSAIRE ..................................................................................................................................3 II. INTRODUCTION ...........................................................................................................................4 III. RATIONNEL DE L’ETUDE...........................................................................................................6 IV. MATERIEL ET METHODES ........................................................................................................8 V. a. Patients ...............................................................................................................................8 b. Echantillons sanguins...........................................................................................................8 c. Détection par droplet digital Polymerase Chain Reaction (ddPCR) .......................................9 d. Seuil de positivité ................................................................................................................9 e. Analyse statistique ............................................................................................................ 10 RESULTATS ................................................................................................................................ 11 a. Caractéristiques et suivi des patientes ............................................................................... 11 b. Statut mutationnel à progression ...................................................................................... 11 c. Valeur pronostique ............................................................................................................ 12 d. Valeur prédictive des traitements ultérieurs à la progression sous AA ............................... 14 d.1 Traitement post progression par chimiothérapie ........................................................... 14 d.2 Traitement post progression par hormonothérapie ....................................................... 14 e. Cinétique ESR1 avant progression...................................................................................... 15 f. Cinétique ESR1 après progression ...................................................................................... 16 VI. DISCUSSION .......................................................................................................................... 17 VII. CONCLUSION......................................................................................................................... 20 VIII. BIBLIOGRAPHIE : ................................................................................................................... 21 IX. ANNEXES: .............................................................................................................................. 25 2 I. GLOSSAIRE AA : Anti Aromatase ADN : Acide DésoxyriboNucléique ASCO : American Society of Clinical Oncology CHB : Centre Henri Becquerel cfDNA : ADN libre circulant ctDNA : ADN tumoral circulant dPCR : digital Polymerase Chain Reaction ddPCR : droplet digital Polymerase Chain Reaction ESR1 : Estrogen Receptor 1 FVA : Fraction Variant Allélique HER2 : Human Epidermal growth factor Receptor 2 HR : Hazard Ratio IC : Intervalle de Confiance IRON : équIpe de Recherche en ONcologie LBD : domaine de liaison au ligand mESR1 : Mutation ESR1 NGS : Next Generation Sequencing PI3K : PhosphoInositide 3-Kinase RH : Récepteurs Hormonaux RO : Récepteur Œstrogènes RR : Risque Relatif SBR : Scarff-Bloom-Richardson SG : Survie Globale SSR : Survie Sans Récidive Tp : Temps à la progression sous AA Tp-6 : 6mois avant progression sous AA Tp-3 : 3mois avant progression sous AA Tp+3 : 3mois après progression sous AA 3 II. INTRODUCTION Le cancer du sein se situe au 1er rang des cancers incidents chez la femme. Ainsi, 54 062 nouveaux cas de cancer du sein ont été diagnostiqués en 2015 en France métropolitaine(1). Environ 11 913 femmes en décèderaient faisant de ce cancer la première cause de mortalité féminine par cancer en France (Projection Inca 2015). On remarque, sur ces dernières années, une hausse du taux d’incidence parallèlement à une diminution de la mortalité. Le dépistage organisé, une prise en charge plus précoce ainsi que l’amélioration de la thérapeutique peuvent expliquer au moins en partie cette évolution inverse. Il est important de distinguer les cancers du sein localisés, des cancers du sein métastatiques. Ces derniers représentent 10% des cas de cancer du sein au diagnostic, mais 20 à 30% des cancers initialement localisés deviendront secondairement métastatiques. Différents facteurs pronostiques du risque de rechute métastatique et du décès ont été identifiés au plan clinique et histologique. Ainsi, la taille tumorale(2), l’atteinte ganglionnaire ou non(3), l’âge de la patiente(4) et le caractère inflammatoire ou non de la tumeur sont les principaux facteurs pronostiques cliniques du cancer du sein. Sur le plan histologique, les principaux facteurs pronostiques sont le grade de Scarff, Bloom et Richardson(5), la qualité des marges d’exérèse(6), la présence ou non d’embole vasculaire(7) et le Ki67(8). L’amplification du gène HER2 présente dans 15 à 20% des cancers du sein constitue un critère de mauvais pronostique mais prédit une réponse au traitement par anticorps monoclonaux anti-HER2(9). La présence de récepteurs hormonaux (RH) à la surface des cellules tumorales est retrouvée dans 70% des cancers du sein et est un facteur de bon pronostique(10). Leur présence conditionne la réponse à l’hormonothérapie et en fait un facteur prédictif majeur(11). Le traitement par hormonothérapie représente un axe thérapeutique de choix chez les patientes suivies pour un cancer du sein lors de la phase adjuvante d’un traitement local, mais également lors de la phase métastatique dès la 1ère ligne(12). Après la ménopause, la sécrétion d’hormones par les ovaires décline rapidement et la principale source d’œstrogènes provient alors de la conversion périphérique des androgènes d’origine surrénalienne (andostenedione et testostérone) par l’aromatase présente dans le foie, le muscle, les follicules pileux, le tissu adipeux et les cellules tumorales. Les inhibiteurs de l’aromatase (AA) permettent ainsi de supprimer cette activité. Actuellement, le traitement par AA en première ligne du cancer du sein avancé est associé à un taux de réponse global de 32%, une survie sans progression (SSP) de 9,4 mois et une survie globale (SG) de 34 mois(13) et constitue un traitement de référence. Cependant, malgré une bonne efficacité initiale, l’émergence de résistances secondaires ou acquises est inéluctable et aboutit à une progression tumorale. Cette hormonorésistance survient en moyenne 8 à 11 mois après l’instauration du traitement et correspond à l’apparition de résistance en lien avec la pression thérapeutique (14). En 1997, est mis en évidence pour la première fois une mutation de novo située au niveau du gène codant les récepteurs aux œstrogènes (RO) (15). Les RO appartiennent à la famille des récepteurs nucléaires caractérisés par la segmentation en 5 régions communes nommées A/B, C, D, E et F (Figure 1). 4 Ces régions participent à la formation des domaines fonctionnels suivants : - le domaine N-terminal (région A et B) qui a pour principal rôle l’activation de la transcription, le domaine de liaison à l'ADN ou DBD (région C) qui comme son nom l’indique participe à la liaison à l’ADN et joue un rôle dans la dimérisation des récepteurs, la région charnière (région D) qui a la capacité de changer de conformation après fixation du ligand et ensuite permet au récepteur de migrer dans le noyau cellulaire, la région C-terminale (région E et F) qui a pour rôle principal la fixation du ligand ; on parle de domaine de liaison au ligand ou LBD. Figure 1 : Structure des récepteurs aux œstrogènes Des études plus récentes réalisées à partir de séquençage de tumeurs ont montré que les mutations au niveau du gène codant le RO (Estrogen Receptor 1 ou ESR1), rares sur les tumeurs primitives, pourraient expliquer des résistances secondaires à l’hormonothérapie (16), ce d’autant que ces mutations affectent le LBD du gène ESR1(17). En effet, plusieurs études indépendantes ont analysé des métastases de patientes présentant un cancer du sein devenu hormonorésistant(17–19). Ces études retrouvent des mutations récurrentes d’ESR1 essentiellement au niveau des codons 537 et 538 de l’exon 8 en particulier chez des patientes traitées par AA. Dans ces travaux, la fréquence estimée de mutations ESR1 acquises était comprise entre 20 et 50% pour des patientes présentant un cancer du sein métastatique avec un taux de mutation très faible, voire nul, au sein de la tumeur primitive (0 à 3%). Sur le plan fonctionnel, les mutations du gène ESR1 sont responsables d’une modification conformationnelle du récepteur aux œstrogènes entrainant ainsi une activité de transcription indépendante du ligand(17). A noter que les mutations situées au niveau des codons 537 et 538 représentent 74% des mutations décrites (20). Les mutations ESR1 sont ainsi le reflet d’une hormonorésistance(21) survenant sous l’effet d’un traitement par AA en phase métastatique. Leur implication n’est actuellement pas démontrée lors d’une hormonorésistance acquise sous Tamoxifène(21). 5 III. RATIONNEL DE L’ETUDE Si le concept de mutations ESR1 acquises dans le tissu métastatique sous l’effet des AA a été suggéré par ces différents travaux, les questions concernant l’utilité de leur recherche ainsi que les modalités de cette détection ont été rapidement soulevées. Concernant ce dernier point, la réalisation de biopsies de métastases est un geste invasif potentiellement risqué qui ne peut donc servir d’outil de suivi en cours de traitement. C’est dans ce contexte que le concept de biopsie liquide a émergé comme voie la plus appropriée (22,23). Parmi les méthodes de détection disponibles, la technique de digital polymerase chain réaction (dPCR) nous a semblée être la plus adaptée à la pratique clinique compte tenu de sa sensibilité lui permettant de détecter de faibles taux de mutations (24,25) et de son coût. Notre équipe a été l’une des premières à travailler sur la détection des mutations ESR1 au niveau circulant. Ainsi, une étude pilote de faisabilité(26) de détection des mutations circulantes ESR1 a été menée par l’équIpe de Recherche en Oncologie (IRON). Les objectifs du travail ont été de développer la dPCR pour la détection des mutations ESR1 et de comparer le séquençage par technique Sanger au séquençage par dPCR sur métastase et plasma prélevé de manière concomitante. Pour ce faire, nous avions sélectionné 7 patientes suivies pour un cancer du sein métastatique RH+ en progression sous AA après une stabilité ou réponse tumorale initiale d’un minimum de 6 mois. Nous disposions pour chacune de ces patientes, de manière concomitante aux échantillons plasmatiques héparinés, d’un échantillon de tissu tumoral initial avant toute exposition à un traitement et de métastases pleurales prélevées au moment de la progression sous AA. Le séquençage Sanger sur métastase a ainsi permis d’identifier 4 patientes mutées (3 mutations différentes D538G, Y537N, Y537S) sur l’ensemble des 7 patientes. La technique de dPCR sur métastase, plus sensible, a permis de mettre en évidence 6 patientes mutées (dont 1 avec double mutation). La même analyse par dPCR réalisée sur ADN tumoral circulant retrouvait 4 mutations chez les 6 patientes mutées (Tableau 1). 6 Sefrioui et al, International Journal of Cancer, 2015 Tableau 1 : Mutations ESR1 détectées par séquençage Sanger ou dPCR sur métastases et par dPCR sur plasma Les résultats obtenus ont corroboré l’hypothèse selon laquelle la technique de dPCR sur sang circulant permettait d’identifier les mutations ESR1 de manière simple, sensible, spécifique et peu couteuse. Concernant notre pratique clinique, l’identification de mutations ESR1 pourrait modifier les modalités de prise en charge des patientes. Nous nous sommes alors demandé si certains traitements seraient plus efficaces que d’autres après progression sous AA chez des patientes présentant une mutation ESR1. Nous nous sommes également questionné sur la possibilité d’une détection circulante, en amont de la progression clinique. Enfin, la question de l’impact de la présence d’une mutation ESR1 sur la survie a également été soulevée. Dans ce contexte, l’objectif de notre étude était de déterminer la valeur pronostique et prédictive de la présence d’une mutation circulante ESR1 au moment de la progression sous AA et de suivre la cinétique d’apparition des mutations au niveau circulant. Pour les besoins de ce travail réalisé au sein du groupe IRON, ma contribution personnelle a été de réaliser l’ensemble du recueil de données cliniques et biologiques après avoir sélectionné les patientes en fonction des critères d’inclusions prédéfinis. Sur le plan technique, j’ai contribué à la recherche et au désarchivage des prélèvements biologiques congelés et stockés avant de participer en partie aux analyses biologiques par dPCR. Enfin, j’ai pu contribuer à la réalisation de l’analyse statistique ainsi qu’à l’écriture de l’abstract et de l’article (joints en annexes). 7 IV. MATERIEL ET METHODES a. Patients Les patientes ont été sélectionnées à partir des réunions de concertation pluridisciplinaire hebdomadaires d’oncologie générale du centre Henri Becquerel (CHB) de Janvier 2010 à Décembre 2012 inclus. Toutes les patientes de plus de 18 ans suivies pour un cancer du sein RH+ localement avancé inopérable ou métastatique présentant une progression clinique, radiologique et/ou biologique en cours de traitement par première ligne d’AA associé ou non à une thérapie ciblée étaient incluses. Les patientes pouvaient avoir reçues un ou plusieurs traitements antérieurs par chimiothérapie, tamoxifène ou fulvestrant. En cas de précédente exposition aux AA lors de la phase adjuvante, un délai de 2 ans minimum devait être respecté entre la fin de l’exposition à l’AA et l’évolution métastatique. Pour chaque patiente, les facteurs pronostiques cliniques et histologiques étaient recueillis, ainsi que l’évaluation clinique, biologique et radiologique après chaque ligne de nouveau traitement (stabilité, progression ou réponse partielle). L’ensemble de ces données étaient obtenues à partir des comptes rendus d’hospitalisations ou de consultations. b. Echantillons sanguins Au CHB, chaque patiente bénéficie d’un prélèvement sanguin concomitant à l’évaluation clinique réalisée tous les 3 à 6 mois. Dans notre étude, toutes les patientes possédaient un échantillon sanguin au moment de la progression clinique et/ou biologique en cours de première ligne de traitement par AA. En cas de mutation détectée à Tp (Temps à progression), les prélèvements disponibles à Tp-6 (Tp6mois), Tp-3 (Tp-3mois) et Tp+3 (Tp+3mois) étaient analysés (Figure 2). Les échantillons de sang ont été recueillis dans des tubes héparinés puis traités dans un délai de deux heures après la collecte, centrifugés une fois à 2000g (10 min) à 4°C et stockés à -20°C. Toutes les patientes sélectionnées avaient signé un formulaire de consentement permettant la conservation et l'étude de leurs échantillons biologiques. Cette étude a été approuvée par le Comité d’Ethique Institutionnel du Centre Henri Becquerel (N° d’enregistrement 1503B). Figure 2 : Schéma des différents temps de prélèvements 8 c. Détection par droplet digital Polymerase Chain Reaction (ddPCR) L’ADN a été extrait de 0,4 à 2 ml de plasma hépariné à l'aide du kit QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Germany) puis élué dans un volume de 30µL et conservé à -20 °C jusqu’à l’étape de quantification. La quantification d’ADN double brin a été réalisée par une méthode colorimétrique utilisant le kit Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA) et par fluoromètre microplaque de type Twinkle LB970 (Berthold, Bad Wildbad, Germany). Nous avons utilisé la plateforme de droplet digtal PCR (Qx200® droplet digital PCR system, Bio-rad laboratories, Hercules, CA, USA) afin de détecter la présence de mutations circulantes ESR1 dans des échantillons de plasma. Quatre nanogrammes de cfDNA ont été préamplifiés avec 2 µl d’héparinase (New England iolabs, Ipswich, MA). Nous avons utilisé un Taqman SNP genotyping assay (Life Technologies, Carlsbad, CA) pour la détection des mutations ESR1 : Y537N, Y537S, Y537C et D538G. Les conditions de cycle de PCR et la composition des réactifs sont décrits en annexes (Annexe 1). Le nombre total de copie d’ADN était compris entre 200 et 2000 copies / µl pour chaque réaction. Au moins trois puits de contrôle négatif sans ADN ont été inclus dans chaque test. Chaque ADN mutant a été dilué en série avec de l’ADN de type sauvage (expériences réalisées en triple) pour évaluer la linéarité et la reproductibilité de ces méthodes. d. Seuil de positivité Le bruit de fond, noté LOD pour « limit of detection » est défini par la concentration minimale de l'allèle mutant qui peut être détectée à partir d'un témoin négatif. Pour évaluer le bruit de fond de notre méthode, la charge de l'allèle a été mesurée à partir de 10 échantillons d’ADN libre circulant (cfDNA) préamplifiés et extraits de plasmas héparinés témoins provenant de patients indemnes de cancer du sein. Ces plasmas témoins ont été prélevés, analysés et stockés dans les mêmes conditions que nos tubes de patients utilisés dans l’étude. Basé sur Hindson et al., nous avons défini pour chaque mutation un seuil pertinent pour discriminer les statuts positifs et négatifs(25). La fraction de variant allélique (FVA) a été définie comme étant la proportion de copies d'ADN mutants par rapport à la somme des copies d'ADN mutants et d’ADN de type sauvage obtenus par ddPCR. Les échantillons prélevés au moment de la progression sous AA ont été considérés comme mutés si au moins deux analyses par ddPCR indépendantes réalisées par deux opérateurs indépendants trouvaient une FVA au-dessus du seuil de mutation. Les analyses de ddPCR ont toutes été effectuées en aveugle sans connaitre les données cliniques. En raison d’une quantité de plasma restante parfois insuffisante, certains échantillons à Tp-6, Tp-3 et Tp+3 n’ont été analysés qu’une seule fois par ddPCR. 9 e. Analyse statistique Le critère principal était l’évaluation de la survie globale en fonction du statut mutationnel ESR1 circulant au moment de la progression sous AA. Dans l'hypothèse que 30% des patientes possèdent une mutation ESR1 au moment de la progression sous AA et que 70% des patientes présentant une progression sous AA (27) mourront au cours des 3 années suivantes (28), nous avons calculé qu’il fallait au moins 121 patientes (29) pour détecter un hazard ratio (HR) d’au moins deux fois le risque de l'autre groupe avec une puissance de 80% et un risque alpha de 5% en utilisant le modèle de Cox. Les critères secondaires regroupaient la fréquence de mutation circulante ESR1 au moment de la progression sous AA, et la survie sans progression de Tp à l’instauration d’une nouvelle ligne thérapeutique. Enfin, nous avons décrit la cinétique des mutations circulantes ESR1 avant et après progression sous AA. Les facteurs pronostiques de SSP et SG ont été déterminés parmi les variables suivantes : le temps entre l’évolution métastatique et la progression sous AA, le performance statut au moment de la progression, le taux de cfDNA à la progression, la présence d’une mutation circulante ESR1 au moment de la progression, un âge supérieur à 65 ans à progression sous AA, le nombre de lignes de traitement avant l'introduction d’AA, la durée d'exposition à l’AA et le type de traitement après progression sous AA. Les comparaisons entre les groupes ont été effectuées en utilisant le test du chi 2 ou le test de Wilcoxon. La SG a été calculée à partir de Tp jusqu’à la date du décès toutes causes confondues. La SSP a été calculée à partir du temps Tp jusqu’ à la date de la progression clinique et/ou biologique (ou la mort toute cause confondue) après la nouvelle ligne de traitement suivant la progression sous AA. Les patientes décédées à Tp ont été exclues de l'analyse de survie. Les courbes de survie ont été calculées en utilisant la méthode de Kaplan-Meier et comparées avec le test du logrank. L'analyse multivariée a été réalisée en utilisant le modèle de Cox. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant la version du logiciel R 3.0.1. 10 V. RESULTATS a. Caractéristiques et suivi des patientes Au total, 156 patientes ont été incluses dans l’étude. Compte tenu d’une quantité insuffisante d’ADN circulant, 12 patientes ont été exclues. Trois patientes sont décédées dans les jours suivants la progression, elles ont été exclues de l’analyse en survie (Figure 3). b. Statut mutationnel à progression Lors de la progression sous AA, 44 patientes (30,6%) avaient au moins une mutation circulante ESR1. Au total, 63 mutations ont été retrouvées, D538G et Y537S étaient les deux plus fréquentes avec un nombre respectif de 24 et 21 mutations. Les mutations Y537N et Y537C étaient présentes respectivement dans 16 et 2 échantillons. Parmi les 44 patientes mutées, 28 avaient une mutation circulante unique, 13 avaient une double mutation et 3 avaient une triple mutation circulante. La présence d'une mutation ESR1 circulante n’était pas liée à un sous-groupe de population. A noter que le temps d'exposition médian aux AA était significativement plus long chez les patientes présentant une mutation ESR1 circulante que chez les patientes non mutées (15 mois et 10,5 mois, respectivement, p = 0,02). Figure 3 : Diagramme de l’étude 11 c. Valeur pronostique Le suivi médian à partir de l'initiation de l'AA était de 40 mois [4-94]. Au moment de l'analyse, 111 patientes étaient décédées, 33 étaient en vie, et aucune patiente n’était perdue de vue. Parmi les 144 patientes, 3 patientes (une mutée et deux nonmutées) sont décédées dans les jours suivants la progression et ont été exclues de l'analyse de la survie. Parmi les 141 patientes analysées, la survie globale médiane était significativement plus faible en cas de détection d’une mutation circulante ESR1 : 15,5 mois [2-44] contre 23,8 mois [2-70]; p = 0,0006 ; HR = 1,9 IC [1,2 -3,1] (Figure 4). Figure 4 : Survie globale en fonction du statut mutationnel Cette valeur pronostique péjorative a été confirmée en analyse multivariée (HR = 1,9 ; p = 0,002 IC [1,3-3]) (Tableau 2). Les autres principaux facteurs pronostiques péjoratifs étaient : Un performance status > 1 (HR = 3 ; p <0,0001 IC [1,9 à 4,7]) Une quantité d'ADN total circulant élevée (au-dessus de la médiane) (HR = 1,8 ; p = 0,006 IC [1,2 à 2,7]). 12 Tableau 2 : Analyse en survie globale : facteurs pronostiques Concernant la SSP, celle-ci était diminuée chez les patientes mutées ESR1 avec une médiane de 5,9 mois comparativement à 7,0 mois pour les patientes non mutées (p = 0,002 ; HR = 1,7 IC [1,1-2,6] (Figure 5). Figure 5 : Survie sans progression en fonction du statut mutationnel 13 En analyse multivariée, si l'on considérait la survie sans progression, avoir une mutation circulante ESR1 et avoir reçu plus d'une ligne de chimiothérapie avant l'introduction d’AA étaient les 2 facteurs de mauvais pronostiques retrouvés (p = 0,008 ; HR = 1,7 IC [1,2-2,5] et p = 0,009 ; HR = 2.3 IC [1,2 au 4,1], respectivement) (Tableau 3). Tableau 3 : Analyse en survie sans progression : facteurs pronostiques d. Valeur prédictive des traitements ultérieurs à la progression sous AA Après progression sous AA, la plupart des patientes ont reçu un traitement par antiœstrogènes (tamoxifène ou fulvestrant, 51 patientes) ou par chimiothérapie (58 patientes). L'ajout d'everolimus ou d’un inhibiteur de Her2 était moins fréquent (14 et 2 respectivement). Huit patientes ont bénéficié d’un changement d’AA, 4 patientes n’ont eu aucune modification du traitement malgré la progression, 3 patientes étaient décédées à la progression et 4 patientes ont reçu d'autres traitements. Concernant l’ensemble des patientes, qu’elles soient mutées ou non mutées, il n’a pas été mis en évidence de différence significative en terme de SSP ou SG en fonction des traitements reçu après progression sous AA. d.1 Traitement post progression par chimiothérapie Chez les patientes traitées par chimiothérapie après progression sous AA, nous avons mis en évidence une SG médiane de 16 mois chez les patientes mutées contre 27 mois chez les patientes non mutées (p = 0,014 ; HR = 2,0 IC [1,01-4,0]). Des résultats similaires ont été observés en SSP. En effet, la SSP médiane étaient de 7 mois en cas de mutation contre 9 mois sans mutation (p = 0,009 ; HR = 1,9 IC [1,01-3,6]). d.2 Traitement post progression par hormonothérapie Chez les patientes traitées par une hormonothérapie hors AA, seule une tendance à une diminution de la SG et SSP en cas de mutation a été retrouvée. La SG médiane était de 12 mois en cas de mutation contre 26 mois sans mutation (p = 0,09 HR = 1,7 IC [0,9-3,3]) et la SSP médiane était de 5 mois en cas de mutation contre 6 mois sans mutation (p = 0,17 ; HR = 1,4 IC [0,8-2,8]). 14 Nous avons alors combiné les patientes ayant été traitées par chimiothérapie et celles traitées par hormonothérapie hors AA. Il est apparu de manière significative une altération de la SG en cas de mutation ESR1 : 16 mois contre 27 mois chez les patients non mutées (p = 0,002 ; HR = 1,9 CI [1,1-3,0]). Enfin, en ce qui concerne les patientes qui avaient été traitées par AA, ou par AA + everolimus, après progression sous AA, le nombre limité de patientes n’a pas permis d’analyse fiable. Cependant, même si cela reste une tendance, nous mettons en évidence une amélioration de la SG chez les patientes non mutées (SG = 42 mois versus 23 mois p = 0,17, HR = 2,1 IC [0,5-8,4]) par rapport aux patientes mutées. Nous retrouvons notamment chez les 11 patientes non mutées traitées par AA + everolimus une SG médiane particulièrement longue de 46 mois. e. Cinétique ESR1 avant progression Parmi les 44 patientes présentant une mutation circulante ESR1 au moment de la progression sous AA, des échantillons de plasma étaient disponibles à Tp-3 ou à Tp6 dans 43 cas. En cas de mutations doubles ou triples, la mutation prédominante était retenue pour l’analyse ultérieure. Parmi ces patientes, nous avons pu analyser les échantillons à la fois à Tp-3 et à Tp6 pour 20 d’entre elles, tandis que ces patientes étaient sous AA et ne présentaient pas encore de progression clinique. Parmi les 20 patientes, 15 (75%) avaient une mutation circulante ESR1 détectable avant la progression clinique, et dans la plupart des cas, le taux de mutation augmentait à 3 mois (p = 0,02 ; entre Tp-6 et Tp-3 et p = 0,0087 entre Tp -3 et Tp,) (Figure 6). A noter que 2 patientes avaient une diminution du taux de mutation entre Tp-3 et Tp. Parmi nos échantillons, 8 patientes analysées présentaient des mutations doubles (n=6) ou triples (n=2) et possédaient des prélèvements à la fois à Tp-3 et Tp-6. Chez 5 d’entres elles (62%) la mutation prédominante était détectable avant Tp. Les mutations non prédominantes étaient le plus souvent non détectables (7/10 mutations) à la fois à Tp-6 et Tp-3 ou à une valeur inférieure à celle de la mutation prédominante. Chez une des patientes, la mutation Y537S est devenue prédominante à Tp alors que la mutation D538G avait un taux plus élevé à la fois à Tp-6 et Tp-3. Chez une autre patiente, une diminution du taux d’une mutation contrastait avec l'apparition d'une autre suggérant une évolution dissociée de 2 sous-clones. 15 Figure 6 : Détection pré clinique des mutations circulantes ESR1. Rouge = Progression tumorale au moment du prélèvement. Bleu= Stabilité ou réponse tumorale au moment du prélèvement f. Cinétique ESR1 après progression Enfin, nous avons également étudié l'évolution du taux de mutation circulante ESR1 dans les échantillons de plasma après progression sous AA. Nous disposions alors pour 33 des 44 patientes mutées (75%) de plasma à Tp+3. Parmi elles, 16 (48%) étaient en progression clinique, tandis que les autres présentaient une stabilité ou une réponse partielle. Toutes les patientes (n = 6, 18%) présentant une augmentation de la quantité de mutation ESR1 circulante au bout de 3 mois étaient en progression clinique. En revanche, chez les 27 patientes présentant une diminution de la quantité de mutation ESR1 circulante, 10 (37%) étaient en progression clinique (Figure 7). Par ailleurs, 3 patientes ne présentaient aucune mutation détectable et pourtant avaient une progression clinique. Figure 7 : Evolution des mutations circulantes ESR1 après changement de thérapeutique. Rouge = Progression tumorale au moment du prélèvement. Bleu= Stabilité ou réponse tumorale au moment du prélèvement. 16 VI. DISCUSSION Notre étude a montré que la mutation circulante ESR1 était détectable chez 30,6% des femmes suivies pour un cancer du sein métastatique lors de la progression sous AA. Nous avons également montré que la présence de cette mutation circulante était un facteur de mauvais pronostic tant en SSP qu’en SG. Notre étude n’a pas permis d’identifier un rôle prédictif de la mutation mais nos analyses ont pu être biaisées par le nombre insuffisant de patient. Enfin, l’étude de la cinétique s’est révélée prometteuse puisqu’elle retrouve un taux de détection pré clinique de 75%. Dans notre étude, sur 144 patientes 30,6% possédaient au moins une mutation du gène ESR1. Des taux similaires sont retrouvés dans la littérature si l’on retient les études aux critères comparables. En effet, il a été décrit 37% de mutations du gène ESR1 dans l’étude de Spoerke et al. (30), 28,6% dans l’étude de Chandarlapaty et al (31). et 25,3% dans l’étude de Fribbens et al. (32) pour un total respectif de 153, 541 et 395 patients. De même le caractère polyclonal des mutations ESR1 et le taux de double (29,5%) et triple mutation (6,8%) est proche de celui précédemment rapporté (26,32,33). Notre étude a retrouvé un taux de mutation ESR1 D538G de 54,5 %, Y537S de 47,7%, Y537N de 36,4% et Y537C de 4,5%. Notre travail a permis de montrer que la présence d’une mutation ESR1 chez les femmes suivies pour un cancer du sein métastatique en progression sous 1 ère ligne d’hormonothérapie apparaissait clairement comme un facteur de mauvais pronostique en SG (15,5 M versus 23,8 M ; p = 0,0006) et en SSP (5,9 M versus 7,0 M ; p = 0,002). L’analyse de sous groupe de l’essai clinique BOLERO 2 (n = 541) retrouvait également des résultats en ce sens avec une SG de 20,7 mois chez les patientes mutées contre 32,1 mois pour les patientes non-mutées (p <0,0001)(31). Dans une analyse de sous-groupe de l'essai clinique PALOMA-3 (n = 395) une SSP de 7,3 mois en cas de mutation contre 9,2 mois était retrouvée pour les patientes non-mutées (p = 0,02)(32). Spoerke ne trouvait aucune différence lié à la mutation ESR1 (30). En dehors d’une moins bonne réponse à la poursuite d’un traitement par AA(21), la valeur prédictive d’une mutation ESR1 sur le traitement reçu après progression sous AA n’était pas clairement établit. Dans notre étude, plusieurs molécules ont été instaurées après progression sous AA : le tamoxifène, le fulvestrant ou la chimiothérapie. La présence d’une mutation ESR1 n’a pas été associée à une réponse différentielle selon les traitements reçus. Cependant, le nombre limité de patientes dans chaque sous groupe de traitement (tamoxifène n=34, fulvestrant n=17 ou chimiothérapie n=58) et le caractère rétrospectif de l’analyse ne permettent pas de conclure formellement. Le fulvestrant est largement utilisé en situation d’hormonorésistance chez des patientes suivies pour un cancer du sein métastatique. Récemment, l’étude SoFEA qui a inclus des patientes suivies pour un cancer du sein métastatique hormonorésistant a montré chez les patientes mutées ESR1, un bénéfice significatif en SSP du fulvestrant (seul ou associé à l’anastrozole) par rapport à l’exemastane (5,7 M versus 2,6 M, p=0,02). Chez les patientes non mutées, il n’existait pas de différence significative entre ces 2 traitements. L’étude PALOMA 3 a comparé 17 fulvestrant + palbociclib à fulvestrant seul chez des patientes traitées pour un cancer du sein métastatique et ayant progressé sous AA. Les auteurs ont rapporté un bénéfice en survie lors de l’utilisation du fulvestrant seul chez les patientes mutées avec une SSP de 3,6 mois. La SSP chez les patientes non mutées était de 5,4 mois. Concernant le bras de traitement par fulvestrant + palbociclib, il a été démontré chez les patientes mutées ESR1 et non mutées une amélioration de la SSP par rapport au bras de traitement par fulvestrant seul (respectivement SSP = 9,4 M versus 3,6 M (p=0,002) et SSP = 9,5 M vs 5,4 M (p<0,001)). Actuellement en phase métastatique, une des options thérapeutiques en cas d’hormonorésistance est l’ajout d’un traitement par inhibiteur de mTor(27). L’essai clinique BOLERO 2 qui s’adressait à des patientes ayant progressé sous letrozole ou anastrozole a mis en évidence une augmentation de la SSP chez les patientes non mutées dans le bras exemestane + everolimus versus exemestane seul (8,5 M versus 3,9 M, p<0,001). Concernant les patientes mutées ESR1, il a été décrit une augmentation de la SSP chez les patientes mutées D538G (5,8 M versus 2,7 M, p<0.001) mais ce bénéfice n’a pas été retrouvé chez les patientes mutées Y537S (4,17 M vs 4,14 M, p=0,95). Ces résultats suggèrent donc une réponse possiblement différente selon le type de mutation ESR1 envisagée. D’un point de vue préclinique, Toy et al. ont récemment montré que les mécanismes de résistances et leurs conséquences fonctionnelles pouvaient en effet être différents en fonctions du type de mutations ESR1. Ils ont notamment décrit une activation constitutionnelle maximale du RO chez les patientes mutées Y537S conférant ainsi une résistance au fulvestrant in vivo. Des antagonistes des RO plus puissants tels que l’AZD9496 permettraient d’obtenir une meilleure efficacité que le fulvestrant chez les patientes mutées Y537S(34). A l’inverse, d’autres mutations comme E380Q ou S463P seraient plus sensibles à l’inhibition apportée par le fulvestrant. Ces résultats préliminaires nécessitent d’être confirmés mais placent le fulvestrant, seul ou en association avec le palbociclib et l’everolimus comme des traitements prometteurs chez les patientes porteuses de la mutation ESR1. L’ensemble de ces données soulignent l’importance de connaitre le statut mutationnel ESR1 au moment de la progression sous AA afin d’orienter la prise en charge thérapeutique. La possibilité d’une détection pré-clinique des mutations ESR1 avait été suggérée par notre équipe (26). Notre nouveau travail, grâce à de nombreux échantillons disponibles, a permis d’établir de façon originale la cinétique des mutations ESR1 à Tp-6, Tp-3 et Tp pour 20 patientes. Nous observons ainsi que 75% des mutations ESR1 sont détectables avant même toute progression clinique. Se pose alors la question de l’intérêt sur la SSP et la SG d’un changement précoce de traitement levant ainsi la pression de sélection établie par les AA. Ainsi, l’étude de phase III PADA-1 vient de débuter (NCT03079011) et prévoit de recruter 800 patientes traitées en première ligne métastatique d’un cancer du sein RH+ par AA + palbociclib. Un suivi tous les 2 mois sera réalisé, et en cas d’apparition d’une mutation ESR1 circulante (attendue pour 200 patientes), une randomisation entre poursuite de l’association AA + palbociclib ou un relais vers du fulvestrant + palbociclib sera proposé. Les co-objectifs primaires de cette étude sont l’analyse de la toxicité des associations hormonothérapie + inhibiteur cdk4/6, ainsi que la comparaison de la SSP entre les deux bras explorés en cas de mutation. Cette étude 18 d’ampleur permettra donc de mieux suivre l’émergence des mutations ESR1, mais également d’évaluer le potentiel bénéfice à un changement thérapeutique précoce basé sur un marqueur tumoral circulant. Dans notre étude, après progression sous AA, nous avons analysé l’évolution des taux circulants de mutation ESR1 à tp+3 en fonction du traitement reçu et de l’évolution clinique. En cas d’augmentation du taux de mutation, il était retrouvé une progression clinique chez 100% des patientes (n=6). Ces résultats sont compatibles avec ceux rapportés par Takeshita et al.(11 progressions sur 13 patientes)(35). L’inverse n’était cependant pas vrai dans notre étude. En effet, la diminution du taux de mutation n’était pas nécessairement liée à une réponse clinique. Spoerke et al. ont également décrit une baisse du taux de mutations alors que les patientes présentaient une maladie stable ou en progression. Ils ont émis l’hypothèse d’une hétérogénéité tumorale avec l’idée que certaine lésions porteuses de mutations ESR1 répondaient alors que d’autres lésions (dont ils ne disposaient pas de marqueur biologique) progressaient(30). Une telle hétérogénéité moléculaire et une évolution génétique parallèle des différents sites métastatiques en cours de traitement a déjà été mise en évidence lors du traitement par un inhibiteur de PI3K chez des patientes suivies pour un cancer du sein(36). Enfin, un des problèmes clés de l'analyse des mutations circulantes est la définition rigoureuse d'un seuil positif. En effet, il n'y a pas de consensus sur cette définition. Wang et al. parlaient d’échantillon positif si la fréquence des allèles était supérieur à 0 après soustraction du bruit de fond, si 2 tests positifs étaient détectés à plusieurs reprises, et si la fréquence de l'allèle était supérieur au bruit de fond ajusté sur au moins 3 tests indépendants(37). Pour Schiavon et al., une mutation était considérée comme positive s’il y avait au moins la présence de mutants ESR1 sur 2 tests(21). Enfin, Takeshita et al. mettaient l'accent sur l'augmentation du taux de mutation ESR1 entre 2 échantillons plutôt que de définir un seuil positif basé sur un seul point(35). Il est impératif d’établir une définition fiable et commune à tous dans l’optique d’une utilisation clinique quotidienne. L’étude prospective FMER, actuellement en cours dans notre centre et au centre François-Baclesse a pour objectif, entre autres, de proposer une définition stricte et reproductible du seuil de positivité des mutations ESR1 afin de valider cette pratique en routine. Même si les implications définitives nécessiteront les résultats d’essais prospectifs, les contours de la recherche de mutations circulantes ESR1 se précisent : probable intérêt en situation métastatique soit durant une exposition à des AA, soit au moment de la progression sous AA. Cette analyse permettra certainement de proposer un traitement spécifique à partir des molécules déjà disponibles, ou des nouvelles hormonothérapies en cours de développement. Par ailleurs, plusieurs questions restent entières. En premier lieu, rappelons que la principale délivrance d’AA se fait lors de la phase adjuvante. Or, aucune étude ne s’est intéressée à l’incidence des mutations ESR1 circulantes en fin de traitement adjuvant. Au moment de la rechute métastatique, Schiavon a décrit une prévalence de mutations ESR1 plus faible chez les patientes exposées aux AA en adjuvant par rapport aux patientes traitées uniquement en phase métastatique par AA (5,8% versus 36,4% p=0,0002). Elle a alors émis l’hypothèse qu’en situation de maladie micro-métastatique, la charge tumorale était 19 trop faible pour permettre d’identifier une mutation ESR1 et pour laisser aux AA la place d’exercer leur pression de sélection et donc de sélectionner un clone majoritaire mutant. Il est possible qu’il existe différents mécanismes d’acquisition d’hormonorésistance. Dans ce contexte l’étude rétrospective ERASE a été mise en place au centre Henri Becquerel afin de définir le taux de mutation ESR1 en fin de traitement adjuvant par AA et à la rechute. Par ailleurs, les mutations ESR1 n’expliquent qu’une part seulement des mécanismes d’hormonorésistance. De nouveaux mécanismes moléculaires potentiellement traçables au niveau circulants ont récemment été décrits. Ainsi, Magnani et al. ont décrit l’émergence de l’amplification CYP19A1 in vivo dans des modèles résistants aux AA. Cette amplification confère aux RO une indépendance vis-à-vis des œstrogènes et ainsi une diminution de la sensibilité aux AA. Basé sur leurs études in vivo, ils ont suggéré que l'amplification CYP19A1 pourrait apparaître en cours de traitement par inhibiteurs réversibles, mais être antagonisée par un inhibiteur irréversible comme l’exemestane. Concernant l’amplification CYP19A1, un taux de 21,5% a été retrouvé parmi les patientes qui rechutaient et qui avaient été traitées en adjuvant par AA contre seulement 4% chez des femmes n’ayant pas été traitées par AA en adjuvant, suggérant ainsi un rôle des AA dans la sélection de clones mutants (38). VII. CONCLUSION Notre étude a clairement illustré le potentiel clinique de la recherche de mutations circulantes ESR1 par dPCR dans la prise en charge des cancers du sein métastatiques RH+ hormonorésistants. La détection d’une mutation circulante ESR1 lors de la progression sous AA chez ces patientes est un facteur majeur et indépendant de mauvais pronostique. Le suivi de la cinétique des mutations ESR1 permet de détecter une résistance pré-clinique aux AA. Désormais, la confirmation de ces résultats, la question d’un changement précoce de traitement en cas d’apparition de mutation circulante et l’évaluation de nouveaux traitements spécifiques tels que des modulateurs des RO plus puissants sont aujourd’hui des questions posées dans le cadre d’essais prospectifs. 20 VIII. BIBLIOGRAPHIE : 1. InVS, INCa. Projection de l’incidence et de la mortalité par cancer en France en 2012, Rapport technique (2012). 2. Neville AM, Bettelheim R, Gelber RD, Säve-Söderbergh J, Davis BW, Reed R, et al. 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ANNEXES: Annexe 1 : Conditions de cycle de PCR et la composition des réactifs Les conditions de digital PCR ont été optimisées pour identifier la température optimale d'hybridation / extension pour chaque mutation, en utilisant l'ADN de type sauvage ensemencé avec un oligonucléotide synthétique mutant inséré dans le plasmide pMT (Invitrogen, GeneArtTM, Carlsbad, CA). 25 Annexe 2: Abstract ASCO 2016 présenté en communication orale Prognostic and predictive value of circulating ESR1 mutations in metastatic breast cancer patients (mBC) progressing under aromatase inhibitor (AI) treatment L Augusto1, N Sarafan-Vasseur2,3, A Perdrix2,4, L Beaussire2,3, J Delacour2,3, D Sefrioui2,3,5, C Calbrix4, JM Picquenot4,6,T Frebourg3, F Jardin6, F Di Fiore1,2,3,5 , F Clatot1,2,6 (1)Oncologie Médicale, Centre Henri Becquerel; (2) Equipe de Recherche en Oncologie (IRON); (3) INSERM U1079; (4) Bio-pathologie, Centre Henri Becquerel; (5) Oncologie digestive, CHU Rouen; (6) INSERM U918 Background: We recently reported that the detection of somatic and circulating activating ESR1 mutations is related to AI resistance in hormone receptor positive (HR+) mBC (Sefrioui et al., 2015). We aimed to evaluate the predictive and prognostic values of circulating ESR1 mutations detection at time of progression in mBC patients under AI. Methods: This study is a monocentric retrospective analysis of all consecutive patients treated with first-line AI for HR+mBC from 2008/01 to 2010/12. ESR1 circulating mutations rates (D538G, Y537S/N/C) were assessed by droplet digital PCR on plasma samples at progression. The impact of the mutational status on OS, PFS and clinical response to subsequent treatments was determined by univariate and multivariate analysis. Results: A total of 144 HR+mBC patients was analyzed. Median follow-up from initiation of AI was 40 months (range 4-94). At progression, 44 patients (30.6 %) presented at least one ESR1 circulating mutation (D538G 54%, Y537S 45%, Y537N 34%, Y537C 4%). Median OS after progression was 15 months (2-44) for mutated patients vs 24 months (2-70) for non-mutated patients (HR=1.9; p=0.006). For the whole population, performance status>1 (HR=3.0; p<0.0001), circulating ESR1 mutation (HR=1.9; p=0.002), and high level of cfDNA (H=1.8; p=0.006) were independent prognostic factors for OS. The mutational status was also independently related to a worse PFS (HR=1.7; p=0.008). After progression, 56 patients were treated by chemotherapy, 55 by fulvestrant/tamoxifen, 14 by AI + everolimus and 19 by no or other modalities. The detection of circulating ESR1 mutation was independently related to a worse OS and PFS in the chemotherapy group (HR=2.0 for both; p=0.04 and p=0.03, respectively). A trend for a worse OS was also observed for mutated patients treated by fulvestrant/tamoxifen (p=0.09). Among mutated patients, no difference was observed in PFS and OS between the different treatment groups. Conclusion: Circulating ESR1 mutation detection at progression under AI is a strong and independent prognostic factor of OS in HR+mBC patients. This detection seems predictive of a worse outcome in any subsequent treatment. 26 Annexe 3: Article paru dans Oncotarget en Octobre 2016 27 Oncotarget, Vol. 7, No. 46 www.impactjournals.com/oncotarget/ Priority Research Paper Kinetics, prognostic and predictive values of ESR1 circulating mutations in metastatic breast cancer patients progressing on aromatase inhibitor Florian Clatot1,2,3, Anne Perdrix3,4, Laetitia Augusto1, Ludivine Beaussire3,5, Julien Delacour3,5, Céline Calbrix4, David Sefrioui3,5,6, Pierre-Julien Viailly2, Michael Bubenheim7, Cristian Moldovan1, Cristina Alexandru1, Isabelle Tennevet1, Olivier Rigal1, Cécile Guillemet1, Marianne Leheurteur1, Sophie Gouérant1, Camille Petrau1,3, Jean-Christophe Théry1,5, Jean-Michel Picquenot1,2,4, Corinne Veyret1, Thierry Frébourg5, Fabrice Jardin2, Nasrin Sarafan-Vasseur3,5,* and Frédéric Di Fiore1,3,5,6,* 1 Department of Medical Oncology, Henri Becquerel Centre, Rouen, France 2 INSERM U918, Henri Becquerel Centre, Rouen, France 3 EquIpe de Recherche en Oncologie, Rouen, France 4 Department of Biopathology, Henri Becquerel Centre, Rouen, France 5 INSERM U1079, Faculty of medecine, Rouen, France 6 Department of Gastroenterology, Rouen University Hospital, Rouen, France 7 Department of Biostatistics, Rouen University Hospital, Rouen, France * These authors have contributed equally to the work Correspondence to: Florian Clatot, email: [email protected] Keywords: ESR1 mutation, digital PCR, breast cancer, aromatase inhibitor, kinetics Received: October 12, 2016 ABSTRACT Accepted: October 24, 2016Published: October 27, 2016 Purpose: To assess the prognostic and predictive value of circulating ESR1 mutation and its kinetics before and after progression on aromatase inhibitor (AI) treatment. Patients and methods: ESR1 circulating D538G and Y537S/N/C mutations were retrospectively analyzed by digital droplet PCR after first-line AI failure in patients treated consecutively from 2010 to 2012 for hormone receptor-positive metastatic breast cancer. Progression-free survival (PFS) and overall survival (OS) were analyzed according to circulating mutational status and subsequent lines of treatment. The kinetics of ESR1 mutation before (3 and 6 months) and after (3 months) AI progression were determined in the available archive plasmas. Results: Circulating ESR1 mutations were found at AI progression in 44/144 patients included (30.6%). Median follow-up from AI initiation was 40 months (range 4-94). The median OS was decreased in patients with circulating ESR1 mutation than in patients without mutation (15.5 versus 23.8 months, P=0.0006). The median PFS was also significantly decreased in patients with ESR1 mutation than in patients without mutation (5.9 vs 7 months, P=0.002). After AI failure, there was no difference in outcome for patients receiving chemotherapy (n = 58) versus non-AI endocrine therapy (n=51) in patients with and without ESR1 mutation. ESR1 circulating mutations were detectable in 75% of all cases before AI progression, whereas the kinetics 3 months after progression did not correlate with outcome. Conclusion: ESR1 circulating mutations are independent risk factors for poor outcome after AI failure, and are frequently detectable before clinical progression. Interventional studies based on ESR1 circulating status are warranted. www.impactjournals.com/oncotarget 74448 Oncotarget INTRODUCTION circulating ESR1 mutations [9, 15, 16]. Nevertheless, the predictive value of circulating ESR1 mutation at progression on AI and its potential use in daily practice remains unclear. In light of these results, circulating ESR1 mutation detection may be a surrogate marker of AI resistance. In this context, based on archive plasmas we evaluated the prognostic and predictive values of circulating ESR1 mutation detection in HR+MBC patients and analyzed its kinetics before and after progression on AI. Endocrine therapy with either tamoxifen or aromatase inhibitors (AIs) is a key treatment in postmenopausal hormone receptor positive (HR+) metastatic breast cancer (MBC) which has a median time before progression of less than one year [1]. An emerging activating mutation in the estrogen receptor gene (ESR1), which leads to a ligand independent receptor activity, is one of the major molecular events involved in AI resistance [2, 3]. First reported in 1997 [4], these mutations have been recently described as (i) an acquired alteration, with a presence in primary tumour in less than 2% of cases [5, 6]; (ii) frequent, with a detection rate approximately 20% in metastases of HR+MBC patients progressing after endocrine therapy [7, 8]; and (iii) recurrent, with 4 hotspot mutations (D538G, Y537S/N/C) contributing to 74% of all ESR1 acquired mutations [5]. Since 2015, several studies have shown that ESR1 mutation detection in circulating tumour DNA (ctDNA) was clinically relevant and correlated with mutational status on metastasis [9-11]. In this context, digital PCR based-methods [12, 13] appear to be a more simple and sensitive approach for ESR1 detection in ctDNA than next-generation sequencing (NGS) techniques [13, 14]. In large retrospective cohorts, ESR1 mutations were found specifically in HR+ MBC patients treated by AI and were highly predictive of a lack of sensitivity to subsequent AI exposure [9]. Recently, some studies have reported a worse outcome after progression on AI with detectable RESULTS Patients characteristics and follow-up A total of 156 HR+MBC patients were included in this study. Due to the small amount of plasma DNA, the ESR1 mutation status could not be performed for 12 patients. Therefore, the analysis was performed on 144 patients (Figure 1). The main characteristics of the population are summarized in Table 1. ESR1 mutational status at AI progression At the time of AI progression (tp), at least one circulating ESR1 mutation was detectable in 44 patients (30.6%). Overall, 63 mutations were found; D538G and Y537S were the two most frequent (24 and 21 samples, Figure 1: Diagram of the study www.impactjournals.com/oncotarget 74449 Oncotarget Table 1: Baseline characteristics of patients with circulating ESR1 mutation versus patients without mutation www.impactjournals.com/oncotarget 74450 Oncotarget respectively), whereas Y537N and Y537C were detected in 16 and 2 samples, respectively. Among the 44 patients with mutation, 28 had a single circulating mutation, 13 had a double mutation and three had a triple mutation. The presence of a circulating ESR1 mutation was not related to patient characteristics except for the median time of AI exposure, which was significantly longer in patients with ESR1 mutations than in patients without mutation (15 vs 10.5 months, respectively, P = 0.02). The overall concordance between the 2 independent ddPCR analyses for each mutation was 98% (564 concordances over 576 analyses performed in duplicate). Figure 2: Progression-free survival (PFS) and overall survival (OS) after progression on first-line of aromatase inhibitor according to ESR1 mutation status. A. PFS of patients with or without ESR1 mutation. B. OS of patients with or without ESR1 mutation Figure 3: Overall survival (OS) after progression on first-line of aromatase inhibitor according to ESR1 mutation status and post-progression treatment. WT : wild-type. CT : chemotherapy. Tam: Tamoxifen. Ful : Fulvestrant. www.impactjournals.com/oncotarget 74451 Oncotarget ESR1 mutational status at AI progression and outcome PFS of 7 months in case of mutation versus 9 months without mutation (P = 0.009, HR = 1.9 CI [1.01-3.6]). When considering non-AI endocrine therapy, a trend over a worse survival in case of mutation was observed (median OS of 12 months in case of mutation versus 26 months without mutation, P = 0.09 HR = 1.7 CI [0.9-3.3] and median PFS of 5 months in case of mutation versus 6 months without mutation, P = 0.17, HR = 1.4 CI [0.82.8]) (Figure 3). When combining patients who received either chemotherapy or non-AI endocrine therapy after progression under AI, the median OS was significantly lower in patients with circulating ESR1 mutation (16 months) than in patients without mutation (27 months; P = 0.002, HR = 1.9 CI [1.1-3.0]), confirming that the worse impact of circulating ESR1 mutation observed over the whole population of the study was not related to patients receiving an AI-based treatment after progression. Concerning the patients who were still treated by AI, or by AI plus everolimus, after progression under first-line of AI, the few number of patients analyzed and the heterogeneity of treatments received provide hardly interpretable data. Nevertheless, a trend over a better survival was observed in case of patients without mutation (median OS of 42 months without mutation versus 23 months with mutation, P = 0.17 HR = 2.1 CI [0.5-8.4]). In particular, the 11 non-mutated patients treated by AI+everolimus had a particularly long median OS of 46 months. The median time of follow-up from AI initiation to progression was 40 months (range 4-94). At time of analysis, 111 patients (77%) died and the 33 remaining were still under follow-up. Three patients (one mutated and two non-mutated) died at tp and were excluded for the survival analysis. Among the 141 patients analyzed, the median overall survival (OS) was significantly lower in patients with circulating ESR1 mutation (15.5 months, range 2-44) than in patients without mutation (23.8 months, range 2-70; P = 0.0006, HR = 1.9 CI [1.2-3.1], Figure 2B). The prognostic value of circulating ESR1 mutation at AI progression was confirmed in multivariate analysis (P = 0.002, HR = 1.9 CI [1.3-3]). A WHO performance status > 1 (P < 0.0001, HR = 3 CI [1.94.7]); and a level of cell-free circulating DNA above the median value (HR = 1.8, P = 0.006 CI [1.2-2.7]) were also identified as independent prognostic factors of OS. A worse progression free survival (PFS) was observed in patients with ESR1 mutation, with a median of 5.9 months, compared to 7.0 months for patients without mutation (P = 0.002, HR = 1.7 CI [1.1-2.5]). In the multivariate analysis of PFS, the presence of circulating ESR1 mutation and a prior line of chemotherapy before AI introduction were identified as independent prognostic factors of worse outcome (P = 0.008, HR = 1.7 CI [1.2-2.5] and P = 0.009, HR = 2.3 CI [1.2-4.1], respectively) (Figure 2A). Circulating ESR1 mutation kinetics before progression Predictive value for subsequent lines of treatment based on circulating ESR1 mutations detection at AI progression Of the 44 patients presenting a circulating ESR1 mutation at AI progression, plasma samples were available at 3 months before progression (tp-3) or 6 months before progression (tp-6) in 43 cases. In case of double or triple mutations, the predominant one was retained for subsequent analysis. For the 20 patients with samples at both tp-3 and at tp-6, 15 (75%) had detectable circulating ESR1 mutations before AI progression, and in most of the cases, the amount increased over 3 months (P = 0.02, between tp-6 and tp-3 and P = 0.0087 between tp-3 and tp) (Figure 4). Of note, 2 patients had a decrease in the mutation amount between tp-3 and tp. For the 8 patients analyzed presenting double or triple mutations and with samples at both tp-3 and at tp-6, 5 (62%) patients had the predominant mutation detectable before tp whereas nonpredominant mutations were usually non-detectable (7/10 mutations) at both tp-6 and tp-3 or at a lower amount than the predominant one. For one patient, a Y537S mutation became predominant at tp while the D538G mutation had a higher rate at both tp-6 and tp-3. For another patient, a decrease of a mutation contrasted with the appearance of another one suggesting a dissociated evolution of 2 subclones. After progression on AI, 51 patients received a nonAI endocrine therapy (34 tamoxifen and 17 fulvestrant), and 58 were treated with chemotherapy. The addition of everolimus or a Her2 inhibitor was used in only 14 and 2 patients, respectively. Finally, 8 patients were switched from one AI to another, 4 had no modification of AI treatment despite progression, 3 patients died at progression as previously mentioned and 4 patients received other treatments. The ESR1 mutational status at AI progression did not selectively predict for better or worse outcome according to whether chemotherapy or non-AI endocrine therapy was given, since we observed similar PFS and OS between patients treated with chemotherapy-based regimens versus non-AI endocrine therapies in both mutated and non-mutated subgroups. Overall, patients with ESR1 circulating mutation presented a worse OS than did patients without mutation regardless of treatment. Indeed, under chemotherapy, a median OS of 16 months was observed in case of mutation versus 27 months without mutation (P = 0.014, HR = 2.0 CI [1.01-4.0]). Similar results were observed in PFS: median www.impactjournals.com/oncotarget 74452 Oncotarget Circulating progression ESR1 mutation kinetics after tp and tp+3 while the predominant mutation at tp remained stable as well as the clinical evaluation at tp+3. For the 12 other patients, all the predominant and non-predominant mutations varied in the same direction between tp and tp+3. Circulating ESR1 mutation kinetics after AI progression were analyzed in the 33/44 patients with mutation (75%) who had samples available at tp+3. Among them, 16 (48%) had a clinical progression, whereas the others had disease control or a response to the subsequent line of treatment. All patients (n = 6, 18%) presenting with an increase in circulating ESR1 mutation at 3 months had disease progression. In contrast, among the remaining 27 patients presenting a decrease of circulating ESR1 mutation, 10 (37%) experienced disease progression (Figure 5). In particular, 3 patients had no detectable mutation despite a clinical progression. For the 13 patients analyzed presenting double or triple mutation and with samples available at tp+3, only one patient (8%) had an increase of non-predominant mutations between DISCUSSION Our results show that the detection of circulating ESR1 mutation is relevant during AI exposure in HR+MBC patients. The present study, based on 144 patients, demonstrates the feasibility of ESR1 detection in ctDNA and its clear association with AI resistance and a poor outcome for both PFS and OS. Furthermore, to our knowledge, we report for the first time that circulating ESR1 mutations are detectable before clinical progression in approximatively 75% of patients. Taken together, our results highlight that ESR1 mutation monitoring in ctDNA may help for decision making and early treatment change in MBC patients. Figure 4: Pre-clinical detection of circulating ESR1 mutation. This figure represents all the 20 patients for whom we had available plasmas at progression (tp), 3 months (tp-3) and 6 months(tp-6) before progression. Red color means a clinical progression at the time of mutational analysis whereas blue color means a stable or responding disease at the time of mutational analysis. To allow comparisons, the amount of circulating mutation have been normalized to 100 % for the time of progression. Circulating rates 3 (dark blue) or 6 (light blue) months before clinical progression are given in percentage of the value observed at progression. Figure 5: ESR1 circulating mutation evolution after progression and treatment change. This figure represents all the 33 patients for whom we had plasma samples available 3 months after progression. The bottom of the figure indicates the post progression treatment received (AI: aromatase inhibitor, EVE: everolimus). The abscissa line is the normalized circulating ESR1 mutation amount at time of progression. The bars represent the relative variation of this mutation amount 3 months after progression. The color of the bars is related to the clinical evolution observed 3 months after progression: blue color means stability or response and red color means a disease progression. www.impactjournals.com/oncotarget 74453 Oncotarget At progression, we observed an ESR1 mutation frequency of 30.6%, which is consistent with those previously reported: 37% among 153 cases [11], 28.8% among 541 cases [16] and 25.3% among 395 patients [15]. In this study, ESR1 mutations were also frequently polyclonal as previously reported [9, 10, 12, 14, 15, 17]. To note, the mutation frequency reported may be influenced by the number of ESR1 mutations analyzed in each study, which usually vary from 2 [16] to 7 [15]. Therefore, the analysis in our study of 4 mutations may have underestimated the ESR1 mutation frequency. Our results showed that circulating ESR1 mutation is associated with significantly worse outcomes with a difference of 8.3 months for OS and 1.1 months for PFS compared to patients without mutation. Similar results have been recently reported in a sub-group analysis of the BOLERO 2 trial (n = 541, OS of 32.1 months for patients without mutation vs 20.7 months for patients with mutation, P < 0.0001) [16], and in a sub-group analysis of the PALOMA-3 trial (n = 395, PFS of 9.2 months for patients without mutation vs 7.3 months in cases of mutation, P = 0.02) [15]. In contrast, Spoerke et al. did not find any difference related to ESR1 mutation [11]. Surprisingly, in this study the median time of AI exposure during the metastatic setting was significantly longer in patients with ESR1 mutations than in patients without mutation whereas it has not been reported previously. If confirmed, this result suggests that mechanisms for primary resistance to AI (progression in the first 3 or 6 months of AI exposure) may not be related to the emergence of an ESR1 mutation. When considering the OS from the introduction of AI, a significantly worse outcome in case of circulating ESR1 mutation was still observed (median OS of 37 months in case of mutation versus 47 without mutation, P = 0.027 HR 1.5 CI [0.992.4]). In our study, post-AI progression treatment was mainly based on tamoxifen, fulvestrant or chemotherapy. To date, the addition of everolimus to AI [18] and, more recently, the addition of palbociclib to fulvestrant [19] has provided additional treatment options. Considering the sample size of patients analyzed for subsequent line, in our cohort, no particular treatment (chemotherapy, tamoxifen or fulvestrant) overcame the worse prognosis for patients with ESR1 mutation. To note, this study was not randomized and therefore subject to biases in treatment allocation and was not powered enough for detecting a predictive value for each of the post progression treatment used. Concerning the addition of everolimus, Chandarlapaty et al. reported no PFS improvement for patients with the Y537S mutation but with a low number of cases in each arm; whereas wild-type patients or patients harbouring the D538G mutation had a better outcome when they were treated with AI + everolimus than with AI alone [16]. Concerning the potential use of palbociclib, a longer PFS for patients treated by fulvestrant + palbociclib www.impactjournals.com/oncotarget compared to fulvestrant + placebo, both for ESR1 wildtypes and patients with mutation, has been reported [15]. In our study, no benefit of fulvestrant over tamoxifen was observed even if such a difference would be hardly detectable with the small sample sizes analyzed (n = 17 and n = 34, respectively). In contrast, the retrospective analysis of patients included in the randomized SoFEA study revealed that among the 63 patients with ESR1 circulating mutation, a significantly better PFS was observed when a fulvestrant-based treatment was given, rather than exemestane (9.4 months versus 3.6 months, respectively, P = 0.002) [15]. Spoerke reported a similar outcome with the use of fulvestrant for patients with or without the ESR1 mutation [11]. Moreover it has also been recently suggested that outcome after progression on AI treatment may be related to specific ESR1 mutations [15]. Due to the numerous ESR1 mutations, only large studies will be powered enough to answer this issue, which was not the case of our study. It is important to note that 26% of the mutations reported in the Spoerke et al. study were E380Q, for which the implication in the AI resistance has not been clearly established [20]. Thus, a dedicated analysis of mutations related to AI resistance, located on the codons 537 and 538, may have modified the survival analysis in this study. Moreover, pre-clinical data have shown that ESR1 mutated cells show a partial resistance to fulvestrant in particular at clinical doses [2, 20]. More potent ESR1 antagonists, such as AZD9496, have recently been reported to be more effective than fulvestrant (even used at supra-clinical doses) or tamoxifen in preclinical ESR1 mutant breast tumour models [21]. Finally, unless not continuing single AI treatment, no definitive recommendation can be made on post-AI treatment based on the presence of a ESR1 circulating mutation after progression on AI. Interestingly, the association of palbociclib to AI does not seem to prevent emergence of ESR1 mutations [22]. One of the strengths of our study was the availability of plasma samples at progression on AI, both before and after progression. Although we had previously reported the potential interest of ESR1 mutation monitoring in plasma [12], the present study is the first, to our knowledge, that provides kinetics patients with ESR1 mutation at tp-6, tp-3 and tp. Our results indicate that 75% of the mutations are already detectable when patients have not yet progressed. Even if this pre-clinical detection rate has to be confirmed by larger studies, it supports the potential interest of early treatment change based on the emergence of circulating mutation of resistance. The circulating mutation detection before clinical progression has already been reported after early breast treatment. In this study, 12 out of the 15 patients (80%) who relapsed had a detectable circulating mutation many months before clinical progression [23]. Nevertheless, this study was not restricted to HR+ tumors and used a patient-specific digital droplet PCR (ddPCR) assay designed after a massively parallel sequencing of 74454 Oncotarget the primary tumor. A restricted analysis of few recurrent mutations as performed in our study will be easier to transfer to daily practice. Concerning the increase in mutation amount observed in our study while patients are still receiving AI therapy, we can hypothesize that stopping AI before clinical progression may improve patient outcomes by interrupting the selection pressure. Nevertheless, this quantitative result must be interpreted cautiously because it was based on a retrospective analysis. We will need to collect prospective data of circulating mutation emergence, including analysis during progression and non-progression to determine the clinical relevance before an interventional study. Such a prospective study is currently ongoing in our centre (NCT02473120). We also analyzed plasma samples at tp+3, while patients were receiving various treatments. In contrast to a homogeneous evolution of ESR1 circulating kinetics before progression, after the end of AI exposure, we observed that ESR1 mutation variation is more heterogeneous. Indeed, we found that an increase in the amount of mutation was related to progression for 100% of the patients, as also reported by Takeshita et al. (11 progressions in 13 patients) [10]. Due to the low number of patients analyzed, this value may be overestimated. In contrast, a decrease in the amount of mutation was related to various clinical outcomes. Similar results have recently been reported by Spoerke who suggested that all metastatic lesions may not harbour ESR1 mutations and may have different responses to post-AI treatment [11]. Such molecular heterogeneity and the parallel genetic evolution of separate metastatic sites under treatment have already been demonstrated under a PIK3 inhibitor in breast cancer patients [24]. In this context, ctDNA has been reported as probably more accurate than circulating tumor cells (CTC) to explore tumor heterogeneity by blood analysis [25]. One of the key issues in the circulating mutation analysis is a rigorous definition of a positive threshold; however, there is no consensus regarding that definition. Wang et al. called a sample positive if: (a) the allele frequencies were > 0 after subtraction of background noise; (b) > 2 mutant droplets were repeatedly detected; and (c) allele frequency was > noise adjusted LOD for at least 3 independent assays [17]. For Schiavon et al., a mutation was considered positive with at least 2 ESR1 mutant droplets [9]. Finally, Takeshita et al. focused on an increase in the amount of ESR1 mutation between 2 samples rather than defining a positive threshold based on only one point [10]. In our opinion, mutation criteria must be reliable before potential clinical use. In conclusion, the present study highlights the potential clinical value of using ddPCR to monitor circulating ESR1 mutation during AI treatment for HR+MBC patients. We showed that the presence of circulating ESR1 mutations is an independent factor for www.impactjournals.com/oncotarget poor outcome in AI failure and that these mutations are also detectable before clinical progression. Although ddPCR provides quick and robust results, a standardized and validated definition of a mutated sample needs to be investigated before its potential use in daily practice. To improve the outcomes in patients with ESR1 mutation, dedicated trials are also warranted, to test the potential benefit of an early treatment change in cases of circulating mutation emergence, and also to test specific treatments, such as ESR1 modulators that are more potent than tamoxifen or fulvestrant, or the addition of palbociclib. PATIENTS AND METHODS Patients All consecutive patients who were treated in our centre between 2010 and 2012 for HR+ MBC and who had clinical progression during first-line AI treatment were retrospectively included. Clinical progression was decided by our local Breast Tumor Board and based on either progression by RECIST criteria or symptomatic worsening despite radiographically stable disease. Previous non-AI treatment for metastatic disease was allowed. Patients who had previously been exposed to AI in an adjuvant setting were eligible if there was at least a two-year delay between the end of treatment and the diagnosis of metastatic relapse. Patients’ clinical and histological baseline characteristics were collected, as were the outcomes of subsequent lines used after AI progression. In our centre, routine biological analyses are performed every 3 months for MBC patients, as well as CT-scan. Remaining plasmas after biological analyses are stored in our plasma bank. Therefore plasma samples were collected prospectively in consecutive HR+MBC patients, but the design of the study and the analyses were performed retrospectively. All patients signed a consent form allowing the conservation and study of their biological samples. The study was approved by the Institutional Review Board of the Henri Becquerel Center (registering order 1503B). Circulating ESR1 status at AI progression and kinetics All patients underwent blood sampling at the time of AI progression (tp) for ESR1 mutation detection. In cases of detectable circulating ESR1 mutation at tp, the kinetics of circulating mutations were analyzed in blood samples that were collected concomitant to the physical examinations 3 or 6 months before (tp-3; tp-6) and after (tp+3) AI progression, respectively. 74455 Oncotarget Plasma DNA extraction (Supplementary Table 3). All data were analyzed using the QuantaSoft software (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) and were manually reviewed to provide precise interpretation of data points. The variant allele fraction (VAF) was defined as the proportion of mutant DNA copies relative to the sum of mutant and wild-type DNA copies obtained by ddPCR. Samples at tp were considered mutated if at least two independent ddPCR analyses by two independent operators found a VAF above the mutation threshold. ddPCR analyses were all performed blindly from clinical data. Samples at tp-6, tp-3 and tp+3 were analyzed on one or two runs according to the available samples. Blood samples were collected in heparinized tubes and processed within two hours after collection with one centrifugation at 2000 g (10 min) at 4°C before storage at 20°C. DNA was retrospectively extracted from 0.4 to 2 mL of stored heparinized plasma using a QIAamp® Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Double-stranded DNA quantification was performed by a fluorimetric method using a Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and a Twinkle LB970 microplate fluorometer (Berthold, Bad Wildbad, Germany). Statistical analysis Droplet digital PCR (ddPCR) analysis The primary endpoint was to evaluate the overall survival (OS) according to circulating ESR1 mutation status at the time of AI progression. OS was calculated from tp to the date of death from any cause. Blinded to the project outcome and considering that 30% of patients would have an ESR1 mutation at progression on AI [27] and that 70% of the patients at progression on AI would die during the 3 following years [28], we determined that at least 121 patient records would have to be retrieved [29] to detect a hazard ratio of at least 2 between mutated and non-mutated ESR1 patients with a power of 80% and an alpha of 5% using the Cox model to test group homogeneity. For secondary endpoints, we analyzed the frequency of circulating ESR1 mutation at progression on AI, PFS and OS from tp and under subsequent lines. Finally, we described the kinetics of the circulating ESR1 mutation before and after AI progression. The prognostic factors of PFS and OS were determined in relation to the following variables: age, time delay from metastatic evolution to AI progression, WHO performance status at AI progression, cfDNA amount at progression, circulating ESR1 mutation at AI progression, prior lines of treatment before AI introduction, duration of AI exposure, and type of treatment after AI progression. Comparisons between groups were made using the chi-squared test or the Wilcoxon test. Patients who died at tp were excluded from survival analysis. Univariate analysis and survival curves were calculated using the Kaplan-Meier method and compared using the log-rank test. Multivariate analysis was performed using the Cox model and a backward method. All statistical analyses were performed using the R software version 3.0.1. Droplet-based dPCR (ddPCR ) platform (Qx200 ddPCR System, Bio-rad Laboratories, Hercules, CA, USA) was used for detection of mutant circulating DNA in plasma samples. Four ng of circulating-free DNA (cfDNA) was preamplified as previously described [12]. Custom Taqman SNP genotyping assay (Life Technologies, Carlsbad, CA) for the detection of ESR1 mutations Y537N, Y537S, Y537C and D538G (references and functional annotations of the ESR1 mutations cited in that paper are available in the Supplementary Table 1). PCR cycling conditions and reagent compositions are described in Supplementary Table 2. Digital PCR conditions were optimized to identify the optimal annealing/extension temperature for each mutation, using wild-type DNA spiked with a mutant synthetic oligonucleotide inserted into pMT plasmid (Invitrogen, GeneArtTM,Carlsbad, CA, USA). Both for ddPCR assays optimization and samples analysis, the total copy number systematically comprised between 200 and 2000 copies/µL per reaction. In the case of an initial low copy number, 2 µL of heparinase (New England iolabs, Ipswich, MA, USA) was added to preamplification to reach the recommended copy number. At least 3 negative control wells with no DNA were included in every run. In case of too low amount of copy number despite use of heparinase, mutation detection could not be performed and the corresponding patient was excluded. We serially diluted in triplicate ESR1 mutant synthetic oligonucleotide into wild-type DNA to determine the ddPCR limit of detection (LOD), linearity and reproducibility (Supplementary Figure 1). Background noise is the minimum concentration of the mutant allele that can be differentiated from a negative control. To assess the background noise of our method, the allele burden was measured in 10 preamplified cfDNA extracted from healthy control heparinized plasma samples collected in the same conditions as the patient samples. Using the method of Hindson et al. [26], we defined the relevant threshold for each mutation to discriminate positive versus negative samples according to the reaction conditions TM www.impactjournals.com/oncotarget ® Abbreviations AI: Aromatase inhibitor CI: Confidence interval CTC: Circulating tumor cell cfDNA: Circulating free DNA ctDNA: Circulating tumor DNA 74456 Oncotarget ESR1: Estrogen receptor gene HR: Hazard Ratio HR+: Hormone receptor positive MBC: Metastatic breast cancer NGS: Next generation sequencing OS: Overall survival PFS: Progression free survival tp: time of AI progression tp-6: 6 months before time of AI progression tp-3: 3 months before time of AI progression tp+3: 3 months after time of AI progression VAF: Variant allele fraction WHO: World Health Organization in Oncotarget. REFERENCES 1. Mouridsen H, Gershanovich M, Sun Y, Pérez-Carrión R, Boni C, Monnier A, Apffelstaedt J, Smith R, Sleeboom HP, Jänicke F, Pluzanska A, Dank M, Becquart D, et al. 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Nat Genet. 2013; 45: 1446-51. doi: 10.1038/ng.2823. CONFLICTS OF INTERESTS 4. Zhang QX, Borg A, Wolf DM, Oesterreich S, Fuqua SA. An estrogen receptor mutant with strong hormone-independent activity from a metastatic breast cancer. Cancer Res. 1997; 57: 1244-9. Florian Clatot received a financial support from Novartis in name of his institution. The authors have no other conflict to declare with regard to the manuscript submitted. 5. Segal CV, Dowsett M. Estrogen receptor mutations in breast cancer—new focus on an old target. Clin Cancer Res. 2014; 20: 1724-6. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-14-0067. FUNDING 6. Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 2012; 490: 6170. doi: 10.1038/nature11412. This work was mainly supported by the Henri Becquerel Centre; and in part by Novartis. 7. Oesterreich S, Davidson NE. The search for ESR1 mutations in breast cancer. Nat Genet. 2013; 45: 1415-6. doi: 10.1038/ng.2831. Authors contributions 8. 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Truffaut, Oise) TITRES ET TRAVAUX SCIENTIFIQUES PUBLICATIONS : - Kinetics, prognostic and predictive values of ESR1 circulating mutations in metastatic breast cancer patients progressing on aromatase inhibitor Florian Clatot1,2,3, Anne Perdrix3,4, Laetitia Augusto1, and Frédéric Di Fiore1,3,5,6,* OncoTarget, Octobre 2016 - ESR1 mutations in breast cancer Florian Clatot, Laetitia Augusto, Frédéric Di Fiore Aging, Editorail, Janvier 2017 COMMUNICATIONS - Poster présenté au Cancéropôle Nord-Ouest à Deauville en juin 2016: Valeur prédictive et pronostique de la détection d’une mutation circulante ESR1 chez des patientes traitées pour un cancer du sein métastatique en progression sous anti aromatase (AA) L Augusto1, N Sarafan-Vasseur2,3, A Perdrix2,4, L Beaussire2,3, J Delacour2,3, D Sefrioui2,3,5, C Calbrix4, JM Picquenot4,6,T Frebourg3, F Jardin6, F Di Fiore1,2,3,5 , F Clatot1,2,6 - Communication orale à l’ASCO 2016 (Dr Clatot) : Prognostic and Predictive Value of Circulating ESR1 Mutations in Metastatic Breast Cancer Patients (mBC) Progressing Under Aromatase Inhibitor (AI) Treatment L. Augusto, N. Sarafan-Vasseur, A. Perdrix, L. Beaussire, J. Delacour, D. Sefrioui, C. Calbrix, JM Picquenot, T. Frébourg, F. Jardin, F. Di Fiore, F. Clatot DIVERS - Secrétaire de l’Association des Jeunes Oncologues Rouennais (AJOR), 2014-2016 - Organisation de soirées d’enseignements en oncologie pour les internes - Cours aux élèves infirmières de l’IFSI du Rouvray : Cancérogénèse, 2014