Résultat recherche SAF - Syndrome Angelman France
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1 Projet de recherche Mise au point d’une puce à ADN dédiée de la région 15q11-12 pour identifier les délétions intragéniques et du centre de l’empreinte afin d’améliorer le diagnostic moléculaire et le conseil génétique dans le syndrome d’Angelman Travail réalisé par Nathalie Kuziner sous la direction du pr Anne Moncla dans le laboratoire de Génétique Chromosomique du département de génétique médicale CHU Timone Enfants –Marseille Rapport 2 Introduction Les syndromes de Prader-Willi (PWS) et d’Angelman (AS) sont liés à des anomalies génétiques et épigénétiques d’une même région chromosomique, la région 15q11-q12 qui est soumise à l’empreinte génomique parentale. Il a été démontré que les gènes soumis à empreinte parentale présentent une méthylation différentielle des deux allèles parentaux. La région 15q11-q12 La région critique du syndrome de Prader-Willi est la plus proche du centromère. Plusieurs gènes d’expression exclusivement paternelle ont été identifiés dans cet intervalle : MKRN3 MAGEL2 et NDN SNURF-SNRPN snoRNA: Small nucleolar RNAs. Ce sont des ARNs introniques. Ils se trouvent dans l’unité de transcription SNURF-SNRPN. Le gène UBE3A (E6-A6 ubiquitin protein ligase, *601623) est soumis à empreinte paternelle (expression uniquement à partir de l’allèle maternel). Ce gène a 16 exons dont 9 codants (exons 8 à 16). La protéine a une activité ubiquitine ligase. Un défaut dans la voie de dégradation par le protéasome des protéines ubiquitinilées semble conduire à un phénotype AS. 3 L’empreinte d’UBE3A est tissu-spécifique, elle est restreinte à certaines cellules dans le cerveau. On note la présence d’un anti-sens d’UBE3A, UBE3A-AS, exprimé par allèle paternel dans le cerveau, qui va contrôler l’empreinte tissu-spécifique du gène UBE3A. Le centre de l’empreinte est localisé au niveau du locus SNURF-SNRPN. C’est un élément régulateur bipartite qui contrôle l’effacement et le ré-établissement de l’empreinte parentale dans les lignées germinales. Le centre de l’empreinte pour le syndrome de Prader-Willi (PWS-IC) est défini par PWSSRO (smallest region of deletion overlaps, région minimale critique) qui s’étend sur 4,3 kb et comprend le promoteur et l’exon 1 du locus SNURF-SNRPN. Le centre de l’empreinte pour le syndrome d’Angelman (AS-IC) est défini par AS-SRO qui s’étend sur 880pb et se situe à environ 35 kb en amont de l’exon 1 du locus SNURFSNRPN. AS-IC contient un des exons alternatifs (U5) de SNRPN qui doit probablement jouer un rôle dans l’empreinte maternelle. Les causes du syndrome d’Angelman (AS) - une microdélétion 15q11-q12 (5Mb) maternelle dans 70% des cas - une disomie uniparentale paternelle dans 10% des cas - une mutation du gène UBE3A dans 5% des cas 4 La stratégie de diagnostic utilisée en routine est la suivante : - analyse du profil de méthylation par Southern blot - étude des microsatellites : ceci permet de vérifier l’origine parentale des allèles. Cette analyse confirme la présence d’une délétion ou d’une disomie monoparentale. - pour les patients ne présentant pas d’anomalie de la méthylation, la recherche de mutation au niveau du gène UBE3A est effectuée par DHPLC ou séquencage direct. Ceci permet donc de porter un diagnostic précis chez 90% des patients et de donner un conseil génétique approprié. Cependant, dans 10% des cas on peut trouver : - Soit une anomalie de la méthylation sans délétion ni disomie uniparentale. Il peut s’agir alors d’une délétion du centre de l’empreinte. - Soit un profil de méthylation normal chez un patient présentant un phénotype de syndrome d’Angelman typique. Il pourrait s’agir d’une délétion intragénique du centre de l’empreinte. Ces deux anomalies (délétion intragénique ou délétion du centre de l’empreinte) peuvent être héritées de la mère. Il existe alors un risque de récurrence élevé (50% pour les grossesses suivantes) et un risque pour les apparentés. Objectifs de l’étude Mise au point d’une puce à ADN haute résolution de la région 15q11-q12 permettant d’identifier à la fois les délétions intra géniques d’UBE3A et les délétions du centre de l’empreinte 5 Matériel et Méthodes Patients 2 groupes de patients issus du centre de référence des syndromes malformatifs et anomalies du développement PACA. Le laboratoire du département de génétique médicale est laboratoire de référence pour l’analyse moléculaire du gène UBE3A. Groupe 1 AS typique sans anomalie du profil de méthylation, ni mutation UBE3A : 5 familles Groupe 2 AS avec anomalie isolée de la méthylation sans délétion ni disomie uniparentale : 8 patients Mise au point d’une puce à ADN spécifique de la région 15q11-q12 CGH : Comparative Genomic Hybridization ou puces à ADN Le principe de cette technique est de mesurer les déséquilibres génomiques, c'est-à-dire les délétions ou les duplications. Elle est basée sur le principe de l’hybridation moléculaire comparative sur une puce à ADN. La puce est une lame de verre sur laquelle se trouvent des séquences d’ADN génomique connues représentatives du génome humain, différents types de séquences peuvent être déposées. L’ADN du patient et l’ADN d’un témoin de même sexe marqués à 2 fluorochromes différents sont hybridés sur une puce. Selon le protocole expérimental établi au sein du laboratoire, les ADN des patients seront toujours marqués avec le fluorochrome cyanine 5 (bleu) et les ADN des témoins avec le fluorochrome cyanine 3 (rose). La cyanine 5 fluoresce en rouge et la cyanine 3 fluoresce en vert. 6 Pour chaque oligonucléotide présent sur la puce, le ratio de fluorescence Cya5/Cya3 est mesuré. L’algorithme d’analyse retenu est ADM2, seuil à 5, avec minimum de 3 sondes déviées. La couverture de la région 15q11-q12 des puces utilisées en diagnostic de routine est insuffisante. La puce spécifique a été construite en utilisant la technique Agilent selon le protocole détaillé dans le projet de recherche. Format de puce 180K 400K 1M Puce dédiée Nombre de sondes de la région PWS-AS 145 349 786 3 296 o o 0 3 Nombre de sondes AS-SRO Résultats Groupe 1 AS typique sans anomalie du profil de méthylation, ni mutation UBE3A : 5 cas Mise en évidence de deux délétions du gène UBE3A, soit 40% des cas. - Une de 82,6 Kb Forme familiale avec deux sœurs atteintes. Présence de la mutation chez la mère - Une de 7,6Kb 7 Groupe 2 AS et PWS avec anomalie isolée de la méthylation : 8 patients étudiés Mise en évidence d’une délétion du centre de l’empreinte AS, soit 12%. Conclusion L’utilisation d’une puce dédiée de la région 15q11-q12 en complément de l’approche classique (étude de la méthylation et séquençage du gène UBE3A) améliore significativement le conseil génétique des familles de patients atteints de syndrome d’Angelman. Cette approche ne peut cependant être utilisée qu’après une évaluation par un centre de référence pour évaluer la pertinence du diagnostic.
