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%NVUEDELOBTENTIONDU %0$503"5%&-6/*7&34*5² %0$503"5%& -6/*7&34*5² %&506-064& $ÏLIVRÏPAR Université Toulouse III Paul Sabatier (UT3 Paul Sabatier) $ISCIPLINEOUSPÏCIALITÏ Immunologie 0RÏSENTÏEETSOUTENUEPAR Lise PASQUET LE Jeudi 25 Octobre 2012 4ITRE ! Prévention du rejet d'allogreffe par les Lymphocytes T Régulateurs:! ! Mécanismes de maintenance de la tolérance à long terme %COLEDOCTORALE Biologie, Santé, Biotechnologies (BSB) 5NITÏDERECHERCHE Inserm UMR 1043 $IRECTEURSDE4HÒSE Joost van MEERWIJK 2APPORTEURS Dr Bernard VANHOVE! Pr Pierre TIBERGHIEN! Dr Eliane PIAGGIO MEMBRESDUJURY: ! Pr Roland LIBLAU Président de Jury! Dr Bernard VANHOVE Rapporteur! Pr Pierre TIBERGHIEN Rapporteur! Dr Eliane PIAGGIO Rapporteur! Pr Joost van MEERWIJK Directeur de thèse Remerci ements Et bien voilà, on y est, après quelques mois d’écriture, de relecture, de confrontations d’idées, de corrections de fautes…., « quelques » années de travail intensif, de rencontres, d’amitiés, de belles réussites mais aussi de doutes, me voici confrontée à l’écriture d’une des partie de la thèse à laquelle on pense pendant longtemps et qui s’avère la plus compliquée car la plus émouvante à écrire. Comment, en quelques lignes, remercier tout le monde ? Tous ceux qui nous ont conduit à essayer de faire de ce jour une réussite, ceux qui nous ont soutenu, épaulé, encouragé, parfois ramassés à la petite cuillère… mais aussi secoué, relancé, remis sur les voies….Pour finalement, on l’espère, être fières de nous aujourd’hui… En tout cas c’est ce que moi j’espère ! Merci aux membres du Jury d’avoir accepté d’évaluer ce travail, du temps pris pour le relire. Merci pour l’ensemble de vos remarques constructives. Merci Joost, mon directeur de thèse, celui que l’on vénère au début de sa thèse, face auquel on apprend à aiguiser ces idées, à les confronter et finalement à les affirmer. Merci de m’avoir accueilli dans votre équipe il y a maintenant un peu plus de 5 ans. Ces années n’ont pas été de tout repos avec mon caractère bien affirmé…. Mais étant dernière d’une lignée d’équipes de filles, je me dis que vous étiez déjà aguerris à l’exercice ! Je vous ai bien fait quelques frayeurs (je n’oublierais pas votre tête à la vue de ma main plâtrée !) et, je vous remercie pour la confiance que vous m’avez accordée et qui finalement, on l’espère tout les deux, sera joliment récompensée dans quelques semaines ! Merci Paola, vous m’avez initiée aux mystères de la sélection thymique… J’en suis sortie moins réfractaire à ce sujet ! Merci aussi pour vos conseils et pour la confiance que vous m’avez accordée. Je vous souhaite bon courage avec cette nouvelle équipe de garçons ! Merci Geneviève, j’ai conscience de la masse de travail que tu abats pour que nos manip puissent avancer. Merci aussi de ta confiance. Je remercie sincèrement tous ceux avec qui j’ai partagé un bureau, un ordi, des moments de vie. Les thésards, la post-doc, les stagiaires qui m’ont suivi, soutenu et supporté toutes ces années. Honneur aux anciennes : Céline, pendant longtemps simple collègue de bureau, ces trois années passées dos à dos nous ont permis de tisser des liens d’amitiés au travers de goûters galette, de délires « kinder surprise », de lancés rageurs de balle anti-stress… Et de longues discussions sur la vie en général. Je te souhaite sincèrement d’être heureuse et n’oublie pas : « Mieux vaut arriver en retard dans ce monde qu’en avance dans l’autre» ! Les Julie ! Julie T., j’avoue, que petite M2 j’avais un peu peur mais les pauses « thé-macarons » m’ont permis de découvrir une personne attachante toujours prête à aider et extrêmement compétente. Tu m’as beaucoup soutenu pendant mon DEA et je te remercie sincèrement pour ça. J’espère que ton expérience Australienne te comblera. Julie R., nous nous sommes à peine croisée mais même de loin tu continue à être présente, merci pour tout. Enfin Thibault et Olivier. Le premier m’a initié aux joies de la transplantation, et pour faire écho à tes propres remerciements, tu m’as refilé le bébé qui m’a effectivement donné autant de bonheur qu’à toi. Olivier, merci pour tes conseils et tes encouragements ces derniers mois et j’espère que tu regardes d’un bon œil les avancés de ce projet que tu as initié. Bon retour dans l’équipe. Svet ! bosseur acharné sous tes faux airs de fêtard, merci pour ta bonne humeur permanente ! Merci Andry pour avoir tenu un moment seul garçon dans cette équipe de fille. Et puis je ne peux oublier Ingrid, je ne t’ai connu qu’en dehors du labo mais ton énergie communicative nous soutien toujours même depuis Amiens ! Un grand MERCI à la « Team B » (comptez-vous !). Rita, la gentillesse, l’empathie et la bonne humeur incarnée ! Toujours sur le pied de guerre pour aider… parfois tard ! Nos discussions le nez au-dessus des tubes (alors c’est de quel côté ?) et ton humour me manque. Je te souhaite vraiment que tes rêves se réalisent et surtout ne change pas! Et puis Jean-Yves, bien plus qu’un simple stagiaire, un collaborateur et un ami précieux. Ces derniers mois auraient été ingérables sans ton aide. Et « nonobstant la conjoncture », je pense que tu n’oublieras pas de sitôt nos soirées au Fortessa… D’ailleurs le fond d’écran de Nico s’en souviens encore ! On en arrive donc aux petits derniers : Gavin, reprendre la suite des travaux de Céline n’est pas une mince affaire... je te souhaite de te voir triompher tel Indiana Jones dans « Gavin à la poursuite du marqueur 1 perdu » ! Bon courage pour la suite. « Petit » Nico, merci d’être toujours présent, à l’écoute, toujours prêt à rendre service …. Et à faire la petite blague qui détend l’atmosphère ! profite de ces années pour t’enrichir de belles rencontres, d’expériences… Ais confiance en toi! Célinette, notre ancien « petit lymphocyte T naïf » merci pour ton soutien, ta gentillesse et ta douceur, tu m’auras réconcilié avec l’ordre des médecins ! Et enfin nos deux petits derniers Mehdi et Bénédicte, je vous souhaite bonne chance pour cette année charnière. Accrochez-vous ! Un grand merci aux membres de la Dream Team pour leur soutien, leur écoute et les innombrables fous rires: Marie-Laure, ma première responsable de stage aujourd’hui une amie, et Eliane, avec vous deux j’ai appris l’entre aide (et la danse de l’autobus !), je n’oublierai pas les nuits au labo à l’approche des exams… Virginie, notre « princesse », dans quelques mois tu seras à ma place et je te souhaite beaucoup de bonheur ! Enfin le garçon de la bande, Cyril, merci pour ton aide à certains moments clés et j’espère que les donuts Australien valent le coup ! Je remercie également mes différents stagiaires, Charline, Elodie, Célinette, Sabine, Jean-Yves, qui obligent constamment à se remettre en question. Merci aussi aux étudiants de TD et de TP auxquels j’ai essayé de transmettre mes petites connaissances et surtout ma passion pour l’immuno. Et parce que le labo devient au fil des mois notre deuxième maison on se crée, en quelque sorte, une petite famille de labo…..Alors je tiens à chaleureusement remercier mes Tatie et Cousine de labo, respectivement Nabila et Julie Tab. Votre bureau a toujours été le refuge dans lequel on rentre en pleurant et duquel on ressort toujours remotivée et pleine d’entrain. Je vous souhaite à toute les deux que l’avenir s’illumine. Merci Lucette de m’avoir donné une chance il y a 6 ans en m’accueillant dans ton équipe et en me permettant de quitter le brouillard Dijonnais ! Merci à tous les membres de l’unité avec qui j’ai partagé un moment, un café, une discussion, Johan, Laurent, Karim, Christophe, Martine, Emily, les Nico, Eric, Magda, Marta, Thomas, Céline A, Perrine, les Jérômes, Olfa.…. Et tous ceux que je n’ai pas cités, merci pour vos conseils, votre aide, les prêts de matériels et les fous rires…. Je remercie également nos services communs qui facilitent grandement notre travail. Une mention spéciale à « Mes Souris » et à l’équipe de l’animalerie qui prend si bien soin de mes « Choupinettes ». Merci également aux plateaux de cytométrie et d’histologie (Alain, Florence, merci pour la rapidité d’exécution dans les urgences de dernières minutes !). Merci également à Sophie et Astrid, je n’ai pas vraiment fait d’imagerie mais merci pour les bons fous rires partagés ! Et puis merci Daniel pour ton aide, ton soutien…. Et ta mauvaise foi permanente ! Tu nous manque à Toulouse (ya plus d’apéros !!) A ce qu’il paraît on garde toujours le meilleur pour la fin, ce remerciement là est plus difficile à formuler mais je me rassure en me disant que depuis plus de 5 ans qu’on se côtoie, elles savent déjà tous ce qu’il y a à dire….Alors, simplement : MERCI « A celles qui redonnent confiance à une musaraigne, en ce considérant les meilleures actrices, tout en coupant des rondell’fines à minuit heure vingt et une, tandis que feu l’éléphant s’écrit sur le spot-it» A vous deux, Fanny et Delphine, mes acolytes mousquetaires ! Surtout ne changez pas ! Je vous souhaite le meilleur pour la suite. « Une pour toute et toute pour une ». Merci à mes amis, de loin, de longue date qui ont toujours été là dans les bons et les mauvais moments: Emilie, Laurie, Christelle, Vanessa, Estelle, Laura, Allan, Marion… Votre amitié m’est précieuse. Un remerciement particulier à Eric, Myriam, Elora, Rémi et Alix pour toute votre aide à mon arrivée à Toulouse. Enfin je tiens à remercier mes proches, mes parents qui ont toujours cru en moi, qui m’ont soutenu dans mes décisions pour surtout n’avoir jamais aucuns regrets (et grâce à vous aujourd’hui je n’en ai pas). Merci à ma grande sœur, qui m’a toujours guidé et protégé, merci d’avoir pendant tant d’années supporté mes séances de révisions dès 6h du matin et mon mauvais caractère associé ! Merci à Papy et Mamy, d’être toujours présents pour nous et de tant nous aimer. MERCI 2 SOMMAIRE RESUME .............................................................................................................................. 7 ABSTRACT........................................................................................................................... 8 Table des Illustrations........................................................................................................... 9 Liste des Abréviations ......................................................................................................... 10 INTRODUCTION ............................................................................................................. 12 Chapitre I - LA TOLERANCE AU SOI .............................................................................. 14 1. Le choix du lignage ...................................................................................................... 14 2. La génération du TCR.................................................................................................. 15 3. La sélection positive ..................................................................................................... 15 4. La sélection négative : Induction d’une tolérance centrale.......................................... 16 a. Les actrices de la sélection négative ............................................................................................16 i. Les cellules thymiques épithéliales médullaires (mTEC)..........................................................................16 ii. Les cellules dendritiques ............................................................................................................................18 b. Les Mécanismes de sélection négative ........................................................................................18 i. La Délétion ...................................................................................................................................................18 ii. L’anergie .....................................................................................................................................................19 5. La tolérance périphérique ............................................................................................ 19 a. La tolérance passive.......................................................................................................................20 i. L’ignorance ..................................................................................................................................................20 ii. L’anergie .....................................................................................................................................................20 iii. La déviation phénotypique ........................................................................................................................22 iv. La délétion ..................................................................................................................................................22 b. La tolérance active.........................................................................................................................23 i. ii. iii. iv. v. vi. vii. Les lymphocytes T CD4+CD25+Foxp3+.....................................................................................................23 Les lymphocytes T CD8..............................................................................................................................23 Les lymphocytes Tr1..................................................................................................................................24 Les lymphocytes Th3..................................................................................................................................26 Les lymphocytes NKT..................................................................................................................................26 Les cellules dendritiques tolérogènes .......................................................................................................26 Les Macrophages......................................................................................................................................28 Chapitre II - LA BIOLOGIE DES LYMPHOCYTES T REGULATEURS.................... 29 1. Historique et découverte............................................................................................... 29 2. La recherche du marqueur........................................................................................... 29 3. a. CD5, CD45RBlow, GITR …. les autres…. et CD25 .................................................................29 b. Foxp3 ...............................................................................................................................................31 c. Les nouveaux marqueurs..............................................................................................................32 Sélection thymique et répertoire des Treg .................................................................... 32 3 4. Homéostasie du compartiment régulateur.................................................................... 33 a. Distinction des compartiments naïfs vs « effecteurs/mémoires » ...........................................33 b. Dépendance à l’IL-2 ......................................................................................................................34 c. Indépendance vis à vis de l’IL-7 ..................................................................................................34 d. Présence de l’antigène ...................................................................................................................35 5. Plasticité du lignage Treg............................................................................................. 35 a. Induction périphérique de Treg ..................................................................................................35 i. Treg induit Foxp3+ (iTreg)..........................................................................................................................35 ii. Mécanismes et voies d’induction ...............................................................................................................35 ! Le TGF-ß ...............................................................................................................................................35 ! mTOR ....................................................................................................................................................36 ! ATP/AMP..............................................................................................................................................38 b. 6. Lignages Treg vs Thelper .............................................................................................................38 Fonctions physiopathologiques .................................................................................... 39 a. Prévention de l’auto-immunité ....................................................................................................39 b. La tolérance fœto –maternelle .....................................................................................................40 c. Modulation des réponses anti-infectieuses .................................................................................41 d. Inhibition des réponses anti-tumorales ......................................................................................42 7. Mécanismes d’action.................................................................................................... 43 a. Production de cytokines inhibitrices...........................................................................................43 b. Cytotoxicité directe........................................................................................................................45 c. CTLA-4 ............................................................................................................................................45 d. Détournement du métabolisme....................................................................................................46 8. Potentiels thérapeutiques des Treg............................................................................... 46 a. Auto-immunité................................................................................................................................46 b. Inhibition de la maladie du greffon contre l’hôte (GvHD) .....................................................47 c. La transplantation..........................................................................................................................47 Chapitre III - LA TRANSPLANTATION ........................................................................ 49 1. Histoire de la transplantation....................................................................................... 49 2. Le manque de donneurs ............................................................................................... 51 3. La mort cérébrale ......................................................................................................... 52 4. La prise en charge du greffon : L’ischémie/reperfusion .............................................. 52 5. Les voies de reconnaissance du greffon par les cellules immunitaires de l’hôte.......... 55 6. a. La voie directe ................................................................................................................................55 b. La voie indirecte.............................................................................................................................56 c. La voie semi-directe .......................................................................................................................58 Les rejets de greffes ...................................................................................................... 59 4 a. Le rejet hyper aigu.........................................................................................................................59 b. Le rejet aigu ....................................................................................................................................59 c. Le rejet chronique ..........................................................................................................................61 Chapitre IV -LA TOLERANCE DE LA TRANSPLANTATION ........................................ 63 1. Les drogues immunosuppressives................................................................................. 63 a. Inhibition de la prolifération........................................................................................................63 b. Les stéroïdes....................................................................................................................................65 c. Déplétion/ modulation des lymphocytes .....................................................................................66 d. Inhibition de la synthèse des cytokines.......................................................................................67 i. Inhibiteurs de la calcineurine .....................................................................................................................67 ii. Inhibiteur de mTOR....................................................................................................................................67 ! Action sur les cellules dendritiques .....................................................................................................68 ! Action sur les cellules T conventionnelles..........................................................................................68 ! Action sur le compartiment régulateur T ............................................................................................68 ! Utilisation thérapeutique ......................................................................................................................69 e. Les anticorps monoclonaux ..........................................................................................................70 i. Anticorps bloquant les co-récepteurs .........................................................................................................70 ii. Anticorps bloquant la co-stimulation ........................................................................................................71 ! CD40-CD40L (CD154) ........................................................................................................................71 ! Immunoglobuline (Ig) de fusion CTLA-4-Ig......................................................................................72 ! Anti-CD28, anti-CD80/86 ....................................................................................................................72 f. 2. Blocage de la migration des cellules effectrices..........................................................................73 Le chimérisme hématopoïétique................................................................................... 74 a. Les cellules d’origine hématopoïétique induisent une tolérance des cellules T par induction d’apoptose et d’anergie.......................................................................................................74 b. Le chimérisme hématopoïétique peut-il induire une réelle tolérance aux allogreffes ? .....75 c. Le chimérisme hématopoïétique en clinique..............................................................................76 3. Les cellules impliquées dans la tolérance de transplantation....................................... 77 a. Les cellules dendritiques tolérogènes ..........................................................................................77 b. Cellules régulatrices en transplantation.....................................................................................80 Les Treg CD4+ .............................................................................................................................................80 ! Utilisation thérapeutique des Treg en transplantation ........................................................................80 ! La linked tolérance ...............................................................................................................................81 ! La tolérance infectieuse........................................................................................................................83 ii. Les Treg CD8+ ............................................................................................................................................85 iii. Les cellules NK et NKT .............................................................................................................................87 iv. Les lymphocytes B régulateurs..................................................................................................................88 v. Les macrophages régulateurs .....................................................................................................................88 i. 4. Impacts des infections en transplantation .................................................................... 90 a. Lien entre la transplantation et le moment de l’infection. ......................................................92 i. Infections avant transplantation. ................................................................................................................92 ii. Infection après transplantation..................................................................................................................93 b. Lien entre infections et alloréactivité. ........................................................................................93 c. Implication pour les thérapies......................................................................................................94 5 RESULTATS ...................................................................................................................... 96 Objectifs .............................................................................................................................. 97 Long term prevention of chronic allograft rejection by regulatory T cell immunotherapy involves host Foxp3-expressing T cells ............................................................................... 99 RESULTATS PRELIMINAIRES .................................................................................... 100 La persistance de la tolérance à une allogreffe de moelle osseuse induite par les Treg n’inhibe pas la mise en place d’une réponse CD4 efficace. .............................................. 101 DISCUSSION .................................................................................................................. 112 I- Mécanismes d’induction de tolérance suite à une immunothérapie par les Treg........ 114 II- Préservation de l’immunocompétence des animaux greffés ........................................ 124 ANNEXES ........................................................................................................................ 126 " In vitro expansion of alloantigen-specific regulatory T cells and their use in prevention of allograft rejection " Hematopoietic chimerism and transplantation tolerance: a role for regulatory T cells REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES.............................................................................. 127 6 RESUME Lise Pasquet Prévention du rejet d’allogreffe par les lymphocytes T régulateurs : Mécanismes de maintenance de la tolérance à long terme Directeur de thèse : Joost van Meerwijk Soutenance de thèse : jeudi 25 octobre 2012 L’activation du système immunitaire de l’hôte conduisant au rejet d’un organe greffé est un obstacle majeur en transplantation. Les drogues immunosuppressives actuellement utilisées en clinique inhibent efficacement le rejet aigu mais pas le rejet chronique. De plus, ces drogues réduisent l’activation du système immunitaire dans sa globalité, augmentant ainsi la sensibilité des patients aux infections opportunistes et à la survenue ou la réactivation de tumeurs. Le développement de nouvelles thérapies inhibant de façon spécifique les rejets aigu et chronique avec de moindres effets secondaires est par conséquent essentiel. Notre laboratoire a développé une thérapie expérimentale innovante induisant la protection efficace et durable d’allogreffes chez la souris. Des lymphocytes T régulateurs (Treg) spécifiques pour les antigènes du donneur sont co-injectés avec une greffe de moelle osseuse dans un animal pré-conditionné assurant par la suite la pérennité d’une allogreffe de peau ou de cœur. Nous avons constaté une disparition progressive, dans le sang et les organes lymphoïdes, des Treg injectés apportant l’interrogation de la nécessité de leur persistance pour maintenir une tolérance efficace à long terme. Afin de répondre à cette question, nous avons utilisé un modèle de souris permettant la déplétion spécifique des Treg injectés. Les souris transgéniques « DEREG » expriment le récepteur à la toxine diphtérique sous le contrôle du promoteur de Foxp3 conférant aux Treg seuls une sensibilité à cette toxine. En utilisant des Treg purifiés de souris DEREG pour protéger les allogreffes de moelle osseuse, nous montrons tout d’abord que les Treg sont indispensables à l’induction de la tolérance mais pas à sa persistance. L’analyse du répertoire des lymphocytes T CD4 de l’hôte a révélé la présence d’une délétion centrale et périphérique des cellules Tde l’hôte spécifiques pour des antigènes du donneur. De façon importante, nous montrons que la persistance des Treg injectés n’est pas nécessaire non plus à la maintenance des allogreffes de peau. Ceci suggère l’implication d’autres mécanismes actifs de maintien de la tolérance. Afin de tester cette dernière hypothèse, nous avons éliminé, par injection de la toxine diphtérique, les Treg injectés ainsi que les Treg de l’hôte DEREG. Alors que dans les souris ainsi traitées la greffe de moelle osseuse persiste, la greffe de peau est rapidement rejetée. Il s’avère donc que les Treg injectés aient transféré leur potentiel tolérogène aux Treg de l’hôte, maintenant ainsi la tolérance aux allogreffes de peau. En conclusion, les Treg administrés sont nécessaires à l’induction d’une protection de l’allogreffe de moelle osseuse. Des mécanismes centraux et périphériques permettent d’éliminer les cellules T de l’hôte spécifiques du donneur assurant à eux seuls la préservation de la greffe de moelle osseuse. En parallèle, les Tregs injectés transmettent leur potentiel tolérogène aux Treg de l’hôte, nécessaire au maintien de la tolérance envers une greffe de peau. L’ensemble de ces mécanismes permet une protection à long terme des allogreffes, même en l’absence de survie des Treg injectés. Mots clés : Lymphocytes T Régulateurs, Transplantation, Tolérance infectieuse Discipline : Immunologie Équipe Tolérance et auto-immunité INSERM UMR 1043 Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan BP 3028 31024 TOULOUSE Cedex3 7 ABSTRACT Lise Pasquet Regulatory T cell-mediated prevention of allograft-rejection: Mechanisms of long-term persistence of tolerance PhD director: Joost van Meerwijk 2012 Octobre 25th Transplantation is frequently the only therapeutic option to replace defective organs or tissues. In the most frequent case of allogeneic transplantation, the major obstacle is activation of the host’s immune system leading to allograft rejection. Immunosuppressive drugs efficiently avoid acute rejection and thereby markedly prolong graft survival, but they do not prevent chronic rejection. Moreover, these drugs globally down-modulate the host’s immune system, increasing the patient’s susceptibility to opportunistic infections and to cancers. Development of therapies specifically inhibiting acute and chronic rejection with limited side effects is therefore essential. We developed an innovating murine model in which bone marrow, skin and heart allograft rejection is durably prevented. Regulatory T cells (Tregs) specific for donor-antigens were injected in pre-conditioned animals that also received a bone marrow allograft. Thus generated hematopoietic chimeras were then transplanted with skin or heart allografts. Tregs of direct and indirect alloantigen-specificity entirely prevented acute and chronic rejection. In these mice, we observed progressive loss of injected Treg in blood and lymphoid organs eliciting the question if Treg survival is important for long-term transplantation persistence. To provide an answer, we used a murine model allowing the specific elimination of injected Tregs. By in vivo depleting injected Treg, we demonstrated that these cells are essential for induction of tolerance to allogeneic bone marrow, but not for its maintenance. We showed that at later time-points host T cells specific for donor-antigens were deleted in the thymus and in the periphery. Central tolerance mechanisms therefore appear to assure maintenance of the bonemarrow allograft. The same results were observed with skin allografts irrespectively of whether the cells were depleted before or after placing the skin allograft. This observation suggests the implication of active tolerance mechanisms. The depletion of injected and endogenous Treg before skin graft indeed revealed that host Treg are essential for survival of skin but not of bone marrow allografts. In conclusion, injected Tregs are essential during the induction-phase of tolerance to bone marrow allografts. Central and peripheral mechanisms then ensure deletion of donor specific T cells. In the same time, injected Treg induce the emergence of host Treg which become fully capable of protecting skin allografts. These mechanisms allow for long-term protection of allografts even after injected Tregs have waned away. Keywords: Regulatory T cells, Transplantation, infectious tolerance Discipline : Immunology Tolerance and auto-immunity team INSERM U1043 Centre de physiopathologie de Toulouse Purpan BP 3028 31024 TOULOUSE Cedex3 8 Ta ble des Illustrations Figure 1 : Les étapes du développement thymique. _______________________________________________ 13 Figure 2 : Mécanismes d’expression d’antigènes tissulaires dans le thymus par les mTEC et les DC._______ 17 Figure 3 : Les mécanismes de tolérance passive._________________________________________________ 21 Figure 4 : Génération in vitro de DC tolérogènes ________________________________________________ 25 Figure 5 : Sous-populations fonctionnelles de macrophages ________________________________________ 27 Figure 6 : les lignages de Treg induit et de Th17 nécessitent un facteur commun de différenciation, le TGF-ß. 37 Figure 7 : Mécanismes de suppression utilisés par les Treg CD4+CD25+_____________________________ 44 Figure 8 : Processus biologiques impliqués dans l’ichémie-reperfusion _______________________________ 53 Figure 9 : Les mécanismes d'alloreconnaissance directe___________________________________________ 54 Figure 10 : Les voies d’alloreconnaissance _____________________________________________________ 57 Figure 11 : Cibles moléculaires des drogues immunosuppressives. __________________________________ 64 Figure 12 : Utilisation thérapeutique des cellules dendritiques en transplantation. ______________________ 78 Figure 13 : Suppression liée et tolérance infectieuse ______________________________________________ 82 Figure 14 : Schéma de l’expérience de mise en évidence d’une tolérance infectieuse en transplantation. _____ 84 Figure 15 : Mécanismes utilisés par les cellules régulatrices adaptatives en transplantation. ______________ 86 Figure 16 : Mécanismes utilisés par les cellules régulatrices de l’immunité innée en transplantation. _______ 89 Figure 17: Possibles effets des infections avant, lors et après la transplantation.________________________ 91 Tableau 1 : Tableaux récapitulatifs du nombre d’inscrits en France sur les listes d’attente de greffes et du nombre de personnes décédées en attente de greffes entre 2006 et 2012.................................................................50 9 Liste de s Abréviatio ns AICD AIRE AMP APECED APL ATP BMDC cAMP CFA CMH CPA cTEC CTL CTLA-4 DC DEREG DN DP DTH DTx EAE FasL Foxp3 GITR GFP GM-CSF GMP GvHD GvL HLA IBD IDO IFN-g Ig IKB IL IMP iNKT IPEX JAK KLH Acivation Induced Cell Death AutoImmune Regulator Adenosine Monohosphate Autoimmune PolyEndocrinopathy Candidiasis Ectodermal Distrophy Altered Peptide Ligand Adenosine triphosphate Bone Marrow derived Dendritic Cells AMP cyclique Adjuvent Complet de Freund Complexe Majeur d'histocompatibilité Cellules Présentatrice de l'Antigène Cellules Epithéliale Thymique corticale Lymphocytes T Cytotoxique Cytotoxic T Lymphocyte Antigen-4 Cellules Dendritiques Depletion of Regulatory T cell mice Cellules Doubles négatives Cellules Doubles Positives Delayed-Type Hypersensitivity Toxine Diphtérique Encéphalomyélite Autoimmune Experimentale Fas Ligand Forkhead box p3 Glucocorticoid-Induced Tumor necrosis factor Receptor familyrelated gene Green Fluorescent Protein Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor Guanosine Monophosphate Graft versus Host Desease Graft versus Leukemia Human Leucocyte Antigen Inflammatory Bowle Disaese Indolamine 2,3- dioxygenase Interferon-g Immunoglobuline Inhibitor of NFkB Interleukine Inosine Monophosphate Invariant Natural Killer T cell Immune dysregulation Polyendocrinopathy Entheropathy X-linked syndrome Janus kinase Keyhole Limpet Hemocyanin 10 LAG-3 LAP LB LT MDSC MICI MMF mTEC mTOR NFAT NFKB NK NKT NOD OVA PAMPs PBMC PD1 pDC PDGF PDL1 PGE2 Pi3K PLP PRR PTEN RAG ROR S1P S1P1 SCF SCID STAT-5 TAM TCR TGF-ß TLR TNF TNFR Tr1 TRAIL Treg VEGF ZAP-70 Lymphocyte Activation Gene 3 Latency-Associated Peptide Lymphocytes B Lymphocytes T Myeloid Derived Supressor Cells Maladies Inflammatoires Chroniques de l'Intestin Micophenolate Mofetyl Cellules Epithéliale Thymiques medullaires Mammalian Target Of Rapamycine Nuclear Factor of Activated T cell Nuclear Factor kappa B Cellules Natural killer Lymphocytes T Natural Killer Non Obese Diabetic mice Ovalbumine Pattogen Associated Molecular Pattern Peripheral Blood Mononuclear Cell Programmed Death-1 Cellules Dendritiques plasmacytoïdes Platelet Growth Factor Program Death Ligand 1 Prostaglandine E2 Phosphatidyl Inositol 3 Kinase Proteolipid protein peptide Pattern-recognition receptors Phosphatade and tensin homologue Recombinaison Activation Gene Retinoic acid-related Orphan Receptor Sphingosine-1-Phosphate Sphingosine-1-Phosphate receptor 1 Stem Cell Factor Severe Combined ImmunoDeficiency Signal Transudcers and Activators and Transcription-5 Tumor Associated Macrophages T Cell Recepor Transforming Growth Factor beta Toll Like Receptor Tumor Necrosis Factor Tumor Necrosis Factor Receptor Lymphocytes T régulateurs 1 TNF- Realted Apoptosis-Inducing Ligand Lymphocyte T Régulateur Vascular Endothelial Growth Factor Zeta-chain-Associated Protein-70 11 INTRODUCTION 12 extrait de Rothenberg et al., Nat. Rev. Immun. 2008 Figure 1 : Les étapes du développement thymique. Les précurseurs multipotents accèdent aux thymus par les vaisseaux de la jonction corticomédullaire. La différenciation T nécessite une migration de la cellule au travers du thymus qui lui permet de rencontrer successivement des microenvironnements favorables à chaque étape de différenciation DN, DP puis SP. CCR : CC-chemokine receptor ; DN : CD4-CD8 double negative cell ; DP : CD4-CD8 double positive cell ; ETP : early thymic precursor ; ISP : immature single positive ; LMPP : lymphoid primed multipotent progenitor ; NK : Natural Killer ; SP : single positive cell ; TCR : T cell receptor. 13 Cha pi tre I - L A TOLERANCE AU SO I Les lymphocytes T et B se développent à partir de précurseurs lymphoïdes communs localisés dans le foie foetal ou la moelle osseuse chez l’adulte. Cependant les cellules T tirent leur nom de l’organe spécialisé dans lequel elles achèvent leur développement : le Thymus. Les 1. précurseurs entrent dans le thymus à la jonction cortico-médullaire 1 . Le choix du lignage Le nombre de précurseurs entrant dans le thymus est très limité 2 , 3. Les cellules les plus immatures qui expriment encore les marqueurs de cellules souches (cKIT+Sca1+Lin-) mais pas encore les marqueurs de cellules T (CD4 et CD8) sont appelées, thymocytes doubles négatifs. Elles se subdivisent en quatre populations en fonction de l’expression des marqueurs CD44 et CD25 4. Le stade DN1 (CD44+CD25-) représente la population la plus immature qui se divise peu et peut encore s’engager dans les lignages B, Natural Killer (NK) et cellules dendritiques (DC). Viennent ensuite les stades DN2 (CD44+CD25+), DN3 (CD44-CD25+) et DN4 (CD44-CD25-). Au stade DN2, les précurseurs peuvent encore se différencier en DC ou NK mais les capacités de bifurcation vers le lignage B sont définitivement perdues. Une fois que toutes les options « non-T » ont été perdues, l’acquisition du récepteur à l’antigène, le TCR (T Cell Receptor) débute avec le réarrangement somatique des gènes des chaînes ! et " par les enzymes RAG (Recombination activation gene) (Mombaerts, 1992 #123 ; Shinkai, 1992 #124). Ainsi, lors du passage du stade DN2 au stade DN3, le choix du lignage T est définitif (Figure 1). Les signaux nécessaires à la différenciation des cellules T sont apportés par l’épithélium thymique. Les facteurs les plus importants sont les ligands du récepteur Notch, delta-like ligand 1 et 4 (DLL1 et 4) exprimés à la surface des cellules stromales 5 , 6 ainsi que le SCF (Stem Cell Factor) 7, ligand de Kit 8 et l’IL-7 9. L’interaction Notch-delta induit le clivage de la queue cytoplasmique de Notch qui agit alors comme un facteur de transcription activant l’expression de gènes cibles essentiels à l’initiation du développement T et au blocage de la différenciation B (rag1, ptcra). 14 2. La génération du TCR C’est au stade DN2 que va débuter le réarrangement somatique des gènes V, D et J codant la chaîne ß du TCR grâce à l’expression des enzymes de recombinaison RAG1 10 et RAG2 11, 12. Si un réarrangement fonctionnel a lieu, la chaîne ß va s’associer, au stade DN3, à une pseudo-chaîne # (pT#) pour former le pré-TCR 13 . Une signalisation initiée par ce récepteur permet la survie et la prolifération des lymphocytes ayant correctement réarrangé leur chaîne ß, c’est la sélection ß. Cette étape est associée à la répression de l’expression des gènes des enzymes RAG empêchant l’expression d’un second TCR : c’est l’exclusion allélique 14. Les thymocytes acquièrent alors les co-récepteurs CD4 et CD8 pour devenir des thymocytes doubles positifs (DP). À ce stade, l’expression du pré-TCR est diminuée, les cellules arrêtent de proliférer et le réarrangement des segments des gènes V et J codant la chaîne # du TCR est amorcé. Un réarrangement fonctionnel de la chaîne # et son appariement correct avec la chaîne ß conduit à l’expression définitive du récepteur à l’antigène. 3. La sélection positive Le côté aléatoire des réarrangements des chaînes du TCR assure la création d’un répertoire de TCR extrêmement diversifié permettant de faire face à la multitude des antigènes. L’autre côté de la médaille est la génération de TCR incapables d’interagir avec les molécules du CMH du soi présentant ces antigènes. Une étape de sélection des LT « utiles » pour l’organisme est donc nécessaire. Les LT sélectionnés positivement reçoivent un signal de survie par leur TCR suite à son engagement avec les complexes peptide-CMH du soi exprimés par le stroma thymique. Ainsi, seuls 20% des thymocytes survivent à cette étape, les autres cellules mourant par négligence 15. La sélection positive a été mise en évidence dès les années 70 par la génération de chimères hématopoïétiques. Le compartiment hématopoïétique, compartiment radiosensible, est détruit par irradiation puis reconstitué par une greffe de moelle osseuse. Les cellules radiosensibles sont ainsi d’origine du donneur alors que les cellules radiorésistantes sont d’origine du receveur. Par cette méthode, il a été montré que la spécificité des LT est restreinte par le CMH exprimé par les cellules du receveur 16. L’importance du thymus dans ce mécanisme a été décrite par la transplantation d’un thymus allogénique dans des chimères 15 thymectomisées. Dans ce modèle, les cellules T du receveur présentaient une spécificité pour les molécules du CMH du donneur 17. La présence exclusive des DP au niveau du cortex suggère un rôle de l’épithélium cortical dans la sélection positive 18 . La génération de souris transgéniques dans lesquelles l’expression du CMH-I ou -II est limitée aux cellules épithéliales corticales (cTEC) n’altère pas la génération de cellules T. À l’inverse, l’expression exclusive de ces molécules par les cellules médullaires de l’épithélium thymique (mTEC) conduit à un défaut de génération des LT 19. 4. La sélection négative : Induction d’une tolérance centrale La sélection positive assure la production de LT restreints au CMH du soi mais aussi de cellules auto-spécifiques potentiellement dangereuses une fois en périphérie. La sélection négative permet donc de générer un répertoire de cellules T matures qui ne soit pas autoréactif. Le développement de cellules auto-spécifiques dans des souris exprimant les molécules de CMH exclusivement sur les cTEC a permis d’exclure un rôle du cortex dans la tolérance 19 , 20. Suite à la sélection positive, l’expression du récepteur CCR7 est augmentée à la surface des thymocytes simple positifs (SP). L’interaction de CCR7 avec ces ligands CCL19 et CCL21 assure la migration des thymocytes du cortex vers la médulla 21. Des souris dans lesquelles la migration cortex-medulla est bloquée, par invalidation du récepteur CCR7 ou dont la médulla est absente ou désorganisée développent de l’auto-immunité 22 . Ces résultats prouvent l’importance de la médulla dans le processus de tolérisation. a. Les actrices de la sélection négative i. Les cellules thymiques épithéliales médullaires (mTEC) Les mTEC représentent le compartiment radio-resistant de la médulla thymique. Leur particularité est d’exprimer de façon ectopique des antigènes tissulaires sous le contrôle du facteur de transcription AIRE (Auto-Immune REgulator) 23 , 24 . Une mutation dans la séquence du gène codant AIRE conduit chez l’homme à un syndrome auto-immun polyendocrinien nommé Auto-immune PolyEndocrinopathy Candidiasis Ectodermal Dystrophy (APECED) 25. Il est à noter qu’un antigène particulier est exprimé par seulement 1 à 3% des mTEC 24. 16 extrait de Klein et al. Nat. Rev. Immunol., 2009 Figure 2 : Mécanismes d’expression d’antigènes tissulaires dans le thymus par les mTEC et les DC. L’expression du facteur de transcription AIRE permet la présentation d’antigènes tissulaires par les molécules de CMH-I et –II des cellules épithéliales thymiques médullaires (mTEC). La présentation d’antigènes endogènes est augmentée par le mécanisme de macro-autophagie caractéristique des TEC. En parallèle, des antigènes dérivés des mTEC peuvent être capturés et présentés par les DC conventionnelles (cDC) du thymus. Ceux-ci peuvent se trouver sous forme soluble ou associés à des corps apoptotiques de mTEC matures. Les cDC ont aussi la capacité de capturer des complexes CMH-peptides intacts issus des mTEC. Enfin, les DC migratoires sirp#+ apportent dans le thymus des peptides capturés en périphérie. TRAs : Tissue-restricted Antigenes. 17 ii. Les cellules dendritiques Les cellules dendritiques thymiques sont représentées par 3 populations principales : deux sous-types de DC conventionnelles CD11chi et une population de DC plasmacytoides (pDC) CD11cmidCD45RA+. Les DC conventionnelles se divisent elles-mêmes en deux sous populations distinguées sur la base de l’expression du marqueur Sirp# (CD172) 26 : les cellules intra-thymiques (Sirp#-) se développent directement dans le thymus à partir d’un précurseur commun aux LT 27 , 28 (distinction des lignages au stade DN2 ; cf Figure 1). Les cellules Sirp#+ migrent de la périphérie dans le thymus avec une localisation préférentielle dans la médulla 29 , 30. Les cellules dendritiques ont la faculté de présenter des antigènes issus de la médulla thymique. Ce transfert d’antigènes a été démontré pour la première fois en 1994 par Humblet et al. par l’utilisation d’anticorps monoclonaux liant un peptide de la chaîne # du CMH-II I-Ed lorsqu’il est associé à la molécule I-Ab du CMH-II 31 . Ce mécanisme est unidirectionnel de la mTEC vers la DC 32. Ce n’est qu’en 2009 que la preuve de ce transfert a été confirmée pour des protéines endogènes 33. Ce transfert d’antigènes peut être dû à la capture de corps apoptotiques de mTEC qui ont un renouvellement rapide 34 , 35, mais aussi à un mécanisme de capture, par les DC thymiques, de complexes CMH-Peptides fonctionnels 33 , 36 (Figure 2). b. Les Mécanismes de sélection négative i. La Délétion La première démonstration de la délétion de clones particuliers de T a été faite en 1987 par le groupe de Marrack 37 . Des LT exprimant la chaîne Vß17a du TCR, qui interagit fortement avec des super-antigènes endogènes (associés avec la molécule IE du CMH de classe II) sont absents de la périphérie des souris H2k. Par contre des cellules Vß17a+ immatures sont présentes dans le thymus, démontrant ainsi que l’élimination a lieu tardivement dans le développement. Un autre modèle d’analyse utilise des souris exprimant un TCR transgénique spécifique pour l’antigène mâle H-Y. Les cellules T CD8+ spécifiques de cet antigène sont éliminées chez le mâle, pour lequel elles sont auto-réactives, mais pas chez la femelle 38. 18 Par l’utilisation de différentes combinaisons de chimères hématopoïétiques, l’équipe de Singer a montré un rôle des cellules dendritiques dans la délétion des cellules T spécifiques d’antigènes du soi 39 . Un rôle mineur des mTEC a récemment été décrit. Gallegos et Bevan ont montré que les mTEC induisent la délétion clonale de cellules T CD8 spécifiques pour un antigène dont l’expression spontanée est forcée dans les mTEC 40. ii. L’anergie L’état d’anergie d’un lymphocyte T est défini comme son absence de réponse à une stimulation antigénique. Cet état se caractérise par un défaut de prolifération et de fonctions. Par des expériences utilisant des chimères hématopoïétiques dans lesquelles l’antigène reconnu par une chaîne Vß spécifique n’est exprimé que par les cellules radiorésistantes de l’hôte, Ramsdell et al. ont montré que les cellules non délétées par les cellules dendritiques lors de la sélection négative sont retrouvées en périphérie dans un état d’anergie 41 . Par la suite, ils ont montré que la présence de l’antigène en périphérie est nécessaire au maintien de l’état d’anergie 42. Plus récemment, il a été décrit que non seulement l’anergie est induite par les cellules épithéliales thymiques mais aussi que les cellules présentatrices de l’antigène (CPA) d’origine hématopoïétique en sont incapables 43. Dans cette étude, l’élimination des LT CD4+ a permis d’exclure un rôle des lymphocytes T régulateurs. Les Lymphocytes T matures vont alors quitter le thymus pour rejoindre la périphérie. Cette émigration fait intervenir S1P (Sphingosine-1-phosphate) produite par les cellules endothéliales vasculaires 44 et son récepteur S1P1 dont l’expression est augmenté dans les LT matures 45. 5. La tolérance périphérique La tolérance centrale assure la production de lymphocytes T matures aptes à répondre de façon spécifique à une infection. Cependant, la présence, en périphérie, de cellules T autoréactives chez des individus sains prouve que la tolérance centrale présente des failles 46 , 47 . Ceci implique la mise en place d’autres mécanismes de contrôle en périphérie. Ces mécanismes se subdivisent en deux ensembles : les mécanismes « passifs » faisant appel aux 19 caractéristiques intrinsèques des cellules T, et les mécanismes « actifs » assurés par des populations immunitaires régulatrices. a. La tolérance passive i. L’ignorance L’ignorance implique principalement une séquestration des antigènes dans des sites n’offrant qu’un accès limité aux cellules immunitaires, comme le cerveau, l’œil ou l’endomètre 48 (Figure 3a). Par ailleurs, les molécules de CMH de classe I sont absentes ou faiblement exprimées à la surface des neurones, des cellules oculaires ou trophoblastiques. Ceci permet de protéger ces organes des attaques par les LT cytotoxiques 49 tout en maintenant leur exposition à la lyse par les NK. L’ignorance peut aussi être due à la faible quantité d’antigènes présents. Celle-ci étant insuffisante pour induire une activation des cellules T 50. ii. L’anergie La rencontre d’un LT avec son auto-antigène peut également conduire à son inactivation fonctionnelle, c’est à dire son anergie. Cet état est observé in vitro lors de l’engagement du TCR en absence de co-stimulation 51 . L’induction de l’anergie implique principalement deux récepteurs : CTLA-4 (Cytotoxique T- lymphocyte- antigen 4) et PD-1 (Programmed Death-1) 52 , 53 (Figure 3b). CTLA-4 est exprimé à la surface des cellules T suite à leur activation et son affinité pour les molécules de co-stimulation CD80/86 est plus forte que celle de CD28. Ainsi CTLA4 entre en compétition avec CD28 inhibant l’activation des cellules T. Lors d’une réponse allogénique classique, ce mécanisme permet de limiter « l’emballement » du système immunitaire et contribue à la phase de compression. Dans le cas d’un engagement bref du TCR au contact d’un antigène du soi par exemple, CD80/86 interagissent préférentiellement avec CTLA-4 induisant l’anergie de la cellule T par activation abortive 52 . Ceci est en adéquation avec l’apparition d’un désordre lymphoprolifératif létal chez les animaux déficients pour CTLA-4 54. PD-1, fortement exprimée à la surface des cellules anergiques, agit plus tardivement que CTLA-4, sur le maintien de l’état anergique. L’interaction de PD-1 avec ses ligands20 Extrait de Walker et al, Nat. Rev. Immunol. 2002 Figure 3 : Les mécanismes de tolérance passive. a$ Les cellules T auto-réactives peuvent ne jamais rencontrer la protéine du soi pour laquelle elles sont spécifiques. b$ l’anergie des clones T auto-spécifiques est principalement provoquée par l’interaction avec des cellules dendritiques immatures. Par ailleurs, l’expression de CTLA-4 à la surface des cellules T activées conduit à une signalisation inhibitrice qui restreint l’expansion des lymphocytes qui participent à une réponse. c$ La déviation immune est la mise en place d’une réponse immune non pathogène et parfois inadaptée. d$ Une stimulation antigénique répétée apporte l’expression de FasL (Fas ligand) qui, en se liant à Fas, provoque la mort du lymphocyte. APC : Antigen presenting cells ; CTLA-4 : Cytotoxic T lymphocyte antigen-4 ; FasL : Fas ligand ; MHC : major histocompatibility complex ; PD-1 : programmed death 1 ; PDL-1 : PD1 ligand ; TCR : T cell receptor ; Th : T helper . 21 PD L1 ou -L2 conduit à une inhibition de la production de cytokine 55 . De même que pour CTLA-4, les animaux déficients pour PD-1 ou ses ligands développent une auto-immunité systémique 56. iii. La déviation phénotypique La déviation immune est une alternative qui induit une réorientation de la réponse afin qu’elle soit non pathogéne (Figure 3c). Ainsi l’injection de cellules Th1 spécifiques du peptide 139-151 de la PLP (proteolipid protein peptide) dans des souris SJL conduit au développement de l’encéphalomyélite auto-immmune expérimentale (EAE), modèle animal de la sclérose en plaques. Cependant, la co-culture préalable de ces cellules avec des cellules T spécifiques du peptide APL (Altered peptide Ligand) prévient le développement de l’EAE par une déviation de la réponse immune Th1 vers une réponse Th2 caractérisée par la production des cytokines IL-4, IL-13 et TGF-ß 57. iv. La délétion La délétion consiste en l’élimination des clones auto-réactifs par un mécanisme d’AICD (Activation Induced Cell Death) suite à l’engagement répété du TCR au contact d’un antigène du soi (Figure 3d). L’un des mécanismes clés est la liaison du récepteur de mort Fas (CD95) à son ligand FasL. Il a en effet été observé un syndrome lupus-like chez des animaux déficients pour le récepteur Fas (MLR/lpr) ou son ligand (gld) 58 . Chez l’homme, un défaut dans la voie de signalisation de Fas conduit à un syndrome auto-immun lymphoprolifératif 59. Des avancées dans la signalisation de l’AICD incluent un rôle pour la phosphatase PTEN (Phosphatase and tensin homologue) dont l’expression est constitutive dans les lymphocytes T. Des souris invalidées pour l’expression de PTEN exclusivement dans les lymphocytes T, présentent des lymphomes multi-organes spontanés due à un défaut de délétion périphérique des cellules CD4 auto-réactives Vß8.1/8.2+ 60. La molécule pro-apoptotique TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) pourrait également jouer un rôle identique à Fas. Ce membre de la famille du TNF (Tumor nécrosis factor) est exprimé à la surface des cellules de l’œil et du fœtus et induit la mort des macrophages et des neutrophiles 61 , 62. 22 b. La tolérance active i. Les lymphocytes T CD4+CD25+Foxp3+. Ces cellules sont considérées comme la population régulatrice par excellence. Bien que leur existence a longtemps été suspectée, leur identification et leur caractérisation claire n’a été faite qu’en 1995 par la découverte du facteur de transcription Foxp3 (Forkhead box P3) 63 . Etant donné le rôle central de ces cellules dans l’ensemble des domaines de l’immunologie et notamment en transplantation, un chapitre leur est entièrement consacré ultérieurement. ii. Les lymphocytes T CD8 Les LT CD8+CD28low représentent environ 25% des splenocytes CD8+. Cependant contrairement aux CD8 activées CD28hi, la contrepartie CD28low possède des activités immunosuppressives. Il est décrit qu’une stimulation répétée des lymphocytes circulants humains par des CPA allogéniques conduit progressivement à une perte des capacités prolifératives des cellules due à la présence de cellules CD8+CD28low suppressives 64 . In vitro, ces cellules produisent de l’IL-10 et du TGF-ß et sont capables d’inhiber la prolifération de CD4+ et d’inhiber leur production d’IFN-% 65 . Chez la souris, le transfert adoptif de cellules CD8+CD28low à des animaux déficients pour CD8 réduit significativement le développement spontané de l’EAE 66. Ces cellules jouent aussi un rôle central dans la prévention des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). La co-injection de cellules CD8+CD28low avec des cellules colitogènes CD4+CD45RBhi permet d’inhiber le développement d’une colite chez des souris déficientes pour RAG 65 . Bien que le développement de ces cellules reste encore peu clair, le facteur de transcription AIRE (Auto-Immune Regulator) est décrit comme acteur central dans l’établissement de leur fonction au niveau intestinal. Des cellules CD8+CD28low purifiées de souris déficientes pour AIRE ne protègent pas de la colite induite par les cellules CD4+CD45RBhi 67 Les LT CD8+CD122+ ont été découverts par la génération de souris déficientes pour CD122 (chaîne ß du récepteur à l’IL-2). Ces souris présentent un nombre élevé de LT activés entraînant une anémie hémolytique sévère 68. Le transfert de cellules CD8+CD122+ dans des nouveaux-nés déficients pour CD122 protège les souris du développement d’un désordre 23 hyperprolifératif des cellules T 69 . In vitro, ces cellules inhibent l’activation des LT conventionnels CD4+ et CD8+. In vivo, des souris déficientes pour RAG et injectées avec des splénocytes CD8+CD122- développent une pathologie létale associée à une anémie sévère. La co-injection de CD8+CD122+ reverse ces symptômes 69. Les Treg CD8+CD122+ n’expriment pas Foxp3 69 et exercent leur fonction régulatrice via une production d’IL-10 70 . Les LT CD8+CD122+ pré-activés sont également capables de protéger les souris contre le développement de l’EAE induite par l’injection du peptide MOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein) 71. iii. Les lymphocytes Tr1 Les lymphocytes T régulateurs Tr1 représentent une population de Treg induits qui n’expriment pas Foxp3. Ils sont induits par l’IL-10 et produisent de l’IL-10. Ces cellules ont été décrites pour la première fois chez des patients présentant une immunodéficience sévère et ayant développé une tolérance à long terme envers une allogreffe de cellules souches 72. Ceci suggère une capacité de ces cellules à réguler les réponses immunes chez l’homme. Les lymphocytes Tr1 sont retrouvés en très grand nombre dans l’intestin où ils joueraient un rôle dans la prévention de la colite et dans le maintien de l’homéostasie immune contre le microbiote intestinal 73. L’induction de colite dans des animaux SCID (Severe Combined Immunodeficient) par l’injection de cellules CD4+CD45RBhi peut être inhibée par la co-injection de clones Tr1 transgéniques possédant un récepteur spécifique pour un peptide de l’ovalbumine (OVA). Cette inhibition de la pathologie est observée uniquement chez les animaux recevant le peptide spécifique de l’OVA dans l’eau de boisson 74. Ceci démontre in vivo une activation de ces cellules spécifiques de l’antigène. De la même manière, dans un modèle d’EAE, le transfert de cellules Tr1 spécifiques de l’OVA générées in vitro permet de limiter le développement des symptômes neurologiques lorsque l’OVA est injectée en intracrânien 75. Enfin, la chimiokine CxCL12 est décrite comme pouvant rediriger la différenciation de cellules Th1 en cellules régulatrices CD4+CD25-Foxp3productrices d’IL-10 qui inhibent l’inflammation dans la phase aiguë de l’EAE 76 . Chez l’homme, les patients souffrant de sclérose en plaques présentent une génération réduite de cellules Tr1 comparés aux personnes saines, suggérant un rôle de ces cellules dans le contrôle de la maladie 77. 24 Extrait de Morelli et al. Nat. Rev. Imm,, 2007 Figure 4 : Génération in vitro de DC tolérogènes Les cellules dendritiques (DC) sont générées in vitro à partir de précurseurs de la moelle osseuse (BMDC) de rongeurs ou de monocytes circulants chez l’homme. Elles sont rendues tolérogènes en contrôlant leurs conditions de culture par exposition à des cytokines, des facteurs de croissance, des médiateurs pharmacologiques ou par ingénierie génétique. Bien que ne stimulant pas la réponse des cellules T effectrices, elles participent à la tolérance active en induisant l’anergie ou l’apoptose des lymphocytes T conventionnels, et la génération de cellules T régulatrices. CCR7 : CC-chemokine Receptor 7 ; CTLA4-Ig : Cytotoxic T Lymphocyte Antigen4immunoglobuline fusion protein ; GM-CSF : Granulocyte/Macrophages colony-Stimulating Factor ; HO1, Haem oxygenase-1 ; IDO : indolamine 2,3- dioxygenase ; I&B : inhibitor of NF-&B ; ILT : Immunoglobulin-Like Transcript ; NF-&B : nuclear factor-&B ; ODN : Oligodeoxynucleotide ; PDL-1 : Programmed cell death ligand-1 ; PGE2 : Prostaglandine E2 ; TGF-ß1 : Transforming Growth Factor-ß1 ; TNFR, Tumor Necrosis Factor Receptor ; VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor. 25 iv. Les lymphocytes Th3 Les cellules régulatrices Th3 ont été décrites pour la première fois lors de l’induction d’une tolérance orale envers les antigènes de la myéline dans un modèle d’EAE 78 . Ces cellules, localisées essentiellement dans l’intestin, sont induites par le TGF-ß et agissent via leur production de TGF-ß 79 . Bien qu’ayant une fonction régulatrice sur l’auto-immunité et l’inflammation, ces cellules n’expriment pas le facteur de transcription Foxp3. L’une de leurs caractéristiques est l’expression à leur surface du peptide LAP (Latency-associated peptide). LAP est un propeptide associé de façon non covalente au domaine N-terminal du TGF-ß le maintenant lié à la membrane plasmique. Des cellules CD4+CD25-LAP+CD45RBlow, identifiées dans la rate, inhibent la colite induite par les CD4+CD45RBhi d’une façon dépendante du TFG-ß 80 . Ces cellules seraient activées suite à la reconnaissance d’antigènes oraux par leur TCR. La production de TGF-ß qui en découle permet d’une part de maintenir le phénotype régulateur des Treg CD4+Foxp3+ se situant à proximité mais permet aussi l’induction de nouvelles cellules régulatrices Foxp3+ 81. v. Les lymphocytes NKT Les cellules Natural Killer T (NKT) sont une sous–population distincte des lymphocytes T qui expriment un TCR #!. Leur TCR reconnaît un antigène glycolipidique présenté par la molécule de CMH-I non-polymorphe CD1d. Les cellules NKT invariantes (iNKT) représentent la plus importante fraction des cellules NKT. Ces cellules sont caractérisées par l’expression d’une chaîne # invariante du TCR (V#14-J#18 chez la souris et V#24-J#18 chez l’homme). Suite à leur activation, les cellules NKT produisent de fortes quantités d’IL-4 et d’IFN-%. Il est décrit que ces cellules peuvent jouer un rôle important dans l’induction de la tolérance orale en modulant l’action des DC 82 ou par l’induction de cellules T régulatrices productrices d’IL-10 et de TGF-ß ou encore en induisant la délétion clonale des cellules spécifiques d’antigènes 83. vi. Les cellules dendritiques tolérogènes Les cellules dendritiques (DC) tolérogènes sont immatures ou résistantes à la maturation, expriment de faible taux de molécules de CMH et de molécules de co-stimulation . 26 Extrait de Galli et al, Nat. Rev. Immunol. 2011 Figure 5 : Sous-populations fonctionnelles de macrophages Les macrophages peuvent être divisés en sous-populations spécifiques selon leur phénotype fonctionnel. Les monocytes circulants se différencient en macrophages lors de leur entrée dans les tissus. Une fois activés par les stimuli appropriés, les macrophages se différencient en cellules ayant des caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles distinctes. MDSC : Myeloid-derived suppressor cells ; TAM : Tumor Associated Macrophages. 27 à leur surface. Ces caractéristiques les rendent incapables de fournir les signaux de costimulation adéquats et nécessaires à l’activation et la prolifération des cellules T. Cette interaction abortive peut conduire à l’apoptose ou l’anergie des LT ou encore à l’expansion ou la génération de lymphocytes T régulateurs. Les DC tolérogènes sont décrites comme ayant un rôle central dans la prévention de maladies auto-immunes expérimentales 84 , 85. Les DC tolérogènes peuvent être générées in vitro, à des fins thérapeutiques, par traitement des précurseurs avec des agents immunosuppresseurs et anti-inflammatoires, comme l’IL-10, le TGF-ß ou les inducteurs de cAMP, par des agents pharmacologiques, comme la cyclosporine, le tacrolimus ou la rapamycine (traités dans un prochain chapitre) ainsi que par ingénierie génétique (Figure 4). L’ensemble de ces molécules inhibe la maturation et/ou l’activation des DC et bloque leur capacité à produire des cytokines proinflammatoires favorisant l’établissement d’un microenvironnement tolérogène. vii. Les Macrophages Les macrophages dérivent d’un précurseur myéloïde commun aux DC. Sous forme de monocytes dans la circulation, ils se différencient en macrophages spécialisés lors de leur passage dans les tissus. Leurs fonctions principales sont le « nettoyage » de l’organisme par l’élimination des cellules mortes et des débris cellulaires, le remodelage tissulaire après une blessure et surtout l’élimination des pathogènes par phagocytose. D’un point de vue fonctionnel, ces cellules se divisent en trois principales catégories: les macrophages dits « Classiques » (M1), qui assurent la défense de l’hôte et la lutte anti-tumorale; les macrophages « alternatifs » (M2) qui sont suppresseurs et régulent la cicatrisation; enfin les macrophages « régulateurs », sécréteurs d’IL-10 (Figure 5). La différenciation en macrophages M1 implique la présence d’Interféron-% (IFN-%) et la reconnaissance de Motifs Moléculaires Associés aux Pathogènes (PAMPS) facilitant l’élimination des pathogènes microbiens. En revanche, la présence de cytokines de type Th2 telles l’IL-4 et l’IL-13 favorise la différenciation en macrophages M2. Les macrophages régulateurs sont induits par des agonistes des TLR en combinaison avec des complexes immuns IgG-corps apoptotiques en présence de prostaglandine. Ils se définissent par leur production d’IL-10 et de TGF-ß favorisant les réponses de type Th2 et régulatrice. 28 Cha pi tre II - L A BIOLOGIE DES LY MPHOCYTES T REGUL ATEURS 1. Historique et découverte La découverte de l’existence d’une population de cellules T suppressives est issue d’études visant à comprendre comment une population de cellules, les lymphocytes, pouvait à la fois induire des réactions inflammatoires et une tolérance. Nishizuka et Sakakura ont observé que la thymectomie de souriceaux de 3 jours conduit au développement de maladies auto-immunes multi-organes 86. En parallèle, Gershon et Kondo ont observé que l’injection de splénocytes adultes, issus de souris tolérisées, à des souriceaux thymectomisés induit une tolérance chez les receveurs 87. De plus, Sakagushi et al. ont observé que l’injection de cellules T issues d’un adulte normal permet d’inhiber le développement de l’auto-immunité observée chez les nouveaux-nés thymectomisés si l’injection est réalisée dans les deux semaines suivant la thymectomie 88. Ces expériences ont permis de démontrer l’existence d’une population de lymphocytes issus du thymus, qui persiste en périphérie à l’âge adulte et qui possède des capacités suppressives. Cette dernière caractéristique a défini leur nom initial de lymphocytes T « suppresseurs ». Cependant l’étude de la biologie de ces cellules impliquait l’identification d’un marqueur spécifique permettant de les isoler et de les manipuler. 2. La recherche du marqueur a. CD5, CD45RBlow, GITR …. les autres…. et CD25 Les premières études ont identifié le marqueur de surface CD5. En effet, l’injection chez la souris BALB/C athymic de cellules CD5low conduit au développement d’une autoimmunité multi-organes qui peut être inhibée par la co-injection de cellules CD5hi 89 . Quelques années plus tard, Powrie et al. proposèrent un rôle pour CD45. Ils ont observé le développement d’une maladie du greffon contre l’hôte et d’un syndrome auto-immun 29 multiple lors de la reconstitution de rats athymiques avec des splénocytes ne contenant pas la population CD4+CD45RBlow 90. En 1995, Sakaguchi a observé qu’une population de CD4 exprimant la chaîne # du récepteur à l’IL-2 (CD25) pouvait contrôler l’émergence de maladies auto-immunes 63 . De plus, il a été observé que l’injection de cellules CD4+CD25+ inhibe le développement de maladies auto-immunes multi-organes chez les souriceaux thymectomisés à 3 jours. Réciproquement, l’équipe de Sakaguchi a confirmé l’absence de ces cellules CD4+CD25+ dans des animaux thymectomisés à 3 jours 91. La recherche de nouveaux marqueurs a alors été menée de front avec l’identification de molécules impliquées dans la fonction des Treg. Ainsi, la molécule CTLA-4 est devenue une cible intéressante. CTLA-4 joue le rôle d’inhibiteur de la prolifération des cellules T grâce à sa compétition avec CD28 pour la liaison avec leurs récepteurs communs CD80/86. L’intérêt pour cette molécule était renforcé par l’observation que les souris déficientes pour CTLA-4 développent une maladie lymphoproliférative fatale accompagnée de signes autoimmuns systémiques 92. En 2002 ce fut au tour de GITR (Glucocorticoide-Induced Tumor necrosis factor Receptor family-related gene) d’être proposé comme candidat potentiel. L’équipe de Sakaguchi a mis en évidence que l’utilisation d’anticorps anti-GITR peut atténuer la suppression induite par les Treg in vitro 93. Cependant, malgré la diversité des marqueurs proposés, et les énormes avancées permises par la découverte de CD25, aucun ne s’est révélé être un marqueur définitif puisque l’expression de chacun d’entre eux est induite à la surface des LT effecteurs activés, ne permettant pas de les distinguer des Treg. Chez l’homme, plusieurs équipes ont confirmé l’utilisation de CD25 comme marqueur des Treg 94 , 95 , 96 , 97 . Néanmoins même si les cellules exprimant un taux élevé de CD25 ont les capacités suppressives les plus importantes, chez l’homme CD25 est également un marqueur de cellules effectrices activées. 30 b. Foxp3 En 1982, Powel et al. ont réalisé la première description d’une maladie inflammatoire et auto-immune multi-organes, l’IPEX (Immune Dysregulation Polyendocrinopathy Enteropathy X linked syndrome) qui débute généralement peu de temps après la naissance 98. L’équivalent murin de l’IPEX est observé chez les souris Scurfy décrites par Godfrey en 1991 99 . En 2001, il a été établi que les syndromes IPEX et Scrufy sont dus à une mutation génétique dans le gène codant le facteur de transcription Foxp3 (Forkhead box protein 3) situé sur le chromosome X 100 , 101 , 102 . L’expression de Foxp3 est nécessaire au développement et à la fonction des lymphocytes T régulateurs (Treg) 103-105 . Non seulement Foxp3 est exclusivement exprimé par les Treg, mais son expression forcée dans des cellules CD4 naïves leur confère des capacités immunosuppressives in vitro et in vivo. De plus, il a été montré que l’expression de nombreux marqueurs identifiés préalablement (GITR, CTLA-4, CD25) est contrôlée par Foxp3 104 . Par la suite, le lien avec les thymectomies à 3 jours a été réalisé grâce à l’utilisation de souris exprimant une protéine de fusion Foxp3-GFP. Le groupe de Rudensky a ainsi détecté une expression de la GFP dans le thymus ainsi qu’en périphérie au 3eme jour après la naissance 106. Des modèles de déplétion spécifique des Treg ont par la suite été développés par le biais d’une construction transgénique conduisant à l’expression du récepteur à la toxine diphtérique sous le contrôle du promoteur de Foxp3. L’injection de toxine chez ces animaux assure la délétion spécifique des Treg aboutissant au développement d’un syndrome autoimmun létal semblable à celui observé chez les souris Scurfy 107. Ainsi, la découverte de Foxp3 a permis de gigantesques avancées dans l’étude de la biologie et de la fonction des Treg, et de ce fait sur la compréhension de certaines maladiesauto-immunes. Cependant Foxp3 présente tout de même quelques limites majeures. Tout d’abord, étant une molécule intra-nucléaire, Foxp3 ne peut être utilisé pour la purification des Treg. De plus, chez l’homme, il est apparu que Foxp3 est exprimé de façon transitoire par les CD4 effecteurs suite à leur activation 108, 109 . Enfin, des analyses sur des patients IPEX ont également révélé des anomalies au niveau des LT conventionnels 110. On peut donc supposer que les choses sont plus complexes chez l’homme où l’expression de Foxp3 ne se limite pas aux Treg. 31 c. Les nouveaux marqueurs La recherche de nouveaux marqueurs encore plus spécifiques se poursuit donc et diverses molécules ont été proposées comme le neuropiline-1 (FR4) 112 111 , le récepteur aux folates ou plus particulièrement, CD127, la chaîne # du récepteur à l’IL-7 113, 114 . L’expression de CD127 est inversement corrélée à celle de Foxp3 à la fois chez l’homme et chez la souris 113 . Ainsi, les cellules CD25+CD127low possèdent des capacités immunosuppressives contrairement à leur contrepartie CD127hi 113, 114. Le niveau d’expression de CD127 permet donc de distinguer précisément les cellules régulatrices des cellules effectrices ainsi que de les isoler efficacement. 3. Sélection thymique et répertoire des Treg L’origine thymique des lymphocytes T régulateurs a été proposée dès les premières expériences de thymectomie sur les nouveaux-nés. La découverte de CD25 et de Foxp3 a permis de traquer ces cellules dans leur développement. Or le thymus étant également l’organe dans lequel se développent les lymphocytes T conventionnels il est naturel de s’interroger sur la sélection thymique des Treg. Par l’utilisation de souris exprimant les molécules de CMH-II exclusivement dans le cortex, Besinger et al. ont observé la présence de cellules CD4+CD25+ dans le thymus et en périphérie. Ceci indique que le CMH-II exprimé par les cTEC permet la sélection des Treg 115 . Afin de mieux comprendre l’impact de la spécificité du TCR des Treg sur leur sélection, Ribot et al. ont généré des chimères hématopoïétiques dans lesquelles l’expression d’un ligand agoniste endogène est restreinte aux cellules épithéliales thymiques. L’analyse du répertoire des Treg développés dans ces thymi indique que l’expression du ligand agoniste n’induit pas la délétion des Treg mais augmente leur sélection positive 116. Il est apparu important de parvenir à distinguer les rôles respectifs du cortex et de la médulla dans cette sélection positive accrue. La génération de souris exprimant un seul couple CMHII- peptide unique, a montré un enrichissement du répertoire des Treg en cellules spécifiques pour le ligand unique 117. Ces résultats démontrent que la reconnaissance d’un ligand agoniste exprimé par l’épithélium cortical augmente la sélection positive des Treg CD4+CD25+. De plus, en 2001 Jordan a décrit une importance de l’affinité du TCR pour son ligand sur la sélection des Treg. Les auteurs ont utilisé un modèle de souris HA (hémagglutinine de 32 l’influenza) transgéniques croisée avec des souris transgéniques pour un TCR spécifique de HA présentée dans le contexte de IEd. Un pourcentage important de Treg se développe lors d’une interaction de forte affinité du TCR avec le complexe CMH-II/HA. À l’inverse, en présence de TCR de faible affinité, la génération de Treg est diminuée 118. Après les étapes de sélection positives, les Treg tout comme les T conventionnels migrent dans la médulla, siège préférentiel de la sélection négative. L’analyse du répertoire des Treg issus de chimères hématopoïétiques dans lesquelles les DC n’expriment pas de CMH-II, a mis en évidence un enrichissement en Treg et en LT conventionnels spécifiques pour des ligands présentés par les mTEC. Ces résultats indiquent que les Treg sont également sensibles que les T conventionnels à la délétion réalisée par les DC 119 . L’implication des mTEC reste en revanche plus incertaine. Anderson et al. ont exclu un rôle prépondérant des mTEC exprimant Aire par l’observation que l’absence d’expression de ce facteur de transcription ne modifie ni le développement ni la fonction des Treg 120 . Toutefois, Aschenbrenner a montré qu’une absence de CMH-II à la surface des mTEC induit une réduction de Treg polyclonaux 121 . Plus récemment, Klein a développé un modèle de souris dans lesquelles l’expression du CMH-II est diminuée mais non aboli 122. Dans ces animaux, la délétion des CD4+ auto-spécifiques est diminuée alors que l’induction de Treg CD4+CD25+ est augmentée démontrant un rôle autonome des mTEC dans les mécanismes dominants et récessifs de tolérance. 4. Homéostasie du compartiment régulateur a. Distinction des compartiments naïfs vs « effecteurs/mémoires » Une fois en périphérie, les Treg migrent via la circulation sanguine, dans les organes lymphoïdes secondaires. À l’équilibre, il a été montré que la taille du compartiment régulateur est stable. Un tel constat pourrait s’expliquer par l’état d’anergie qui caractérise les Treg. En effet, in vitro les Treg ne prolifèrent pas suite à une stimulation antigénique 123 . Cependant, l’équipe de Salomon a montré que le compartiment régulateur se divise en deux souspopulations 124 . L’une est composée de cellules naïves et quiescentes montrant une forte expression de CD62L (CD62Lhi), un niveau intermédiaire de CD44 (CD44int), et qui sont capables de persister plusieurs semaines dans les organes lymphoïdes secondaires. La deuxième population correspond aux cellules régulatrices les plus auto-spécifiques. Leur 33 prolifération suite à l’interaction avec leur antigène spécifique induit la diminution de l’expression de CD62L à leur surface et l’augmentation de l’expression de facteurs d’activation comme CD69 et CD44 caractéristiques de cellules activées. Cette dernière population que l’on pourrait appeler « effectrice/mémoire » représente la majorité des Treg. b. Dépendance à l’IL-2 La prolifération des Treg « effecteurs/mémoires » n’est possible qu’en présence d’IL-2 qui s’est révélée jouer un rôle central dans l’homéostasie et la fonction des Treg. En effet, les souris déficientes pour l’IL-2, qui développent spontanément une auto-immunité combinée à une inflammation sévère, possèdent significativement moins de Treg malgré un nombre normal de cellules T et une répartition classique des compartiments CD4 et CD8 125. Des chimères hématopoïétiques générées par co-injection de cellules T déficientes pour l’IL-2 et de cellules T sauvages ne développent pas d’auto-immunité ou d’inflammation et révèlent une génération normale du compartiment Treg CD4+CD25+ 125. Ainsi, l’IL-2 apparaît comme un facteur clé de la croissance et de la survie des Treg. Ceci est renforcé par l’observation que la présence de fortes doses d’IL-2 dans une culture de Treg reverse leur état anergique 123 . De plus, des études récentes ont montré que le traitement de souris NOD avec de faible doses d’IL-2 permet de réduire la progression d’un diabète établi126. c. Indépendance vis à vis de l’IL-7 L’absence d’expression de CD127 est une caractéristique phénotypique permettant d’identifier les Treg. La répression de cd127 serait inversement corrélée à l’expression de Foxp3. Le groupe de Bandeira a montré que la génération et l’homéostasie des Treg sont maintenues en absence d’IL-7 127 . Les souris déficientes pour l’IL-7, qui développent une colite après déplétion des cellules CD4+CD25+, entrent en rémission spontanément en même temps que le compartiment régulateur se reforme. Ainsi l’absence de pathologie auto-immune dans les souris IL7-/- serait dû à la génération centrale et périphérique de Treg. 34 d. Présence de l’antigène Il a été mis en évidence dès 1999 que les Treg ont besoin de la persistance de leur antigène en périphérie pour se maintenir 128 . Dans un modèle de rats thymectomisés et irradiés, il est apparu une thyroïdite et un diabète auto-immun curables par transfert de Treg. Lorsque ces cellules sont issues d’animaux dont la thyroïde a été détruite in utéro par administration d’iode 131, elles ne parviennent pas à contrôler le diabète de type 1. Par contre, les thymocytes sont capables de prévenir la survenue des 2 pathologies. Garza et al. ont utilisé une approche similaire pour étudier la tolérance à un antigène ovarien, ZP3 129. Une oophorite auto-immune peut être induite expérimentalement, chez des souris mâles ou femelles simultanément ovariectomisés, par la greffe d’un ovaire accompagnée d’une immunisation contre ZP3. La sévérité de la pathologie est plus marquée chez le mâle que chez la femelle. En revanche, si l’ovariectomie a eu lieu plus d’une semaine avant l’induction de l’oophorite, la protection chez la femelle est perdue, ce qui montre que cette tolérance nécessite la persistance des antigènes ovariens. 5. Plasticité du lignage Treg a. Induction périphérique de Treg i. Treg induit Foxp3+ (iTreg) La population de CD4 régulatrice retrouvée en périphérie est en majorité constituée de cellules Foxp3+ différenciées dans le thymus. Cependant une induction de Treg est également observée en périphérie. Des CD4 naïfs peuvent, sous l’influence de l’IL-10, être convertit en cellules régulatrice Tr1 sécrétrices d’IL-10 72 alors que le TGF-ß induit une conversion en cellules Th3 sécrétrices de TGF-ß 79. Plus récemment il a été décrit l’induction en périphérie de cellules CD4+Foxp3+ à partir de cellules CD4 naïves Foxp3-. ii. Mécanismes et voies d’induction ! Le TGF-ß L’une des principales cytokines impliquées dans la biologie et la fonction des Treg Foxp3+ est le TGF-ß. C’est donc vers cette cytokine que bon nombre d’études se sont 35 tournées. Il est décrit qu’une stimulation de cellules T Foxp3- combinée à une culture en présence de TGF-ß permet d’induire l’expression de Foxp3 dans ces cellules leur conférant des capacités immunosuppressives 130 , 131 . L’induction de Foxp3 par le TGF-ß dépend de l’activation du facteur de transcription SMAD3 132 qui en parallèle de NFAT se lie à la région enhancer du gène de Foxp3 et active sa transcription. Cette voie d’activation serait principalement impliquée dans la conversion de T effecteurs en Treg Foxp3+ au niveau de l’intestin 133. De plus, une étude de Shevach et al. en 2008 a clairement montré in vitro que l’induction d’iTreg peut être réalisée par contact direct avec des Treg naturels. Les auteurs ont mis en évidence que l’expression de LAP (Latency associated peptid), forme membranaire du TGF-ß, à la surface des Treg activés conduit à une inhibition de la prolifération des cellules T effectrices activées. De plus, la co-culture de Treg LAP+ avec des cellules naïves conduit à l’expression de novo de Foxp3 dans ces dernières par un mécanisme dépendant d’un contact entre les cellules T mais indépendant d’un contact avec une cellule présentatrice de l’antigène. Enfin ces cellules « induites » présentent une activité suppressive in vitro et in vivo 134. Enfin, Il a été décrit que les DC tolérogènes intestinales CD103+ induisent des Treg Foxp3+ par co-production de TGF-ß et d’acide Rétinoïque 135, 136. ! mTOR L’induction d’expression de Foxp3 peut aussi être due à une inhibition de la voie PI3K/AKT/mTOR (mammalian Target of Rapamycine). Cette voie de signalisation assure la perception de l’environnement énergétique permettant d’adapter la croissance et la prolifération cellulaire. mTOR semble également impliquée dans le choix de lignage T effecteurs/Treg 137. Il a été décrit que les Treg induisent l’expression par les DC d’enzymes de consommation des acides aminés, telle que l’IDO qui diminue le taux de tryptophane dans le milieu. Il a récemment été montré que la présence de Treg module la disponibilité de 5 acides aminés en particulier (le tryptophane, la valine, l’arginine, la phénylalanine, et l’histidine). La carence en un seul de ces acides aminés conduit à une diminution de la prolifération des cellules T par une inhibition de la voie de signalisation AKT/mTOR. Cette inhibition associée à la stimulation du TCR en synergie avec le TGF-ß conduit à l’expression de novo de Foxp3 et ainsi à la conversion de CD4 naïfs en Treg 138. 36 Adapté de Weaver et al, Nat. Rev. Immunol., 2009 Figure 6 : les lignages de Treg induit et de Th17 nécessitent un facteur commun de différenciation, le TGF-ß. Les cellules dendritiques (DC) conditionnées dans un environnement riche en TGF-ß présentent des antigènes qui induisent la différenciation de CD4 naïfs en Treg ou en Th17 selon la prédominance, respectivement, en acide rétinoïque ou en IL-6. En conditions basales, les DC chargées avec des dérivés de flore commensale ou de produits alimentaires produisent de l’acide rétinoïque par dégradation de la vitamine A, induisant l’expression de Foxp3 et la différenciation en Treg induits. En présence d’une infection bactérienne, les DC activées par les différents signaux pro-inflammatoires produisent de l’IL-6, arrêtent la production d’acide rétinoïque favorisant la différenciation en Th17. L’IL-6 et l’IL-21 (induite par l’IL-6) inhibent l’expression de Foxp3 et activent celle des gènes des facteurs de transcription ROR%t et ROR# conduisant à l’expression de la chaîne inductible du récepteur à l’IL-23. La production d’IL-17 par les Th17 active la génération de neutrophiles et leur attraction au site de l’infection. L’IL-17 ainsi que l’IL-22 favorisent également la production de peptides antimicrobiens par les cellules endothéliales. Les Th17 agissent ainsi à la fois sur l’élimination du pathogène et sur la restauration de la fonction de barrière. DC : Dendritic cells ; G-CSF : Granulocyte colony-stimulating factor ; Foxp3 : Forkhead box P3 ; IL : Interleukine ; ROR : Retinoic acid-related orphan receptor ; TGF-ß : transforming growth factor-ß 37 ! ATP/AMP Les ectoenzymes CD39 et CD73 transforment l’ATP (qui a un pouvoir proinflammatoire) en AMP puis en adénosine qui a des propriétés anti-inflammatoires 139. CD39 est constitutivement exprimée à la surface des DC. CD73 est fortement exprimée suite à une exposition des DC au TGF-ß. Tout comme pour les Treg 139 l’expression de CD73 à la surface des DC et de macrophages peut conduire à la dégradation d’ATP en AMP capable d’inhiber la prolifération des cellules T 140 . Cependant l’adénosine peut également être captée par un récepteur spécifique et transformée à l’intérieur de la cellule en AMP inhibant la voie de signalisation mTOR aboutissant à l’expression de novo de Foxp3 et ainsi à l’induction de Treg en périphérie 141. b. Lignages Treg vs Thelper Dans l’évolution du système immunitaire, il est maintenant établi que les Treg se sont développés conjointement avec les Th17 142 . Cette autre lignée de cellules CD4+ est caractérisée par l’expression des facteurs de transcription ROR%t et ROR# et par la production des cytokines pro-inflammatoires IL-17A, F et IL-22. L’une des preuves de la coévolution de ces deux lignages est leur dépendance au TGF-ß. Bien que pour les Treg le TGFß favorise l’induction de l’expression de Foxp3 parmi les populations CD4 naïves limitant l’inflammation, l’association du TGF-ß avec l’IL-6 induit l’expression des facteurs de transcription ROR et la différenciation des CD4 naïfs en Th17 assurant la mise en place d’une inflammation efficace pour l’élimination d’un pathogène (Figure 6). Le choix du lignage Treg ou Th17 est contrôlé par la répression mutuelle qu’exercent les facteurs de transcription Foxp3 et ROR%t 143 . La disponibilité en composés métaboliques joue aussi un rôle dans l’équilibre de cette balance. En effet, la différenciation en Th17 est dépendante d’enzymes glycolytiques comme HiF1 (Hypoxia inducible factor 1) spécifiquement exprimée par les Th17 et qui agit via l’activation de la voie mTOR. L’inhibition de HiF1 favorise la différenciation en Treg au détriment du lignage Th17 144. Cependant une réversion de chacun des phénotypes est également possible. Ainsi il a été montré que lors d’une infection bactérienne, les Treg Foxp3+ peuvent, sous l’influence de cytokines pro-inflammatoires, diminuer l’expression de Foxp3 et augmenter celle de ROR%t devenant des cellules productrices d’IL-17 145, 146. 38 De façon similaire, il a récemment été proposé un rôle potentialisateur des Treg sur le développement de Th17. Dans le cas d’une infection par Candida albicans, les Treg stimulent la production d’IL-17 par les LT effecteurs favorisant l’élimination du champignon 147 . Ces résultats indiquent clairement que l’interrelation entre les lignages est bien plus complexe qu’envisagée initialement. Le ratio entre les populations Treg et Th17 joue un rôle primordial dans l’immunité. Il a été montré, en transplantation, qu’un déséquilibre de cette balance en faveur des Th17 est un facteur pronostic de rejet aigu chez l’homme 148. En effet, la déficience en IL-17 est associée à un allongement de la survie d’une greffe cardiaque chez la souris et à une augmentation du pourcentage de Treg 149. 6. Fonctions physiopathologiques a. Prévention de l’auto-immunité L’importance de l’existence d’une population régulatrice a été démontrée dans de nombreux modèles. Les expériences fondatrices ont révélé que l’élimination des Treg conduit systématiquement au développement de pathologies auto-immunes. : la thymectomie 86 néonatale mène à une oophorite , et le transfert de cellules CD4+CD25- à un animal immunodéficients aboutit à une auto-immunité systémique mortelle 63. Moins artificiellement, les conséquences graves d’une absence de Treg sont illustrées par le syndrome de l’IPEX 98 , 100 , ou par l’infection néonatale avec le MTLV (mouse T lymphotropic virus) qui, en détruisant le compartiment CD4, cause entre autres une gastrite 150 . D’une façon moins drastique, la diminution des fonctions effectrices des Treg peut être à l’origine de désordres dans la tolérance au soi. Ainsi, des cellules régulatrices avec des capacités suppressives amoindries ont été isolées de sang de patients souffrant d’une forme relativement peu sévère de l’IPEX 110, de diabète de type I 153 151 , de sclérose en plaques 152, de polyarthrite rhumatoïde ou du syndrome de Wiskott-Aldrich 154. La perturbation de l’homéostasie des Treg pourrait également conduire à la survenue de pathologie : la déficience en IL-2 ou l’incapacité à y répondre handicape lourdement les Treg, ce qui provoque chez les animaux invalidés des atteintes auto-immunes 155 . Dans le cas de l’IL-2 une simple insuffisance dans la production d’IL-2 a été suggérée comme un des facteurs de susceptibilité au diabète de la souris NOD (Non Obese Diabetic) et à l’EAE 156, 157 . Bien que dans le cas de la souris NOD l’impact du nombre de Treg sur l’amplitude de la maladie soit encore débattu 158-160, il semblerait que les 39 capacités suppressives des Treg d’origine NOD décroissent avec l’âge des animaux, parallèlement à l’apparition d’une résistance des LT conventionnels à l’action du TFG-ß 161 . Paradoxalement, Salomon et al. ont récemment montré un rôle potentialisateur des LT effecteurs sur la prolifération et les fonctions suppressives des Treg dans le modèle de souris NOD. Ils ont identifié un rôle du TNF et non de l’IL-2 dans l’établissement de cette boucle de rétrocontrôle qui permettrait de limiter le développement de la pathologie 162. Par ailleurs, l’accumulation de Treg dans le système nerveux central a été associé à la rémission observée chez la souris C57BL/6 dans le modèle de l’EAE 163. Chez cette souche, l’induction de la maladie se traduit par l’apparition d’une inflammation aiguë du tissu nerveux qui se résorbe spontanément. Une fois guéris, les animaux deviennent réfractaires à la réinduction de la pathologie. La délétion des Treg avant la première immunisation retarde la rémission spontanée, tandis qu’une élimination postérieure au rétablissement empêche l’acquisition de la résistance. Les Treg s’avèrent donc capables de contrôler la réponse autoimmune, mais leur enrichissement suite à une première réponse pourrait établir une tolérance durable. b. La tolérance fœto –maternelle Du fait de l’expression d’antigènes paternels, le fœtus est souvent considéré par les immunologistes comme un greffon semi-allogénique. De ce fait, une tolérance est induite pendant la grossesse, et a été mise en évidence par l’acceptation par le système immunitaire maternel d’une greffe de cellules tumorales paternelles 164 . Cette tolérance est transitoire puisque la réactivité est restaurée après la délivrance. L’implication des Treg a été découverte chez la souris par le groupe de Betz 165. Il a montré que la population régulatrice s’amplifie de manière systémique dès les premiers jours de gestation, et ce même dans le cas de fœtus syngéniques. Cette observation soulève l’hypothèse d’une possible influence des hormones sexuelles féminines sur l’homéostasie des cellules régulatrices, et pourrait en partie expliquer l’effet bénéfique de la grossesse sur certaines pathologies auto-immunes comme la sclérose en plaques. Une importante infiltration de l’utérus par les Treg est également décrite. De plus, la déplétion des Treg conduit à un rejet du fœtus et à un avortement 165. Récemment, Rudensky a décrit un rôle préférentiel et prépondérant des iTreg spécifiques d’antigènes paternels dans la tolérance foeto-maternelle. L’absence de génération de Treg induit au niveau placentaire conduit à une augmentation du nombre d’avortement spontané chez la souris 166. 40 Chez la femme, une élévation du nombre de Treg a également été rapportée durant la grossesse normale 167 , de même que leur présence dans la décidua 168 . En fait, un nombre faible de Treg dans l’utérus a été corrélé avec l’avortement spontané et la pré-éclampsie168, 169. c. Modulation des réponses anti-infectieuses Lors d’une réponse immunitaire anti-infectieuse, le système immunitaire met en place différents mécanismes effecteurs : la production de cytokines pro-inflammatoires, la production de chimiokines permettant le recrutement de cellules immunitaires sur le lieu de l’infection et finalement l’activation de cellules cytotoxiques comme les CTL et les NK qui ont la capacité de lyser les cellules infectées. Bien que ces mécanismes soient cruciaux pour limiter la propagation de l’agent pathogène, ainsi que pour éliminer le pathogène de l’organisme, ils doivent être drastiquement contrôlés afin d’éviter tout risque d’hyper inflammation et de dommages tissulaires collatéraux. En effet, il est possible que lors de la réponse immunitaire adaptative contre les antigènes du pathogène il y ait génération d’une réaction immunitaire croisée contre les antigènes du soi aboutissant au développement de pathologies auto-immunes. Des mécanismes suppresseurs ont ainsi été spontanément développés afin de préserver l’homéostasie de l’organisme. Le rôle central des Treg dans ces processus a été établi par différents modèles infectieux 170 . La plupart des infections où les Treg ont un rôle protecteur important sont des cas d’infections chroniques 171. Un modèle bien documenté à ce jour est le cas de l’infection gastro-intestinale bactérienne par helicobacter hepaticus qui cause une inflammation intestinale. Le transfert de cellules CD4+ isolées à partir d’une souris IL-10-/- infectée par helicobacter hepaticus dans une souris RAG-/- infectée par cette même bactérie va permettre un excellent contrôle de l’infection, mais cela va également augmenter l’inflammation intestinale et induire l’apparition d’une colite inflammatoire. La même expérience réalisée cette fois à partir de CD4 isolées d’une souris sauvage infectée et transférées dans un hôte RAG-/- également infecté assure une réponse immunitaire moindre contre le pathogène mais protège du développement de la colite. Par ce travail, l’équipe de Sher a montré l’importance de la génération d’un pool de Treg spécifiques de l’antigène qui va moduler la réponse immunitaire anti-bactérienne par un mécanisme dépendant de l’IL-10 172. Une autre conséquence de la modulation des réponses anti-infectieuses par les Treg va être d’augmenter la survie de l’agent infectieux dans l’organisme et dans certains cas, cela 41 favorise même une persistance à long terme du pathogène créant un nouvel état d’homéostasie pour l’organisme. Ceci a été illustré dans un modèle murin d’infection par leishmania major. En 2002, Belkaid et al. ont montré que la persistance du parasite au niveau de la peau de souris C57BL/6 après résolution de la phase aiguë de l’infection est due à l’action endogène des Treg CD4+CD25+ (Belkaid, 2002 #476). Cependant, l’activité suppressive des Treg permet également au système immunitaire de mettre en place une réponse mémoire immunitaire efficace en cas de réinfection par le même pathogène. Ce mécanisme est dépendant de l’IL-10. L’infection de souris IL-10-/- conduit à l’élimination complète du pathogène mais à l’absence de mise en place d’une réponse immunitaire capable de protéger l’animal en cas de réinfection. Depuis, il a été montré que l’attraction des Treg au site de l’infection est assurée par la chimiokine CCR5 173 et que les Treg retrouvés in situ sont spécifiques d’antigènes du parasite 174. d. Inhibition des réponses anti-tumorales Les pathologies infectieuses sont induites par des organismes exogènes (virus, bactéries, parasites..). Les cancers au contraire sont des pathologies inflammatoires induites suite à des divisions anarchiques et non contrôlées de cellules du soi. Du fait de l’origine endogène des tumeurs, générer une immunité anti-tumorale efficace est un processus délicat car cela pourrait conduire à la mise en place d’une réponse auto-immune. Cependant, les antigènes tumoraux sont d’avantage qualifiés d’antigènes du soi modifiés du fait qu’ils possèdent des caractéristiques propres (forme mutée de p53 dans certains carcinomes épithéliaux par exemple). Du fait de leur répertoire majoritairement auto-spécifique, les Treg se sont révélés être un frein à l’immunité anti-tumorale. En effet, au début des années 1980, il a été observé que les T CD4 isolés de souris porteuses de tumeurs inhibaient le rejet de la tumeur 175-177. Depuis ces dix dernières années, un nombre élevé de Treg a été retrouvé dans de nombreux cancers comme le cancer des poumons 178, 179, les tumeurs gastriques 180, les mélanomes 181 ainsi que dans les lymphomes hodgkinien 182 et non-hodgkinien 183 . Surtout, il est établit qu’une forte infiltration de la tumeur par les Treg est un signe de mauvais pronostic chez l’homme 180, 184. Ainsi il a été montré que la déplétion des cellules CD4+CD25+ chez la souris, augmente l’immunité anti-tumorale induisant ainsi une réduction de la croissance tumorale, favorisant la régression tumorale et de ce fait augmente la survie de l’animal. 42 7. Mécanismes d’action a. Production de cytokines inhibitrices L’implication des cytokines immuno-modulatrices IL-10 et TGF-ß sur le contrôle de l’auto-immunité par les Treg a longtemps été controversée. Les premières études in vitro ont montré que l’action des Treg nécessitait une interaction cellulaire directe 123, 185 . De plus, l’utilisation d’anticorps bloquants ou de T effecteurs ne pouvant pas répondre à l’IL-10 ou au TGF-ß suggérait que ces cytokines n’étaient pas indispensables à la fonction des Treg 95, 185, 186 . Cependant, ces résultats se sont révélés en contradiction avec ceux obtenus in vivo (Figure 7a). En effet, dans des modèles d’asthme allergique, il est décrit un contrôle de la pathologie par les Treg par un mécanisme dépendant de l’IL-10 187 . Dans ce cas, l’IL-10 semble produite par les LT effecteurs sous l’impulsion des Treg. A l’inverse, il est décrit que la production d’IL-10 par les Treg joue un rôle central dans le contrôle du développement de la colite chez la souris 188. Le rôle du TGF-ß a été tout aussi controversé. Cependant des études ont montré l’absence de contrôle par les Treg de LT effecteurs ne répondant pas au TGF-ß dans un modèle murin de maladie inflammatoire de l’intestin 189 . Certaines études se sont plus spécifiquement intéressées au TGF-ß sous sa forme membranaire. Cette forme particulière du TGF-ß, permettant une action par contact cellulaire 190, est impliquée dans le contrôle de l’infiltration des CD8+ dans les îlots pancréatiques aboutissant à un délai de développement du diabète 191. 43 Extrait de Vignali et al. Nat. Rev. Immunol., 2008 Figure 7 : Mécanismes de suppression utilisés par les Treg CD4+CD25+ a$ La sécrétion de cytokines permet aux LT régulateurs (Treg) d’inhiber l’activation des LT conventionnels ou d’orienter les cellules dendritiques (DC) vers un phénotype tolérogène, et donc incapable d’activer les LT conventionnels. b$ Les Treg peuvent également avoir une capacité cytotoxique par la production de perforines et de granzymes. c$Les Treg peuvent créer un environnement suppressif en déprivant le milieu en cytokines de survie, telles que l’IL-2. Elles expriment en outre les ecto-enzymes CD39 et CD73 qui génèrent de l’adénosine, nucléoside dont la concentration locale élevée inhibe les LT effecteurs activés qui expriment son récepteur A2AR. d$Les Treg peuvent cibler les DC par des mécanismes modulant leur activation et leur fonction. L’engagement de CTLA-4 par la DC induit la synthèse d’IDO, enzyme du catabolisme du tryptophane, qui appauvrit le milieu en cet acide aminé essentiel et libère des catabolites (comme les kinurénines). L’engagement de LAG3 inhibe aussi la maturation des DC. AMPc : cyclic adenosine monophosphate ; A2AR : adenosine receptor 2 ; CTLA-4 : cytotoxis T lymphocyte antigen-4 ; DC : dendritic cell ; IDO : indolamine 2,3-dioxygenase 44 Récemment, une autre cytokine a été décrite : l’IL-35. Cette cytokine est préférentiellement produite par une sous –population de Treg qui n’expriment pas Foxp3. L’IL-35 est dans ce cas requise pour leur différenciation et pour leur activité suppressive 192 Bien que l’implication de l’IL-35 dans la fonction des Treg dans l’auto-immunité reste encore à déterminer, il est intéressant de noter que l’expression ectopique de l’IL-35 confère in vitro des capacités régulatrices à des T effecteurs 192. b. Cytotoxicité directe Longtemps considérée comme la spécialité des cellules lytiques professionnelles (CD8, NK), la lyse cellulaire par les granzymes B et la perforine a également été décrite chez les Treg humains 193. Chez la souris, Noelle et al. furent les premiers à mettre en évidence in vitro une diminution des capacités suppressives de Treg déficients pour les granzymes-B. Dans ce cas, la lyse par les granzymes B passerait par un mécanisme indépendant de la perforine 194. Ainsi les Treg ont la capacité de lyser des LB par un mécanisme dépendant des granzymes B mais indépendant de la perforine 195 . En revanche, la lyse des NK et CTL, impliqués dans l’élimination des tumeurs, est réalisée par un mécanisme dépendant de la perforine 196 (Figure 7b). c. CTLA-4 Différentes expériences de « transwell » ont clairement établi que le contact cellulaire est indispensable entre les Treg et les LT effecteurs pour que l’inhibition de la prolifération puisse avoir lieu 93, 185. Des études d’imagerie intra-vitale ont montré in vivo l’existence d’une interaction directe entre les Treg et les DC. Cette interaction diminuerait l’activation des LT effecteurs par les DC par un processus impliquant la molécule de co-stimulation CTLA-4 197, 198 qui est constitutivement exprimée à la surface des Treg 199 (Figure 7d). L’absence de signalisation de CTLA-4, induite par blocage avec des anticorps ou encore par inhibition de son expression à la surface des Treg, conduit à une réduction de la suppression des T effecteurs via les DC 200. Récemment CTLA-4 a été montré comme pouvant capturer ses ligands (CD80-86) exprimés à la surface des la CPA par un processus de trans-endocytose 45 201 . Ces molécules sont alors dégradées dans la cellule en cours d’activation interférant dans la co-stimulation via CD28. Cette capture observée in vitro et in vivo est dépendante de l’engagement du TCR. d. Détournement du métabolisme On a longtemps cru que l’inhibition de la prolifération s’expliquait par une inhibition de la transcription de l’IL-2 par les LT effecteurs une autre hypothèse déjà suggérée en 2004 202 185 . Les travaux de Pandiyan ont proposé : le concept de déprivation de l’IL-2 dans le microenvironnement. La présence de Treg dans les co-cultures induit une diminution de la concentration en IL-2, mais les auteurs n’ont pas observé de diminution de sa transcription 203 Ils ont donc proposé que la déprivation en IL-2 ainsi qu’en IL-7, induirait une apoptose des cellules effectrices par une voie dépendante du facteur pro-apoptotique Bim (Figure 7c). CTLA-4 est également impliquée dans l’induction de l’expression d’IDO (indolamine 2,3-desoxygenase) par les DC. IDO est une enzyme de dégradation du tryptophane dont le catabolisme produit des composés métaboliques toxiques : les kinurénines 204 qui conduisent à l’anergie des Teffecteurs ou à leur conversion en Treg. Récemment il a été montré que les Treg expriment à leur surface les deux ectoenzymes CD39 et CD73 capables de transformer l’ATP (qui a un pouvoir pro-inflammatoire) en AMP puis en adénosine qui a des propriétés anti-inflammatoires 139 . La déprivation du milieu environnant en métabolites énergétiques inhibe ainsi la fonction des T effecteurs. 8. Potentiels thérapeutiques des Treg a. Auto-immunité De nombreuses études pré-cliniques réalisées dans des modèles animaux ont montré que le transfert adoptif de Treg est capable de prévenir le développement de pathologies autoimmunes ou immuno-inflammatoires telles que le diabète de type 1, la polyarthrite rhumatoïde, l’EAE 205. Les travaux montrant que le transfert de Treg peut corriger une pathologie auto-immune active et déjà établie sont plus rares 206, 207. Le groupe de Powrie a montré en 2003 que l’injection de Treg polyclonaux dans le traitement d’une pathologie inflammatoire intestinale déjà établie (modèle murin de l’IBD) permettait de réduire les infiltrats lymphocytaires inflammatoires au niveau de la lamina propria intestinale et de 46 rétablir une architecture intestinale physiologique 206. Après expansion ex vivo de Treg transgéniques stimulés par des cellules dendritiques autologues présentant des antigènes des îlots pancréatiques, Tarbell et al. ont montré que l’injection de ces Treg antigène-spécifiques permettait de corriger un diabète auto-immun déjà établi dans une souris NOD de 13 semaines 208. Les souris ainsi traitées possèdent toujours des LT effecteurs diabétogénes mais elles présentent parallèlement un nombre accru de cellules FoxP3+ au niveau des noeuds lymphatiques drainant le pancréas 208. La prévention ou le traitement de pathologies auto-immunes peut ainsi être obtenue par transfert de Treg exogènes, cependant l’amplification de la population endogène peut être une autre voie envisageable. Par exemple, l’administration d’anti-CD3 en combinaison avec une immunisation intra-nasale de proinsuline, qui induit la prolifération des Treg, a une action curative chez la souris NOD 209. b. Inhibition de la maladie du greffon contre l’hôte (GvHD) La maladie du greffon contre l’hôte (ou graft versus host disease-GvHD) est une complication fréquente de la greffe de moelle osseuse. C’est une pathologie inflammatoire caractérisée par l’infiltration de cellules inflammatoires dans la peau, le tractus intestinal et divers autres organes conduisant à une atteinte systémique. L’élimination des cellules T matures présentes dans la moelle avant transplantation permet certes de diminuer la GvHD mais en contrepartie diminue également l’efficacité de la prise de la greffe. L’utilisation des Treg CD4+CD25+ polyclonaux ou spécifiques d’antigènes dans la prévention de la GvHD est une approche thérapeutique importante 210 . La co-transplantation de Treg purifiés avec une moelle osseuse allogénique inhibe la GvHD tout en conservant une réponse de la greffe contre la tumeur (ou graft versus leukemia- GvL) 211, 212. L’équipe de Strober a montré que les Treg inhibent l’expansion précoce des T effecteurs, l’expression de CD25 à leur surface et leur capacité d’induction de la GvHD sans diminuer la GvL qui passe par un mécanisme dépendant de la perforine 211. c. La transplantation L’utilisation de lymphocytes T régulateurs dans la prévention du rejet de greffe est une voie prometteuse et activement étudiée en médecine de transplantation. Tout comme pour la 47 prévention des maladies auto-immunes, l’inhibition du rejet de greffe peut être obtenue par transfert de Treg exogènes 205, 213 mais aussi par induction in vivo de l’expansion du compartiment régulateur endogène par utilisation de molécules chimiques comme la rapamycine stimulation 214 ou par traitement bref avec des anticorps bloquants les molécules de co- 215 , 216 . L’ensemble de ces points seront abordés en détail dans la suite de ce manuscrit. 48 Cha pi tre III 1. - L A TRANSPLAN TAT IO N Histoire de la transplantation Les témoignages écrits faisant état d’essais de transplantation d’organe remontent au fond des âges. Au deuxième siècle, en Chine, on trouve les premières références au remplacement d'organes malades par des organes sains. Au fil des temps, la fascination va s’affirmer et, profitant des premières dissections aux XVéme et XVIéme siècle, connaît un nouvel essor. Malheureusement, ces différentes tentatives n’ont pour fonction que de soigner un cas isolé et ne font en rien progresser la discipline. Ce n’est qu’en 1774 avec les débuts des expériences de greffes sur l’animal, réalisées par Abraham Trembley que la transplantation, jusqu’alors simple curiosité chirurgicale, passe par une démarche scientifique permettant de développer de nouvelles techniques. Cependant, une des difficultés majeures encore insurmontables est l’incapacité des chirurgiens de l’époque à suturer de façon durable les vaisseaux sanguins des organes transplantés et ceux des receveurs. C’est Alexis Carrel, prix Nobel de médecine en 1912, qui résout le problème en mettant au point une nouvelle technique de sutures vasculaires. Il est également le premier à suggérer la réfrigération des organes avant transplantation. En 1906, Mathieu Jaboulay est le premier à tenter une greffe de rein de porc chez une femme. Sa tentative se solde par un échec. À partir de cette date, de nombreuses tentatives de d’allogreffes (entre individus de même espèce) ou de xénogreffes (entre individus d’espèces différentes) sont réalisées sans jamais parvenir à allonger la survie de l’organe. Il devient alors évident que d’autres mécanismes entrent en jeu. Cependant il faut attendre 1933 pour que les travaux du russe Serguei Voronoy suggèrent les notions de rejet immunologiques par les premières expériences d’allogreffes humaines de rein. Le contexte mondial des années 40 ralentit la recherche. Cependant, l’année 1952 est prolifique en résultats majeurs. D’une part, le Français Jean Hamburger réalise une greffe de rein entre une mère et son enfant. L’enfant survivra 21 jours 217. La même année, Jean Dausset et son équipe mettent à jour l’existence de marqueurs moléculaires jouant le rôle de «carte d’identité génétique » spécifique à chaque individu : C’est la découverte du système HLA (human leucocyte antigen) dont le rôle et les différents groupes (HLA-A, -B et -C chez l’homme, H2-K, -D et -L chez la souris) seront établis en 1958 assurant l’attribution en 1980 49 Données extraites de l’Agence de Biomédecine Tableau 1 : Tableaux récapitulatifs du nombre d’inscrits en France sur les listes d’attente de greffes et du nombre de personnes décédées en attente de greffes entre 2006 et 2012. 50 d’un prix Nobel de médecine à Jean Dausset. 1962 est l’année de la première transplantation d’un rein prélevé sur un donneur décédé ; le patient survivra 21 mois grâce à un nouveau médicament immunosuppresseur : l’aziathropine. S’ensuit une période de nombreuses « premières fois » : 1967 : première greffe de foie ; 1968 : première greffe de cœur ; 1981 : première greffe de bloc cœur-poumon. Les années 70 connaissent une avancée dans le domaine de l’immunosuppression qui était jusqu’alors un problème insurmontable. En effet, la découverte et l’utilisation initiale de la cyclosporine lors d’une greffe de foie permet d’augmenter le taux de survie des greffons à 5 ans de 40 à 75%. Depuis, bien que la greffe d’organe soit devenue un acte relativement « courant » des exploits techniques sont encore régulièrement réalisés. Les derniers en date concernent les greffes de visage : partielle en 2005 (France), elle est quasi complète (80%) en 2008 aux Etats Unis. Enfin, une greffe complète de visage a été réalisée pour la première fois en 2010 en Espagne. 2. Le manque de donneurs Cependant, malgré les progrès extraordinaires de la médecine et de la science le premier obstacle auquel les patients sont confrontés est la pénurie des dons d’organes. En 2011, sur les 9997 inscrits sur les listes d’attentes de greffes, seuls 4 945 ont été greffés et 421 trouvèrent la mort (données EFG) (Tableau 1). Depuis de nombreuses années, le nombre de demande de greffe est en constante augmentation, mais les dons ne suivent pas cette tendance. L’une des raisons en est la peur de l’atteinte au corps du défunt et l’absence de législation adaptée. Ce n’est que depuis la fin des années 50 que les actes de transplantation sont juridiquement encadrés. Ceci a débuté avec la description légale de l’état de mort cérébrale, promulguée au journal officiel en 1968. La loi Caillavet du 2 Décembre 1976 autorise le prélèvement d’organe à partir d’un donneur vivant ou en état de mort cérébrale « confirmée » et instaure pour la première fois le concept de consentement présumé. Elle sera complétée par les Lois de Bioéthique du 06 Août 2004. Quatre principes éthiques sont alors établis : Le consentement, la gratuité du don, l’anonymat entre le donneur et le receveur et l’interdiction de publicité envers une personne ou un organisme déterminé. Aujourd’hui, sauf en cas de refus clairement exprimé par inscription sur le Registre National des Refus géré par l’agence de biomédecine, le don d’organe est considéré comme consentis. Néanmoins, par respect des patients dans ce moment difficile, l’accord de la famille est demandé par principe. 51 3. La mort cérébrale La mort cérébrale est définie comme l'état d'absence totale et définitive d'activité cérébrale chez un patient. L'absence apparente de fonctionnement cérébral ne saurait constituer le diagnostic à elle seule, la preuve devant être faite de l’irréversibilité de cet état. Elle est considérée par l'OMS comme le critère médico-légal du décès, par contraste avec un simple arrêt cardio-circulatoire. En effet, contrairement à ce dernier, un individu en état de mort cérébrale est considéré comme étant engagé dans un processus irréversible vers le décès définitif ; il n'est maintenu en vie que par les procédures de réanimation modernes. L’établissement de l’état de mort cérébrale nécessite un examen neurologique ne présentant aucune réactivité constatée par au moins deux médecins ainsi que par deux électroencéphalogrammes plat de 30 minutes réalisés à 4 heures d’intervalle. Lorsque l’état de mort cérébrale est constaté et que l’accord de la famille pour le don d’organe est obtenu, commence une course contre la montre. En effet, afin d’éviter un endommagement trop important des tissus, le temps entre la constatation de la mort, le prélèvement de l’organe et sa réimplantation dans le patient receveur doit être le plus court possible. 4. La prise en charge du greffon : L’ischémie/reperfusion Les manifestations classiques de l’ischémie sont l’obstruction des vaisseaux sanguins par une embolie qui aboutit à un déséquilibre négatif entre l’apport et la consommation des métabolites causant une hypoxie des tissus. La restauration du flux sanguin n’est pas sans moindre danger puisqu’elle est fréquemment associée à une augmentation des lésions du tissu et à l’apparition d’une réponse inflammatoire 218 . Il est à noter que l’exposition d’un seul organe à un phénomène d’ischémie/reperfusion peut provoquer des complications inflammatoires dans d’autres organes aboutissant parfois à des lésions multi-organes 219. Ainsi, l’activation de plusieurs procédés pathologiques est à l’origine des lésions causées par l’ischémie/reperfusion (Figure 8). Dans un premier temps, l’hypoxie est associée à une perte de fonction des cellules de la barrière endothéliale due à une diminution de l’activité de l’adénylate cyclase aboutissant à une diminution de la concentration intracellulaire en cAMP associée à une augmentation de la perméabilité vasculaire 52 220 . De plus, l’ischémie/reperfusion conduit à l’activation de programmes de mort cellulaire incluant l’apoptose, la mort par autophagie et la nécrose 221. La période ischémique est particulièrement associée à une altération significative du contrôle transcriptionnel de l’expression des gènes. Par exemple, l’hypoxie inhibe les phosphohydroxylases de perception de l’oxygène conduisant à une activation des cascades de signalisation de l’hypoxie et de l’inflammation qui contrôlent respectivement la stabilité des facteurs de transcription HIF (hypoxia-inducible factor) et NF-&B 222. Malgré la réouverture de vaisseaux, la reperfusion de l’organe ischémique n’est pas immédiate. De plus, les lésions de reperfusion sont caractérisées par des atteintes autoimmunes comprenant la libération d’anticorps reconnaissant des néo-antigènes suivies de l’activation des cascades du complément 223. Bien que les phases d’inchémie/reperfusion se déroulent dans un environnement stérile, les réponses immunitaires innées et adaptatives sont activées et contribues en grande partie à la destruction de l’organe. Les zones lésées libèrent des ligands des TLR et d’autres molécules de danger activant une réponse inflammatoire. L’ensemble des volets de la réponse inflammatoire va conduire in fine à l’activation des cellules T et au rejet de l’organe. Il a été montré que la phase d’ischémie/reperfusion pouvait, à elle seule, être responsable des mécanismes de rejets aigu et chronique. Adapté de Eltzschig et al. N. Engl. J. Med., 2011 Figure 8 : Processus biologiques impliqués dans l’ichémie-reperfusion Les phases d’ischémie-reperfusion conduisent à la dégradation voire la destruction complète d’un organe ou d’un tissu par l’intermédiaire de divers mécanismes physiologiques (hypoxie, mort cellulaire, épanchement vasculaire…) et immunitaires. 53 Extrait de Lechler et al. Nat. Rev. Immunol., 2003 Figure 9 : Les mécanismes d'alloreconnaissance directe L’interaction entre les molécules du CMH du donneur et le TCR du receveur peut être vue comme l’étendue d’un spectre distribué entre deux extrêmes : d’un côté le modèle du « déterminant de haute affinité » » propose que la molécule de CMH elle-même constitue le ligand du TCR. La forte fréquence de lymphocytes mobilisés serait liée à une avidité augmentée, toutes les molécules du CMH étant activatrices à la surface d’une même CPA. A l’autre extrême se situerait le modèle du « complexe multiple binaire » qui attribue ce fort pourcentage à l’existence d’un grand nombre de complexes immunogènes à la surface des CPA allogéniques, une grande majorité des peptides présentés par les molécules du CMH étant d’origine allogénique. 54 5. Les voies de reconnaissance du greffon par les cellules immunitaires de l’hôte. a. La voie directe La voie directe d’allo-reconnaissance fait intervenir les cellules présentatrices de l’antigène du donneur apportées avec la greffe, dont les complexes CMH/peptides sont directement reconnus par les TCR des cellules T de l’hôte. In vitro, la force de cette réponse allogénique a été donnée par des études de réactions lymphocytaires mixtes (MLR). La culture de CPA allogéniques irradiées avec des cellules T de l’hôte conduit à une activation et une prolifération massive des cellules spécifiques du donneur (qui représentent 1 à 7% des précurseurs) 224 . In vivo, plusieurs stratégies de déplétion des CPA de la greffe (culture in vitro de l’organe ou utilisation d’un hôte intermédiaire) ont montré une augmentation de la survie de la greffe 225 , 226 . Enfin la greffe d’un donneur histocompatible avec le receveur permet d’augmenter la survie de la greffe aussi bien dans les modèles expérimentaux qu’en clinique humaine. La force d’activation observée dans les MLR a conduit à corréler la voie de reconnaissance directe avec le rejet aigu d’allogreffes. Cependant la preuve formelle de l’existence et de l’importance de cette voie d’activation dans le contexte des allogreffes a été apportée par l’équipe de Ronald Gill 227 . Des hôtes SCID ou Rag1-/- déficients pour les molécules du CMH-II ont été reconstitués avec des CD4 syngéniques avant de recevoir une greffe de cœur. Les auteurs ont observé un rejet aigu des greffes de cœur par les CD4 de l’hôte. Dans ce modèle, seules les CPA apportées par la greffe de cœur ont la possibilité d’activer les CD4 et ce par la voie directe d’alloreconnaissance. L’expérience inverse utilisant des greffes de cœur déficientes pour le CMH a montré une absence de rejet des greffes même dans un hôte exprimant des molécules de CMH-II. L’existence de l’allo-reconnaissance directe et son importance dans le rejet de greffe remettent en question le dogme de la restriction du TCR au CMH du soi. Des études structurales ont cependant montré l’existence d’une cross-réactivité des TCR spécifiques pour le CMH du soi envers un CMH allogénique 228. De plus, un TCR peut réagir de façon croisée avec plusieurs haplotypes de CMH indiquant une co-évolution entre le TCR et le CMH 229 . Cette notion est supportée par le fait qu’une forte proportion des cellules activées par la voie directe a un phénotype mémoire suggérant une activation de ces cellules par des antigènes étrangers présentés dans le contexte du CMH du soi 230. 55 Dans un modèle de greffes de peau allogéniques, l’analyse par ELISPOT de la fréquence des spécificités des TCR des animaux greffés a montré que plus de 90% des T étaient spécifiques de la voie directe d’alloreconnaissance mais également que 10% étaient spécifiques pour la voie indirecte 231. Deux hypothèses visent à expliquer le mécanisme d’alloreconnaissance directe (Figure 9). L’une propose que le TCR reconnaisse le CMH lui-même, indépendamment du peptide allogénique qui y est fixé, c’est le « déterminant de haute densité ». La seconde hypothèse, celle du « complexe binaire multiple » avance que le TCR est spécifique pour un complexe CMH-peptide particulier ressemblant de façon très proche aux complexes du soi. Dans la réalité ces deux modèles sont probablement les deux extrêmes d’un gradient dans lequel le CMH et le peptide participent à des degrés différents à l’interaction entre le TCR et son ligand. Obst a en effet démontré que le peptide a d’autant plus d’importance que les molécules du CMH du donneur et du receveur sont proches. À l’inverse, plus les molécules du CMH sont structurellement éloignées, plus l’interaction entre le TCR et son ligand est préférentielle pour le CMH 232. Le lien entre voie directe d’alloreconnaissance et rejet aigu est renforcé par l’observation d’une diminution au cours du temps de la fréquence de cellules T spécifiques du donneur (Figure 10). Ceci s’explique probablement par la mortalité progressive des CPA du donneur n’apportant plus les ligands nécessaires à l’activation des CD4+ 233. b. La voie indirecte La voie d’allo-reconnaissance indirecte fait intervenir l’apprêtement et la présentation, par les CPA de l’hôte, de peptides allogéniques capturés dans la greffe et présentés aux lymphocytes T de l’hôte dans le contexte classique du CMH-II du soi (Figure 10). L’existence de cette voie a été proposée pour la première fois après les expériences de greffe de rein via un hôte intermédiaire éliminant les CPA du greffon 226. Dans ce modèle, les alloantigènes sont principalement apprêtés et présentés par les CPA du receveur conduisant à un rejet tardif de l’organe. Cependant la preuve formelle de l’existence de la voie d’alloreconnaissance indirecte et son importance dans le rejet de greffe n’a été apportée qu’en 1993 par les travaux 56 de Auchincloss et al. 234. Les auteurs ont réalisé des greffes de peau de souris déficientes pour Extrait de Lechler et al, Front. immunol., 2012 Figure 10 : Les voies d’alloreconnaissance Les LT de l’hôte peuvent reconnaître les complexes peptides-CMH allogéniques présentés à la surface des CPA du donneur : voie directe ; mais aussi les peptides allogéniques présentés dans le contexte du CMH de l’hôte : voie indirecte. Les CPA de l’hôte peuvent aussi capturer des complexes peptides- CMH allogéniques intacts stimulant les LT de l’hôte par la voie semi-directe. Les trois voies d’alloreconnaissance ont des intensités et des durées d’action différentes après la transplantation. APC : Antigen presenting cell ; HLA : Human leukocytes antigens ; post-Tx : posttransplantation periode ; rel intensity : relative intensity. 57 les molécules de CMH-II à des souris dépourvues de lymphocytes T CD8. Dans ce modèle, l’absence de T CD8 de l’hôte et de molécules de CMH-II du greffon exclut toute possibilité d’activation par la voie d’alloreconnaissance directe. Ainsi les lymphocytes T CD4 ne peuvent être stimulés que par reconnaissance de peptides issus de molécules de CMH-I du donneur apprêtés et présentés de façon indirecte dans le contexte des molécules de CMH-II de l’hôte. Les auteurs ont observé un retard voire une inhibition complète du rejet des allogreffes de peau indiquant qu’un rejet de peau peut être initié par la voie d’allo-reconnaissance indirecte indépendamment d’une activation du système immunitaire par la voie directe. Si l’importance de cette voie est faible lors du rejet aigu, il semble qu’elle soit la voie prédominante lors du rejet chronique. En effet, la voie directe diminue avec la disparition des CPA du donneur alors que la voie indirecte se maintient élevée chez des patients présentant un rejet cardiaque chronique comparés à des patients acceptant l’organe greffé (Baker, 2001 #96) c. La voie semi-directe L’activation des lymphocytes T CD8 requiert en grande partie l’aide de lymphocytes T CD4 activés au contact de la même CPA. Néanmoins, des études de Lee et al. 235 ont montré que des CD4 spécifiques pour la voie indirecte ont la capacité d’amplifier la réponse des CD8 spécifiques pour la voie directe d’alloreconnaissance. Afin d’expliquer ce phénomène, l’équipe de Lechler a démontré que les cellules dendritiques sont capables de capturer, à la surface de l’endothelium de la greffe ou à partir d’autres cellules dendritiques, des molécules de CMH-I et -II 236 . Cette capture conserve l’intégrité des complexes CMH/Peptides du donneur permettant l’activation des CD4 et CD8 spécifiques du donneur. Ainsi une cellule dendritique de l’hôte à la possibilité d’une part de capturer et présenter des peptides allogéniques activant les CD4 par la voie indirecte, et d’autre part d’acquérir des molécules de CMH-I intactes activant les CD8 par la voie directe. Cette voie d’activation faisant le lien entre voie directe et indirecte fut appelée voie semidirecte (Figure 10). 58 Une activation du système immunitaire par la voie semi-directe pourrait expliquer l’expérience de Mandelbrot et al. 237. Les auteurs ont montré un rejet rapide de greffe de cœur CD80/86-/- par un hôte CMH-II-/-. Ces résultats peuvent s’expliquer d’une part par une costimulation en trans aussi efficace qu’une stimulation en cis. Cependant il est décrit qu’une stimulation en trans n’est que peu efficace pour l’activation des lymphocytes 238. Ainsi il est plus fortement probable que ce rejet rapide soit dû à une activation directe de T de l’hôte au contact de molécules du CMH du donneur exprimées de façon intacte à la surface des CPA de l’hôte. 6. Les rejets de greffes Il existe trois types de rejets caractérisés selon leur cinétique d’apparition ainsi que d’après les signes cliniques qui leur sont associés. a. Le rejet hyper aigu. Le rejet aigu est le plus fulgurant puisqu’il apparaît dans les heures qui suivent la réalisation de la greffe. Ce rejet est dû à la présence d’anticorps préformés contre des molécules antigéniques présentes à la surface des cellules endothéliales, et des molécules du système de groupes sanguin ABO 239. La présence de ces anticorps induit l’activation de la cascade du complément conduisant à la nécrose des cellules du tissu greffé aboutissant à la perte rapide et irréversible de la greffe 240. Ce rejet n’est quasi plus observé de nos jours. En effet, les progrès de la médecine et le typage systématique des groupes sanguins et des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité ont permis d’augmenter les compatibilités entre hôte et receveur . b. Le rejet aigu Le rejet aigu prend place dans les semaines voire les premiers mois qui suivent la greffe. D’un point de vue mécanistique, des corrélations avec les réactions de MLR décrites précédemment suggèrent que le rejet aigu serait lié à la voie d’alloreconnaissance directe. In vivo il a été montré qu’une déplétion des CPA du donneur par culture in vitro ou par 59 utilisation d’un hôte intermédiaire augmente le taux de survie de la greffe 225. Mais la preuve du lien entre rejet aigu et voie d’activation directe a été faite en 2000 par Pietra 227. Des souris SCID ou Rag-/- ont été injectées avec des CD4 syngéniques puis ont reçu une greffe de cœur CMH-/- ou CMH WT. Les auteurs ont observé le rejet des greffons CMH WT alors que les greffons CMH-/- étaient protégés que le receveur soit CMH-/- ou sauvage. Ces études montrent que dans les premières semaines suivant la greffe les CPA allogéniques apportées avec le greffon migrent dans les organes lymphoïdes drainant la greffe où elles sont reconnues de façon directe par les CD4 de l’hôte conduisant à un rejet rapide de la greffe. Lombardi et al. ont montré que les CD4 alors recrutés sont en grande majorité des CD4 mémoires, activés une première fois au contact d’antigènes environnementaux présentés par les molécules de CMH du soi 230. Des études ont montré une disparition progressive des cellules spécifiques de la voie directe sûrement liée à la mortalité des CPA du donneur 233. Une infiltration rapide et massive de cellules NK et NKT a également été observée dans des allogreffes de cœur et de rein bien avant l’arrivée de cellules T 241 , 242 , 243 . Les cellules NK produisent de l’IFN-% qui induit une augmentation de l’expression des molécules de CMH-I et II à la surface des cellules endothéliales de la greffe augmentant leur sensibilité à la lyse par les cellules T 244 . De plus, les cellules NK semblent favoriser l’expansion et les fonctions des cellules T alloréactives 245. Enfin une étude de Coudert et al. a montré que les cellules NK peuvent moduler la réponse CD4. L’alloréactivité des cellules NK induite par la reconnaissance du CMH-I exprimé à la surface des CPA du donneur tend à favoriser la production de cytokines de type Th1. À l’inverse, le blocage des NK dans ces mêmes conditions semble restaurer une production de cytokines de type Th2 246. La réaction d’hypersensibilité retardée (Delayed-type hypersensibility ou DTH) a été associée aux épisodes de rejet aigu dans des modèles d’allogreffes de peau ou de cœur chez le rongeur 247 , 248 , 249 . Elle est généralement caractérisée par un œdème consécutif à l’augmentation de la perméabilité vasculaire ainsi qu’à l’infiltration massive du tissu par des cellules T, des macrophages et des neutrophiles 250 . Elle est due au recrutement de lymphocytes Th1 et de CTL au sein du greffon qui, après activation, sécrètent des cytokines telles que l’IFN-%, et le TNF-# qui vont participer à l’activation des macrophages. Ceux-ci vont alors libérer des molécules toxiques telles que le TNF-#, des radicaux libres et du monoxyde d’azote. Le monoxyde d’azote est toxique à haute concentration, il est aussi 60 responsable de la vasodilatation et des oedèmes caractéristiques de la DTH. Le TNF-#, en s’associant à son récepteur, induit l’apoptose de la cellule cible par l’activation de la voie des caspases. c. Le rejet chronique Le rejet chronique apparaît beaucoup plus tardivement que le rejet aigu. Sa mise en place est discrète et caractérisée par une perte très progressive des fonctions du greffon par remodelage de l’endothélium vasculaire conduisant à l’obstruction des vaisseaux ou à la génération de néo-vaisseaux non-matures. L’ensemble de ces modifications favorise l’hypoxie de l’organe et à terme sa perte. Les cellules endothéliales vasculaires jouent un rôle central dans les différentes étapes de développement d’un rejet chronique. Les lésions produites par l’ischémie-reperfusion, les attaques par les cellules CD4 allospécifiques ou les alloanticorps provoquent une inflammation caractérisée par une disparition de cellules endothéliales mais surtout par l’activation et la prolifération des cellules saines. Les cellules endothéliales sécrètent alors des facteurs de remodelage tissulaire (métalloprotéinases), des facteurs pro-inflammatoires (TNF-#) ou encore des facteurs pro-angiogéniques tels que le PDGF (platlet growth factor) ou le VEGF (Vascular endothelial growth factor) 251 . Sous l’effet du PDGF, les cellules musculaires lisses perdent leurs fonctions contractiles, prolifèrent et migrent vers des cellules endothéliales activées afin d’y sécréter des protéines de la matrice extra-cellulaire. L’ensemble de ces processus conduit à l’apparition d’une fibrose de l’organe greffé. En parallèle, la sécrétion de VEGF, essentiellement par les LT activés 252, induit une néovascularisation anarchique. Cette néo-angiogenèse est un indicateur de mauvais pronostic dans les greffes de rein et de poumon 253 , 254. La sécrétion de VEGF peut être induite par des cytokines (IL-1, TNF, IL-6) mais aussi par la ligation de CD40, exprimé à la surface des cellules endothéliales et de monocytes, avec son ligand CD154 exprimé par les LT et les plaquettes 253. Le VEGF sécrété agit comme un facteur pro-angiogénique mais également proinflammatoire : il a une action chemoattractante pour les cellules immunitaires en augmentant l’expression des molécules d’adhésion à la surface des cellules endothéliales 255. En résumé, l’ischemie-reperfusion conduit à l’activation des cellules endothéliales qui produisent des facteurs pro-angiogéniques et inflammatoires attirant les cellules immunitaires 61 qui à leur tour amplifient la boucle inflammatoire aboutissant inexorablement à une destruction de l’organe. 62 Cha pi tre IV - L A TO LERANCE DE L A TRANSPLAN TATION La greffe de tissu ou la transplantation d’organe sont des actes médicaux majeurs dont la réussite est l’un des grands défis de la médecine poursuivis depuis plusieurs siècles. Les avancées dans le développement de techniques chirurgicales et de prise en charge des greffes ont permis d’augmenter le taux de réussite de cette intervention. Cependant ce n’est qu’avec la découverte du rôle central du système immunitaire et des mécanismes de rejet que les plus grandes avancées ont été possibles. En effet, l’identification des voies d’alloreconnaissance et des mécanismes de rejet a permis d’envisager la notion d’induction de tolérance de transplantation. Depuis, de nombreuses techniques anti-rejet ont été développées avec plus ou moins de succès. Initialement tournés vers un blocage quasi total du système immunitaire, les progrès de la recherche s’intéressent aujourd’hui d’avantage à une modulation des interactions entre l’hôte et le receveur afin de diminuer les effets secondaires et d’augmenter toujours plus la survie des greffons et le bien-être des patients. 1. Les drogues immunosuppressives Les traitements anti-rejet utilisés couramment en clinique humaine ont pour objectif d’inhiber de façon plus ou moins directe l’activation et la migration des LT, acteurs principaux du rejet. Ainsi plusieurs sortes de drogues et traitements immunosuppresseurs ont été développés. Ils diffèrent par leurs cibles et leurs modes d’action 256 a. Inhibition de la prolifération Les stratégies anti-prolifératives ont d’abord été basées sur l’irradiation qui détruit rapidement et sans distinction toutes les cellules en prolifération. En 1915, Murphy et Morton ont montré que l’irradiation d’animaux conduit à l’élimination du compartiment lymphoïde ainsi qu’à la prise durable d’une tumeur allogénique 257. Cette destruction non sélective des 63 Extrait de Kahan et al., Nat. Rev. Immunol., 2003 Figure 11 : Cibles moléculaires des drogues immunosuppressives. L’anticorps OKT3, la cyclosporine et/ou le tacrolimus agissent sur la progression de phase G0-G1 requise pour le signal 1 ; Le sirolimus (rapamycine) et les stéroïdes agissent sur la costimulation ou signal 2 alors que les anticorps anti-CD25 perturbent la liaison de l’IL-2 à son récepteur. Le sirolimus agit aussi sur la transduction du signal déclenché par les cytokines (signal 3). Le mycophenolate mophetil (MMF) agit sur la synthèse des bases guanosiques (phase S). APC : Antigen présenting cell ; CTLA-4 : Cytotoxic T lymphocyte antigen 4 ; GMP : guanosine monophosphate ; I&B : inhibitory &B ; IMP : Inosine monophosphate ; JAK3 : Janus Kinase 3 ; mTOR : mammalian target of rapamycine ; NFAT : Nuclear factor of activated T cell ; NF-&B : Nuclear factor -&B ; PKB : Protein kinase B ; STAT5 : signal transducer and activator of transcription 5 ; TCR : T-cell receptor ; TLR-4 :Toll-like receptor 4 ; ZAP-70 : '-chain-associated protein-70. 64 cellules en cycle sera alors utilisée en clinique humaine par Jean Hamburger. En 1959, il décrit que le conditionnement de patients par irradiation totale du corps permet la survie à 2 ans d’une allogreffe de rein dans 9 cas sur 25 258. Malgré les bons résultats et les adaptations successives afin de limiter les doses et l’étendue des zones irradiées, cette méthode ne s’est pas révélée cliniquement acceptable. Ainsi ont été développées les premières drogues immunosuppressives. Après différents travaux reposant sur l’utilisation du benzène, les traitements à l’azathioprine, toujours utilisée de nos jours, furent les premiers à donner des résultats probants en prolongeant chez l’homme la survie d’allogreffes de rein 259 . Une fois administrée cette molécule est rapidement hydrolysée en 6-mercaptopurine, inhibiteur compétitif des bases puriques (Guanine et Adénine). Cependant, 80% des patients traités présentaient un rejet aigu. Cette limite majeure a permis le développement des produits analogues mais plus efficaces tel que le mycophenolate mofetil (MMF). Le MMF inhibe, de manière non compétitive et réversible, la deshydrogénase inosine monophosphate, une enzyme indispensable à la synthèse de nucleosides guanosiques 260 (Figure 11). Néanmoins, ce composé a montré des capacités d’immunosuppression aléatoires dues aux fortes variabilités inter-individuelles d’absorption intestinale. Ce frein associé à la toxicité générale des traitements antiprolifératifs vis-à-vis des tissus à fort taux de renouvellement (tractus intestinal, tissu hématopoïétique…) a fortement restreint son utilisation actuelle. b. Les stéroïdes La seconde étape majeure dans le développement des drogues immunosuppressives a été la découverte des stéroïdes. Ceux-ci réduisent les effets inflammatoires dus à l’activation des cellules mononucléées 261 . Entre 1964 et 1978, l’utilisation combinée de la prednisone avec l’azathioprine a permis d’augmenter à un an la survie de 50% des patients ayant reçu une greffe de rein 262 . Malgré cela, l’utilisation des stéroïdes a des effets secondaires majeurs traduits par une altération du compartiment hématopoïétique, des désordres intestinaux, ou une sensibilité accrue aux infections fongiques. Ainsi il est recommandé d’interrompre le traitement dans les premiers mois suivant la greffe. Cependant, l’arrêt des stéroïdes trois mois après la greffe a montré une augmentation du risque de rejet. 65 c. Déplétion/ modulation des lymphocytes Vu le rôle central des lymphocytes dans le rejet d’allogreffes, des stratégies de déplétion des lymphocytes ont été développées. Dans un premier temps, ces stratégies utilisaient des sera polyclonaux spécifiques des lymphocytes. L’un des plus anciens anticorps développé et toujours utilisé est l’anticorps OKT3 dont les premiers essais cliniques datent du début des années 1980 263 . Cette immunoglobuline de souris reconnaît CD3(, une molécule clé du complexe TCR qui joue un rôle primordial dans les premières étapes de la transduction du signal. Ainsi, OKT3 inhibe l’activation des cellules T naïves (Figure 11). Plus tard, Calne a développé l’alemtuzumab, un anticorps monoclonal humanisé spécifique de la molécule CD52 (CAMPATH-1H) exprimé par la majorité des cellules immunitaires mais également par la peau 264 . L’administration de cet anticorps a permis de réduire les doses de drogues immunosuppressives tout en préservant la tolérance à des allogreffes de rein. L’alemtuzumab est à ce jour couramment utilisé, associé à d’autres drogues immunosuppressives, dans la prévention des rejets de greffes d’organes. De la même manière, une exposition à l’anti-thymocytes globuline (ATG) permet de limiter l’exposition aux drogues immunosuppressives 265. L’un des effets indésirables majeurs imputable à ces anticorps est l’importante immunosuppression qu’ils engendrent du fait de leur non spécificité vis-à-vis des cellules T naïves ou activées. Leur utilisation est donc restreinte à de faibles doses administrées sur de courtes périodes afin de réduire au maximum les risques d’infections opportunistes ou le développement de novo de tumeurs malignes. Afin de remédier à cela, deux autres anticorps monoclonaux, le Daclizumab Basiliximab 267 266 et le , visant spécifiquement les lymphocytes T ont été développés. Ces anticorps sont dirigés contre la chaîne # du récepteur à l’IL-2 (CD25) exprimée à la surface des cellules T et NK activées. Cependant même s’ils permettent de réduire la fréquence des épisodes de rejet aigu lors de transplantations rénales, ces anticorps ont une efficacité limitée du fait de leur faible compétition avec l’IL-2 endogène, et de leur action inhibitrice de l’AICD induite par cette cytokine. De nouveaux anticorps monoclonaux plus spécifiques sont en cours de développement chez le rongeur et le primate non humain (PNH). 66 d. Inhibition de la synthèse des cytokines Pour parachever leur activation et leur différenciation, les lymphocytes T requièrent un signal dépendant des cytokines. En court-circuitant ce signal, les médecins pensaient ainsi pouvoir réduire la réponse allogénique. i. Inhibiteurs de la calcineurine La découverte de la cyclosporine en 1970 a ouvert la voie à l’immunosuppression chimique. Ce polypeptide, isolé à partir d’un champignon, testé dès 1978 a permis de significativement réduire les épisodes de rejet aigu 268. Depuis, le Tacrolimus (FK506), agent plus puissant, a été isolé à partir d’une bactérie. Ces deux molécules, en s’associant à la calcineurine, inhibent son activité, laquelle sert de relais entre le TCR et différents facteurs de transcription, tels que JNK, NFAT, ou NF&B. La transcription de certains gènes cibles comme l’IL-2 est alors fortement réduite (Figure 11). Récemment il a été montré que le tacrolimus, seul ou en association avec le MPA (mycophenolate acid) un analogue du MMF, diminue l’expression de gènes spécifiques des cellules Th17 en faveur des gènes spécifiques des Treg favorisant la survie des greffes 269, 270. Cependant, même si l’action de ces drogues est relativement restreinte aux cellules lymphoïdes, elles ne peuvent pas être administrées seules à des doses élevées pour inhiber le rejet d’allogreffe. En effet, la calcineurine étant largement distribuée, son inhibition va avoir de nombreux effets indésirables tels que des dommages neurologiques ou rénaux ainsi que l’apparition de diabète. ii. Inhibiteur de mTOR. La rapamycine (ou Sirolimus) a été isolée d’une bactérie, streptomyces hygroscopicus, au début des années 1970. Dans un premier temps considérée comme un métabolite antifongique, ses fonctions anti-prolifératives et immunosuppressives ont par la suite été mises en évidence faisant de la rapamycine une molécule de choix pour inhiber le rejet de greffe. La rapamycine agit en inhibant la fonction de la serine-thréonine protéine Kinase mTOR (Mammalian Target of Rapamycine) centrale dans les réponses immunitaires innées et 67 adaptatives (Figure 11). mTOR est un régulateur central de la croissance et de la prolifération cellulaire 271 . Lors de l’activation des cellules T, la stimulation des lymphocytes T par leur TCR combinée à la co-stimulation apportée par l’interaction de CD28 avec CD80/86 conduit à une activation de la voie PI3K-AKT assurant l’activation du complexe mTOR. ! Action sur les cellules dendritiques Le traitement de DC myéloïdes à la rapamycine inhibe leur maturation et leurs fonctions stimulatrices des cellules T. Ces cellules expriment alors à leur surface moins de molécules de co-stimulation bloquant leur capacité de production d’IL-12, de TNF-# 272 . De plus, la rapamycine bloque in vivo les capacités de capture antigénique des DC mais pas leur capacité de présentation antigénique 272. ! Action sur les cellules T conventionnelles La rapamycine bloque la transition des thymocytes du stade DN au stade DP. Ainsi un traitement prolongé à la rapamycine conduit à une forte réduction du nombre de LT 273. D’un autre côté, il semble que la rapamycine n’influence pas le développement thymique des Treg 274 . En périphérie, la rapamycine bloque d’une part la prolifération des cellules T lors de la transition G0 -G1. D’autre part, la rapamycine, via son action sur la PI3K et mTOR, régule négativement le facteur de transcription KLF2 (Krupper-Like factor 2) qui contrôle l’expression des molécules de homing SP1, CD62L et CCR7 lors de l’activation des LT 275. Ainsi en plus d’inhiber la prolifération des cellules T, l’inhibition de mTOR par la rapamycine conduit à la séquestration des cellules T activées dans les organes lymphoïdes bloquant leur accès aux tissus cibles. ! Action sur le compartiment régulateur T La rapamycine ne semble pas influencer la fonction et l’homéostasie des Treg. Contrairement aux LT conventionnels, les Treg humains exposés à la rapamycine ne perdent pas leur fonction immunosuppressive 276 . Or celle-ci est liée à une stimulation de leur TCR 68 combinée à la signalisation via l’IL-2. Cette originalité a été éclaircie par la mise en évidence d’une expression accrue du régulateur négatif de la PI3K, PTEN dont l’expression est maintenue élevée après la stimulation des Treg par leur TCR 277 278. De ce fait, il est observé que les patients ayant reçu une greffe de rein sous traitement à la rapamycine présentent un nombre absolu plus élevé de Treg CD4+Foxp3+ dans les organes lymphoïdes secondaires que les patients traités aux inhibiteurs de la calcineurine 279 , 280 . L’expression de Foxp3 est dépendante du facteur de transcription SMAD3 (Tone Y, Nat Imm, 2008), or de façon intéressante, la signalisation par la voie AKT-mTOR peut inhiber l’activation de SMAD3 permettant d’expliquer pourquoi l’inhibition de mTOR par la rapamycine favorise l’expression de FOXP3 281. ! Utilisation thérapeutique Les effets inhibiteurs de la rapamycine sur les DC et les LT conventionnels mais pas sur les Treg permet d’envisager son utilisation dans des stratégies thérapeutiques prometteuses en transplantation. En effet, la rapamycine est à ce jour couramment utilisée pour la prévention du rejet des allogreffes de rein 282. Récemment l’utilisation d’un modèle de souris rapporteur de l’expression de Foxp3 a montré que la rapamycine permet l’induction de novo de Treg dans des conditions tolérisantes. Les Treg ainsi générés sont résistants à la mort cellulaire induite par l’AICD et leur transfert induit la protection d’une deuxième greffe de même donneur mais pas celle issue d’un tierce donneur 214 . Il est décrit qu’une association de la rapamycine avec l’IL-10 permet de générer des cellules régulatrices Tr1 induisant la tolérance stable à des allogreffes d’îlots pancréatiques 283 . De façon similaire, l’utilisation combinée de la rapamycine avec le TGF-ß assure l’inhibition de la prolifération des LT effecteurs mais aussi un déséquilibre de la balance Treg/Th17 en faveur des Treg diminuant les effets négatifs des Th17 sur la survie d’une allogreffe d’îlots pancréatiques 284 . Enfin de plus en plus d’études se tournent vers l’utilisation combinée de la rapamycine en traitement court avec une injection de Treg générés ou expandus ex vivo. Il est décrit qu’une telle association prolonge la survie d’une allogreffe de cœur 285. La voie Akt/mTOR est également impliquée dans l’activation des cellules endothéliales vasculaires qui ont un rôle central dans l’établissement du rejet chronique. L’inhibition de cette voie par la rapamycine permet de limiter l’activation des cellules 69 endothéliales et ainsi de diminuer la néo-vascularisation anarchique de l’organe et le développement d’une fibrose ischémique 286. De ce fait, l’utilisation de la rapamycine assure une inhibition du rejet aigu mais également du rejet chronique. e. Les anticorps monoclonaux Découvert dans les années 1980, les anticorps monoclonaux ont pour but d’inhiber la réponse immunitaire permettant l’induction d’une tolérance. D’abord déplétants et induisant une tolérance envers des antigènes mineurs, leur utilisation a été perfectionnée. Aujourd’hui les anticorps utilisés sont bloquants et ont la capacité d’induire une tolérance envers différents tissus vascularisés ou variants au niveau des antigènes mineurs et majeurs. i. Anticorps bloquant les co-récepteurs Dès 1986, Waldmann et al. ont observé qu’un traitement d’une souris hôte par des anticorps déplétants anti-CD4 permettait d’induire une tolérance envers la protéine étrangère HGG (Heat aggregate Human %-globulin) 287 . Cependant quelques années plus tard la même équipe a observé que les animaux tolérisés présentaient une réactivité normale des LT lors d’une nouvelle exposition à l’antigène si celle-ci a lieu après qu’il y ait eu élimination naturelle de l’antigène tolérisant 288 . Il apparaît ainsi que la persistance de l’antigène de tolérisation est nécessaire à la conservation de la tolérance. Cette découverte a donné tout l’intérêt de l’utilisation des anticorps déplétants en transplantation puisque l’organe greffé et toléré devient source permanente d’alloantigènes. De plus, les anticorps bloquants ne permettent l’induction de tolérance que pour quelques alloantigènes spécifiques et non pas par exemple pour l’ovalbumine ou la %-globuline de poulet 287. Ainsi, des anticorps anti-CD4 nondéplétants ont été développés 289 capables d’induire une tolérance . Ces anticorps utilisés en court traitement sont également 288 . Cette tolérance est renforcée lorsque la déplétion ou le blocage des CD4 est combiné avec celle des CD8 288, 290 . D’un point de vue mécanistique, il a été démontré que les anticorps monoclonaux induisent une tolérance dominante 291. Dans ce modèle, des souris CBA athymiques acceptent une greffe de peau B10Br (Antigènes mineurs différents) sous couvert d’anticorps anti-CD4 et anti–CD8. Le transfert de splénocytes de souris tolérantes permet d’induire une tolérance 70 envers une peau B10Br chez un second receveur. Cette induction de tolérance n’est pas observée si les cellules CD4 sont déplétées avant transfert des splénocytes. De plus, la tolérance induite n’est pas rompue pas l’injection de cellules CD4 naïves. Au contraire cellesci deviennent tolérantes à leur tour. Cette expérience a posé les bases de l’étude du mécanisme de tolérance infectieuse en transplantation qui sera décrite ultérieurement dans ce manuscrit. ii. Anticorps bloquant la co-stimulation L’activation des cellules T alloréactives implique un premier signal de stimulation via le TCR, suivi d’un deuxième signal via l’interaction entre les molécules de co-stimulations CD28, exprimée à la surface des LT, et CD80/86 à la surface des CPA. Ainsi le blocage de ces molécules de co-stimulation est devenu une cible de choix dans le développement de nouveaux protocoles d’induction de tolérance aux allogreffes. ! CD40-CD40L (CD154) Le blocage de la voie CD40-CD40L a longtemps été considéré comme la voie majeure permettant d’induire une tolérance durable aux allogreffes 292 . La molécule CD40 est exprimée à la surface des DC suite à leur activation et interagit avec la molécule CD40L (CD154) présente à la surface des cellules T. Cette interaction est indispensable à l’activation et la maturation des DC assurant leur production de cytokines pro-inflammatoires. CD40L est également exprimée à la surface des LB. Dans ce cas, l’interaction avec CD40 assure la maturation d’affinité et la commutation de classe des immunoglobulines. Cependant malgré les excellents résultats obtenus chez la souris et les Primates Non Humain (PNH) les essais cliniques en transplantation chez l’homme ont dû être interrompus à cause de complications thrombocytopéniques dues à l’expression de CD154 sur les plaquettes 293 294 . Les études se sont alors tournées vers le ciblage de la molécule CD40. Les anticorps monoclonaux antiCD40 semblent montrer une efficacité comparable aux anti-CD154 chez la souris et le PNH 295 . Ainsi le blocage de la voie CD40-CD154 combiné avec une transfusion de cellules du donneur permet d’induire une tolérance durable envers des allogreffes de cœur 296 de peau 297 71 et de rein 298. De plus, l’induction de tolérance aux allogreffes par blocage de cette voie de costimulation implique la génération de novo de Treg Foxp3+ spécifiques de l’antigène 299. Chez la souris, le traitement avec cet anticorps peut aussi être couplé à des anticorps bloquant les co-récepteurs CD4 et CD8 favorisant la tolérance aux allogreffes de peau par des mécanismes d’induction de Treg et de tolérance infectieuse 300. ! Immunoglobuline (Ig) de fusion CTLA-4-Ig CTLA-4 est exprimé à la surface des LT suite à leur activation afin de limiter une amplification excessive de la réponse immunitaire. CTLA-4 se lie avec une affinité 10 à 20 fois supérieure que CD28 aux molécules de co-stimulation CD80/86. L’engagement de CTLA-4 conduit à une activation de l’AICD chez les LT conventionnels et favorise les fonctions régulatrices des Treg. L’Ig de fusion CTLA-4-Ig combine le domaine de liaison extra-cellulaire de CTLA-4 avec la portion Fc de l’IgG1 humaine. Cette Ig entre en compétition avec CD28 pour la fixation à CD80/86 301. Ainsi, l’engagement de l’Ig conduit à une activation abortive des LT, diminue la production d’IL-2, diminue la production d’Ig anti-donneur et induit une protection d’allogreffes de cœurs, de reins et d’îlots pancréatiques chez la souris 302 , 303 . Cependant les effets sont apparus plus modérés chez le PNH 304 , 305. ! Anti-CD28, anti-CD80/86 La voie de co-stimulation CD28-CD80/86 est sûrement la plus importante pour l’activation des cellules T et de ce fait, est l’une des plus étudiées. L’expression de CD28 à la surface des LT et celle de CD80/86 à la surface des DC est augmentée suite au premier signal de stimulation donné par l’interaction du TCR avec le CMH présentant le peptide pour lequel il est spécifique. L’engagement de CD28 avec CD80/86 permet la production d’IL-2 finalisant l’activation des LT et donnant le dernier signal pour leur prolifération. Les premières études visant à bloquer cette voie de signalisation se sont intéressées au blocage des molécules CD80/86. Ainsi, les anticorps monoclonaux anti-CD80/86 induisent un délai significatif du rejet d’allogreffe de rein chez le PNH sans autre thérapie associée 306 . Cependant le blocage direct de CD80/86 bloque également l’interaction de ces molécules 72 avec CTLA-4 qui est nécessaire au contrôle négatif de l’activation des LT et à la fonction suppressive des Treg. Les études se sont alors tournées vers le blocage de la molécule CD28. En effet, il a été montré qu’un traitement bref avec un anticorps monoclonal anti-CD28 inhibe le rejet d’allogreffe de rein chez le rongeur 307 308. De façon surprenante, des études ont montré qu’un anticorps agoniste de CD28, qui accentue l’AICD, atténue la réponse allogénique à une allogreffe et inhibe la GvHD. De plus ces anticorps peuvent agir en synergie avec la 309 rapamycine . Cependant, le premier essai clinique de phase I a montré des résultats dramatiques par le fait que, chez l’homme, cet anticorps provoque une délétère, massive et rapide sécrétion de cytokine 310. À l’inverse, le développement d’un anticorps antagoniste de CD28 a montré une inhibition des rejets aigu et chronique d’allogreffes chez le rongeur en synergie avec une inhibition de la calcineurine. Cette combinaison assure, chez le PNH, l’inhibition de la réponse allogénique mais aussi l’augmentation des cellules T régulatrices dans le sang et dans la greffe 216 . Afin d’affiner la pharmacocinétique de cet anticorps, il a été développé un fragment Fab’ anti-CD28 monovalent humanisé (FR104) qui in vitro inhibe la prolifération de LT humain et leur production de cytokine. De plus, cet anticorps inhibe le développement d’une GvHD chez la souris NOD/SCID humanisée transférée avec des PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) humaines 311. f. Blocage de la migration des cellules effectrices En 1992, une nouvelle classe de drogues anti-rejet est découverte, suite à la modification chimique d’une molécule immunosuppressive naturelle retrouvée chez le champignon, la myriocine. Nommée FTY720, cette nouvelle drogue est un agoniste de haute affinité du récepteur 1 à la sphingosine-1 phosphate (S1P1) 312 . Il agit en induisant l’internalisation de S1P1, empêchant l’émigration des cellules T des organes lymphoïdes vers la périphérie 45 , 313. Ainsi, il a été montré chez le rat, que son administration est associée à une importante diminution de l’infiltration des cellules T CD3+ dans les greffes de peau allogéniques. Si son administration seule n’a que peu d’effets sur la survie du greffon, en combinaison avec la cyclosporine, elle en permet une augmentation très significative 314. Cette molécule est testée en essai clinique de phase III chez des patients ayant bénéficiés de greffe de rein. Les effets du FTY720 ont été comparés à ceux du mycophenolate mofetil tous 73 deux associés au tacrolimus montrant que le FTY720 est autant, voire moins, efficace que le MMF dans la prévention du rejet aigu de greffe 315. Ainsi, le développement des drogues immunosuppressives et des anticorps bloquants a permis d’augmenter la survie des greffons sans pour autant permettre la mise en place d’une tolérance efficace. D’autres mécanismes d’induction de tolérance ont été proposés tels que l’utilisation d’une greffe hématopoïétique préalable à la greffe d’organe. 2. Le chimérisme hématopoïétique Owen en 1945 a été le premier à observer que des veaux dizygotes qui développent des anastomoses placentaires présentaient des similitudes sanguines 316 . Il en tira la conclusion d’un « échange critique des cellules embryonnaires ancestrales aux érythrocytes ». Plus tard, Billingham et Medawar ont montré que ces jumeaux chimériques acceptaient une greffe de peau réalisée plus tardivement à l’âge adulte 317 . Ce même groupe a également montré que la survie d’une allogreffe de peau peut être prolongée par injection in utero ou dans les nouveaux nés d’une suspension cellulaire du donneur 318. Un tel traitement conduit à des taux variables de chimérisme hématopoïétique qui ont par la suite été décrits comme cruciaux pour la survie d’allogreffe 319 , 320 . En 1984, Ildstad et Sachs ont définitivement montré qu’une irradiation létale du receveur reconstitué avec de la moelle osseuse du donneur conduisait à une tolérance à long terme envers une allogreffe et une xénogreffe de peau 321. a. Les cellules d’origine hématopoïétique induisent une tolérance des cellules T par induction d’apoptose et d’anergie. Dès 1987 est décrit l’existence d’un mécanisme de délétion thymique de certaines cellules possédant des chaînes Vß particulières. Des LT exprimant la chaîne Vß17a du TCR qui interagit fortement avec des super-antigènes endogènes (associés à la molécules IE du CMH de classe II) sont absents de la périphérie de souris H2K. Par contre, des cellules Vß17a+ immatures sont présentes dans le thymus, démontrant ainsi que la délétion a lieu tardivement dans le développement 37 . De plus, les auteurs ont montré que la délétion clonale requiert l’expression, par les cellules thymiques d’origine hématopoïétique, du ligand permettant la sélection négative 322. Une telle élimination des cellules alloréactives peut-elle être à l’origine 74 de la tolérance induite chez les nouveaux nés ? Macdonald et al. ont montré que le transfert de splénocytes exprimant des super-antigènes 323 thymique des cellules T réactives aux sAg chez des nouveaux-nés conduit à une délétion 324 . Cette délétion thymique a plus tard été observée dans des chimères hématopoïétiques adultes en utilisant des cellules TCR transgéniques comme traceur 325. Par l’utilisation de FTOC (Fœtal thymic organ culture), il a été montré un rôle crucial des DC dans ce processus 326 , 327 . Parmi les sous-types de DC thymiques, les DC conventionnelles Sirp#+ ainsi que les cellules Sirp#- sont impliquées dans les mécanismes de délétion thymique 328 , 329. Cependant toutes les cellules alloréactives ne sont pas éliminées dans le thymus et il est décrit des mécanismes périphériques de délétion. En effet, dans un modèle d’induction de tolérance à une allogreffe de moelle osseuse par blocage de la co-stimulation (CTLA4-Ig + anti-CD154) dans un hôte thymectomisé, Wekerle et al. ont observé une rapide délétion des cellules CD4 spécifiques du donneur 330. Plus tard, il sera montré que cette délétion implique deux mécanismes : l’AICD 331 , 332 et la mort par négligence (Fas-independante) 333 , 334. Ainsi les cellules d’origine hématopoïétique peuvent induire une tolérance « passive ». b. Le chimérisme hématopoïétique peut-il induire une réelle tolérance aux allogreffes ? Nous avons montré que le chimérisme hématopoïétique peut induire une tolérance aux allogreffes par des mécanismes de délétion clonale centrale et périphérique et par induction d’anergie. Cependant, dans les premières études sur la tolérance aux allogreffes chez les veaux dizygotiques il est apparu que nombres de transplants de peau étaient rejetés sur le long terme 335 , 336. Une seconde greffe de même donneur survivait moins longtemps mais toujours plus qu’une greffe tierce, prouvant que les mécanismes de tolérance n’avaient pas totalement disparu. Ainsi, bien qu’une tolérance aux allogreffes de peau soit obtenue, celle-ci ne corrèle pas avec une absence de réponse immunologique 337 , 338. Le préconditionnement du receveur peut être réalisé par irradiation létale et utilisation de drogues lymphoablatives et/ou myeloablatives. Dans ce cas, les allogreffes de peaux de même souche que le donneur de moelle survivent plus longtemps mais pas indéfiniment et le rejet chronique a rarement été analysé. De plus, dans certaines combinaisons hôte/receveur, le chimerisme n’inhibe pas le rejet aigu d’allogreffe de peau 339 probablement dû à la réactivité des cellules T envers des antigènes spécifiques de la peau non exprimés par les cellules hématopoïétiques 340 , 341 . De plus, bien que le chimérisme hématopoïétique augmente la 75 survie d’allogreffes de cœur 342, des analyses histologiques ont révélé des signes fréquents de rejet chronique 343. Le chimérisme hématopoïétique peut également être obtenu par des drogues nonlymphoablatives. De façon surprenante, la survie des allogreffes réalisées avec ces conditions sont augmentées. Ainsi, si des signes de rejet chronique sont observés dans des greffes protégées uniquement par les drogues, la combinaison des drogues avec un chimérisme hématopoïétique bloque l’apparition du rejet chronique dans des modèles d’allogreffes de cœur et de peau 344 , 345 , 346. Dans ces conditions, la tolérance aux allogreffes est dominante et dépend des Treg au moins dans les premiers temps 347 , 348. c. Le chimérisme hématopoïétique en clinique Sur la base des résultats prometteurs du chimérisme hématopoïétique induit chez le rongeur, plusieurs équipes ont essayé de transposer le modèle et d’induire une tolérance aux allogreffes dans les modèles de grands animaux 349 , 350. Chez le singe Cynomolgus, le préconditionnement consistait en une déplétion des cellules T, une faible dose d’irradiation du corps entier, une irradiation du thymus et une splénectomie, suivie d’une greffe de moelle osseuse et de rein 351 , 352 . Bien que seul un chimérisme transitoire ait ainsi pu être induit, 8 greffes sur 15 ne montraient aucun signe de rejet 353. Un protocole similaire a été utilisé dans un modèle de greffe de cœur. Même si le chimérisme obtenu dans ce cas était plus élevé, les allogreffes présentaient des signes de rejet 354. L’ensemble de ces résultats mettent en évidence la difficulté d’obtenir une prise efficace et persistante d’une allogreffe de cellules souches hématopoïétiques chez le grand animal. Cependant, ces résultats étant assez prometteurs, l’induction d’un chimérisme hématopoïétique pour la protection des allogreffes a été testée chez l’homme. L’injection de cellules de moelle osseuse du donneur a montré des effets bénéfiques dans les cas de greffes de rein 355 et de greffe de foie 356. Une étude majeure a été réalisée en 2008 sur cinq patients présentant des atteintes rénales fatales ont reçu des greffes de rein de donneurs possédant des molécules HLA différentes sur un haplotype. Les patients ont été traités avec des drogues immunosuppressives mais non myéloablatives avant de recevoir une greffe de rein combinée 76 à une greffe de moelle osseuse. Quatre patients sur cinq ont présentaient une protection de la greffe sur plus de 1400 jours sans que l’analyse histologique des biopsies rénale ne révèle de signes majeurs de rejet chronique 357 . Les divers cas cliniques concernés sont abordés dans une revue située en annexe. 3. Les cellules impliquées dans la tolérance de transplantation a. Les cellules dendritiques tolérogènes Nous avons vu précédemment que les cellules dendritiques tolérogènes sont naturellement impliquées dans l’établissement de la tolérance au soi par blocage de l’activation des cellules T ou par induction de novo de Treg. Les recherches visant à allonger la survie des allogreffes ont assez tôt mis en évidence le rôle central que pourrait avoir une manipulation des DC dans ce domaine. Les premières études se sont intéressées à la manipulation des DC issues du donneur (Figure 12). Des DC tolérogènes ont été induites par traitement au GM-CSF de précurseurs de moelle du donneur. L’injection de ces DC 7 jours avant transplantation permet de prolonger la survie d’une allogreffe de coeur 358 , 359. Les DC plasmacytoïdes semblent également avoir un rôle dans la tolérance de transplantation. L’injection intraveineuse de précurseurs de pDC du donneur avant la transplantation prolonge la survie d’une allogreffe de cœur. Cependant dans ce cas, la tolérance ne semble pas être spécifique des antigènes puisqu’une greffe tierce est également protégée 360. Les DC issues du donneur ont également été utilisées afin d’amplifier in vitro des Treg spécifiques d’antigènes présentés par la voie directe d’alloreconnaissance contrôlant par la suite le développement de GVHD 361 et d’auto-immunité 362 et le rejet de greffes 363. Cependant la majorité des protocoles expérimentaux utilisant des DC du donneur nécessitent une préparation des cellules difficilement envisageable en clinique lors de transplantations d’organes de donneurs décédés. Pour pallier à cela, des études reposant sur des cellules dendritiques syngéniques ont été proposées. L’utilisation de DC dérivées de l’hôte, chargées avec des allopeptides du donneur permet de réduire la réactivité des LT de l’hôte et de promouvoir la tolérance envers la greffe (Figure 12). Il est décrit que l’injection intra-thymique de DC chargées, combinée à un traitement bref du receveur à l’ATG (Anti-thymocyte Globuline) 7 jours avant la greffe 77 Extrait de Morelli et al. Nat. Rev. Immunol., 2007 Figure 12 : Utilisation thérapeutique des cellules dendritiques en transplantation. Des cellules Dendritiques (DC) immatures ou résistantes à la maturation peuvent être générées à partir de précurseurs de la moelle osseuse chez les rongeurs ou à partir de monocytes chez l’homme. Les DC tolérogènes dérivées in vitro (à partir de l’hôte, du donneur, ou d’une combinaison des deux) sont injectées en intra-veineuse avant la transplantation afin de diminuer la réponse des cellules T de l’hôte spécifiques de la voie d’alloreconnaissance directe et /ou indirecte. D’autre part, un panel complet d’alloantigènes peut être directement délivré aux DC situées dans les organes lymphoïdes drainant la greffe afin de ne pas altérer l’état quiescent des DC et donc leurs capacités intrinsèques d’induction et de maintien d’une tolérance périphérique des cellules T. Plus récemment, des DC dérivées du donneur chargées avec des allopeptides ont été utilisées afin de générer des cellules T régulatrices spécifiques de la voie indirecte d’alloreconnaissance permettant de prolonger la survie d’allogreffes. 78 permet d’induire une tolérance à des allogreffes de cœur et d’îlots pancréatiques chez le rat 364 . De même, l’injection une semaine avant greffe de DC conditionnées à la rapamycine et chargées avec des antigènes du donneur permet de protéger à long terme une allogreffe de cœur. Ceci est associé à une infiltration de Treg dans la greffe 365. Enfin, il a été décrit que les DC CD8+ de la lignée lymphoïde chargées avec des peptides d’îlots pancréatiques permettent l’amplification in vitro de Treg autologues spécifiques pour ce peptide à partir d’une population polyclonale. Ces Treg inhibent alors les LT diabétogènes prévenant ainsi le développement d’un diabète de Type I366. En parallèle, il est décrit un rôle central des pDC de l’hôte dans la protection d’une allogreffe de cœur suite à une greffe de cellules souches sous contrôle d’anticorps anti-CD154 367 . Dans ce cas, les pDC capturent des alloantigènes dans la greffe, migrent vers les nœuds lymphatiques (et pas vers la rate) où elles induisent la génération de Treg CD4+Foxp3+ spécifiques de l’antigène. Une déplétion des pDC ou bien le blocage de leur entrée dans les nœuds lymphatiques inhibe l’induction de la tolérance. Enfin, certaines études ont envisagé l’utilisation de DC présentant ensemble à leur surface des molécules du CMH du donneur et de l’hôte (Figure 12). Ainsi chez la souris, l’injection, sept jours avant la greffe, de DC (Balb/c x B6)F1 surexprimant l’IL-10 et le récepteur aux chimiokines CCR7 induit une survie à long terme des greffes de cœurs dans plus de 80% des receveurs B6 368. De façon similaire aux DC dérivées du donneur, les DC (hôte x donneur)F1 permettent in vitro l’expansion de Treg spécifiques des antigènes du donneur présentés cette fois par la voie indirecte d’alloreconnaissance. L’injection de ces cellules combinées à une allogreffe de moelle osseuse permet d’inhiber à la fois les rejets aigu et chronique d’allogreffes de peau et de cœur 213. Cependant, en transplantation, l’un des problèmes majeurs de l’utilisation de DC est qu’en présence de signaux de danger et de cytokines pro-inflammatoires (le cas lors de l’acte chirurgical en lui-même), les DC peuvent perdre leur état quiescent, devenir matures et de ce fait perdre leur potentiel immunosuppresseur ou même conduire encore plus rapidement au rejet de l’organe greffé. Ces effets peuvent être inhibés si les DC sont injectées dans un environnement non inflammatoire donc plusieurs jours avant la greffe. Cette situation est possible dans le cas des greffes prélevées sur des donneurs vivants. Dans le cas de greffes issues de donneurs morts, de courts traitements aux drogues immunosuppressives ont montré de très bons résultats 369. 79 b. Cellules régulatrices en transplantation i. Les Treg CD4+ Comme nous l’avons décrit précédemment, on distingue deux sous-populations de Treg CD4 définies selon leur origine. D’une part, les Treg « naturels » dérivés et sélectionnés dans le thymus dont la fonction principale est d’inhiber les réponses aberrantes contre les antigènes du soi. D’autre part, des CD4 naïfs, ayant rencontré leur antigène dans un environnement tolérogène en périphérie, peuvent se différencier en Treg « induits » qui expriment également un taux élevé de Foxp3. En conditions basales, les patients possèdent un trop faible nombre de Treg spécifiques du donneur pour pouvoir inhiber le rejet de la greffe d’autant plus que les patients possèdent fréquemment des cellules mémoires spécifiques du donneur 370 . Ceci induit donc un déséquilibre en faveur d’un rejet de l’organe greffé. Cependant, la greffe peut par elle-même favoriser la différenciation ou la prolifération de Treg afin d’induire sa protection. En effet, des cellules ayant les caractéristiques de cellules régulatrices sont retrouvées non seulement dans des greffes tolérées 371 mais également dans des greffes rejetées 372. Une évolution de la balance en faveur d’une tolérance envers l’allogreffe peut être obtenue par différents mécanismes, notamment par l’utilisation de drogues immunosuppressives qui permettent la génération de Treg 373. ! Utilisation thérapeutique des Treg en transplantation Sur la base de l’ensemble des données existantes sur l’induction de tolérance en transplantation par chimérisme hématopoïétique et sur le potentiel immunosuppresseur des Treg, plusieurs équipes ont décidé de combiner l’injection de Treg avec les transplantations de moelle osseuse. Cette méthode devrait permettre l’établissement de mécanismes de tolérance complémentaires, mimant les systèmes régulateurs naturellement impliqués dans la tolérance au soi. En plus de leurs effets immunomodulateurs, les Treg Foxp3+ ont la capacité d’établir des niches immuno-privilégiées pour les cellules souches hématopoïétiques après transplantation dans un hôte non irradié 374 . Ainsi, l’administration de Treg spécifiques du donneur prévient le rejet d’allogreffe de moelle osseuse dans une souris préconditionnée 376 375, . Dans ce cas, cette tolérance induite par les Treg est spécifique puisque seule la moelle 80 osseuse de même souche que les CPA ayant servi à l’activation est protégée alors que la greffe tierce co-injectée est rejetée. La co-injection de Treg avec des cellules souches hématopoïétiques permet d’induire une protection envers une allogreffe de peau et de cœur 213. D’une façon similaire, Kathrine Wood a montré que les Treg humains amplifiés ex vivo ont la capacité de prévenir le rejet d’une greffe de peau réalisée chez une souris humanisée 377. Néanmoins la spécificité de ces Treg est importante. En effet, des Treg amplifiés au contact de CPA présentant des antigènes du donneur, donc spécifiques pour la voie directe d’alloreconnaissance, permettent de protéger une allogreffe de moelle, cependant, ils n’inhibent pas le rejet chronique des allogreffes de peau ou de cœur réalisées en suivant. En effet, malgré l’absence de signes macroscopiques de rejet, l’analyse histologique a révélé une infiltration massive d’éosinophiles caractéristique d’un rejet chronique 378 . À l’inverse, des Treg amplifiés au contact de CPA (hôte x Donneur)F1, donc spécifiques pour la voie indirecte d’alloreconnaissance, inhibent totalement le rejet chronique 213 générant ainsi une tolérance durable à l’allogreffe. Ces résultats démontrent clairement le potentiel clinique des Treg dans l’induction d’un chimérisme hématopoïétique et dans la prévention des rejets aigu et chronique d’allogreffes. ! La linked tolérance Dès 1983, Holan et al. font l’observation que des cellules alors dites « suppressives », induite in vitro au contact de cellules allogéniques inactivées par la chaleur, sont capables d’inhiber in vitro la prolifération induite par des alloantigènes tierces si ceux-ci sont exprimés à la surface des mêmes cellules que celles ayant servis à l’activation des T « suppressives » 379 . In vivo, l’injection de cellules modifiées génétiquement pour exprimer à la fois les molécules de CMH syngénique et allogénique permet de prolonger la survie d’une greffe de cœur de même donneur 380. Cependant dans ces modèles, la tolérance induite envers la greffe tierce peut être due à une dilution des alloantigènes ou à une diminution de leur immunogénicité. La démonstration claire du mécanisme de «linked tolerance » a été apportée plus tardivement par l’équipe de Waldmann dans un modèle de greffes de peau présentant des antigènes mineurs différents (Figure 13). Des souris CBA (H2k) rendues tolérantes pour des greffes de peau de souche 81 Extrait de Waldmann H, Immunol. Rev., 2006 Figure 13 : Suppression liée et tolérance infectieuse Des souris CBA/Ca ont reçu une greffe de cœur allogénique (B10 ou Balb/c) sous contrôle d’anticorps bloquants non déplétants anti-CD4 et CD8. Les greffes de cœur ont été acceptées plus de 100 jours. Les splénocytes de ces souris ont été capables de transférer leur tolérance spécifique pour le donneur à un autre receveur non manipulé ayant reçu une greffe de cœur de même souche de donneur. Ce second receveur est tolérant plus de 100 jours et possède des splénocytes capables d’induire une tolérance dans un troisième hôte et ainsi de suite sur neuf générations. Afin d’exclure un rôle d’une expansion sériée de la population régulatrice originelle, les splénocytes de souris tolérante Thy1.1 ont été transférés dans un hôte congénique Th1.2. Ce dernier hôte est tolérant pour une greffe de cœur même après déplétion des cellules Thy1.1 quatorze jours après leur transfert démontrant le côté « infectieux » de cette tolérance. Enfin, si le receveur de splénocytes tolérants reçoit une greffe de cœur F1 exprimant des antigènes tierces et des antigènes du donneur initial sur le même organe, celui–ci devient pleinement tolérant pour les antigènes tierces. Démontrant le processus de tolérance liée. 82 B10Br (exprimant des antigènes mineurs différents mais des CMH identiques) présentent une augmentation de la survie de greffes de peau issues d’un donneur (CBKxB10Br)F1. Dans ce cas, les antigènes mineurs différents sont exprimés à la surface de la même CPA 381 . À l’inverse, un greffon CBK transplanté sur le même animal est rapidement rejetée. La « linked Tolerance » est aussi impliquée dans l’induction d’une tolérance envers des CMH différents. En effets, des animaux d’haplotype k acceptent une greffe de moelle osseuse kxb et présentent un délai dans le rejet d’une greffe de cœur d’haplotype b réalisée le même jour. Une tolérance totale peut être observée lorsque la greffe de cœur est réalisée 14 jours après la greffe de moelle osseuse elle-même protégée par des anticorps bloquant anti-CD4 382. Ainsi il est décrit que les cellules induisant la tolérance contre les antigènes tierces doivent être capables de reconnaître ces antigènes exprimés dans le contexte du CMH de l’hôte, autrement dit, l’induction d’une tolérance liée implique la voie de reconnaissance indirecte 383 . L’induction d’une tolérance liée observée lors des traitements par des anticorps bloquants implique les populations CD4 384 et plus particulièrement les CD4+CD25+. ! La tolérance infectieuse La tolérance infectieuse existe à l’état naturel pour le contrôle de l’autoimmunité lors de la présentation d’antigènes libérés des sites immunoprivilégiés ou par des APC activées lors d’inflammation 385. La première description d’un mécanisme de «tolérance immunologique infectieuse» a été faite dans les années 1970 par Gershon et Kondo 87. Cependant, le concept de tolérance infectieuse a été plus clairement établi par les travaux de Waldmann et al. sur l’induction d’une tolérance à une allogreffe de peau par l’utilisation d’anticorps bloquants, non– déplétants dirigés contre les co-récepteurs et les molécules de co-stimulation CD4, CD8 et CD154 287 , 386 , 387 (Figure 13). La démonstration principale a été réalisée avec des souris athymiques dont l’ensemble des lymphocytes expriment le marqueur congénique CD2 humain 291 (Figure 14). Ces souris, rendues tolérantes pour une greffe de peau différant sur les antigènes mineurs, sont résistantes à la rupture de la tolérance par l’injection de cellules CD4 naïves n’exprimant pas CD2. L’élimination des cellules CD2+ de l’hôte au moment de l’injection des cellules naïves CD2conduit à un rejet rapide de la greffe. À l’inverse, une incubation de deux semaines de ces 83 Extrait de Waldmann et al. Annu Rev Immunol., 1998 Figure 14 : Schéma de l’expérience de mise en évidence d’une tolérance infectieuse en transplantation. Des souris CBA portant un gène CD2 transgénique humain, comme marqueur de l’ensemble des LT, ont été rendues tolérantes pour une greffe de peau B10Br par traitement avec des anticorps non-déplétants anti-CD4 et anti-CD8. Après quelques semaines, les souris ont reçu une injection de splénocytes naïfs issus d’un animal non transgénique. Le marqueur CD2 n’étant de ce fait plus exprimé que par une partie des cellules T, le receveur présente alors un certain degré de chimérisme. Malgré la présence des cellules naïves du donneur initial, les greffes ne sont pas rejetées, preuve de l’existence d’une tolérance dominante. Enfin, les cellules initialement tolérantes, CD2+, sont éliminées par un anticorps anti-CD2 humain. La tolérance envers la greffe initiale est conservée même avec la réalisation d’une nouvelle greffe. Cet état de tolérance peut ainsi être transféré d’une population à une autre. 84 deux populations conduit à une persistance de la tolérance après déplétion des cellules de l’hôte. Ces animaux acceptent par la suite une nouvelle greffe de peau de même donneur tout en gardant la capacité à rejeter une greffe tierce, montrant l’acquisition de capacité tolérogène par les effecteurs. La tolérance infectieuse n’est pas un simple effet de tolérance « bystander » en effet celle-ci est spécifique d’antigène. Il est décrit que l’induction d’une tolérance orale pour un seul antigène peut tolériser une greffe de peau de même souche 388. Nous avons vu que l’identification des marqueurs CD25 et Foxp3 a révélé le rôle central des Treg dans l’induction de tolérance aux allogreffes. Une étude de Waldmann et al. a montré l’implication d’une induction de Treg indispensable à la tolérance infectieuse 389 . Des femelles Rag1-/- possédant un TCR transgénique spécifique de l’antigène mâle DBY ne produisent pas de cellules Foxp3+. Ceci se traduit par un rejet d’une greffe de peau mâle. Cependant, lorsque la greffe est réalisée sous couvert d’un blocage de la co-stimulation, une induction de Treg Foxp3+ est observée dans la rate et les nœuds lymphatiques drainant la greffe. Ceci est corrélé avec l’établissement d’une tolérance à l’allogreffe. De plus, la déplétion spécifique des cellules Foxp3+ conduit à un rejet rapide de la greffe démontrant une fois encore l’importante nécessité d’une persistance des Treg «induits» pour le maintien de la tolérance dans ce modèle 390. ii. Les Treg CD8+ Ces cellules sont entre autre décrites pour leur rôle protecteur dans l’immunité intestinale 391 . Cependant dans un modèle d’induction de tolérance à une allogreffe de cœur suite à une transfusion de sang du donneur, il a été montré une rupture de cette tolérance lorsque le sang est dépourvu de cellules CD8+ 392 , 393 . De plus, les cellules CD8+ de l’hôte induisent l’expression de la fractalkine, ligand de CX3CR1, par les cellules endothéliales de greffe acceptée 394 . Cette expression entraîne l’attraction de cellules CX3CR1+ telles que les DC pouvant assurer la mise en place et le maintien de la tolérance. On distingue plusieurs sous-populations de CD8 ayant des fonctions immunosuppressives. L’une est caractérisée par l’absence d’expression de la molécule de co-stimulation CD28. Ces cellules inhibent l’activation des cellules T induites par les DC via un mécanisme contact 85 b Adapté de Wood K, Nat. Rev. Immunol., 2012 Figure 15 : Mécanismes utilisés par les cellules régulatrices adaptatives en transplantation. a$ Au moment de la transplantation, le receveur possède des Treg naturels dérivés du thymus et pouvant être activés par les voies de reconnaissance indirecte. Dans les organes lymphoïdes drainant la greffe, ces cellules inhibent la prolifération des LT. Les cellules B régulatrices ainsi que les DC tolérogènes favorisent le développement de Treg induits à partir de cellules T naïves. Ces cellules induisent alors la tolérance à l’allogreffe par différents mécanismes : production d’IL-10 et de TGF-ß, inhibition de la fonction des cellules présentatrices de l’antigène, effets sur la disponibilité en acides aminés et le métabolisme énergétique. b$En présenced’IL-10 dans le milieu environnant, les CD8 naïves peuvent se convertir en cellules CD8 régulatrices elles-mêmes productrices d’IL-10. Ces cellules peuvent inhiber les activités pro-inflammatoires des cellules T. Les cellules CD8+CD28- peuvent inhiber les fonctions des APC pour favoriser la tolérance immune. CTLA-4 : Cytotoxic T lymphocyte antigen 4 ; IDO : indolamine 2,3-dioxygenase ; LAG3 : lymphocyte activation gene 3 ; PDL1 : Programmed death 1 ligand ; TNF : Tumor necrosis factor. 86 dépendant et ont été identifiées dans des greffes de rein de patients traités par un anticorps monoclonal déplétant les lymphocytes, l’alemtuzumab 395 . Une autre population de CD8 régulateurs est induite par l’IL-10 et produit de l’IL-10. Ces cellules ont été décrites in vivo chez un patient présentant une tolérance stable à une allogreffe de rein 396 (Figure 15b). Il existe également parmi les populations CD8+ régulatrices une population qui exprime le facteur de transcription Foxp3. Ces cellules, isolées de rats rendus tolérants pour des cœurs allogéniques par plusieurs transfusions sanguines, peuvent induire la protection envers une greffe de cœur lors de leur transfert dans un deuxième hôte 397. Dans ce modèle, le transfert de LT CD4+ n’induit pas de protection de l’allogreffe. Enfin, il a récemment été décrit qu’un traitement par CD40-Ig induit une tolérance à long terme, et transférable sur plusieurs générations, envers des allogreffe de cœur. Ce transfert de tolérance n’est dû dans ce cas qu’aux cellules CD8+CD45RClow présentent dans la rate des animaux tolérants. La tolérance passerait par la production d’IDO exclusivement par les cellules endothéliales du donneur sous l’impulsion de l’IFN-% produit par les CD8+CD45RClow 398. iii. Les cellules NK et NKT Les cellules NK et NKT sont impliquées à la fois dans le rejet et la tolérance aux allogreffes de par leur capacité à produire rapidement et précocement des cytokines pro et anti-inflammatoires 399. Le rôle des cellules NK en transplantation a été décrit dans un modèle d’induction de tolérance obtenu par l’utilisation l’anticorps anti-CD154 et anti-LFA-1. Dans ce modèle de transplants d’îlots pancréatiques, la tolérance nécessite la présence de cellules CMH-I+ NK1.1+, mais est indépendante des CD8 400. De plus, il est décrit que l’induction de tolérance par anti-CD154 est dépendante de l’action de la perforine. L’injection de cellules NK (productrices de perforine) permet de restaurer la tolérance chez des animaux déficients pour cette molécule 400. D’un point de vue fonctionnel, les cellules NK de l’hôte lysent les DC allogéniques apportées par le greffon. Ainsi en absence de NK, l’activation des cellules T spécifiques de la voie directe, moins sensibles à l’immunosuppression par les drogues, est augmentée 401. Ces résultats sont renforcés par une étude démontrant un rôle de la perforine dans la lyse des DC allogéniques par les NK de l’hôte, régulant ainsi l’activité des CD4 402 . L’ensemble de ces études indiquent que les 87 cellules NK, via l’élimination des cellules dendritiques allogéniques limitent la persistance des cellules dérivées du donneur contribuant ainsi à l’induction d’une tolérance de transplantation. Un rôle protecteur des cellules NKT a été proposé dans un modèle de greffe de cœur réalisée sous contrôle d’anti-LFA-1/ICAM-1 ou d’anti-CD80/86. Dans ce modèle, les receveurs sauvages acceptent la greffe à long terme alors que les animaux dépourvus de cellules NKT (V#14-/-) rejettent la greffe. Surtout, l’injection de cellules NKT dans les animaux déficients permet de restaurer la tolérance 403. iv. Les lymphocytes B régulateurs Malgré l’absence d’anticorps spécifiques du donneur, un nombre élevé de cellules B présentant une plus forte expression de gènes associés aux LB (CD20, CD79b) ont été identifiées chez des transplantés rénaux n’ayant subi aucune immunosuppression 404. Chez la souris, les LB régulateurs sont caractérisés par une expression élevée de CD1d, CD21, CD24, d’IgM et un taux modéré de CD19. Chez l’homme, ces cellules qui présentent un phénotype aussi immature que les cellules murines sont identifiées par les marqueurs CD19+CD24hiCD38hi. Tout comme leur contrepartie T, les Breg sécrètent de l’IL-10, une cytokine immunomodulatrice. Une stimulation via la molécule CD40 semble requise pour la production d’IL-10 par les Breg 405 . De façon intéressante, il est décrit que les cellules B activées par CD40 ont la capacité d’induire in vitro la différenciation de CD4 naïfs en Treg CD25+Foxp3+ 406 (Figure 15a). Cependant, il reste à déterminer si cette conversion implique des cellules B productrices d’IL-10. Récemment, une analyse de la cinétique de réponse des Breg a été réalisée chez des transplantés rénaux traités à l’alemtuzumab. Des cellules B régulatrices ont été retrouvées de façon transitoire dans le sang des patients après la greffe 407. Cette présence serait corrélée à l’apparition ultérieure des Treg chez les patients recevant des protocoles de pré-conditionnement 408 . Néanmoins le lien entre les fonctions des Breg et des Treg dans la protection contre le rejet d’allogreffe reste encore largement à découvrir. v. Les macrophages régulateurs Les macrophages se divisent en plusieurs sous-groupes sur la base de leur localisation tissulaire et de leurs propriétés fonctionnelles 409. En transplantation, les macrophages sont 88 Adapté de Wood K, Nat. Rev. Immunol., 2012 Figure 16 : Mécanismes utilisés par les cellules régulatrices de l’immunité innée en transplantation. Les cellules suppressives myéloïdes (MDSC), les cellules stromales mesenchymateuses (MSC) s’accumulent dans la greffe suite à l’inflammation causée par l’endommagement du tissu au moment de l’acte chirurgical. Les MDSC inhibent la prolifération des cellules T, B et NK par différents mécanismes incluant l’expression d’oxide nitric synthase (iNOS) et d’arginase1. Les MSC agissent par des mécanismes impliquant les prostaglandines E2 (PGE2) les TGF-ß et les métalloprotéinases (MMP). Les macrophages régulateurs produisent une forte quantité d’IL-10 créant un environnement favorable au développement de Treg et de Tr1. ADAM 17 : disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17 ; DC, dendritic cells ; HO1 : Haem Oxygenase 1 ; IDO : indolamine 2,3-dioxygenase ; iNOS : inducible nitric oxide synthase ; MDSC : Myeloid-derived supressor cells ; MMP : Matrix metalloproteinase ; MSC : mesenchymal stromal cells ; NK : Natural killer cells ; PGE2 : protaglandine E2. 89 principalement activés par les lésions infligées au tissu par l’ischémie-reperfusion et contribuent au rejet précoce de la greffe 410. À l’inverse, les macrophages M2 peuvent inhiber la production par les macrophages M1 de cytokines pro-inflammatoires, favorisant la cicatrisation et le remodelage tissulaire. Importante dans les premiers temps après la greffe, la cicatrisation permet le rétablissement de l’homéostasie cellulaire cependant plus tardivement elle favorise la fibrose conduisant au rejet chronique de l’organe. Les macrophages régulateurs produisent de larges quantités d’IL-10 tout comme les macrophages M2 mais n’expriment pas l’arginase 1 et ne sont pas dépendants de STAT6 (Signal Transducer and Activator of Transcription 6). L’interaction d’un macrophage avec des Treg peut induire des macrophages M2 ou des macrophages régulateurs 411 (Figure 16). Chez l’homme, les macrophages régulateurs inhibent in vitro la prolifération de cellules T. Dans un essai clinique de transplantation rénale, les macrophages régulateurs humains semblent diminuer la nécessité des drogues immunosuppressives 412. Les macrophages de l’hôte jouent aussi un rôle sur la tolérance à long terme. En effet, une diminution du nombre de macrophages de l’hôte est lié à une expansion des cellules T du donneur aboutissant à l’apparition d’une GVHD suite à une transplantation de cellules souches hématopoïétiques 413. 4. Impacts des infections en transplantation Les infections ou les événements directement liés à l’acte chirurgical de transplantation, comme l’ishémie-reperfusion, peuvent augmenter l’alloréactivité et favoriser les épisodes de rejet de l’organe greffé. Les drogues immunosuppressives actuellement utilisées en clinique induisent une inhibition globale du système immunitaire des patients augmentant leur sensibilité aux infections. Les mécanismes immunitaires conduisant au rejet de l’organe sont différents selon que l’infection à lieu avant ou après la greffe. Ceci joue un rôle sur les protocoles immunosuppresseurs dispensés aux patients ainsi que sur les voies de recherches actuelles visant à induire une tolérance stable aux allogreffes tout en conservant la capacité à mettre en place une réponse immunitaire efficace contre les pathogènes. 90 Extrait de Chong et al. Nat. Rev. Immunol., 2012 Figure 17: Possibles effets des infections avant, lors et après la transplantation. Certains LT spécifiques pour des peptides microbiens présentés des molécules du CMH du soi peuvent réagir de manière croisée avec des molécules de CMH allogéniques, et des superantigènes bactériens peuvent directement activer une large proportion de cellules T. Lorsque l’infection a lieu avant la transplantation, ceci génère des LT mémoires alloréactifs qui peuvent être plus résistants à l’immunosuppression que les LT naïfs. L’engagement des PRR, au moment, ou après la transplantation peut induire divers signaux et la production de plusieurs cytokines. Ceci augmente l’activation, la survie et l’expansion des LT alloréactives en plus de diriger leur phénotype au cours de leur différenciation. Les infections qui ont lieu après la transplantation peuvent induire des signaux pro-inflammatoires. Ces signaux activent les LT tolérants e nfacilitant leur échappement à l’immunosuppression et/ou au mécanismes périphériques de tolérance, favorisant ainsi le rejet. CPA : cellules présentatrices de l’antigène ; PRR : pattern-recognition receptors ; Treg : Lymphocytes T régulateurs. 91 a. Lien entre la transplantation et le moment de l’infection. i. Infections avant transplantation. Les atteintes fatales d’un organe suite à une infection sont fréquemment à l’origine des actes de transplantation. C’est notamment le cas pour les greffes de foies rendues nécessaires suite à des infections par les virus des hépatites B et C, ou encore pour les greffes de reins suite à des infections bactériennes ou fongiques. Ces infections engendrent des cellules T mémoires qui réagissent de façon croisée, via la voie directe d’alloreconnaissance, avec les molécules de CMH allogéniques apportées par la greffe 414 (Figure 17). Cette réaction croisée peut être due au mimétisme moléculaire permettant à un TCR spécifique pour des complexes CMH-peptides du soi de réagir avec des molécules du non-soi. L’affinité des TCR peut parfois même être plus forte pour des molécules allogéniques bien que ceux-ci soient restreints par les molécules du soi 415 . Ainsi, les cellules T mémoires possèdent un seuil d’activation plus bas que des cellules T naïves générant des réponses immunes plus fortes et plus rapides 416 . Bien que les cellules alloréactives soient représentées en proportions similaires dans les populations naïves et mémoires, ces dernières ont un rôle central en transplantation du fait de leurs capacités accrues de prolifération et de production d’IFN-%, de granzymes B et de perforines. Ainsi, il a été décrit, chez des patients, un lien entre la fréquence de cellules mémoires spécifiques du donneur avant transplantation rénale et les risques d’épisodes de rejet de greffe 417. Ces réactions croisées confèrent une résistance aux protocoles d’induction de tolérance aux allogreffes comme le blocage de la co-stimulation, ou la transfusion de cellules du donneur 418 . Les données démontrant la participation des cellules T spécifiques de virus dans les alloréponses sont issues d’études dans lesquelles des CD8 mémoires murins spécifiques pour le virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV) ont été générés in vitro par infections par le LCMV. Les cellules spécifiques du LCMV ont été purifiées grâce à des tétramères. Ces cellules ont révélé des capacités de réactivité croisée provoquant le rejet aigu d’allogreffes de peau lors de leur transfert dans des souris présentant une immunodéficience combinée sévère (SCID) 419. Les infections fongiques et bactériennes peuvent également induire la génération de cellules T mémoires possédant une réactivité croisée pour les molécules allogéniques prévenant l’induction de tolérance envers des transplants de peau 420 . De plus certaines espèces bactériennes peuvent produire des toxines possédant des propriétés des 92 superantigènes activant ainsi plus de 20% du répertoire des cellules T de l’individu aboutissant à une génération massive de cellules mémoires alloréactives 421. ii. Infection après transplantation La fragilité immunitaire des patients après la transplantation, due à l’acte chirurgical en lui-même mais aussi aux drogues immunosuppressives utilisées pour prévenir le rejet de l’organe, augmente leur sensibilité aux infections (Figure 17). Il a été décrit que les infections par des bactéries intracellulaires (Listeria monocytogenes) ou extracellulaires (Staphylococcus aureus) induisent le rejet d’allogreffe de peau chez des souris traitées avec des anticorps anti-CD154 et une transfusion de cellules du donneur 422, 423 . Cependant d’autres infections nosocomiales comme les infections par Pseudomonas aeruginosa n’ont pas d’effets sur l’acceptation de greffe chez la souris démontrant que seules certaines infections bactériennes spécifiques sont associées à l’augmentation de l’incidence de rejet 422 . Ceci serait dû aux différentes cytokines pro- inflammatoires induites par chaque souches bactériennes. Les infections par le virus de la chorioméningite (CMV) sont des infections virales fréquentes en cliniques et sont associées à une augmentation de la fréquence de rejet de greffe. Le vaste tropisme cellulaire du CMV suggère que les infections locales et/ou systémiques peuvent avoir un impact sur l’alloréactivité précoce mais également sur le rejet.tardif. Chez la souris, les infections par la souche murine du CMV (MCMV) affectent négativement l’acceptation des greffes 424 ou conduisent à la réactivation d’une infection latente 425. Il a été rapporté que le rejet induit par les infections aux LCMV ne sont pas dues à une activation de cellules T spécifiques du virus mais à une stimulation des cellules de l’immunité innée. Ces infections augmentent la maturation des cellules dendritiques conduisant à une activation des cellules T alloréactives par une voie indépendante de CD28 et de CD40 426 b. Lien entre infections et alloréactivité. Les microorganismes expriment ou libèrent des motifs moléculaires (PAMPs) reconnus par des récepteurs spécifiques (PRR) exprimés par les cellules hématopoïétiques. Les TLR (Toll Like Receptors) appartiennent à la famille des PRR. Certaines évidences cliniques indiquent que la signalisation via les TLR intervient dans l’alloréactivité. En effet, des souris 93 invalidées pour la signalisation TLR (myd88-/-) présentent un délai dans le rejet des allogreffes. À l’inverse, des agonistes des TLR augmentent le rejet et inhibent l’acceptation des allogreffes 427. Les réponses immunes sont adaptées au type d’infection rencontré. Il en résulte une activation de différentes populations de CPA et la génération d’un microenvironnement cytokinique spécifique qui agit directement sur la différenciation des cellules T dans les organes lymphoïdes secondaires. Ainsi il est connu qu’une infection par le HCV ( infection courante chez les transplantés hépatiques) déclenche la production d’Interférons de type I. Or le traitement classique des infections chroniques au HCV par IFN-# est décrit pour augmenter le risque de rejet de la greffe 428 . Les traitements par IFN-ß inhibent la délétion des cellules CD8+ alloréactives qui a normalement lieu durant l’induction de tolérance, et favorisent l’activation de ces cellules lors d’immunosuppressions par anti-CD154 429. Pareillement, l’infection par S. aureus induit la production d’IL-6 par les cellules de l’hôte. Cette production d’IL-6 favorise le rejet de greffe en diminuant la sensibilité des cellules de l’hôte aux anticorps anti-CD154. Les LT se différencient alors préférentiellement en cellules Th1 ou encore Th17 422 . De même, l’activation du TLR 9 par des ligands agonistes, les CpG, conduit à une augmentation du rejet de greffe cardiaques 430. Les infections peuvent aussi avoir un effet en agissant directement dans l’organe greffé. C’est le cas lors des infections virales respiratoires chez les patients ayant reçu une greffe de poumons. L’infection est associée à une augmentation de la production d’IFN-% qui induit à son tour la production des chimiokines CXCL9, -10 et -11 (ligands de CXCR3), par les cellules épithéliales bronchiques. Ces chimiokines recrutent dans la greffe des lymphocytes activés qui participent au rejet chronique de l’organe 323. Ainsi, les cytokines et chimiokines produites en réponse à une infection peuvent augmenter l’alloréactivité, dans les organes lymphoïdes mais aussi dans la greffe elle même. c. Implication pour les thérapies. Le but des thérapies anti-rejet actuelles est d’induire une tolérance stable aux allogreffes tout en conservant la capacité de répondre de manière efficace à une infection. 94 Le contrôle des LT alloréactifs mémoires par blocage des molécules d’adhésion (LFA1, VLA-4) a donné des résultats positifs, en limitant le rejet aigu d’allogreffes de rein et d’îlots pancréatiques chez la souris et le PNH 431, 432 . Cependant ces traitements diminuent aussi l’effet protecteur des cellules mémoires en cas de réinfection ce qui limite leur potentiel clinique. Les protocoles d’inhibition des voies de signalisation des IFN de type I ou de l’IL-6 sont décrits comme favorisant à la fois l’induction et le maintien de la tolérance aux allogreffes dans des modèles animaux 422, 423 . Cependant ces cytokines ont des effets pleiotropes et jouent un rôle central dans le contrôle des infections virales, bactériennes et fongiques. Leur utilisation en clinique s’avère donc encore très hasardeuse. L’une des solution serait de cibler les cellules de l’immunité innée qui dirigent l’alloréactivité mais ne sont que peu impliquées dans les protections contre les infections. De façon intéressante, la Rapamycine est connue pour augmenter le degrés et la qualité des réponses CD8 effectrices et mémoires tout en inhibant les CD8 alloréactifs 433. La rapamycine inhibe l’activation des DC, la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires par ces cellules et inhibe la prolifération des T 434. Ces observations suggèrent que les réponses spécifiques contre la greffe pourraient être contrôlée de manière ciblée permettant de maintenir les réponses contre les pathogènes. 95 RESU LTATS 96 Objectifs La réussite des transplantations d’organe est l’un des grands défis de la médecine poursuivi depuis plusieurs siècles. Au-delà des progrès techniques de la chirurgie, l’induction d’une tolérance vis-à-vis de l’organe greffé assurant sa survie à long terme est primordiale mais pas encore atteinte. En effet, malgré l’utilisation efficace des drogues immunosuppressives, celles-ci ne parviennent pas à totalement inhiber le rejet de la greffe et sont associées à des effets secondaires majeurs. Parmi les nouveaux protocoles prometteurs actuellement en développement, l’induction de tolérance par thérapie cellulaire à base de lymphocytes T régulateurs a une place centrale. Notre équipe a précédemment développé un protocole de thérapie cellulaire visant à protéger les allogreffes par l’utilisation de lymphocytes T régulateurs. Les Treg de la même souche que l’hôte étaient purifiés sur la base de CD25 et cultivés durant deux semaines avec des cellules présentatrices de l’antigène irradiées de souche donneuse afin d’amplifier les populations régulatrices spécifiques du donneur. L’injection de ces Treg permettait d’induire une tolérance stable envers une allogreffe de moelle osseuse. Nous avons montré que les animaux chimériques acceptaient alors une allogreffe de peau ou de cœur de même souche que la moelle. De plus, nous avons montré que la réalisation d’une greffe de moelle osseuse est une étape indispensable à la protection des allogreffes de peau ou de cœur ultérieures. Par cette étude, nous avons également mis en évidence l’impacte de la spécificité des Treg sur l’inhibition du rejet chronique. Ainsi des Treg spécifiques de la voie indirecte d’alloreconnaissance inhibent totalement les rejets aigu et chronique d’allogreffes de peau et de cœur. Cependant les mécanismes soutenant cette tolérance restaient encore flous, notamment l’importance d’une survie à long terme des Treg injectés. De plus, l’une des autres grandes questions actuelles en transplantation concerne la coexistence d’une tolérance envers l’organe greffé et la capacité des patients à mettre en place une réponse immunitaire efficace et spécifique lors d’une infection, sans affecter la greffe. Nous savions que les Treg protégeaient exclusivement la greffe pour laquelle ils étaient spécifiques puisqu’une greffe tierce était rejetée. Cependant il restait à déterminer si l’inhibition de la réaction immunitaire contre la greffe était elle aussi spécifique sur le long terme. 97 Mon travail de thèse s’est donc divisé en deux parties. L’une consistait à identifier les mécanismes cellulaires impliqués dans le maintien de la tolérance aux allogreffes de moelle osseuse et de peau. L’autre, à évaluer la capacité de réponse des animaux ayant accepté une greffe suite à une immunisation visant à activer les cellules CD4+. L’ensemble de ces analyses avait pour but de renforcer le potentiel du transfert d’une thérapie par les Treg en clinique humaine. 98 Long term prevention of chronic allograft rejection by regulatory T cell immunotherapy involves host Foxp3-expressing T cells Lise Pasquet1,2,3, Jean-Yves Douet1,2,3, Tim Sparrwasser4, Paola Romagnoli1,2,3, Joost P.M. van Meerwijk1,2,3 1 Inserm, U1043, Toulouse, F-31300, France; 2CNRS, U5282, Toulouse, F-31300, France ; 3Université de Toulouse, UPS, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan (CPTP), Toulouse, F-31300, France; 4Institut für Infektionsimmunologie, TWINCORE - Zentrum für Experimentelle und Klinische Infektionsforschung GmbH, Feodor-Lynen-Str. 7, 30625 Hannover, Germany. Article soumis au journal « Blood » 99 Abstract Despite the use of immunosuppressive drugs, chronic allograft rejection remains a major hurdle in transplantation-medicine. Induction of specific immunological tolerance to antigens expressed by the graft would avoid its eventual functional loss and the severe side effects of paralyzing the immune system. We previously showed that donor-specific regulatory Tlymphocytes prevent rejection of fully allogeneic bone-marrow grafts in mice. Thus generated hematopoietic chimeras then accepted skin and heart allografts of the same donor. We noticed that injected regulatory T-cells disappeared with time and therefore investigated the mechanisms involved in the long-term persistence of allograft-tolerance. Using regulatory Tcells that can be depleted in vivo with diphtheria toxin, we show that injected cells are required for induction but not for maintenance of tolerance to bone-marrow allografts. We observed progressive deletion of donor-specific T-lymphocytes, accounting at least in part for maintenance of tolerance. Toxin-induced depletion of administered as well as host regulatory T-cells did not affect hematopoietic chimerism, but it led to rapid loss of skin allografts. Our data therefore show that newly generated host regulatory T-cells can prevent chronic allograft-rejection. Long-lasting tolerance to allografts is thus achieved. ! 2 Introduction Transplantation of allogeneic tissue and organs is severely hindered by the vigorous reaction of the host’s immune system to the foreign graft. Unless inhibited by immunosuppressive drugs, this alloreactivity leads to rapid rejection. However, these medicaments do not prevent chronic allograft rejection. Moreover, the induced paralysis of the immune system explains the increased incidence of cancer and opportunistic infections. The life-long use of drugs is also associated with direct toxic side effects. Means to prevent chronic allograft rejection should therefore be developed 1,2 . Despite the random nature of the somatic rearrangements that determine the antigenspecificity of developing T lymphocytes, these cells normally do not attack self-tissues. 3,4 Several mechanisms are involved in this self-tolerance . For example, developing autospecific T cells die upon recognition of their peptide/MHC ligand expressed by thymic dendritic cells. Indeed, the T cell repertoire developing in mice in which thymic dendritic cells do not express MHC molecules is strongly autoreactive in vitro and in vivo autospecific T cells nevertheless escape to the periphery 9,10 5-8 . Some . These cells are kept under control by regulatory T cell (Treg)-populations. The most extensively studied Treg express the co-receptor CD4 and Foxp3. Patients and mice carrying mutations in the gene encoding this forkhead/winged helix transcription factor rapidly develop a lethal autoimmune syndrome, best illustrating the central role of Treg in the control of autospecific lymphocytes 11-13 . Self- tolerance is therefore maintained by at least two important mechanisms: deletion and regulation. Induction of genuine tolerance to donor-antigens therefore presumably also needs these two mechanisms. Seminal work by Medawar and colleagues showed that congenital hematopoietic chimerism strongly favors acceptance of skin grafts of the same donor 14 . Deletion of autospecific T cells presumably played a major role in this phenomenon. However, unless chimerism induced Treg, which has never been shown, it appears unlikely that it will lead to full tolerance to the skin grafts. Indeed, despite the substantial delay in acute rejection, chronic rejection is not prevented by hematopoietic chimerism (reviewed in ref. 15). We and others therefore ! 3 assessed the capacity of Treg to induce long-lasting transplantation tolerance in the mouse. Donor-specific Treg were administered to sublethally irradiated host mice at the time of bone marrow (BM) transplantation. Thus, the hosts accepted the fully allogeneic BM grafts 16,17 . When these hematopoietic chimeras were grafted with skin or heart from the same donor, transplants survived for at least 100 days and chronic rejection was fully prevented. The combination of hematopoietic chimerism and Treg of appropriate specificity, therefore, appeared to ensure full tolerance to the grafts strongly favor acceptance of allografts 19,20 18 . Separately, these two approaches also , but best results were obtained by associating them. Whereas, in absence of rejection, hematopoietic chimerism is maintained by self-renewing stem cells, little is known about the life expectancy of Treg. In our earlier work we showed that injected Treg survived substantially longer in presence of hematopoietic cells for which they were specific than in their absence 18 . However, nine weeks after injection their representation in the blood had dropped substantially and it was unclear if these cells would home to tissues or entirely disappear. It was therefore important to assess if persistence of administered Treg is required for long-term maintenance of tolerance to the graft. We here address this issue by first quantifying the persistence of injected Treg in different tissues. We then actively eliminated these cells in vivo and monitored survival of BM and skin allografts. Given that we observed that injected Treg become dispensable for persistent tolerance to the grafts, we also investigated mechanisms involved in the long-term prevention of chronic rejection. ! 4 Methods Mice Mice were purchased from the Centre de Recherche et d’Elevage Janvier (Le Genest St. Isle, France) and were used between 6 and 10 weeks of age. C57BL/6 (B6) Thy1.1 and DEREG mice 21 were bred in our specific pathogen-free animal facility. All experiments involving animals were performed in compliance with relevant laws (authorization # 31 09 555 45) and institutional guidelines (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Inserm) and were approved by the local ethics committee (Midi-Pyrénées, France; ref. MP/01/40/11/06). Antibodies Antibodies with the following specificities were used for analyses and for the purification of b d Tregs: FITC or biotin-labeled anti-H-2K (AF6-88.5); PE-labeled anti-H-2K (SF1-1.1) and k anti-H-2K (36-7-5); Pacific Blue-labeled anti-CD4 (RM4-5); Pacific Blue-labeled anti-CD8 (53.6.7); APC-labeled anti-CD25 (PC61); biotin-labeled anti-V!3, V!4, V!5, V!6 and V!14 (BD Biosciences, Heidelberg, Germany); PE-Cy7-labeled anti-CD4 (GK1.5); APC-labeled anti-Thy1.1 (HiS51); PE-labeled anti-CD25 (PC61.5); purified F4/80 antibody (BM8); Streptavidin-eFluor710 (eBioscience, San Diego, CA). Hybridoma supernatants of antibodies to Fc"RII/III (2.4G2), CD8 (53.6.7), MHC class II (M5/114.15.2), and Thy1.2 (AT83) were produced in our laboratory. + + Purification of CD4 CD25 Treg + + CD4 CD25 splenic T cells were purified and cultured with "-irradiated splenocytes as previously described 16 . Briefly, after depletion of erythrocytes (Lympholyte-M; Cedarlane + Laboratories, Hornby, ON, Canada), splenocytes were enriched in CD4 T cells by incubation with a cocktail of monoclonal antibodies to CD8 (53.6.7), Fc"RII/III (2.4G2), and MHC class II (M5), followed by magnetic depletion with sheep anti-rat antibody-coated Dynabeads (Dynal Biotech, Oslo, Norway). The resulting population was then labeled with PE-conjugated anti- ! 5 + CD25 (PC61) and CD4 CD25 + cells enriched with anti-PE coated microbeads using a magnetic column (Miltenyi Biotec, Paris, France). Cell purity was checked by flow-cytometry on a FACSCalibur (BD Bioscience, San Jose, CA) using PE-labeled anti-CD25 mAb PC61 + + and PE-Cy7-labeled anti-CD4 (GK1.5). Thus isolated CD4 CD25 T-cells were routinely more than 95% pure. + + In vitro culture of CD4 CD25 T cells CD4 CD25 T cells (2x10 /well, 100 µL) from wt B6, B6-Thy1.1 or B6 DEREG mice were + + 3 5 cultured with 5x10 !-irradiated (17 Gy; 137 Cs source) total splenocytes from DBA/2, B6D2F1 or CBAB6F1 mice in 96-well round-bottom plates for 14 days. Cells were cultured in RPMI 1640 (Eurobio, Les Ulis, France) supplemented with 10% heat-inactivated fetal calf serum, 2mM L-glutamine, penicillin, streptomycin, 10mM HEPES, 1mM sodium pyruvate and 100 U/mL IL-2 (supernatant of phorbol myristate acetate [PMA]-stimulated EL4.IL-2 cells; American Type Culture Collection [ATCC], Manassas, VA). At day 7, 100µL fresh medium was added and cells were cultured for another 7 days. BM transplantation BM from femurs and tibias was collected in RPMI (Invitrogen, Paisley, United Kingdom) supplemented with 10% FCS, 2mM L-glutamine, penicillin, and streptomycin. Single-cell + suspensions were washed in complete medium. Thy1 cells were eliminated using AT83 Ab 7 and rabbit complement (Saxon Europe, Suffolk, United Kingdom). 10 donor cells were injected intravenously into !-irradiated hosts (5 Gy !; 137 Cs source) that were kept on antibiotic-containing drinking water (0.4% pediatric suspension of Bactrim; Roche, Basel, 6 Switzerland) for the first three weeks of the experiment. 2 x 10 Treg were coinjected with BM cells. ! 6 In vivo depletion of Treg To deplete Treg, chimeras were injected IP with 1.5µg Diphtheria Toxin (Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France) diluted in PBS on two consecutive days at the indicated time point after BM reconstitution. Flow cytometry Hematopoietic reconstitution and Treg persistence were determined by analyzing peripheral blood mononuclear cells (PBMC) after erythrocyte depletion. Repertoire analysis was performed on spleen and thymus. In each case, cells were resuspended in 2.4G2 hybridoma supernatant with saturating concentrations of indicated antibodies. Chimerism was analyzed k d b by anti-H-2K -PE or H-2K -PE in combination with H-2K biotin revealed by streptavidineFluor-710. Repertoire analysis was assessed using PE-Cy7-labeled anti-CD4; Pacific Bluelabeled anti-CD8; biotin-labeled anti-V!3, V!4, V!5, V!6 and V!14 revealed by streptavidineFluor-710; and APC-labeled anti-Thy1.1. Acquisition was performed on a LSRII or a FORTESSA cytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, US) and data were analyzed using FlowJo software (Tree Star, Ashland OR). Skin transplantation Skin grafts of approximately 0.5 x 0.5 cm were prepared from tails of female DBA/2 mice, grafted onto the prepared back of recipients, fixed with 4 suture-points (5.0 Polyamide monofilament, non absorbable, Flexocrin", Braun Aesculap, Tuttlingen, Germany), and protected by a bandage during 7 days. Skins were considered rejected if # 70% of the surface was necrotic. Histological analysis Skin biopsies were fixed in 10% buffered formalin and embedded in paraffin. Sections were stained with Hematoxilin and eosin or with Luna’s eosinophil staining. Antibodies specific for F4/80 were used to detect macrophages and revealed using secondary anti-rat biotin-labeled ! 7 antibody (DAKO, Denmark) followed by streptavidine-HRP staining (Vector laboratories, Berlingame, CA). Statistical analysis Statistical significance was determined by using Student’s t-test with Bonferroni correction. ! 8 Results Administered Treg wane away with time We previously showed that donor-specific Treg durably prevented rejection of semi and fully allogeneic BM allografts 16 . To assess if administered Treg need to persist to maintain tolerance to the donor, we set up an experimental system in which Treg can be deleted in vivo. DEREG mice carry a transgenic BAC construct in which the Foxp3-promoter drives expression of the Diphtheria Toxin Receptor (DTR) and enhanced green fluorescent protein 21 + (eGFP) . Practically all CD4 CD25 + high Treg in C57BL/6 (B6) DEREG mice therefore express eGFP (Fig. 1A). We isolated CD4 CD25 high cells from spleens of transgenic animals (Fig. 1B, left-hand panel) and cultured them with (donor x host)F1 (i.e. [CBA x B6]F1) mice derived irradiated splenocytes as stimulators in presence of high levels of IL-2, required for the proliferation of Treg. Semi-allogeneic F1 splenocytes were used because they present alloantigens via the direct and indirect pathways. This allows for the expansion of Treg specific for indirectly presented alloantigens, required for prevention of chronic rejection of skin and heart allografts 18 . After a two-week culture period, Foxp3-expression, as assessed by eGFP fluorescence, was maintained (Fig. 1B, right-hand panel). We then used these donor-specific Treg to protect a BM allograft. Recipient B6 mice were sublethally irradiated (5 Gy !), reconstituted with T cell-depleted CBA BM, and simultaneously injected with the in vitro cultured DEREG Treg. Thus, the fully allogeneic BM graft was protected from rejection by the recipient’s immune-system for more than 100 days (Fig. 1C). Wt and DEREG Treg were equally efficient in inducing tolerance to the CBA BM allograft, i.e. similar levels of hematopoietic chimerism were observed. In protected mice administered DEREG Treg were + clearly visible among blood CD4 T lymphocytes (Fig. 1D). However, DEREG Treg waned away with time and after 70 days they were no longer visible in PBMC of the chimeras (Fig. 1D and E). At this time, also in spleen, lymph nodes, and BM, administered Treg had almost completely disappeared (Fig. 1F). ! 9 Diphtheria toxin-mediated in vivo depletion of Treg These data therefore suggested that persistence of injected donor-specific Treg is not required for maintenance of tolerance to the BM allograft. However, at 70 days after injection, a very small number of DEREG Treg still remained detectable, especially in BM (Fig. 1F). Therefore, we cannot formally conclude that administered Treg do no longer play a role in protection of the graft. To directly address this question, we next depleted administered DEREG Treg by injection of diphtheria toxin. Preconditioned wt B6 mice were grafted with CBA bone marrow and simultaneously injected with in vitro cultured donor-specific wt or DEREG Treg. Diphtheria toxin was injected four weeks after BM transplantation. Two and six weeks after toxin injection, administered DEREG Treg were no longer detected in spleen, BM, lymph nodes, and PBMC (Fig. 1G). Injection of diphtheria toxin, therefore, very efficiently depleted administered DEREG Treg. Administered Treg are required for induction, but not maintenance, of tolerance to MHC mismatched BM allografts We next assessed if persistence of administered Treg is required for maintenance of tolerance. Wt B6 mice were preconditioned, grafted with CBA BM, and simultaneously injected with donor-specific DEREG Treg. Mice injected with diphtheria toxin at one week after BM grafting did not develop hematopoietic chimerism (Fig. 2A). This effect was due neither to a non-specific effect of the toxin (mice injected with wt Treg and treated with toxin developed chimerism, not shown), nor to an intrinsic defect of DEREG Treg (mice injected with DEREG Treg but not treated with toxin developed chimerism, Fig. 2A). Therefore, administered Treg are required during the initial phases of tolerance induction. These data also confirmed that injection of diphtheria toxin efficiently depleted injected DEREG Treg. We next performed similar experiments but injected diphtheria toxin at two or four weeks after BM grafting and Treg injection. In both cases, hematopoietic chimerism developed normally and persisted for at least 100 days (Figs. 2B and C). No significant difference in chimerism was observed between the groups injected with wt or DEREG Treg, treated or not ! 10 with diphtheria toxin. It therefore appears that, two weeks after transplantation, administered Treg are no longer required for maintenance of tolerance to the BM allograft. After depletion of administered Treg, tolerance to BM allografts appears maintained by deletion of donor-specific T cells, not by host Treg We then assessed which mechanisms were involved in the tolerance to BM allografts that persisted despite depletion of administered Treg. First, we wished to investigate what happens to donor-specific T lymphocytes. To track such cells, we chose to use DBA/2 donors. These mice present a large number of mammary tumor virus-encoded superantigens d by their I-E MHC class II molecules. T cells expressing several TCR V! segments, among which V!3, V!5, V!6, but not V!4 and V!14, recognize these superantigens 22 . Preconditioned B6 (Thy1.2) mice were grafted with T cell-depleted DBA/2 BM and injected + b+ with donor-specific B6 Thy1.1 Treg. The TCR V! repertoire of host (i.e. Thy1.2 H-2K ) T cells was analyzed in spleen and thymus of these chimeras. In sublethally irradiated B6 mice that received a DBA/2 BM in absence of Treg, and that therefore rapidly rejected the allograft, the TCR V! repertoire in the spleen did not change very much during the 28-day follow-up period and was similar to that observed in B6 ! B6 control chimeras (Fig. 3A). In contrast, in B6 mice that had received a DBA/2 BM allograft and donor-specific Treg, and that therefore accepted the allograft and became chimeric, superantigen-specific TCR V!3, 5, and 6+ expressing CD4 T cells gradually disappeared and reached levels found in DBA/2 ! DBA/2 control chimeras by 28 days (Fig. 3A). Similar results were obtained for the thymus (Fig. 3B). + The representation of CD4 T cells expressing V!4 (Fig. 3A, B) and V!14 (not shown), which do not recognize donor-encoded superantigens, was similar in spleen and thymus of all four + types of chimeras studied. Peripheral and central deletion of donor-specific CD4 T cells, therefore, was gradually established in the chimeras and most surely contributed to the maintenance of tolerance after depletion of administered Treg. We also investigated if host Treg played a role in the maintenance of tolerance to the BM allograft after depletion of administered Treg. To this end, we preconditioned B6 DEREG hosts and grafted them with DBA/2 BM co-administered with donor-specific DEREG Treg. ! 11 Injection of diphtheria toxin into these mice would deplete administered as well as host Treg. Rapid reconstitution of newly developing Treg avoids autoimmune pathology 21 . Again, depletion of administered Treg at one week after reconstitution led to rejection of the BM allograft (i.e. in DEREG or wt hosts, Fig. 4A). In contrast, injection of diphtheria toxin at two or four weeks did not lead to rejection of the allografts (Fig. 4B and C). These results strongly suggest that host Treg are not involved in the maintenance of tolerance to the BM allografts after depletion of administered Treg. Persistence of administered Treg is not required for tolerance to skin allografts We next investigated if persistence of injected Treg was required for maintenance of tolerance to fully allogeneic skin allografts. Wt B6 hosts were preconditioned and reconstituted with DBA/2 BM. DEREG Treg in vitro expanded using (donor x host)F1 (i.e. [DBA/2 x B6]F1) antigen presenting cells, and therefore specific for directly and indirectly presented alloantigens, were injected with the BM allograft. The thus generated hematopoietic chimeras were grafted with skin from the same donor strain six weeks after BM reconstitution. Grafts were monitored for macroscopic signs of rejection and, if no rejection was observed at the end of the 100-day observation period, they were taken for histological analysis of chronic rejection. In a first experiment we depleted administered DEREG Treg at ten weeks after BM reconstitution, i.e. at four weeks after skin grafting. During the 100-day observation period we did not observe any macroscopic signs of rejection of the skins (Fig. 5A, B, upper panels). Histological analysis of the grafts taken at 100 days after skin grafting did not reveal any signs of (chronic) rejection neither (Fig. 5C, upper panels). Most importantly, we did not see infiltration by mononuclear cells (e.g. macrophages) nor eosinophils, previously observed in chronic rejection of skin allografts 18,23 . It therefore appears that once the skin allograft is in place, administered Treg are dispensable for maintenance of tolerance. We next investigated if administered Treg can be depleted before skin grafting. Diphtheria toxin was injected four weeks after BM grafting. Skin from the same donor strain was transplanted two weeks later. During the 100-day observation period no macroscopic signs of ! 12 rejection were observed in nine out of eleven thus treated mice (Fig. 5A, B, middle panels) and histological analysis of the grafts did not reveal any signs of chronic rejection (Fig. 5C, middle panels). Host Treg are required for maintenance of skin allograft tolerance. Central and peripheral deletion, as shown in Fig. 3, may be involved in the continued protection from chronic rejection of the skin grafts after depletion of injected Treg. We wished to investigate the possibility that host Treg also played a role. B6 DEREG mice were preconditioned and grafted with fully allogeneic DBA/2 BM under cover of DEREG Treg specific for directly and indirectly presented alloantigens. Four weeks later, administered and + host Foxp3 Treg were depleted by injection of diphtheria toxin. Treg-depletion did not change the hematopoietic chimerism (Fig. 4C). Two weeks later, DBA/2 skins were transplanted on these chimeras. Grafts were monitored for signs of rejection during a 100-day observation period. Depletion of administered and host Treg in DEREG hosts led to rapid rejection, clearly visible macroscopically (Fig. 5D right panel). All grafts on DEREG hosts (five out of five performed) were rejected by 23 days (Fig. 5D, left panel). Importantly, in all these mice the BM allograft remained in place (Fig. 5E), and the loss of tolerance was therefore specific for the skin grafts. These data show that host Treg were involved in the continued prevention of skin rejection after depletion of injected Treg. They also demonstrate that DEREG host-Treg are effectively depleted by injection of diphtheria toxin in our experimental model and thus confirm that host Treg are not required for maintenance of the allogeneic BM graft (Fig. 4). Combined, our data demonstrate that administered Treg had transmitted their role in the protection of fully allogeneic skin grafts to host Treg that became sufficient for the prevention of chronic rejection. ! 13 Discussion Previously published data from our laboratory and those of others demonstrated the potential of Treg to induce tolerance to BM, skin and heart allografts in mice 17-19,24 . Since injected Treg vanish with time it was important to study if tolerance would persist in their absence. Here we show that injected Treg are essential for the induction of tolerance to BM allografts. In contrast, once tolerance is established, its maintenance does no longer require injected Treg. The persistent tolerance appears at least in part mediated by deletion of donorspecific T-cells, but host Treg were not involved. Mice that had accepted the BM allograft were also tolerant to subsequent skin grafts from the same donor-strain. Injected Treg were not required for acceptance of the skin-grafts. However, when injected Treg were depleted, host Treg became critical for skin graft-acceptance. It therefore appears that the Tregmediated immunotherapy against skin graft rejection leads to development of host Tregmediated tolerance. This mechanism will ensure long-term tolerance to allografts. Administration of in vitro expanded Treg leads to permanent protection of BM allografts in mice 16 . Treg-mediated immunotherapy may therefore be envisaged for clinical protocols in which administration of donor stem cells or BM is used to promote tolerance to e.g. kidney allografts. Treg administration may allow for induction of stable hematopoietic chimerism, not detected in the clinical protocols, and thus further improve results 15,25,26 . Importantly, our data demonstrate that once the administered Treg had induced tolerance, its maintenance no longer required the presence of these cells. Deletion of donor-specific T cells upon interaction with donor hematopoietic cells, as shown before also by others, probably plays an important role in this persistent, self-sustained, tolerance 27 . Whereas other mechanisms (e.g. clonal anergy, ref. 28) may also be involved, host Treg are not. In our experimental approach, skin grafts are placed after hosts accepted BM grafts. The hematopoietic chimerism alone is insufficient for full tolerance to the skin grafts, consistent with the literature 15 . Here we show that, in chimeras, administered Treg are not required for acceptance of skin grafts. However, after depletion of injected Treg, host Treg became critically involved in the prevention of skin allograft rejection. Despite the fact that they ! 14 rejected the skin grafts, recipients in which administered and host Treg were depleted did not reject the BM allograft. These data confirm that hematopoietic chimerism is insufficient for maintenance of tolerance to allogeneic skin in this model, and that Treg are required. More importantly, our data demonstrate that injected Treg had transferred their tolerogenic role to host Treg. Transmission of tolerogenic activity from one T-cell population to another one is known as “infectious tolerance” (reviewed in refs. 29,30). Allograft-tolerance can be induced by blockade of e.g. CD4 and CD8 co-receptors tolerance to a secondary host 33 31,32 . Treg from tolerant mice transferred . When the transferred donor T cells were subsequently + depleted, tolerance persisted, and it is thought that host Foxp3 Treg are involved 34 . Using a very different experimental system, we here directly show that administered Treg had + transferred their tolerogenic activity to host Treg. Differentiation of host Foxp3 Treg from - Foxp3 conventional T cells may occur, e.g. under influence of TGF-!, or depletion of essential amino acids, which is known to induce Foxp3 via inhibition of the mTOR pathway 38 35- . Alternatively, (thymus-derived) host Treg of appropriate specificity may expand. These issues merit further investigation. This is, to our knowledge, the very first demonstration that Treg can transfer their tolerogenic capacity to other Treg in hematopoietic chimeras in absence of other donortissue. This conclusion is consistent with data showing that hemagglutinin-specific Treg can induce Treg with the same specificity from responder T cells in vivo 37 . It strongly suggests the involvement of hematopoietic cells, probably dendritic cells, acting in secondary lymphoid organs. In any case, solid donor tissue is not required. + + Lastly, in previous reports it was shown that CD4 CD25 Foxp3 infectious transplantation tolerance 33,34 + Treg could mediate . This conclusion was based on adoptive transfer experiments, and the potential implication of other regulatory populations was not assessed. + By in vivo depleting only Foxp3 Treg we abolished development of tolerance to skin grafts. Potential other regulatory populations were therefore clearly insufficient for prevention of skin allograft rejection in our experimental model. ! 15 In conclusion, experimental Treg-mediated immunotherapy against acute and chronic rejection of skin allografts does not require persistence of administered Treg. A newly emerging host Treg population fully prevents chronic rejection. This mechanism allows for long term maintenance of tolerance. Administration of in vitro manipulated Treg for the treatment of e.g. graft-rejection or GvHD should turn out to be an attainable goal results indicate that thus induced tolerance should be self-perpetuating. ! 16 39 , and our Acknowledgements We thank Drs. Sylvie Guerder, Jean-Charles Guéry, and Olivier Joffre for critical reading of the manuscript, and Drs. Fatima-Ezzahra L'Faqihi-Olive and Valérie Duplan-Eche (Inserm U1043 flow-cytometry facility), the personnel of the Inserm US006 ANEXPLO/histology facility (Dr. Talal Al Saati, Florence Capilla, and Alain Marrot) and the personnel of the Inserm US006 ANEXPLO/CREFRE animal facility, in particular Maryline Calise, for expert technical assistance. This work was supported by institutional funds, the ‘Agence Nationale pour la Recherche’ (ANR-08-BLAN-0187), the ‘Région Midi-Pyrénées’ (08004389), and the “Agence de la Biomédecine” (2007). ! 17 Author contributions LP designed and performed experiments, analyzed results, and wrote the manuscript JYD performed experiments and analyzed results TS contributed transgenic mice PR and JVM designed experiments, analyzed the data, and wrote the manuscript The authors declare no competing financial interests. ! 18 References 1. Kahan BD. 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(B) Expression of CD25 vs. Foxp3-eGFP by purified DEREG Treg was analyzed before (left) and after (right) in vitro culture with donortype irradiated splenocytes as stimulators. Sublethally irradiated B6 wt mice were grafted with CBA BM under cover of (CBA x B6)F1-specific DEREG Treg. (C) Hematopoietic chimerism in + + PBMC and percentage of Foxp3-eGFP cells among CD4 T lymphocytes in (D, E) blood and (F) spleen, lymph node (LN), and BM was assessed at the indicated time points. Dot plots are representative of 4 experiments. Indicated are mean values ± SD (n!3, 4 independent experiments). (G) Four weeks after BM grafting, chimeric mice received (black bars), or not (white bars), two consecutive injections of diphtheria toxin (DTx). Percentage of Foxp3-eGFP + + cells among CD4 T lymphocytes was analyzed in spleen, lymph node (LN), BM, and PBMC. Indicated are mean values ± SD (n=5, 2 independent experiments). Figure 2: Administered Treg are dispensable for persistence of tolerance to BM allografts Sublethally irradiated B6 wt mice were grafted with CBA BM co-injected with DEREG or wt Treg in vitro cultured with (CBA x B6)F1 antigen-presenting cells. Treg depletion by diphtheria toxin (DTx) injection was performed one (A), two (B) or four (C) weeks after transplantation. Allograft survival was followed up to 100 days. Shown is the percentage of donor cells among PBMC, as assessed by flow-cytometry, mean values ± SD (n!5, 4 independent experiments). ! 23 Figure 3: BM allografts induce deletion of donor-specific T cells. Sublethally irradiated B6 mice were grafted with DBA/2 BM co-injected or not with Thy1.1 + Treg specific for DBA/2 antigens. Control syngeneic chimeras were realized by reconstituting sublethally irradiated B6 and DBA/2 mice with syngeneic BM. TCR-V!3, V!5, V!6-expressing + CD4 T cells are specific for superantigens presented in DBA/2, but not B6, mice. The + + percentage of V! cells among host CD4 T cells was assessed, by flow-cytometry, in spleen (A) and thymus (B) at the indicated time points after reconstitution. V!4-expressing T cells do not recognize superantigens in DBA/2 mice. Indicated are mean values ± SD (n"4, 4 independent experiments). ***p<0.001; **p<0.01; *p<0.05, ns, not significant, Student’s t-test. Figure 4: Host Treg are not required for persistence of BM tolerance Sublethally irradiated DEREG or wt mice were grafted with DBA/2 BM under cover of DEREG Treg in vitro cultured in presence of (B6 x DBA/2)F1 irradiated antigen presenting cells as stimulators. Treg depletion, by diphtheria toxin (DTx) injection, was performed one (A), two (B) or four (C) weeks after transplantation. BM allograft survival was assessed by flow-cytometry (illustrated in left-hand panels) up to 10 weeks by analyzing the percentage of allogeneic cells in PBMC (quantitative assessment in right-hand panels). Indicated are mean values ± SD (n"4, 4 independent experiments). ! 24 Figure 5: Upon depletion of administered Treg, host Treg are required for acceptance of skin allografts. (A-C) Sublethally irradiated wt B6 mice were grafted with DBA/2 BM under cover of DEREG or wt Treg specific for antigens expressed by (B6 x DBA/2)F1 antigen-presenting cells. Skin allografts were placed six weeks after BM grafting. Mice received (or not) diphtheria toxin (DTx) four or ten weeks after reconstitution, as indicated. Control mice were not injected with Treg at the time of BM transplantation. (A) Skin allograft survival was monitored daily by assessment of macroscopic signs of rejection. Graft-survival curves for indicated conditions (4 independent experiments). Representative macroscopic (B) and histologic (C) features of skins 100 days after transplantation. (HE, H&E; F4/80, immuno-histocheministry with antibody to the macrophage marker F4/80; Luna, Luna’s eosinophil stain) Scales represent 200µm for HE and F4/80 staining and 20µm for Luna staining. (D, E) Sublethally irradiated DEREG mice were grafted with DBA/2 BM under cover of DEREG Treg in vitro cultured in presence of (B6 x DBA/2)F1 stimulator cells. Injected Treg were depleted or not by diphtheria toxin (DTx) injection four weeks after BM grafting. DBA/2 Skin transplantation was performed two weeks later. Skin allograft survival was monitored daily. (D, left panel) Skin allograft survival during the 100-day observation period. (D, right panels) In toxin treated mice, rejection was macroscopically clearly visible (2 independent experiments). (E) Chimerism was analyzed in PBMC 2 days before skin transplantation and after rejection in toxin treated mice. ! 25 Cultured Treg 95.9 95.8 C 40 D 30 # of cells among CD4+ 8.6 Purified Treg 20 0 Foxp3-eGFP Foxp3-eGFP Foxp3-eGFP+ among CD4+ (%) 0 20 40 60 80 100 Time after BM graft (d) F E 12 DEREG Treg wt Treg 10 20 Spleen 16 LN 8 BM 12 4 8 4 0 0 20 40 60 80 100 0 28 42 70 Time after BM graft (d) Time after BM graft (d) PBMC G Foxp3-eGFP+ among CD4+ (%) B Donor cells in PBMC (%) DEREG CD4+ CD25 CD25 A 10 SPLEEN DTx 5 LN DTx 4 3 2 1 0 14d 42d 5.0 0.3 102 104 20 4 16 6 3 12 4 2 8 2 1 4 8 0 28 42 70 0 BM DTx 102 104 70d 0.0 102 104 Foxp3-eGFP PBMC DTx 3 2 DTx w/o DTx 1 0 0 28 42 70 28 42 70 28 42 70 Time after BM allograft (d) Figure 1: Administered Treg wane away with time. (A) DEREG splenocytes were analyzed by flow-cytometry. CD25 vs Foxp3-eGFP expression on electronically gated CD4+ cells. (B) Expression of CD25 vs. Foxp3-eGFP by purified DEREG Treg was analyzed before (left) and after (right) in vitro culture with donor-type irradiated splenocytes as stimulators. Sublethally irradiated B6 wt mice were grafted with CBA BM under cover of (CBA x B6)F1-specific DEREG Treg. (C) Hematopoietic chimerism in PBMC and percentage of Foxp3-eGFP+ cells among CD4+ T lymphocytes in (D, E) blood and (F) spleen, lymph node (LN), and BM was assessed at the indicated time points. Dot plots are representative of 4 experiments. Indicated are mean values ± SD (n!3, 4 independent experiments). (G) Four weeks after BM grafting, chimeric mice received (black bars), or not (white bars), two consecutive injections of diphtheria toxin (DTx). Percentage of Foxp3-eGFP+ cells among CD4+ T lymphocytes was analyzed in spleen, lymph node (LN), BM, and PBMC. Indicated are mean values ± SD (n=5, 2 independent experiments). Fig.1 Donor cells in PBMC (%) A B C 40 DTx @ 1w 30 50 DTx @ 2w 50 DTx @ 4w 40 40 30 30 20 20 20 10 10 10 0 0 0 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 Time after BM graft (d) Time after BM allograft (d) Time after BM graft (d) DEREG Treg + DTx DEREG Treg wt Treg+ DTx wt Treg Figure 2: Administered Treg are dispensable for persistence of tolerance to BM allografts. Sublethally irradiated B6 wt mice were grafted with CBA BM co-injected with DEREG or wt Treg in vitro cultured with (CBA x B6)F1 antigen-presenting cells. Treg depletion by diphtheria toxin (DTx) injection was performed one (A), two (B) or four (C) weeks after transplantation. Allograft survival was followed up to 100 days. Shown is the percentage of donor cells among PBMC, as assessed by flow-cytometry, mean values ± SD (n!5, 4 independent experiments). Fig.2 A B Vß4+ (% of CD4+) Vß6+ (% of CD4+) Vß5+ (% of CD4+) Vß3+ (% of CD4+) SPLEEN 8 4 *** 0 8 ********* *** ns *** 4 *** * ns *** 8 4 ********* *** ns 8 4 0 2 1 0 8 6 4 0 * * 12 0 12 3 *** 4 0 4 8 12 16 20 24 28 Time after grafting (d) B6 ! B6 DBA/2 ! DBA/2 THYMUS ns *ns *** *** *** ns ***14** *** ns ns 2 0 ns 10 14 ns 8 *** * *** *** 6 4 2 0 14 28 10 8 6 4 2 0 14 28 Time after grafting (d) DBA/2 ! B6 DBA/2 + Treg ! B6 Figure 3: BM allograft induces deletion of donor-specific T cells. Sublethally irradiated B6 mice were grafted with DBA/2 BM co-injected or not with Thy1.1+ Treg specific for DBA/2 antigens. Control syngeneic chimeras were realized by reconstituting sublethally irradiated B6 and DBA/2 mice with syngeneic BM. TCR-V"3, V"5, V"6-expressing CD4+ T cells are specific for superantigens presented in DBA/2, but not B6, mice. The percentage of V"+ cells among host CD4+ T cells was assessed, by flow-cytometry, in spleen (A) and thymus (B) at the indicated time points after reconstitution. V"4-expressing T cells do not recognize superantigens in DBA/2 mice. Indicated are mean values ± SD (n#4, 4 independent experiments). ***p<0.001; **p<0.01; *p<0.05, ns, not significant, Student!s t-test. Fig.3 97 100 Donor cells in PBMC (%) DEREG Host + DTx @ 1w H2Kb A 0 H2Kd 25 35 62 H2Kd DTx @ 2w 75 50 25 0 DTx @ 4w 100 Donor cells in PBMC (%) H2Kb C 25 100 71 H2Kd DEREG Host + DTx @ 4w 50 0 Donor cells in PBMC (%) DEREG Host + DTx @ 2w H2Kb B DTx @ 1w 75 75 50 25 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Time after graft (d) DEREG Host + DTx DEREG Host wt Host + DTx wt Host Figure 4: Host Treg are not required for persistence of BM tolerance Sublethally irradiated DEREG or wt mice were grafted with DBA/2 BM under cover of DEREG Treg in vitro cultured in presence of (B6 x DBA/2)F1 irradiated antigen presenting cells as stimulators. Treg depletion, by diphtheria toxin (DTx) injection, was performed one (A), two (B) or four (C) weeks after transplantation. BM allograft survival was assessed by flow-cytometry (illustrated in left-hand panels) up to 10 weeks by analyzing the percentage of allogeneic cells in PBMC (quantitative assessment in righthand panels). Indicated are mean values ± SD (n!4, 4 independent experiments). Fig.4 Graft survival (%) A B 100 Graft survival (%) DTx @ 10w C HE F4/80 Luna DEREG Treg (n=6) wt Treg (n=9) 75 50 25 0 w/o Treg (n=3) 0 20 40 60 80 100 100 75 DEREG Treg (n=11) wt Treg (n=9) 50 25 0 Graft survival (%) w/o Treg (n=3) 0 100 w/o DTx 20 40 60 80 100 DEREG Treg (n=8) wt Treg (n=18) 75 50 25 0 w/o Treg (n=3) 0 20 40 60 80 100 Time after skin graft (d) w/o DTx graft survival (%) D 100 75 w/o DTx (n=5) 50 25 0 DTx @ 4w E 100 Donor cells in PBMC (%) DTx @ 4w 75 50 25 DTx @ 4w (n=5) 0 20 40 60 80 100 Time after skin graft (d) 0 Before After skin skin graft rejection Figure 5: Upon depletion of administered Treg, host Treg are required for acceptance of skin allografts. (A-C) Sublethally irradiated wt B6 mice were grafted with DBA/2 BM under cover of DEREG or wt Treg specific for antigens expressed by (B6 x DBA/2)F1 antigen-presenting cells. Skin allografts were placed six weeks after BM grafting. Mice received (or not) diphtheria toxin (DTx) four or ten weeks after reconstitution, as indicated. Control mice were not injected with Treg at the time of BM transplantation. (A) Skin allograft survival was monitored daily by assessment of macroscopic signs of rejection. Graftsurvival curves for indicated conditions (4 independent experiments). Representative macroscopic (B) and histologic (C) features of skins 100 days after transplantation. (HE, H&E; F4/80, immunohistocheministry with antibody to the macrophage marker F4/80; Luna, Luna!s eosinophil stain). Scale represents 200µm for HE and F4/80 staining and 20µm for Luna staining. (D, E) Sublethally irradiated DEREG mice were grafted with DBA/2 BM under cover of DEREG Treg in vitro cultured in presence of (B6 x DBA/2)F1 stimulator cells. Injected Treg were depleted or not by diphtheria toxin (DTx) injection four weeks after BM grafting. DBA/2 Skin transplantation was performed two weeks later. Skin allograft survival was monitored daily. (D, left panel) Skin allograft survival during the 100-day observation period. (D, right panels) In toxin treated mice, rejection was macroscopically clearly visible (2 independent experiments). (E) Chimerism was analyzed in PBMC 2 days before skin transplantation and after rejection in toxin treated mice. Fig.5 RESU LTATS PRELIMINAIRES 100 La persistance de la tolérance à une allogreffe de moelle osseuse induite par les Treg n’inhibe pas la mise en place d’une réponse CD4 efficace. INTRODUCTION La greffe d’organe permettant de remplacer un organe lésé et non fonctionnel par un organe sain est l’un des défis de la médecine prolongeant la vie de nombreux patients. Afin d’inhiber le rejet de l’organe par le système immunitaire du receveur, les patients greffés sont traités par des combinaisons de drogues immunosuppressives. Cependant, bien qu’efficaces, ces drogues inhibent le système immunitaire de l’hôte dans sa globalité augmentant chez les patients les risques d’infections opportunistes, de réapparition d’infections chroniques latentes et de survenues de cancers. Il est donc crucial de développer des thérapies qui induisent une inhibition spécifique des réponses dirigées contre l’organe greffé. Nous avons développé une thérapie à base de lymphocytes T régulateurs issus de l’hôte et amplifiés ex vivo au contact de cellules présentatrices de l’antigène du donneur. Ces cellules co-injectées avec une allogreffe de moelle osseuse inhibent le rejet de la greffe et protègent également des allogreffes des peaux ou de cœur de même donneur réalisées par la suite 213, 375 . Dans ce modèle les Treg injectés protègent spécifiquement la greffe de même souche que les CPA ayant servit à leur amplification. Nous avons par la suite montré que la tolérance induite par l’injection de Treg amplifiés ex vivo et spécifiques du donneur passe par des mécanismes de délétion (centrale et périphérique) des cellules de l’hôte allospécifiques et par des mécanismes d’induction de nouveaux Treg (manuscrit soumis). Les modifications cellulaires observées dans le compartiment hématopoïétique de l’hôte conduisent à s’interroger sur les capacités des animaux acceptant une greffe à mettre en place une réponse immunitaire efficace contre un pathogène conduisant à son élimination. En parallèle, il est important que cette réponse n’endommage pas la greffe par une rupture de la tolérance préalablement induite. Afin de répondre à cette question nous avons utilisé un modèle d’immunisation des animaux greffés sous contrôle de Treg, permettant d’évaluer la capacité de réponse des cellules CD4 chez ces animaux. 101 MATERIELS ET METHODES Animaux Les animaux sont issus du centre de Recherche et d’élevage Janvier (Le Genest St Isle, France) et ont été utilisés entre 6 et 10 semaines. Toutes les expérimentations ont été réalisées en accord avec la loi et les directives institutionnelles (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Inserm) et ont été approuvées par le comité éthique local (MidiPyrénées, France) Anticorps Des anticorps avec les spécificités suivantes ont été utilisés pour les analyses et la purification des Treg : anti-H-2Kb (AF6-88.5) couplé FITC ou biotine ; anti-H-2Kd (SF1-1.1) couplé PE ; anti-CD3 couplé pacific orange (500 A2) (BD Bioscience, Heidelberg, Germany) ; anti-CD4 couplé PE-Cy7 (GK1.5) ; anti-CD25 couplé PE (PC61.5) ; anti-B220 couplé APC (RA3-6B2) ; anti-panNK couplé FITC (DX5) (eBioscience, San Diego, CA). Les anticorps de surnageant d’hybridomes anti-Fc%RII/III (2.4G2), anti-CD8 (53.6.7), anti-CMHII (M5/114.15.2) et anti-Thy1.2 (AT83) ont été produits dans notre laboratoire. Purification des Treg CD4+CD25+ : Les splénocytes CD4+CD25+ ont été purifiés et cultivés en présence de splénocytes irradiés au Cs137 comme décrit précédemment 375 . Brièvement, Après déplétion des érythrocytes (Lympholyte-M, Cedarlane Laboratories, Hornby, ON, Canada), les splénocytes sont été enrichis en cellules CD4+ par incubation avec un cocktail d’anticorps monoclonaux anti-CD8 (53.6.7), Fc%RII/III (2.4G2), et anti-CMH de classe II (M5), suivie par une déplétion magnétique par des billes liées à des anticorps de mouton anti-rat (Dynal Biotech, Oslo, Norway). La population ainsi obtenue est marquée par un anticorps anti-CD25 couplé PE (PC61) et les cellules CD4+CD25+ ont été enrichies sélection positive sur colonne magnétique grâce à des microbilles anti-PE (Miltenyi Biotec, Paris, France). La pureté cellulaire a été vérifiée par cytométrie en flux sur un FACSCalibur (BD Bioscience, San Jose, CA) par marquage avec un anticorps anti-CD4 couplé PE-Cy7 (GK1.5). La population CD4+CD25+ ainsi obtenue est en routine pure à plus de 95%. 102 Culture in vitro de cellules CD4+CD25+ : Les cellules CD4+CD25+ (2x103/ puits, 100!L) issus de souris B6, CBA ou DBA/2 ont été cultivées en présence de 5x 107 spenocytes irradiées de souris DBA/2, B6 ou CBA.en plaques 96 puits à fond rond pendant 14 jours. Les cellules ont été cultivées en milieu RPMI 1640 (Eurobio, Les Ulis, France) supplémenté avec 10% de Sérum de veau fœtal, 2mM de LGlutamine, penicilline, Streptomycin, 10mM d’HEPES, 1mM de sodium Pyruvate et 100 U/mL d’IL-2 (surnageant d’hybridome EL4.IL-2 stimulée à l’acétate de Phorbl Myristate (PMA), American Type Culture Collection [ATCC], Manassas, VA). Apr ès 7 jours de culture, 100!L de milieu frais ont été ajoutéet les cellules cultivées durant 7 jours upplémentaires. Greffe de moelle osseuse : La moelle osseuse est collectée des fémurs et tibias en milieu RPMI (invitrogen, Paisley, UK) supplémenté avec 10% de SVF, 2mM de L-Glutamine, de pénicilline, et de Streptomycine. La suspension cellulaire a été lavée en milieu complet. Les cellules Thy1.1+ ont été éliminées en utilisant un anticorps AT83 et du complément de lapin (Saxon Europe, Suffolk, UK). 107 cellules du donneur ont été injectées en intra veineuse dans un hôte irradié sous létalament à 5 Gy (Source 137Cs) et ont été maintenues sous antibiotique (0,4% de Bactrim suspension pédiatrique ; Roche, Basel, Suisse) placé dans l’eau de boisson durant les trois premières semaines de l’expérience. 2x106 Treg ont été co-injectés avec les cellules de moelle osseuse Analyse de la reconstitution hématopoïétique: La reconstitution hématopoïétique a été évaluée par analyse des cellules du sang périphérique avant et sept jours après immunisation. Après lyse des érythrocytes, les cellules ont été resuspendues dans du surnageant d’hybridome 2.4G2 puis avec les anticorps suivant en concentration saturante. Le chimérisme hématopoïétique a été analysé avec des anticorps anti-H-2Kd-PE ou anti-H-2Kk-PE en combinaison avec des anticorps anti-H-2Kb-FITC. Immunisation : KLH : L’évaluation de la capacité de réponse des cellules CD4 a été évaluée par immunisation des chimères avec 75!g de KLH (Keyhole limpet hemocyanine) (Sigma aldrich, St Quentin Fallavier, France) émulsionné au polytron dans de l’adjuvant complet de Freund (CFA) (Sigma aldrich, St Quentin Fallavier, France) et du PBS (Invitrogen, Paisley, 103 United Kingdom) en concentration 1/1. Les souris ont été immunisée avec 200!L de cette émulsion en sous-cutanée répartie à la base du cou, la base de la queue et dans la voûte plantaire. Purification des lymphocytes CD à partir des nœuds lymphatiques 7 jours après immunisation, les cellules CD4 ont été purifiées à partir nœuds lymphatiques poplités, inguinaux, axillaires, mésentériques, para-aortiques, et sousmaxilaires. les cellules sont été enrichis en cellules CD4+ par incubation avec un cocktail d’anticorps monoclonaux anti-CD8 (53.6.7), Fc%RII/III (2.4G2), et anti-CMH de classe II (M5), suivie par une déplétion magnétique par des billes liées à des anticorps de mouton antirat (Dynal Biotech, Oslo, Norway). La population ainsi obtenue est marquée par un anticorps anti-CD4 couplé FITC (GK1.5) et les cellules CD4+ ont été enrichies par sélection positive sur colonne magnétique grâce à des microbilles anti-FITC (Miltenyi Biotec, Paris, France). La pureté cellulaire a été vérifiée par cytométrie en flux sur un FACSCalibur (BD Bioscience, San Jose, CA). La population CD4+ ainsi obtenue est en routine pure à plus de 95%. Test de prolifération à la thymidine tritiée 105 CD4 ont été mis en culture en présence de 4.105 CPA allogéniques ou syngéniques (splénocytes irradiées 1750rad au Cs137) en présence de concentrations décroissantes de KLH en plaques 96 puits à fond plat. L’analyse de la prolifération des CD4 a été évaluée par ajout de 1!Ci de thymidine tritiée 3 jours après mise en culture et incubation de 16 à 18h à 37°C 5% de CO2. L’incorporation de la thymidine a été analysée à l’aide d’un harvester (…) et d’un lecteur de plaque (…) 104 RESULTATS Les cellules du donneur reconstituent l’ensemble des lignages lymphocytaires Tout d’abord nous avons évalué la reconstitution de l’ensemble des lignages lymphocytaires par les cellules souches du donneur. Des souris B6 ont été irradiées souslétalement et greffées avec de la moelle osseuse DBA/2 sous contrôle de Treg. 15 ou 21 semaines après reconstitution, une analyse en cytométrie de flux des différents lignages lymphocytaires a été réalisée dans la rate. Nous avons analysé les proportions de cellules B, NK, NKT, CD3+, CD8+ et CD4+ parmi les cellules de l’hôte (H-2Kb+) et du donneur (H-2Kb-) comme illustré dans la figure 1a. Nous observons de façon surprenante que le pourcentage de cellules du donneur représente à plus de 90% des lymphocytes B alors que cette population représente 20% des cellules hématopoïétiques de l’hôte (Fig.1b). L’ensemble des autres lignages hématopoïétiques (CD4, CD8, NKT) se développe en grande majorité à partir des cellules souches de l’hôte. Une autre façon de présenter ces résultats est d’analyser le pourcentage de cellules issues du donneur (H-2Kb-) ou de l’hôte (H-2Kb+) parmi les différents lignages, comme illustré en figure 1c. Nous observons clairement que les cellules souches du donneur assurent la reconstitution des lignages B et NK mais très discrètement celle des lignages CD4 et CD8, provenant eux à plus de 90% des cellules souches de l’hôte (Fig 1d). Ainsi malgré le fait que les cellules souches du donneur aient la capacité de reconstituer l’ensemble des lignages lymphocytaires, cette reconstitution n’est pas équivalente entre les différents lignages. La tolérance établie envers une allogreffe de moelle osseuse est conservée après l’immunisation. Nous avons dans un premier temps voulu analyser la persistance suite à l’immunisation de la tolérance établie envers une allogreffe de moelle osseuse. Des souris B6 et DBA/2 ont été irradiées sous létalement et greffées avec de la moelle osseuse allogénique, respectivement DBA/2 et B6 sous contrôles de Treg amplifiés ex vivo. 6 semaines après reconstitution, les animaux alors chimériques ont été immunisés en sous–cutanée avec un protéine étrangère : la KLH (Keyhole limpet hemocyanine) émulsionnée en adjuvant complet de Freund (CFA). Cette protéine, est capturée par les cellules dendritiques, apprêtée et présentée via la voie endosomale sur les molécules de CMH-II conduisant à l’activation des CD4. 105 Le niveau de chimérisme hématopoïétique a été analysé dans le sang 1 jour avant et 7 jours après immunisation (Figure 2) par quantification du pourcentage de cellules exprimant les molécules de CMH-I de l’hôte (H-2Kb) ou du donneur (H-2Kd). Les molécules du CMH étant exprimées sur l’ensemble des cellules nucléées de l’organisme cette analyse permet une bonne évaluation du chimérisme réel. Lors de l’immunisation, toutes des souris greffées avaient accepté la greffe de moelle osseuse allogénique. L’analyse du chimérisme sept jours après immunisation ne révèle pas d’élimination de la greffe même chez les animaux ne possédant initialement qu’un très faible taux de chimérisme. Ainsi malgré l’apport d’une protéine immunogène et une forte stimulation des TCR par le CFA, la tolérance induite envers la greffe de moelle osseuse par les Treg injectés est conservée. Les cellules CD4+ des animaux greffés sont activées au contact d’une protéine étrangère. N’observant pas de rejet de la greffe de moelle osseuse après immunisation par la KLH, nous avons souhaité évaluer l’immunocompétence des chimères. Dans ce modèle, nous avons évalué la capacité d’activation des cellules CD4+ par analyse de leur prolifération. Des souris B6 et DBA/2 irradiées sous-létalement ont été reconstituées avec de la moelle osseuse allogénique (respectivement DBA/2 et B6) sous contrôle de lymphocytes T régulateurs amplifiés ex vivo au contact de CPA du donneur. Des chimères syngéniques ont été utilisées comme contrôles (B6#B6 et DBA/2#DBA/2). Les animaux ont été immunisés avec la KLH suspendue en CFA six semaines après reconstitution par la moelle osseuse. Sept jours après immunisation par la KLH, les cellules CD4 ont été isolées à partir de divers nœuds lymphatiques. Les CD4 alors obtenues ont été co-cultivées avec des CPA allogéniques ou syngéniques en présence de concentrations croissantes de KLH pendant 3 jours. L’activation des cellules CD4 a été évaluée par mesure de l’incorporation de thymidine tritiée. Dans un premier temps, les CD4 de chimères syngéniques B6#B6 co-cultivées avec des CPA B6 répondent de façon dépendante de la dose de KLH et plus fortement que les cellules issues de chimères syngéniques DBA/2#DBA/2 (Fig.3a). De la même façon, les CD4 des chimères DBA/2#DBA/2 répondent plus fortement à la présentation de la KLH présenté par des CPA DBA/2 que par des CPA B6 (Fig. 3b). L’utilisation des CPA B6 comme stimulatrices conduit à une prolifération des CD4 issues des chimères allogéniques DBA/2#B6 de façon dépendante de la dose de KLH. La réponse des CD4 issues des chimères est donc spécifique de la protéine immunogène. De plus, cette réponse est plus élevée que celle des CD4 issues des chimères B6#DBA/2 (Fig.3a). 106 Les mêmes résultats sont obtenus dans la combinaison inverse de stimulation des CD4 des chimères B6# DBA/2 par des CPA DBA/2 (Fig.3b). Ainsi, il apparaît que les CD4 purifiés à partir de souris chimériques tolérantes envers une allogreffe de moelle osseuse ont la capacité d’induire ex vivo une réponse immunitaire spécifique du pathogène et que cette réponse est d’autant plus efficace que l’antigène est présenté dans le contexte du CMH de l’hôte. DISCUSSION Au delà de l’importance de réussir à induire une tolérance stable à une allogreffe, la mise en place d’un protocole qui permettrait aux patients de conserver en même temps des capacités immunitaires efficaces contre les pathogènes est tout aussi centrale. Avec ce travail, nous avons montré que les animaux acceptant une greffe de moelle osseuse ne rejettent pas la greffe suite à une immunisation par une protéine immunogène. De plus, cette persistance de la tolérance n’est pas liée à une absence de réponse des cellules CD4 qui répondent de façon dose dépendante à la protéine. Enfin nous avons montré que les cellules souches du donneur ont la capacité des reconstituer l’ensemble des lignages hématopoïétiques malgré une propension en faveur des lignages B et NK. Ainsi dans notre modèle d’irradiation sous létale des receveurs reconstitués avec de la moelle osseuse uniquement allogénique, on constate que la greffe reconstitue préférentiellement les lignages dont le développement se fait dans la moelle osseuse alors que les lignages qui ont un développement thymique sont principalement issus de l’hôte. Ceci peut s’expliquer par le fait que nous réalisons une irradiation sous létale qui libère de la place en périphérie favorisant l’expansion homéostatique des LT résiduels de l’hôte réduisant les possibilité de reconstitution par les cellules du donneur. Les Treg utilisés dans ce protocole d’induction de tolérance inhibent les réponses dirigées contre les alloantigènes qu’ils soient majeurs ou mineurs. L’apport d’une protéine immunogène et de CFA, stimulant les TLR, pourrait par réactivité croisée conduire à l’activation de cellules spécifiques du donneur qui échapperaient alors au contrôle exerçé par les Treg. Or nous n’avons pas observé de rejet de la greffe de moelle osseuse une semaine après immunisation. Ces résultats indiquent les Treg injectés inhibent spécifiquement les réponses dirigées contre la greffe. Nous avons également observé que les CD4 réagissent plus fortement lorsque la protéine immunogène est présentée dans le contexte du CMH du soi plutôt que dans celui du 107 donneur. Ceci peut s’expliquer par les mécanismes de sélection positive dans le thymus 16 . L’ensemble des cellules CD4 qu’elles soient issues de l’hôte ou du donneur subissent des étapes de sélection positive dans le thymus. Cette sélection à pour but de ne conserver que les cellules « utiles » pour l’organisme et qui sont donc capables de reconnaître avec une affinité adéquate les molécules de CMH-II qui leurs sont présentés par les cellules épithéliales corticale (cTEC). Ainsi la reconnaissance de l’antigène par les LT libérés en périphérie est principalement restreinte par les molécules de CMH de l’hôte. De ce fait, bien que le chimérisme hématopoïétique soit fréquemment assez élevé, la réponse à un antigène sera plus importante si celui-ci est présenté dans le contexte du CMH de l’hôte. Ces résultats révèlent aussi que les CD4 ont la capacité d’être activées de façon spécifiques par les CPA du donneur, puisque la réponse apparaît dépendante de la dose de KLH. Cette observation laisse entrevoir qu’en cas d’infection des cellules de la greffe, le système immunitaire du receveur serait apte à la protéger. De ce fait, il serait important d’identifier si les DC sont majoritairement issues de l’hôte ou du donneur Enfin, nous savons que les Treg injectés ne sont pas nécessaires au maintien de la greffe de moelle osseuse. Il est donc important de réaliser la même analyse dans un modèle dans lequel les Treg jouent un rôle primordial comme dans le cas des greffes de peau. 108 Figure 1 : La greffe de moelle osseuse allogénique reconstitue l’ensemble des lignages lymphocytaires. Des souris B6 ont été irradiées sous-létalement et reconstituées avec de la moelle osseuse DBA/2 sous contrôles de lymphocytes T régulateurs cultivés avec des CPA B6D2F1. Vingt et une semaines après la greffe, la reconstitution des différents lignages lymphocytaires a été évaluée dans la rate. (A et B)- Pourcentage de cellules de chaque lignage parmi les cellules de l’hôte et du donneur. (C et D)- Pourcentage de cellules de l’hôte ou du donneur parmi chaque lignage. (2 expériences, n=5 ± SD) 109 Figure 2 : L’immunisation ne rompt pas la tolérance induite envers une allogreffe de moelle osseuse. Des souris B6 ou DBA/2 ont été irradiées sous-létalement et reconstituées respectivement avec des cellules de moelle osseuse DBA/2 ou B6 sous contrôle de lymphocytes T régulateurs. Six semaines apres la greffe, les souris ont été immunisées en sous-cutanée avec de la KLH. Le chimérisme hématopoïétique a été analysée un jour avant et sept jours après l’immunisation. (3 expériences indépendantes, n=12) 110 Figure 3 : Les CD4 des chimères s’activent au contact d’un antigène exogène. Des souris B6 ou DBA/2 ont été irradiées sous-létalement et reconstituées respectivement avec des cellules de moelle osseuse DBA/2 ou B6 sous contrôle de lymphocytes T régulateurs. Des chimères syngéniques ont été réalisées comme contrôles. Six semaines après la greffe, les souris ont été immunisées en sous-cutanée avec de la KLH. Une semaine après l’immunisation, les cellules CD4+ ont été isolées à partir des noeuds lymphatiques et restimulées in vitro avec des cellules présentatrices B6 (A) ou DBA/2 (B) en présence de concentrations croissantes de KLH. La prolifération des cellules a été évaluée par mesure de l’incorporation de thymidine tritiée. Les courbes représentent la différence entre la mesure à un point donné par rapport à la mesure sans KLH ()cpm). (3 expériences indépendantes, n=12 ± SEM) 111 DISCUSSION 112 La réussite de la transplantation d’organe est un but recherché en médecine depuis plusieurs siècles. Bien que les progrès de la chirurgie aient permis d’améliorer l’intégrité des greffons, leur rejet n’a vraiment pu être contrôlé que suite à l’identification des mécanismes permettant à l’organisme de discriminer le soi du non-soi. Ainsi l’identification des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité et des groupes sanguins a permis de réduire le pourcentage des rejets observés par simple typage des compatibilités entre donneurs et receveurs. L’identification des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le rejet de greffe a permis le développement, par les industries pharmaceutiques, de molécules immunosuppressives qui ont grandement augmenté la survie et le confort des patients. Ces drogues ont cependant une efficacité relative puisqu’elles n’inhibent que le rejet aigu mais n’ont que peu, voire pas d’effet sur le rejet chronique. De plus, leur utilisation est associée à des effets secondaires majeurs telle l’augmentation de la sensibilité aux infections opportunistes et la survenue ou réactivation de tumeur s’ajoutant à une toxicité importante pour divers organes. Enfin la découverte des mécanismes centraux et périphériques de tolérance au soi a permis des avancés majeurs dans le domaine de la transplantation. De façon primordiale, les expériences de Billingham concernant l’induction de tolérance envers une allogreffe chez des nouveaux-nés ont instillé l’hypothèse qu’une manipulation du système immunitaire était possible. La découverte des lymphocytes T régulateurs et de l’ampleur de leurs capacités suppressives dans des pathologies aussi différentes que l’auto-immunité ou l’inflammation ont permis d’envisager leur utilisation thérapeutique. Le rôle des Treg dans la tolérance foetomaternelle et l’observation que la déplétion des cellules CD25+ exacerbe les réponses allogéniques de l’hôte mais aussi du greffon dans les cas de GvHD ont conduit plusieurs équipes à utiliser les cellules régulatrices pour contrôler le rejet de greffe. 113 I- Mécanismes d’induction de tolérance suite à une immunothérapie par les Treg Les protocoles de thérapies cellulaires basés sur l’utilisation des Treg visent soit à transférer des Treg amplifiés ex vivo soit à amplifier in vivo les Treg du receveur. Dans le premier cas, condition qui est utilisée dans notre équipe, la question de l’implication à long terme des Treg injectés dans le maintien de la tolérance était primordiale afin de comprendre les mécanismes mis en place. Nous avions préalablement observé que le nombre de Treg injectés, identifiés par l’expression de marqueurs congéniques différents de l’hôte, était réduit au cours du temps jusqu'à devenir quasiment indétectable dans le sang et les organes lymphoïdes environ 10 semaines après la greffe de moelle osseuse. Nous avons donc souhaité contrôler ce phénomène et en étudier les effets sur le maintien de la tolérance. En effet, le fait que les Treg injectés soient quasiment indétectables dans ces compartiments ne signifie pas qu’ils aient totalement disparu. Ils pourraient être localisés directement dans la greffe où, même en très petit nombre, ils pourraient avoir des effets sur la tolérance. 1- Le modèle DEREG Nous avons donc utilisé un modèle de souris transgéniques nous permettant d’identifier et d’éliminer spécifiquement les Treg injectés. Ces souris transgéniques nommées DEREG, pour « Depletion of regulatory T cell », expriment, sous forme de protéine de fusion, la GFP et le récepteur à la toxine diphtérique (DTR) sous contrôle du promoteur de Foxp3. Ainsi comme décrit par l’équipe de Sparwasser 107, l’injection de la toxine diphtérique (DTx) chez les nouveaux-nés conduit à une déplétion de plus de 90% des Treg de l’animal qui développe alors les symptômes du syndrome scurfy observés chez les animaux déficients en Foxp3. Nous avons purifié les Treg des souris DEREG sur la base de l’expression de CD4 et d’une expression élevée de CD25. Nous avons obtenu une pureté en cellules CD25+FoxP3+ de plus de 95%. Principalement, plus de 99% des cellules CD25+ expriment Foxp3-GFP. Ce pourcentage de pureté est conservé après les 14 jours de culture avec des CPA allogéniques. Nous avons montré que les Treg DEREG sont aussi efficaces que les Treg sauvages à induire une tolérance à une allogreffe de moelle osseuse puis une allogreffe de peau. Nous 114 avons alors testé l’efficacité de la déplétion des Treg DEREG par injections de DTx. Les résultats de l’équipe de Sparwasser montrant une déplétion de seulement 90% des Treg de l’hôte indiquent que la déplétion par la DTx pourrait ne pas être complète dans notre modèle et qu’un petit nombre de Treg résiduels pourrait persister puis proliférer. Nous avons montré que la dose totale de 3!g de DTx élimine complètement les cellules Foxp3-GFP+ injectées que l’on ne détecte plus une semaine après l’injection. Ce résultat, combiné au fait que nous obtenions après purification plus de 99% de cellules Foxp3-GFP+ parmi les 95% de cellules CD25+ purifiées, suggère que la toxine élimine la totalité des Treg injectés. Principalement, nous n’avons observé aucune réapparition de cellules Foxp3-GFP plus de 40 jours après la déplétion, validant ainsi notre modèle. 2- Cinétique d’action des Treg. Nous avons alors éliminé les Treg DEREG à différents temps après la greffe de moelle osseuse afin d’évaluer leur implication dans la tolérance à long terme. Comme attendu, nous avons observé que l’élimination des Treg seulement sept jours après la greffe de moelle osseuse conduit à un rejet rapide et total de la greffe. À l’inverse, l’injection de toxine chez les animaux ayant reçu des Treg sauvages insensibles à la toxine, ne conduit pas au rejet de la greffe. Ces résultats indiquent l’absolue nécessité des Treg, dans les premiers jours qui suivent la greffe, pour l’établissement de la tolérance. De plus, ceci confirme la déplétion efficace des Treg injectés. Nous avons testé l’impact d’une déplétion des Treg, deux et quatre semaines après la greffe et nous avons constaté de façon surprenante que dans les deux cas, la greffe de moelle osseuse reste protégée sur plus de 100 jours. En effet, un taux similaire de chimérisme a été observé entre les souris greffées sous contrôle de Treg DEREG ou sauvages et ayant reçu une injection de toxine ou pas. L’ensemble de ces résultats indiquent que la suppression appliquée par les Treg sur les cellules alloréactives de l’hôte est indispensable durant les premiers jours suivant la greffe mais que durant la deuxième semaine des mécanismes complémentaires de maintien de la tolérance prennent le relais. Nous avons par la suite testé l’importance de la survie des Treg dans le modèle très immunogène de greffe de peau. Ces greffes ont été réalisées sur des souris ayant préalablement reçu et accepté une greffe de moelle osseuse indispensable à la mise en place 115 d’une tolérance envers une allogreffe de peau ou de cœur dans notre modèle 213 . En effet, nous avons montré dans des travaux précédents que la protection d’une greffe de cœur par les Treg est impossible sans greffe de moelle osseuse préalable. Ceci est probablement dû non pas à un défaut d’action des Treg mais à une survie trop brève de ces cellules. Les Treg ayant besoin de rencontrer leur antigène spécifique pour survivre en périphérie 128 , il est probable qu’une greffe de cœur ou de peau n’apporte pas les antigènes suffisants ou ne les met pas assez à disposition des Treg pour que ceux-ci survivent assez longtemps pour protéger les allogreffes d’organes. Nous avons réalisé des greffes de peaux allogéniques sur des souris ayant reçu six semaines plus tôt une greffe de moelle osseuse de même donneur sous contrôle de Treg DEREG spécifiques de la voie indirecte d’alloreconnaissance. Les Treg DEREG ont été éliminés deux semaines avant ou quatre semaines après la greffe de peau. Nous n’avons, dans les deux cas, observé aucun signe macroscopique de rejet durant les 100 jours de suivi. Ceci est en adéquation avec les nombreuses expériences démontrant que l’induction d’un chimérisme hématopoïétique peut à lui seul induire une tolérance à une allogreffe d’organe 435 . Cependant dans ces études, l’analyse d’un rejet chronique de l’organe n’a que très rarement été effectuée. Les quelques analyses histologiques recensées révèlent alors des signes microscopiques de rejet chronique (fibrose du tissu, épaississement des vaisseaux sanguins, infiltration de cellules immunitaires) 343. Pareillement, nos propres résultats publiés précédemment démontrent clairement l’importance capitale de la spécificité des Treg injectés sur l’inhibition du rejet chronique de greffe de peau, même en présence d’un chimérisme hématopoïétique stable et élevé. En effet, l’injection de Treg amplifiés ex vivo au contact de CPA présentant les alloantigènes uniquement par la voie directe d’alloreconnaissance, inhibe le rejet aigu mais pas le rejet chronique qui est caractérisé principalement par un infiltrat massif d’éosinophiles 378 . À l’inverse, des Treg amplifiés au contact de CPA (hôte x donneur)F1, qui présentent les alloantigènes par les voies directe et indirecte inhibent l’ensemble des rejets aigu et chronique. Ainsi par ce modèle nous avons montré que le chimérisme hématopoïétique seul n’est pas suffisant pour induire une tolérance stable et durable envers une greffe d’organe. Ainsi, bien que dans notre modèle les Treg injectés soient spécifiques de la voie indirecte d’alloreconnaissance, nous avions émis l’hypothèse que leur totale déplétion conduirait à un rejet chronique de la greffe qui ne pourrait pas être contrôlé par le seul chimérisme. De ce fait, nous avons été surpris de constater, lors de l’analyse histologique des greffes de peau, que les greffons ne présentaient, 100 jours après la greffe, aucun signe 116 microscopique de rejet chronique, laissant supposer dans ce cas également, la mise en place de mécanismes de tolérance complémentaires Plusieurs hypothèses pouvaient être envisagées. D’une part, la réalisation d’une greffe de moelle osseuse permettant la mise en place d’un chimérisme hématopoïétiques est connu pour induire la délétion des clones T spécifiques des antigènes de l’allogreffes 436 325 . Une autre possibilité serait l’induction de nouvelles cellules régulatrices capables d’inhiber spécifiquement le rejet de la greffe. Nous avons donc évalué ces deux possibilités. 3- Délétion clonale. Les mécanismes de sélection négative ayant lieu dans le thymus visent à limiter la libération en périphérie de clones T possédant des TCR auto-spécifiques. Les précurseurs de ces cellules peuvent être éliminés par délétion clonale lors de leur interaction avec les CPA médullaires d’origine hématopoïétique ou épithéliale. Dans des modèles d’induction de tolérance à une allogreffe de moelle osseuse par traitement des hôtes avec des anticorps déplétants ou bloquants ou encore par des drogues immunosuppressives 437 , il est décrit l’existence d’un mécanisme similaire de délétion des cellules de l’hôte spécifiques d’antigènes du donneur favorisant ainsi la survie de la greffe. Dans la combinaison de souche que nous avons choisie, les cellules du donneur apportent des Super-antigènes exprimés en association avec les molécules IE du CMH-II non présentes dans la souche receveuse. Nous avons ainsi mis en évidence une délétion, à la fois dans la rate et dans le thymus, des cellules de l’hôte spécifiques des antigènes exclusivement exprimés par le donneur. En condition basale, la délétion thymique des cellules spécifiques d’antigènes du soi est assurée par des cellules présentatrices d’antigènes d’origine épithéliale (mTEC) ou hématopoïétique (DC). Les DC thymiques peuvent avoir deux origines distinguables par l’expression du marqueur de surface Sirp#. Les DC (Sirp#-) se différencient directement dans le thymus à partir d’un précurseur commun aux lymphocytes 27 alors que les DC Sirp#+ migrent depuis la périphérie 30. Les cellules souches hématopoïétiques allogéniques injectées sont capables de reconstituer l’ensemble des lignages hématopoïétiques dont notamment les cellules dendritiques. On peut alors supposer que les DC générées à partir de la moelle donneuse ont la capacité de migrer dans le thymus, où elles présentent les antigènes du donneur. Dans notre cas, les antigènes utilisés pour identifier la délétion de TCR spécifiques 117 sont exclusivement associés aux molécules de CMH du donneur. Pour cette raison, la délétion observée n’est due qu’aux cellules du donneur. Cependant, la même délétion est observée dans des modèles utilisant des antigènes présentés dans le sillon peptidique reconnus par des TCR transgéniques spécifiques de ce peptide 325. Dans ce cas, la présentation des antigènes du donneur pourrait être assurée de façon directe par des DC circulantes du donneur ou indirecte par des DC circulantes de l’hôte ayant capturé les alloantigènes en périphérie. Il serait donc intéressant, dans un modèle non spécifique des Super-antigènes, d’identifier l’origine des DC thymiques (du donneur ou de l’hôte, circulantes ou résidentes) afin d’établir l’implication de chaque population dans la délétion des LT spécifiques du donneur. Néanmoins, nous savons d’une part que l’inhibition de l’activation des cellules de l’hôte spécifiques de la voie indirecte d’alloreconnaissance est nécessaire à l’établissement d’une protection stable d’une allogreffe de peau et d’autre part que le chimérisme hématopoïétique ne prévient pas à lui seul le rejet chronique principalement associé à la voie indirecte d’alloreconnaissance. Il est donc fort probable que la délétion des cellules allospécifiques soit assurée par les cellules du donneur et non celles de l’hôte. Enfin, nos résultats indiquent une délétion massive des cellules spécifiques de l’hôte, néanmoins quelques cellules résiduelles spécifiques du donneur sont encore détectables. On peut envisager qu’à défaut d’être délétées ces cellules peuvent être maintenues en périphérie dans un état d’anergie et/ou leur activation peut être limitée par des mécanismes périphériques dominants. 4- Emergence de Treg de l’hôte spécifiques du donneur : Tolérance infectieuse ? L’utilisation des souris DEREG à la fois comme source de Treg et comme hôte a permis de mettre en évidence l’importance des Treg de l’hôte dans la protection des allogreffes. En effet, nous avons montré que l’élimination de l’ensemble des Treg (endogènes et injectés) de l’hôte n’a pas d’influence sur la tolérance envers la greffe de moelle osseuse mais impacte négativement la tolérance aux allogreffes de peaux qui sont alors rapidement rejetées. Plusieurs hypothèses pourraient expliquer ces résultats. 118 a- Amplification d’une population naturelle spécifique du donneur Dans un premier temps, nous pourrions envisager l’amplification de la population de Treg spécifiques du donneur naturellement présente chez l’hôte. Cependant, ces cellules, qui correspondent à la population que nous amplifions in vitro pour nos expériences, sont présentes en très faible nombre. De plus il est à noter que nous injectons 2.106 Treg spécifiques du donneur soit un nombre deux fois plus important que le nombre total de Treg retrouvé au niveau de la rate d’une souris saine. Il est donc fort peu probable qu’une amplification des cellules endogènes puisse ici assurer à elle seule la protection de la greffe. b- Génération thymique de Treg spécifiques du donneur. Une autre hypothèse pouvant expliquer les résultats observés concerne la génération thymique de Treg spécifiques du donneur. Chez un individu sain, la génération des Treg est contrôlée à la fois par les cellules épithéliales médullaires 121 et par les cellules dendritiques 438 . Parmi les différentes populations de DC thymiques conventionnelles, il semblerait que les DC recirculantes Sirp#+ soient préférentiellement impliquées 26. Cependant, nos résultats indiquent qu’une infusion de seulement deux semaines des Treg avec les cellues de l’hôte est suffisante à l’apparition d’un mécanisme suppresseur efficace remplaçant les Treg injectés. Ce laps de temps semble court pour observer les effets de DC qui devraient dans ce cas, capturer les antigènes périphériques, migrer dans le thymus et induire la sélection de Treg qui devraient, dès la deuxième semaine après la greffe, être opérationnels en périphérie. De plus, se repose la question de la nécessité d’une spécificité des Treg pour la voie indirecte qui est indispensable à la protection d’une allogreffe de peau contre le rejet chronique. Les Treg générés dans le thymus pourraient, selon la DC avec laquelle ils interagiraient, être spécifiques de la voie directe (sélection par des DC circulantes du donneur) ou de la voie indirecte (sélection par des DC circulantes de l’hôte ayant capturé des alloantigènes en périphérie). L’absence d’inhibition du rejet chronique d’allogreffe de peau par le chimérisme hématopoïétique dément cette possibilité. 119 c- Génération périphérique de Treg spécifiques du donneur La dernière hypothèse concerne l’induction périphérique de Treg. Il a été décrit un processus d’induction périphérique de Treg Foxp3+ à partir de cellules CD4 naïves Foxp3dans des modèles de greffes de peau réalisées sous couvert d’anticorps bloquants 291 . Ce processus de « tolérance infectieuse » a été décrit dans des modèles de greffes variant au niveau des antigènes mineurs mais également des antigènes majeurs d’histocompatibilité. Nous suggérons donc que dans notre modèle, la protection des allogreffes de peau, maintenue lors de la déplétion unique des Treg injectés mais perdue lors de l’élimination de l’ensemble des Treg endogènes et injectés, est due a l’établissement d’une tolérance infectieuse. Ainsi les Treg injectés transfèrent leurs capacités immunosuppressives à des cellules naïves spécifiques de la greffe. Ce transfert serait spécifique de la voie indirecte d’alloreconnaissance. En effet, nous savons que la spécificité des Treg est primordiale pour la tolérance à long terme des allogreffes de peau et nous n’observons aucun rejet chronique des greffons lors de la déplétion des Treg injectés. Ceci suggère que les Treg induits en périphérie possèdent la même spécificité que les Treg injectés. Afin de vérifier cette hypothèse il serait important de réaliser des expériences de transfert adoptif de Treg issus de souris tolérantes pour une allogreffe de peau. Si notre hypothèse est exacte, l’injection de ces cellules au moment d’une allogreffe de peau dans des hôtes DEREG préalablement rendus tolérants pour une allogreffe myéloïde sous contrôle de Treg DEREG et traité à la DTx, devrait inhiber le rejet de la greffe de peau que nous observons. L’induction périphérique de Treg, observée dans notre modèle, pourrait être analysée par l’utilisation de souris déficientes pour la séquence CNS1 (conserved non-coding sequence 1) du gène de FoxP3. La séquence CNS1 possède des sites de liaison pour NFAT, Smad3 et RAR# et joue un rôle central dans l’induction de l’expression périphérique de Foxp3 dépendante, entre autre, du TGF-ß 439 . Les animaux déficients pour CNS1 présentent un défaut majeur de différenciation périphérique des Treg se traduisant par une inflammation intestinale et bronchique associée aux Th2 440. CNS1 assure la génération de Treg spécifiques d’antigènes paternels et leur accumulation dans le placenta, favorisant la tolérance foetomaternelle, l’absence de CNS1 étant associée à une augmentation du rejet des fœtus par le système immunitaire maternel 166. Cette dernière découverte renforce l’hypothèse d’un rôle de cette séquence dans le mécanisme de tolérance infectieuse observée en transplantation. Ainsi la greffe de moelle osseuse puis de peau sous couvert de Treg amplifiés ex vivo dans un receveur CNS1-/- nous permettrait de visualiser l’impact des iTreg dans notre modèle. 120 L’induction de tolérance infectieuse a été identifiée exclusivement dans des modèles de greffe d’organe. Une seule étude fait état de l’induction de tolérance infectieuse dans un modèle de greffe myéloide. Néanmoins dans ce cas également l’induction de Treg n’a été révélée que suite à un greffe de peau consécutive à celle de moelle 436 . Dans notre modèle, l’induction périphérique de Treg indispensable à la protection des allogreffes de peau est induite en présence de la moelle seule. Ceci constitue donc la première réelle identification de l’établissement d’une tolérance infectieuse par une greffe myéloïde. Ceci pose le problème de la spécificité des Treg induits qui doivent reconnaitre des antigènes de la peau présentés de manière indirecte sans pour autant avoir été mis en contact avec ces antigènes. Ceci pourrait être expliqué par un processus de « linked tolérance » qui permet l’inhibition de l’activation de LT effecteurs spécifiques pour un antigène X par des Treg spécifiques eux pour un antigène Y à condition que les deux antigènes soient présentés par la même CPA. Ainsi dans notre cas, il est possible que des Treg induits avant la greffe de peau et spécifiques d’antigènes de la moelle puissent inhiber l’activation et/ou induire la conversion de T effecteurs spécifiques d’antigènes de la peau présentés de façon indirecte par des CPA de l’hôte présentant également des antigènes de la moelle. Suite à la délétion de l’ensemble des Treg Foxp3+ de l’hôte par injection de DTx, les greffes de peau sont rejetées rapidement (en moins de 15 jours). La rapidité de ce rejet suggère qu’il soit dû à la voie directe d’alloreconnaissance. Or, dans le même temps, nous n’observons aucun rejet de la moelle osseuse dont les cellules présentent pourtant des alloantigènes par cette même voie directe. De ce fait il semblerait que la levée de la suppression dominante appliquée par les Treg exacerbe le rejet dû en réalité à une activation des cellules par la voie indirecte d’alloreconnaissance. Cependant il est également possible que suite à leur culture et à leur injection, un petit pourcentage de Treg injectés ait perdu l’expression de Foxp3 devenant des cellules effectrices fortement allospécifiques. Dans le cas où seuls les Treg injectés sont déplétés, les cellules qui ont perdu l’expression de Foxp3, qui deviennent donc résistantes à la déplétion par la DTx, resteraient sous le contrôle des Treg de l’hôte induits en périphérie par la tolérance infectieuse. Or ces cellules sont, de par leurs conditions de culture, fortement spécifiques d’antigènes du donneur présentés par les voies directe et indirecte. La déplétion de l’ensemble des Treg de l’hôte lèverait le contrôle de ces cellules extrêmement alloréactives pouvant expliquer la rapidité et la force du rejet observé. Cette hypothèse pourrait être testée en greffant des souris B6 dans lesquelles l’expression du marqueur congénique Thy1.1 est placée sous contrôle du promoteur de 121 Foxp3. La greffe de moelle osseuse serait protégée par des Treg purifiés de souris B6 dont toutes les cellules hématopoïétiques expriment Thy1.1. L’injection d’un anticorps déplétant anti-Thy1.1 permettrait d’éliminer les Treg injectés et les Treg endogènes. L’intérêt de ce modèle réside dans l’absence de corrélation dans les Treg injectés, entre l’expression de Foxp3 et celle du marqueur de surface permettant la déplétion. 5- Mécanismes cellulaires et moléculaires de l’induction de tolérance infectieuse a- Les cellules dendritiques. Les cellules dendritiques sont les chefs d’orchestre de la mise en place des réponses immunitaires. Les DC matures ont la capacité d’activer une réponse efficace contre un pathogène alors que certaines populations de DC tolérogènes peuvent créer un environnement favorable à une immunosuppression. Il est donc logique d’envisager qu’elles aient un rôle essentiel dans l’induction d’une tolérance infectieuse. Cette hypothèse pourrait être testée par la réalisation de greffes de moelle osseuse dans, et/ou à partir, d’une souche de souris dans laquelle le récepteur à la toxine diphtérique est conditionnée par l’expression du marqueur de DC, CD11c (souris CD11c-DTR). Ainsi une greffe de moelle osseuse B6-CD11c-DTR dans un hôte DBA/2 apporterait des DC du donneur sensibles à la toxine. Dans la combinaison inverse d’une greffe de moelle osseuse DBA/2 dans un hôte B6-CD11c-DTR la sensibilité à la toxine serait cette fois portée par les DC de l’hôte. Ainsi, l’injection de DTx dans de telles chimères éliminerait spécifiquement soit les DC de l’hôte soit celles du donneur. Ceci permettrait d’identifier clairement un rôle des DC ainsi que de discriminer un rôle préférentielle des DC de l’hôte ou du donneur. b- Le TGF-ß L’une des principales cytokines impliquée dans la biologie et la fonction des Treg + Foxp3 est le TGF-ß. In vitro, le TGF-ß permet la conversion de cellules CD4+Foxp3- naïves en cellules Foxp3+ 130, 131 . De plus, dans notre modèle nous avons préalablement montré que les LT effecteurs doivent pouvoir répondre au TGF-ß pour que la greffe soit protégée. Ainsi il 122 est logique d’envisager un rôle central de cette cytokine dans l’établissement d’une tolérance infectieuse. Cette action pourrait passer par les DC, et/ou par un contact direct entre les Treg injectés et les cellules effectrices de l’hôte. Afin d’éclaircir cette question, il serait important d’analyser dans un premier temps l’expression de LAP (forme membranaire du TGF-ß impliquée dans l’action contact-dépendante) à la surface des Treg après les 14 jours de culture. Par la suite, il serait nécessaire de réaliser des greffes de moelle osseuse dans des combinaisons donneur/receveur dans lesquelles les DC de l’une ou l’autre origine sont incapables de répondre au TGF-ß. Ceci pourrait être permis par l’utilisation de souris dans lesquelles les DC CD11c expriment un dominant négatif du récepteur au TGF-ß (dnTßRIICD11c). c- La signalisation via mTOR La protéine kinase mTOR (mammalian Target of Rapamycine) est impliquée dans la survie, la prolifération, et les fonctions cellulaires. La voie de signalisation mTOR est naturellement inhibée lors d’un appauvrissement du milieu en nutriment induisant un blocage de la prolifération des cellules et semble impliquée dans la différenciation des lignages T effecteurs et Treg 137 . De plus, l’inhibition de mTOR par des traitements à la rapamycine favorise in vitro et in vivo la différenciation de T effecteurs en Treg. In vivo, l’interaction Treg-DC peut conduire, dans les DC, à l’expression d’IDO par exemple qui est une enzyme de consommation des acides aminés aboutissant à l’appauvrissement métabolique du microenvironnement. Lors de l’interaction d’un T effecteur avec cette DC, la combinaison de la signalisation TCR, du TGF-ß également sécrété dans un milieu tolérogène et la diminution de la disponibilité en acides aminés permet la conversion du T effecteur en Treg 138 . L’implication de mTOR pourrait être testée par l’utilisation d’une souche receveuse de souris dans lesquelles mTOR serait constitutivement activée (contrôle positif d’induction d’iTreg) ou inhibée (contrôle négatif). 123 II- Préservation de l’immunocompétence des animaux greffés L’une des limites de l’utilisation des drogues immunosuppressives dans la protection des allogreffes concerne leur mode d’action aspécifique. Le système immunitaire du receveur étant inhibé dans sa globalité, les patients sont plus sensibles aux infections opportunistes et à la survenue de cancer. Ceci est problématique lors de l’apparition d’une infection après la greffe. Cependant, la transplantation est fréquemment dictée par une défaillance de l’organe suite à son infection préalable. C’est le cas lors de greffes de foie rendues nécessaire à cause d’une infection par le virus de l’hépatite B 441 . Il est alors fréquent que l’infection soit propagée et dans ce cas l’utilisation des drogues dans le but de protéger le greffon inhibe les réponses immunitaires efficaces contre le virus qui persiste dans l’organisme. Nous avons montré que notre modèle d’induction de tolérance basé sur l’utilisation des Treg semble avoir une action spécifique vis-à-vis des antigènes du donneur. Cela avait également était suggéré par nos résultats préalables montrant que les Treg injectés sont spécifiques de la souche de CPA ayant servi de stimulatrices in vitro permettant à la fois de protéger la greffe de moelle de même souche et d’éliminer un greffe tierce 213 . Il reste cependant à évaluer si les animaux greffés conservent la capacité d’éliminer une infection qui peut toucher les cellules de l’hôte mais également celles du donneur. Par l’immunisation de souris tolérantes pour une allogreffe de moelle osseuse avec une protéine immunogène (KLH) pouvant activer les cellules CD4+, nous avons dans un premier temps montré que l’infection ne conduit pas à un rejet de la greffe de moelle osseuse. Nous avons par la suite montré que le maintien de la tolérance n’est pas dû dans ce cas à une absence d’activation des cellules du système immunitaire. En effet, la restimulation in vitro des CD4 purifiés des chimères en présence de concentrations croissantes de KLH révèle une prolifération des CD4 de façon dépendante de la dose de protéine. Il apparaît ainsi que les CD4 des chimères ont la capacité de répondre spécifiquement à une infection tout en maintenant la tolérance envers la greffe de moelle osseuse. Bien que la réponse des CD4 soit plus importante lorsque la protéine est présentée par les CPA de l’hôte (à cause de la sélection positive par les TEC de l’hôte), nous observons 124 également une petite prolifération des CD4 activés au contact de CPA du donneur. Cette activation est aussi spécifique de l’antigène puisque dépendante de la dose de protéine ajoutée dans la culture. Ceci suggère que le système immunitaire des chimères ait la capacité de contrôler une infection, que celle-ci touche les cellules de l’hôte ou du donneur. Sur la base de ces résultats préliminaires prometteurs, il serait important dans un premier temps de tester la préservation de l’immunocompétence dans le cas d’une allogreffe de peau avec le même modèle. En effet, les mécanismes de protection d’une allogreffe de peau sont différents de ceux d’une allogreffe de moelle osseuse. De ce fait il est possible que la protéine immunogène conduise à une réaction immunitaire croisée conduisant à l’activation de cellules spécifiques de la protéine mais également spécifiques de la greffe ce qui pourrait provoquer le rejet de la greffe. Il serait par la suite nécessaire d’utiliser un modèle plus physiologique par l’intermédiaire d’infections par le parasite de la toxoplasmose, Toxoplasma gondii, par exemple. Enfin, le traitement par les drogues immunosuppressives, par l’immunosuppression globale qu’elles provoquent, augmente le risque de développement ou de réactivation de tumeurs. Ainsi il serait important de tester la spécificité de l’immunothérapie par les Treg dans un modèle de tumeurs dites « dormantes » 442 . En effet, il est connu que des patients ayant développé puis résorbé une tumeur, peuvent posséder des masses tumorales « dormantes » de taille réduite. Ces tumeurs dormantes contrôlées par le système immunitaire peuvent reprendre une prolifération massive suite à la levée de la pression du système immunitaire 442. Notre travail a permis de montrer que dans un modèle d’induction de tolérance grâce à l’injection de Treg amplifiés ex vivo, ceux-ci sont indispensables à l’établissement de la tolérance envers des allogreffes de moelle osseuse ou de peau mais pas à sa persistance. Cette tolérance est due en partie à une délétion des cellules de l’hôte spécifiques du donneur (suffisante pour la protection de la moelle), mais surtout à un processus de « tolérance infectieuse » traduisant l’induction périphérique, par les Treg injectés, de Treg Foxp3+ spécifiques d’alloantigènes indispensables à la protection de la greffe de peau. Nous montrons également que ce protocole permettrait non seulement de protéger les allogreffes mais aussi de conserver des capacités de réponses à un pathogène que celui-ci infecte les cellules de l’hôte ou du donneur. Ainsi l’efficacité et la spécificité d’action des Treg dans la protection des allogreffes chez le petit animal soutien le potentiel du transfert d’une thérapie par les Treg en clinique humaine. 125 ANNEXES 126 Chapter 12 In Vitro Expansion of Alloantigen-Specific Regulatory T Cells and Their Use in Prevention of Allograft Rejection Clémence Nouzé, Lise Pasquet, and Joost P.M. van Meerwijk Abstract Regulatory T lymphocytes expressing CD4, high levels of CD25, and the transcription factor Foxp3 play a crucial role in the control of immune responses to self and nonself antigens. In contrast to immunosuppressive drugs currently used to treat immunopathology, these cells act in a very specific manner. Consequently, their clinical potential in the treatment of autoimmune disorders, inflammatory diseases, graft-versus-host disease, and allograft rejection is currently extensively studied in experimental animal models as well as in clinical trials. We have previously shown that appropriately in vitro stimulated CD4+CD25high regulatory T cells can be used to prevent rejection of bone marrow, skin, and heart allografts in the Mouse. We here describe the protocols used in our laboratory to isolate mouse regulatory T cells, to stimulate them in vitro in order to enrich in cells specific for donor-antigens, and to transplant bone marrow under cover of regulatory T cells. Thus, generated hematopoietic chimeras may subsequently be transplanted with solid tissues and organs from the same donor. Key words: Immunology, Immunoregulation, Regulatory T lymphocyte, Transplantation, Hematopoietic chimerism, Mouse, Allograft rejection, Immunosuppression 1. Introduction Regulatory T lymphocytes (Treg) play a central and nonredundant role in the control of immune responses (1). One of the bestcharacterized regulatory T cell populations expresses the coreceptor CD4, high levels of the IL-2RA chain CD25, and the forkhead/winged helix transcription factor Foxp3 (2). Absence of these cells because of mutations in the FOXP3 gene leads to the syndrome Immunodysfunction Polyendocrynopathy Enteropathy X-linked (IPEX) (3). This observation clearly demonstrates the crucial role of Treg in prevention of autoimmune George Kassiotis and Adrian Liston (eds.), Regulatory T Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 707, DOI 10.1007/978-1-61737-979-6_12, © Springer Science+Business Media, LLC 2011 187 188 Nouzé, Pasquet, and van Meerwijk pathology and also strongly suggests that these cells play an important role in the control of immune responses to nonself antigens. From experimental animal studies and clinical research, we now know that Treg control immune responses not only to self-antigens but also to tumors (4), to pathogens (5), and to the fetus (6). Given the fundamental physiological role of Treg in control of immune responses, the use of these cells for therapeutic purposes appears very tempting. In contrast to immunosuppressive drugs, Treg act in an antigen-specific manner (7), and their clinical use should therefore avoid the severe side effects of currently used drugs. The observation that Treg control maternal immune responses to paternal antigens of the fetus (6) suggested that these cells may be very efficient in preventing immune responses to antigens expressed by allografts. We have tested this hypothesis in, initially, a bone marrow transplantation model in the Mouse (7, 8). Host-derived Treg were isolated by selecting CD4+CD25high splenocytes. To enrich this population in cells specific for donor antigens, we cultured them in presence of donor spleen-derived antigen-presenting cells. We also added high levels of IL-2 to break the in vitro anergic state of Treg (9). These cultured Treg were subsequently injected in preconditioned hosts that were simultaneously transplanted with donor bone marrow. Thus, the allograft was efficiently protected from rejection by the host’s immune system. We showed that protection was durable and donor-specific. When the generated hematopoietic chimeras were subsequently grafted with skin or heart from the same donor, the latter allografts were fully protected from acute and chronic rejection (10). Importantly, prevention of chronic rejection required that the injected Treg were specific for donor antigens directly presented by donor APC and indirectly by host APC. The latter observation indicated that protection from solid allograft rejection was due to the injected Treg and not (solely) to the previously induced hematopoietic chimerism. It also has important implications for the in vitro Treg culture protocol. We here describe the detailed protocols for isolation of splenic Treg, their in vitro culture, and allogeneic bone marrow transplantation under cover of Treg in the Mouse. The protocol has allowed for permanent acceptance of bone marrow allografts in all of the numerous semi- or fully allogeneic host/donor combinations we tested. The generated hematopoietic chimeras can subsequently be transplanted with skin or heart allografts from the same donor using specialized protocols previously described (11, 12). In Vitro Expansion of Alloantigen-Specific Regulatory T Cells 189 2. Materials 2.1. Isolation of Splenic Treg 1. Mice: Any strain of inbred mouse can be used. These mice are commercially available from several suppliers. We always use specific pathogen free (SPF) animals. 2. RPMI 1640 medium (Eurobio, Les Ulis, France) supplemented with 10% heat-inactivated fetal calf serum (FCS), 2 mM L-glutamine, penicillin, streptomycin, 10 mM Hepes, 50 MM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate. 3. Lympholyte-M (Cedarlane laboratories, Hornby, ON, Canada). 4. MACS Buffer: phosphate buffered saline (PBS), supplemented with 3% BSA (Bovine Serum Albumin) and 0.5 mM EDTA. Sterilize by filtration on a 0.2-MM membrane filter (e.g., Millipore, Billerica, MA). Store at 4–8°C. 5. Mouse CD4 Cell Negative Isolation Kit (Dynal Biotech, Oslo, Norway). 6. Hybridoma supernatants: hybridomas are cultured in complete medium with 5% FCS. When more than 90% of the cells are dead, supernatants are harvested by centrifugation and subsequent filtration on a 0.4-MM membrane filter. 7. MicroBeads coated with anti-PE antibody (Miltenyi Biotec, Paris, France). 8. MS columns and MiniMACS separator (Miltenyi Biotec, Paris, France). 9. Fluorochrome-conjugated antibody to mouse antigens: CD25-PE (PC61), CD4-APC (L3T4) (eBiosciences, San Diego, CA; BD Pharmingen, San Jose, CA). 2.2. Flow Cytometry 1. ACK buffer: 10 mM KHCO3, 155 mM NH4Cl, 0.1 mM Na2EDTA in H2O, pH 7.2–7.4. Membrane-filter the solution (0.2 MM) and store at 4°C. Refresh ACK buffer at least every 3 weeks. 2. FACS buffer: PBS, supplemented with 2.5% FCS, filtered on a 0.2-Mm membrane filter. 3. Appropriate mouse fluorochrome-conjugated antibodies (e.g., from eBiosciences or BD Pharmingen). 4. Flow cytometer: e.g., LSR II (BD Biosciences, San Jose, CA). 5. Analysis: FlowJo software (Tree Star, Ashland, OR). 190 Nouzé, Pasquet, and van Meerwijk 2.3. Treg Culture 1. Tissue potter. 2. Lympholyte-M (Cedarlane Laboratories). 3. Tissue Culture Plate, 96 well, U-Bottom. 4. RPMI 1640 medium (Eurobio) supplemented with 10% heat-inactivated FCS, 2 mM l-glutamine, penicillin, streptomycin, 10 mM Hepes, 50 MM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate. 5. IL-2: filtered supernatant of EL4.IL-2 cells (American Type Culture Collection [ATCC], Manassas, VA) stimulated during 24 h with 10 ng/ml of phorbol myristate acetate [PMA]. IL-2-concentration is determined by ELISA. 2.4. Bone Marrow Chimeras 1. Mice: Any strain of inbred mouse can be used as donors and hosts. These mice are commercially available from several suppliers. We use male or female 8–10-week-old SPF animals. 2. Cs134 G-ray research irradiator. 3. Hybridoma supernatants: Anti-Thy1 antibody (AT83 for Thy1.2, HO22.11 for Thy1.1, ATCC) prepared as described in Subheading 2.1, item 4. 4. Rabbit complement (Saxon Europe, Suffolk, UK). 5. Antibiotics: 0.4% pediatric suspension of Bactrim (Roche, Basel, Switzerland) in the drinking water. 3. Methods The following protocols are established for one spleen, usually allowing for isolation of 0.3 to 1 × 106 Treg. After in vitro culture, typically a 20-fold increase in Treg cell numbers is observed. For generation of ten hematopoietic chimeras, we typically use five host-type spleens for isolation of Treg, three donor-type spleens to be used as source of antigen-presenting cells, and three to four bone marrow donors. Since the protocols heavily depend on primary cell cultures, particular attention needs to be paid to avoid contamination. Use, as much as possible, laminar flow hoods and, for interventions on dead or live animals, clean procedures. 3.1. Preparation of a Total Host-Type Splenocyte Suspension 1. Euthanize the host-type mouse by cervical dislocation, clean the left flank with 70% alcohol, make an incision with sterile scissors, and carefully remove the spleen using sterile forceps. Transport the spleen in ice-cold complete medium. 2. Make a raw splenocyte suspension in complete medium by careful mechanical disruption of the spleen in a potter. Centrifuge at 345 × g for 5 min at 4°C. In Vitro Expansion of Alloantigen-Specific Regulatory T Cells 191 3. Wash cells by resuspending the cell pellet in 10 ml complete medium. Centrifuge. 4. Pass cells through sterile cotton-wool in a syringe. 5. Resuspend cells in 8 ml of complete medium and carefully deposit them on 2 ml of Lympholyte-M in a 15-ml tube (see Note 1). 6. Centrifuge at 1,118 × g for 15 min at room temperature (RT) without brake. 7. Recover the leukocyte layer between the Lympholyte-M and the medium (see Note 2). 8. Wash cells twice in complete medium, resuspend cells at 3 × 107 cells/ml in complete medium. 9. When the prepared splenocytes are stained with anti-CD4, anti-CD25, and anti-Foxp3 antibodies and analyzed by Flow cytometry, results similar to those shown in Fig. 1a should be obtained. 3.2. Enrichment of CD4+ T Cells 1. Incubate the prepared splenocytes on ice with saturating concentrations of the following hybridoma supernatants: antiCD8 (53.6.7), anti-FcGRII/III (2.4G2), and anti-MHC class II (M5) for 30 min. Agitate every 10 min. 2. Centrifuge at 345 × g for 5 min at 4–8°C. 3. Resuspend cells in 1 ml of complete medium. 4. Add 40 Ml of the antibody cocktail provided in the Dynal CD4 cell negative isolation kit. 5. Mix well and incubate for 10 min on ice. 6. Wash cells by adding 9 ml of complete medium, centrifuge at 345 × g for 5 min at 4°C. 7. Resuspend splenocytes in 2 ml of complete medium. 8. Wash (3×) 250 Ml of the anti-rat IgG-coated Dynabeads provided in the kit (see Note 3) by adding 10 ml of complete medium. Then, place the tube in a Dynal magnet for 1 min and discard the medium. 9. Add the cells to the washed beads and incubate for 30 min on ice, inverse tube regularly to resuspend cells and beads. 10. Add ice-cold complete medium up to 10 ml, place the tube in the Dynal magnet for 1 min and transfer the cell suspension to a new tube. 11. Place the new tube in the magnet for 1 min and transfer the cell suspension to another tube, centrifuge cells at 345 × g at 4°C. 12. Wash cells once, resuspend them in 10 ml complete medium and centrifuge. Resuspend the cells at 3.107 cells/ml. 192 Nouzé, Pasquet, and van Meerwijk CD25 enriched a 1st column Total splenocytes 1.89 CD25 105 CD4 enriched 105 8.34 104 103 103 102 0 102 0 13.6 8.64 105 104 0 102 103 104 105 Positive fraction Negative fraction 104 68.1 2nd column 105 59.8 Negative fraction 105 40.4 Positive fraction 105 104 104 104 103 103 103 103 102 0 102 0 102 0 0 102 103 104 105 67.2 0 102 103 104 105 23.4 0 102 103 104 105 35.1 0 102 103 104 105 102 0 94.2 1.95 0 102 103 104 105 # Cells CD4 3.49 0 102 103 104 105 13.4 10.3 0 102 103 104 105 61.8 0 102 103 104 105 0 102 103 104 105 45 0 102 103 104 105 97.6 0 102 103 104 105 Foxp3 b isolated 92.3 CD25 105 cultured 105 104 104 103 103 102 3.29 0 102 0 0 102 103 104 105 84.1 1.4 0 102 103 104 105 CD4 # Cells 150 600 100 400 50 0 99.2 200 96.6 0 0 102 103 104 105 0 102 103 104 105 Foxp3 Fig. 1. Purification and culture of mouse regulatory T cells. (a) Total mouse splenocytes from mice transgenic for a bacterial artificial chromosome containing an EGFP-encoding sequence under control of the Foxp3 promoter (13) were prepared as described in Subheading 3.1, stained with antibodies to CD4 and CD25, and analyzed by flow cytometry. Life cells are gated on forward and side scatter, and CD4/CD25 distribution (upper panel) and EGFP fluorescence (Foxp3) (lower panel) shown. Cell-samples from subsequent steps in the isolation procedure were analyzed similarly: CD4-enriched (Subheading 3.2), CD25+ cells magnetic bead sorted once (3.3.15) or twice (3.3.16). “Negative fraction” corresponds to the flow-through of the column, “positive fraction” to the cells retained on the magnetic column. (b) CD4+CD25high cells thus isolated (left hand panels) from Foxp3-IRES-EGFP mutant mice (generously provided by Dr. Bernard Malissen, Marseille, France) (14) were cultured as described in Subheading 3.4 (right hand panels) and analyzed similarly. Numbers indicate percentages of cells within indicated gates. 13. When the prepared cells are stained with anti-CD4, antiCD25, and anti-Foxp3 antibodies and analyzed by Flow cytometry, results similar to those shown in Fig. 1a should be obtained. 3.3. Isolation of CD25 high Cells 1. Add saturating amounts of anti-mouse CD25-PE to the CD4-enriched cells. In Vitro Expansion of Alloantigen-Specific Regulatory T Cells 193 2. Carefully mix suspension and incubate for 20 min in the dark on ice. 3. Wash cells twice in MACS buffer (see Note 4). Centrifuge at 345 × g, 4°C. 4. Resuspend cell pellet in 80 Ml MACS buffer per 107 cells. 5. Add 5 Ml of anti-PE Miltenyi microbeads per 107 total cells, mix well. 6. Incubate 20 min at 4°C. 7. Centrifuge at 345 × g for 5 min at 4°C. 8. Resuspend up to 108 cells in ice-cold 500 Ml of MACS buffer. 9. Place Miltenyi MS column in the MiniMACS separator. 10. Prepare column by rinsing it with 500 Ml of MACS buffer. 11. Apply cells suspension on the column. 12. Collect flow-through in a tube and add, 4 times, 500 Ml of ice-cold buffer to the column. Collect total effluent. 13. Remove column from separator and place it on a collection tube. 14. Pass 1 ml of ice-cold MACS buffer and flush out the labeled fraction by softly applying the plunger. 15. Repeat this magnetic separation (steps 7–14) with a new column to increase the purity. 16. Check the purity of the different fractions by flow cytometry. We typically obtain results similar to those shown in Fig. 1a. 3.4. In Vitro Expansion of Alloantigen-Specific Treg 1. Prepare a suspension of donor-type total splenocytes (3 × 107 cells/ml) as described in Subheading 3.1, step 1–3. Then, the cells are G-irradiated (17.5 Gy), passed through sterile cotton wool in a syringe, counted, and washed once more (see Note 5). 2. Coculture-purified regulatory T cells (2,000/well) and allogenicirradiated splenocytes (2.5 × 105/well) in 100 Ml/well complete RPMI medium complemented with 100 U/ml IL-2 in 96-well round-bottom plates at 37°C, 5% CO2. Fill as many wells as the number of isolated CD4+CD25high cells allows. 3. At day 7, add 100 Ml of fresh medium (complete RPMI with 100 U/ml IL-2) and culture cells for another 7 days. 4. Harvest and pool cells from all wells, wash twice, and resuspend at 107 cells/ml in complete medium. 5. Analyze cultured cells by flow cytometry for expression of CD4, CD25, and Foxp3. Results typically obtained in our laboratory are shown in Fig. 1b. 6. Just prior to injection, pellet the cells and resuspend them in ice-cold PBS at 2 × 106 cells/50 Ml. 194 Nouzé, Pasquet, and van Meerwijk 3.5. Allogenic Bone Marrow Graft 1. G-irradiate (5 Gy) hosts 1 day before bone marrow transplantation. 2. Add antibiotic to the drinking water during the complete duration of the experiment. 3. Collect tibias and femurs from donor mice in complete medium. 4. Carefully cut off the ends of the bones with scissors, keep them with forceps and thoroughly flush them with complete medium using a 26-G needle. 5. Carefully pipette the collected cells in complete medium to dissociate clumps. Wash cell suspension with complete medium (see Note 6). 6. Resuspend bone marrow cells in RPMI with 1% FCS (no other additives) at 107 nucleated cells/ml. 7. Add appropriate concentrations of anti-Thy1 antibodycontaining hybridoma supernatant and rabbit complement (see Note 7). 8. Incubate 1 h at 37°C in a water bath. Fill the tube with icecold complete medium containing 10% FCS, centrifuge cells. 9. Wash cells twice more in complete RPMI, count, and resuspend them at 107 cells/150 Ml PBS. 10. Intravenously coinject 150 Ml (=107) bone marrow cells and 50 Ml (=2.106) Treg into host mice irradiated 1 day earlier. 3.6. Determination of Allograft Acceptance 1. Collect blood samples in a tube containing 5–10 Ml 500 mM EDTA. 2. Wash cells 3× with 500 Ml of ice-cold FACS buffer, centrifuge at 220 × g for 5 min at 4°C. 3. Resuspend the pellet in 500 Ml of ACK buffer. 4. Incubate 10 min at RT. 5. Stop the reaction by adding 500 Ml of FACS buffer. 6. Centrifuge at 220 × g for 5 min at 4°C (see Note 8). 7. Wash cells once more with FACS buffer. 8. Resuspend the pellet in 100 Ml of 2.4G2 (anti-FcGR) hybridoma supernatant. 9. Incubate 20 min on ice. 10. Add antibodies to donor and host MHC class I (or other appropriate marker) and incubate 20 min on ice. 11. Wash cells and analyze them by flow cytometry. 12. Results routinely obtained in our laboratory are shown in Fig. 2. In Vitro Expansion of Alloantigen-Specific Regulatory T Cells CBA B6 w/o Treg 10 10 H2Kb 10 10 5 195 + Treg anti-CBA 85.7 10 4 10 3 10 2 5 60.7 4 3 2 0 0.035 0 10 2 H2Kk 10 3 10 4 5 10 10 0 30.1 0 10 2 10 3 4 10 10 5 Fig. 2. In vitro cultured regulatory T cells prevent rejection of bone marrow allografts. CBA (H-2k) bone marrow was transplanted into B6 (H-2b) mice without further treatment (left hand panel) or under cover of in vitro cultured regulatory T cells as described in Subheading 3.5 (right hand panel). Three weeks later, blood samples were taken and analyzed by flow cytometry as described in Subheading 3.6. 4. Notes 1. Lympholyte-M has to be conserved at 4°C but needs to be used at RT. Make sure that the cells suspension, the centrifuge, and the buckets are at RT. The technique can be realized by two different manners: (a) The cell suspension is slowly deposited on the Lympholyte-M. (b) The Lympholyte-M is slowly deposited under the cell suspension using a Pasteur pipette. 2. After centrifugation with the Lympholyte-M, carefully recover the white interface layer using a Pasteur pipette. 3. Careful prewashing of Dynabeads is a very crucial step since the solution in which they are conserved is toxic. 4. The MACS buffer should always be used cold to avoid nonspecific retention of cells on the magnetic column. 5. For bone marrow transplantation, use donor-type splenocytes to stimulate Treg. If, after induction of hematopoietic chimerism, transplantation of solid tissues or organs is envisaged, use (donor x host)F1 splenocytes to enrich Treg specific not only for directly but also for indirectly presented alloantigens (10). 6. To recover a maximum of cells, flushing of bones must be continued until bones are fully white. 196 Nouzé, Pasquet, and van Meerwijk 7. Appropriate concentrations of anti-Thy1 antibody and rabbit complement need to be determined by complement lysis. 8. After the first incubation with ACK buffer, the cell pellet may still be red showing that some erythrocytes are left. Do not hesitate to repeat ACK-mediated lysis to remove all erythrocytes allowing for better analysis by flow cytometry. References 1. Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., and Ono, M. (2008) Regulatory T cells and immune tolerance, Cell 133, 775–787. 2. Tang, Q., and Bluestone, J. A. (2008) The Foxp3+ regulatory T cell: a jack of all trades, master of regulation, Nat. Immunol. 9, 239–244. 3. Ziegler, S. F. (2006) FOXP3: of mice and men, Annu. Rev. Immunol. 24, 209–226. 4. Beyer, M., and Schultze, J. L. (2006) Regulatory T cells in cancer, Blood 108, 804–811. 5. Belkaid, Y., Blank, R. B., and Suffia, I. (2006) Natural regulatory T cells and parasites: a common quest for host homeostasis, Immunol. Rev. 212, 287–300. 6. Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., and Betz, A. G. (2004) Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus, Nat. Immunol. 5, 266–271. 7. Joffre, O., Gorsse, N., Romagnoli, P., Hudrisier, D., and van Meerwijk, J. P. M. 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REVIEW ARTICLE published: 28 December 2011 doi: 10.3389/fimmu.2011.00080 Hematopoietic chimerism and transplantation tolerance: a role for regulatoryT cells Lise Pasquet 1,2,3 ‡ , Olivier Joffre 1,2,3 †‡ , Thibault Santolaria 1,2,3 † and Joost P. M. van Meerwijk 1,2,3 * 1 2 3 INSERM U1043, Toulouse, France CNRS U5282, Toulouse, France Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, Université Paul Sabatier, Université de Toulouse, Toulouse, France Edited by: Stephen Paul Cobbold, University of Oxford, UK Reviewed by: Stephen Paul Cobbold, University of Oxford, UK Xian Chang Li, Brigham and Women’s Hospital, USA *Correspondence: Joost P. M. van Meerwijk , INSERM U1043, BP 3028, 31024 Toulouse Cedex 3, France. e-mail: [email protected] Present address: Olivier Joffre, INSERM U932, Institut Curie, F-75005 Paris, France.; Thibault Santolaria, INSERM U892, F-44007 Nantes, France. † Lise Pasquet and Olivier Joffre have contributed equally to this work. ‡ The immunosuppressive regimens currently used in transplantation to prevent allograft destruction by the host’s immune system have deleterious side effects and fail to control chronic rejection processes. Induction of donor-specific non-responsiveness (i.e., immunological tolerance) to transplants would solve these problems and would substantially ameliorate patients’ quality of life. It has been proposed that bone marrow or hematopoietic stem-cell transplantation, and resulting (mixed) hematopoietic chimerism, lead to immunological tolerance to organs of the same donor. However, a careful analysis of the literature, performed here, clearly establishes that whereas hematopoietic chimerism substantially prolongs allograft survival, it does not systematically prevent chronic rejection. Moreover, the cytotoxic conditioning regimens used to achieve long-term persistence of chimerism are associated with severe side effects that appear incompatible with a routine use in the clinic. Several laboratories recently embarked on different studies to develop alternative strategies to overcome these issues. We discuss here recent advances obtained by combining regulatory T cell infusion with bone-marrow transplantation. In experimental settings, this attractive approach allows development of genuine immunological tolerance to donor tissues using clinically relevant conditioning regimens. Keywords: transplantation tolerance, hematopoietic chimerism, regulatoryT lymphocytes, passive tolerance, active tolerance, chronic rejection INTRODUCTION The immunosuppressive regimens developed since the discovery of cyclosporine A showed ever increasing efficiency in reducing the severity and occurrence of acute rejection episodes. Recently, a systematic analysis of the literature firmly identified acute rejection events as a bad prognosis factor for long-term graft survival (Wu et al., 2009). Since immunosuppressive drugs efficiently control acute rejection, this explains how they significantly improved allograft survival over the past 40 years despite failing to have a direct impact on chronic rejection. The failure of current treatments to control chronic rejection processes combined with their deleterious side-effects urgently call for development of novel therapies against allograft rejection (Kahan, 2003; Meier-Kriesche and Kaplan, 2011). During lymphocyte development in primary lymphoid organs, and due to the random rearrangement of genes encoding the antigen receptor, many autospecific T and B cell precursors arise. Since such cells would cause devastating autoimmune pathology, the natural mechanisms involved in the induction of self-tolerance play a crucial role in the survival of the species (Waldmann, 2010). Self-tolerance is defined as a state in which autoimmune attack is either prevented or deviated to non-detrimental responses (Walker and Abbas, 2002; Hogquist et al., 2005). It allows development of protective immunity and is therefore very specific. It appears very attractive to manipulate the mechanisms involved in self-tolerance in order to make them prevent allograft www.frontiersin.org rejection. If successful, this would allow for indefinite survival of grafts. TOLERANCE-INDUCTION BY CELLS OF HEMATOPOIETIC ORIGIN: PROOF OF PRINCIPLE Several layers of complementary mechanisms ensure tolerance to self-antigens. Interestingly, considerable insight into these mechanisms was obtained through transplantation models and by manipulating the development of the immune system early in life, during embryogenesis or in neonates. Owen (1945) first observed that dizygotic twin cattle, that almost invariably develop placental anastomosis, “have identical blood types” as adults and he concluded “the critical interchange is of embryonal cells ancestral to the erythrocytes”. Later, Billingham, Medawar, and colleagues showed that these chimeric twins “accepted” each other’s skins when grafted later in life (Billingham et al., 1952). In a 1953 landmark paper, the same group showed that skin allograft survival could be substantially prolonged by injecting a single-cell suspension of donor tissues in utero or into neonates (Billingham et al., 1953). Such treatment led to varying levels of hematopoietic chimerism, which was later shown to be critically involved in allograft survival (Lubaroff and Silvers, 1973; Wood and Streilein, 1982; Wren et al., 1993; Alard et al., 1995). In the two systems described above, lymphocytes developed in the presence of (and thus learned to be tolerant to) donor antigens. However, in adults the situation is more complicated as, in addition December 2011 | Volume 2 | Article 80 | 1 Pasquet et al. to developing lymphocytes, preexisting donor-specific mature cells would also need to be rendered tolerant. To bypass this concern, several laboratories decided to deplete the pool of mature T cells (Main and Prehn, 1955; Trentin, 1956; Brocades Zaalberg et al., 1957). These groups first experimented this approach through the elimination of all hematopoietic cells. Recipient mice were lethally irradiated or treated with cytotoxic drugs, reconstituted with donor bone marrow, and grafted with skin. These strategies invariably led to substantially increased survival of homoand xenografts. More recently, Ildstad and Sachs (1984) definitely validated these observations by inducing long-term survival of allogenic and xenogenic skin grafts using a comparable approach. Similar results were obtained in the rat for heart and skin grafts (Colson et al., 1995b; Orloff et al., 1995). Combined, these observations clearly demonstrated that hematopoietic chimerism leads to prolonged survival of allografts. CELLS OF HEMATOPOIETIC ORIGIN INDUCE T CELL TOLERANCE BY INDUCTION OF APOPTOSIS AND ANERGY To address the question of how cells of hematopoietic origin induce tolerance, researchers needed a means to identify T cell precursors specific for a given antigen. Kappler et al. (1987b) showed that practically all T cells expressing the variable TCR segment Vβ17a, representing up to 15% of the T cell repertoire in certain mouse-strains, recognized the MHC class II molecule I-E. Given that they had developed an antibody against this Vβ domain, the mechanisms involved in T cell tolerance to I-E could now be analyzed. It was shown in I-E expressing mice that Vβ17a+ T cell precursors were eliminated at an immature stage during thymic development (Kappler et al., 1987a). The following year, the same authors further characterized this mechanism and showed that clonal deletion requires the expression of the negatively selecting ligand by thymic cells of hematopoietic origin (Kappler et al., 1988). Many other illustrations of clonal deletion of T cells expressing given TCR Vβ segments by endogenous or exogenous superantigens have since been published (MacDonald et al., 1988b; Luther and Acha-Orbea, 1997). Could thymic elimination of reactive clones also be involved in the neonatal induction of tolerance to alloantigens? This question was addressed by MacDonald et al. (1988a) who showed that the transfer of superantigen-expressing spleen cells into neonates lead to the intrathymic deletion of superantigen-reactive T cells. Similar conclusions were rapidly drawn by others (Streilein, 1991). Later, intrathymic deletion of donor-specific precursors was also reported in adult mixed hematopoietic chimeras using TCR transgenic cells as a tracer population (Manilay et al., 1998). Thus, thymic cells of hematopoietic origin are involved in deletion of autospecific T cell-precursors and mixed hematopoietic chimerism leads to deletion of alloreactive cells. Using thymic organ cultures to analyze the involvement of different stromal cells, it was shown that dendritic cells (DC) are critically involved in this process (Matzinger and Guerder, 1989; Jenkinson et al., 1992; Anderson et al., 1998). This was further confirmed using a transgenic mouse model in which TCR ligand-expression was essentially restricted to DC using the CD11c promoter (Brocker et al., 1997). Among the thymic DC subtypes, both Sirpα+ and Sirpα − conventional DC have been implicated in central Frontiers in Immunology | Immunological Tolerance Hematopoietic chimerism, Treg, and transplantation tolerance tolerance-induction by deletion (Wu and Shortman, 2005; Baba et al., 2009). However, other populations of hematopoietic cells may also play a role in this process, including CD4+ CD8+ thymocytes, thymic macrophages and B cells (Pircher et al., 1992, 1993; Kleindienst et al., 2000), and circulating peripheral DC (Bonasio et al., 2006). Combined, the data discussed thus far showed that DC, and potentially other cells of hematopoietic origin, contribute to tolerance induction by elimination of developing thymocytes. Using conditioning regimens that totally deplete host T cells before bonemarrow transplantation, it was proposed that this mechanism was necessary and sufficient for maintenance of tolerance and that peripheral mechanisms do not contribute to this process (Khan et al., 1996). However, other mechanisms could be involved when less aggressive regimens are used. In normal mice, it has been proposed that deletion of autospecific T cells that escaped thymic selection could also occur in peripheral lymphoid organs and could be involved in the maintenance of self-tolerance (Russell, 1995). To test if similar mechanisms were involved in induction of tolerance to alloantigens following bone-marrow transplantation, Wekerle et al. (1998) tracked T cells specific for a given superantigen in thymectomized mice transplanted with allogeneic bone-marrow under cover of CTLA4-Ig and antibody to CD154 (“co-stimulatory blockade”). They observed a rapid deletion of donor-specific host T cells from the peripheral CD4+ compartment. This observation was later confirmed using a TCR transgenic mouse model (Kurtz et al., 2004) and it was further shown that peripheral deletion relies essentially on two types of mechanisms: activation-induced cell death, a Fas-dependent process that can be promoted by IL-2 and that leads to apoptosis of activated T cells when restimulated with high doses of antigen (Lenardo, 1991; Ju et al., 1995; Russell, 1995); and passive cell death or death “by neglect,” a Fas-independent process that can be prevented by overexpression of Bcl-2 or Bcl-xL and that leads to T cell apoptosis when stimulated with low dose of antigen and/or in the absence of co-stimulatory signals (Boise et al., 1995; Van Parijs et al., 1996; Wekerle et al., 2001). It was also shown that in addition to DC, other populations of hematopoietic cells such as B cells have the capacity to delete allospecific precursors from the peripheral T cell compartment (Fehr et al., 2008a,b). Finally, hematopoietic cells can also cause T cell tolerance by inducing a non-responsive state called clonal anergy (Rammensee et al., 1989; Tomita et al., 1994; Hawiger et al., 2001). Combined, the cited reports clearly show that cells of hematopoietic origin can induce “passive” tolerance (i.e., apoptosis and anergy). CAN HEMATOPOIETIC CELLS INDUCE ACTIVE REGULATORY MECHANISMS? T lymphocytes from chimeric mice in which radioresistant cells express MHC molecules but hematopoietic cells do not, vigorously react to self-antigens in vitro (van Meerwijk and MacDonald, 1999) and in some well-defined experimental conditions in vivo (Hudrisier et al., 2003). Combined with the observations listed above, this shows that hematopoietic cells play a central role in the deletion and/or functional inactivation of self-reactive precursors. However, passive mechanisms are not sufficient to fully control self-reactivity. Individuals carrying a mutated FOXP3 gene December 2011 | Volume 2 | Article 80 | 2 Pasquet et al. develop the rapidly lethal autoimmune syndrome immuno dysfunction, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked (IPEX). This is explained by the fact that Foxp3 is required for the programming of a population of regulatory CD4+ T lymphocytes (Treg) that inhibit and/or divert innate and adaptive immune responses, mainly those directed against self-antigens. Genuine tolerance to self, and consequently probably to non-self-antigens, therefore requires Treg (Fontenot and Rudensky, 2005; Sakaguchi et al., 2006; Shevach et al., 2006). Given their central (though not exclusive) role in the control of autoimmune responses, it was probably not a very surprising finding that the Treg repertoire is strongly enriched in autospecific cells (Romagnoli et al., 2002; Hsieh et al., 2004). Development of self-antigen-specific Treg in the thymus depends on interaction of developing precursors with MHC/self-peptide ligands expressed by thymic epithelial cells (Bensinger et al., 2001; Romagnoli et al., 2005; Ribot et al., 2006, 2007; Aschenbrenner et al., 2007). Moreover, the transplantation of allogeneic thymic anlagen (i.e., the initial cluster of pluripotent embryonic cells from which the thymus will develop) into mice induces Treg-mediated tolerance to subsequent skin grafts of the same donor, again showing that thymic epithelial cells can select antigen-specific Treg (Le Douarin et al., 1996). However, the capacity to trigger Treg differentiation in the thymus is not a property restricted to epithelial cells as it has been reported that thymic DC are also involved in this process (Watanabe et al., 2005; Proietto et al., 2008; Wirnsberger et al., 2009). Moreover, induction of Treg differentiation by DC has also been reported in peripheral lymphoid organs under certain carefully controlled experimental conditions (reviewed by Romagnoli et al., 2008). It may therefore be hypothesized that hematopoietic chimerism can lead to differentiation and/or expansion of Treg specific for donor antigens and thus to the development of dominant tolerance. However, in experimental systems where the conditioning regimen used to induce mixed hematopoietic chimerism involved the total deletion of host T cells, transfer of syngeneic naïve CD4+ T cells into the recipient leads to bone-marrow rejection and to the concomitant loss of donor-specific transplantation tolerance (Wren et al., 1993). This result clearly demonstrated that hematopoietic chimerism per se is insufficient for induction of dominant tolerance to alloantigens. Given the non-redundant role of Treg in maintenance of self-tolerance, hematopoietic chimerism therefore appears unlikely to be sufficient for permanent survival of allografts. Active tolerance mechanisms are not limited to those mediated by Treg. “Immune deviation” from a harmful Th1 to a less detrimental Th2 response has also been shown to play a role in control of immune responses (Rocken, 1996; Walker and Abbas, 2002). Alloreactive Th2 cytokine producing T cells have been observed after neonatal injection of lymphohematopoietic cells (Streilein, 1991) and immune deviation by IL-4 was shown to play a critical role in tolerance to alloantigens (Donckier et al., 1995). The hematopoietic (micro-)chimerism induced in this experimental model, which is critically required for the allograft tolerance (Lubaroff and Silvers, 1973), therefore appears to induce an active regulatory mechanism. However, this mechanism appears insufficient for induction of full immunological tolerance to alloantigens www.frontiersin.org Hematopoietic chimerism, Treg, and transplantation tolerance (see below). Stem-cell transplantation under cover of cyclophosphamide can induce tolerance to MHC-matched skin allografts in mice. It was shown that NKT cells, another immunoregulatory population, play a central role in this phenomenon (Iwai et al., 2006). Regulatory T cell populations other than Foxp3+ cells may therefore be induced by hematopoietic chimerism but their activity appears insufficient for prevention of chronic allograft rejection. DOES HEMATOPOIETIC CHIMERISM INDUCE GENUINE TOLERANCE TO ALLOGRAFTS? As discussed above, hematopoietic chimerism is thought to be sufficient for induction of tolerance to allografts. The mechanisms involved include central and peripheral clonal deletion and anergy. After the initial reports on allograft tolerance in dizygotic cattle twins that had shared blood circulation during embryonic life, it became clear that most skin grafts were rejected in the long term (Stone et al., 1965, 1971). Second skin grafts from the same donor survived less long than the first grafts, but substantially longer than third party organs, showing that the tolerance mechanism had not waned away. Also neonatal injection of allogeneic splenocytes, leading to hematopoietic microchimerism, is thought to induce tolerance to subsequent skin grafts. However, this procedure appeared to work only in a limited number of donor/host combinations. Importantly, most of the reported donor/host combinations concerned MHC congenic strains (i.e., expressing distinct MHC haplotypes on an identical genetic background) and chronic rejection was not systematically studied (Streilein and Klein, 1977). Moreover, even when acceptance of skin allografts was achieved, it did not correlate with immunological unresponsiveness (Streilein, 1991; Donckier et al., 1995). In adult mice, lymphoablation was achieved using lethal total body irradiation or depleting antibodies to, e.g., CD4 and CD8. Myeloablation, required for induction of hematopoietic chimerism, was induced by the irradiation or administration of myeloablative drugs. Subsequent transplantation of allogenic or xenogenic bone marrow led to persistent chimerism (reviewed in Wekerle and Sykes, 1999; Cosimi and Sachs, 2004). Skin grafts from the bone-marrow donors could survive for prolonged periods, but success-rates were often well below 100% and chronic rejection was not studied. In some host/donor combinations, hematopoietic chimerism failed to prevent acute rejection of skin allografts (Boyse et al., 1970), and T cell reactivity to skin-specific antigens not expressed by hematopoietic cells was responsible for this observation (Scheid et al., 1972; Boyse et al., 1973). Also the survival of cardiac allografts was favored by hematopoietic chimerism (Steinmuller and Lofgreen, 1974). However, histological analysis of surviving hearts revealed frequent chronic rejection (Russell et al., 2001). Also in the rat, myelo- and lymphoablation followed by induction of hematopoietic chimerism was reported to prolong survival of skin, heart, and renal allografts (Slavin et al., 1978; Colson et al., 1995b; Orloff et al., 1995; Blom et al., 1996). However, chronic rejection was seldom adequately studied. It appears therefore that immunological tolerance to allografts is not systematically achieved by induction of hematopoietic chimerism in lymphoablated recipients. December 2011 | Volume 2 | Article 80 | 3 Pasquet et al. Hematopoietic chimerism can also be induced with nonlymphoablative regimens. Surprisingly, under certain of these conditions, allografts appear to do better than when lymphoablative conditioning is used (Table 1). Blocking the T cell co-stimulatory molecule CD28 with an Ig-fusion protein of its CTLA4-ligand (CTLA4-Ig), combined with inhibition of the CD40/CD40L (i.e., CD154) pathway involved in activation of antigen presenting and B cells, substantially prolongs heart and skin allograft survival (Larsen et al., 1996). However, histological signs of chronic rejection of cardiac allografts was observed in all thus conditioned mice (Shirasugi et al., 2002). When co-stimulatory blockade was combined with induction of hematopoietic chimerism, heart, skin, and also intestine allografts survived substantially longer and no chronic rejection was observed (Wekerle et al., 1998, 2000; Adams et al., 2001; Shirasugi et al., 2002; Guo et al., 2003). Transplantation tolerance in such settings was dominant and depended on Treg, at least during early stages (Bigenzahn et al., 2005; Domenig et al., 2005). Combined, these data indicate that hematopoietic chimerism per se appears insufficient for induction of transplantation tolerance. However, when combined with conditioning regimens that allow for development of dominant tolerance, prevention of chronic rejection can be achieved. INDUCTION OF HEMATOPOIETIC CHIMERISM: TOWARD THE CLINIC Given the very encouraging results obtained with mixed hematopoietic chimerism in rodents, several groups have attempted to induce hematopoietic chimerism and transplantation tolerance in large animal models (Wekerle and Sykes, 1999; Cosimi and Sachs, 2004; Horner et al., 2006). Experimental protocols are necessarily more complex than in rodents since adult recipients were used and high dose whole body irradiation is associated with a too high level of morbidity. A combination of immunosuppressive drugs and antibodies, as well as lower levels of irradiation or irradiation limited to lymphoid organs, was therefore used as conditioning regimen (Table 2). In miniature swine, a preconditioning of T cell depletion, low dose total body irradiation, thymic irradiation, and splenectomy, followed by bone-marrow and skin transplantation, led to persistent hematopoietic chimerism in five out of six animals. Four of these animals were transplanted with donor skin. Half of these animals appeared to accept, but the other half rejected the skin allografts (Fuchimoto et al., 2000). Also using a milder conditioning regimen, persistent chimerism was obtained in miniature swine and one out of two skin grafts appeared to be permanently accepted (Fuchimoto et al., 2000). When the latter protocol was used for kidney transplantation, four out of four allografts survived more than 100 days (Fuchimoto et al., 2000, 2001). Therefore, as observed in rodents, persistent hematopoietic chimerism led to an incomplete level of allograft tolerance that appeared efficient for protection of poorly immunogenic organs such as kidney but fails to prevent rejection of highly immunogenic skin allografts. In Cynomolgus monkeys, a preconditioning regimen was used that consisted of T cell depletion, low dose total body irradiation, thymic irradiation, and splenectomy, followed by bonemarrow and kidney transplantation (Kawai et al., 1995, 2002, 2004; Frontiers in Immunology | Immunological Tolerance Hematopoietic chimerism, Treg, and transplantation tolerance Kimikawa et al., 1997b). Only transient hematopoietic chimerism was observed, but nevertheless 8 out of 15 grafts did not show signs of rejection (Table 2). An acute cellular rejection process led to the loss of the other grafts (Kimikawa et al., 1997a; Kawai et al., 1999). A similar preconditioning regimen was used for monkeys that received a cardiac allograft. Three out of five animals developed transient chimerism, but all five hearts were eventually lost by a rejection-process characterized by cellular infiltrates (Kawai et al., 2002). The observation that kidney allografts were more likely to be accepted than heart allografts confirmed earlier data on transplantation in miniature swine that, interestingly, also showed that kidneys can play an important role in tolerance to heart allografts (Madsen et al., 1998; Mezrich et al., 2003a,b). Taken together these data highlight the difficulty to obtain an efficient and persistent engraftment of hematopoietic stem cells in large animal models. When only transient, hematopoietic chimerism induces tolerance mechanisms that are probably different from and less efficient than those induced in hosts with long-term persistence of hematopoietic donor cells. INDUCTION OF HEMATOPOIETIC CHIMERISM: IN THE CLINIC Based on the promising results in monkeys, induction of hematopoietic chimerism for prevention of allograft rejection has also been performed in humans (Table 3). Infusion of donor bone-marrow showed some beneficial effect in renal allograft recipients (Monaco, 2003). Interestingly, in an early report in which large numbers of patients were described, infusion of donor bone marrow, leading to transient chimerism, inhibited acute but not chronic rejection (Barber et al., 1991; McDaniel et al., 1994). One of the first reported cases of long-term allograft survival achieved by induction of hematopoietic chimerism concerned a woman with end-stage renal disease secondary to multiple myeloma (Spitzer et al., 1999). The patient received an immunosuppressive but non-myeloablative conditioning regimen. HLAmatched bone marrow and kidney from the patient’s sister were transplanted and the immunosuppressive drug cyclosporine A administered for 73 days. Whereas the hematopoietic chimerism disappeared after discontinuation of immunosuppression, the kidney remained functional for at least another 7 years (Fudaba et al., 2006). In total, six multiple myeloma patients receiving this treatment have been reported and all maintained renal function after discontinuation of immunosuppression for 2– 7 years (Spitzer et al., 1999; Buhler et al., 2002; Fudaba et al., 2006). Stem-cell transfusion was also shown to have a beneficial effect in liver transplantation (Donckier et al., 2004). Another example concerned a patient with end-stage renal disease who received an HLA-matched kidney graft. The conditioning regimen, which included total lymphoid irradiation, immunosuppression, and a graft of mobilized CD34+ stem cells, led to persistent hematopoietic chimerism. At the time of publication, the renal graft had remained functional for 34 months (Scandling et al., 2008). Induction of hematopoietic chimerism followed by kidney transplantation was also performed with HLA single haplotype mismatched grafts (Kawai et al., 2008), a clinically important setting. Five patients with end-stage renal disease received an immunosuppressive but non-myeloablative preparative regimen December 2011 | Volume 2 | Article 80 | 4 Pasquet et al. Hematopoietic chimerism, Treg, and transplantation tolerance Table 1 | Combined bone-marrow and organ transplantation in the mouse: non-myelo- and lymphoablative procedures. BM/SC graft => host Organ/tissue Conditioninga Hematopoietic Allograft survival Reference αCD154 and 7/7 > day 70 (no Larsen et al. (1996) CTLA4-Ig chronic rejection at chimerismb graft ANTIBODIES No BM, C3H host BALB/c heart d63) BALB/c skin 15/15 > day 50 (no chronic rejection at day 50) B10.A => B6 B10.A skin B10.A => B6 B10.A skin BALB/c => B6 BALB/c skin BALB/c => B6 BALB/c heart αCD154 and Persistent 8/8 at day 145 Wekerle et al. (2000) CTLA4-Ig αCD154 and Transient 1/5 at day 145 Persistent 7/9 at day 160 Wekerle et al. (1998) Persistent 7/7 at day 250 Adams et al. (2001) Undetectable 8/9 at day 180, Shirasugi et al. (2002) CTLA4-Ig, sublethal TBI αCD154 and CTLA4-Ig, BUS αCD154 and CTLA4-Ig chronic rejection at day 300 in 8/8 hosts αCD154 and Persistent CTLA4-Ig, BUS 5/5 at day 180, no chronic rejection at day 300 BALB/c => B6 BALB/c αCD154 and intestine CTLA4-Ig, BUS BALB/c => B6 BALB/c skin αCD154 and BALB/c => B6 BALB/c skin Persistent 5/7 at day 92 Guo et al. (2003) Persistent? 7/7 at day 170 Pilat et al. (2010) Persistent 0/4 at day 60 Luo et al. (2007) CTLA4-Ig, Rapa, Treg low dose TBI, αCD154 B6.C-H-2d skin BALB/c => B6 BALB/c skin αCD154 4/4 > day 180 Persistent 4/7 > day 270 Metzler et al. (2004) andαLFA-1 αCD154 and Rapa 4/7 > day 226 αCD154 and BUS 22/24: chronic and various rejection BALB/c heart 4/24: mild chronic rejection BALB/c => B6 BALB/c skin αLFA-1 and Rapa BALB/c Rapa, low dose pancreatic TBI 0/6 day 117 Persistent 6/6 > day 100 Luo et al. (2005) Persistent 8/8 at day 240 Qin et al. (1990) 7/7 at day 100 Pearson et al. (1992) 10/15 at day 159 Mayumi and Good (1989) islets B10.BR => CBA B10.BR skin B10 DST => C3H C3H heart αCD4(nd) N/D BALB/c => B6 BALB/c skin SC, CP, αThy1 Persistent B6 => C3H αCD4 andαCD8(nd) DRUGS BALB/c = > C3H BALB/c skin 7/8 at day 165 B6 skin 4/9 at day 185 C3H => B6 C3H skin B10.BR or B10.BR or BALB/c => B10 BALB/c skin 0/19 (chronic rejection) Sublethal TBI, CP Persistent 9/10 at day 60 Colson et al. (1995a) (Continued) www.frontiersin.org December 2011 | Volume 2 | Article 80 | 5 Pasquet et al. Hematopoietic chimerism, Treg, and transplantation tolerance Table 1 | Continued Conditioninga BM/SC graft => Organ/tissue host graft BALB/c => B10 BALB/c heart B10.A(5R) skin SC, CP Transient 4/10 at day 200 Tomita et al. (1990b) C3H => AKR C3H skin SC, CP Transient 5/8 at day 100=> Tomita et al. (1990a) B10.BR skin 5/6 at day 100 AKR => C3H B10.D2 => BALB/c B10.A(5R) => B10 B10.BR => AKR Hematopoietic Allograft survival 6/6 > day 420 AKR skin 5/8 at day 100 B10.BR => C3H B10.BR skin 4/8 at day 100 B10.D2 skin 5/6 at day 100 B10 => AKR B10 skin 0/6 at day 12 B6 => C3H B6 skin 0/6 at day 13=> B6 => AKR B6 skin AKR SC => C3H AKR skin 0/6 at day 12 CP Persistent 9/10, day 120 AKR SC => C3H B10.BR skin B10.BR skin 10/10 at day 120 B10.BR SC => C3H AKR skin 0/5 at day 14 DBA/2 => BALB/c DBA/2 skin 8/10 at day 80 DBA/2 => BALB B10.D2 skin DBA/2 DBA/2 skin B10.BR SC => C3H Reference chimerismb Eto et al. (1990) 0/5 at day 13 0/5 at day 13 CP SC => BALB/c wt DBA/2 SC =>Vα14 Persistent 6/6 at day 100 Iwai et al. (2006) 6/6 at day 100 Mapara et al. (2001) 0/6 at day 50 NKT KO B10.A => B6 B10.A skin αCD4(d) and Persistent αCD8(d), CP, TI, TBI a α, antibody to; BUS, busulfan; CP, cyclophosphamide; nd, non-depleting; SC, CD34+ stem cells; TBI, total body irradiation; TI, thymic irradiation; Treg, CD4+CD25+ regulatory T cells. b N/D, not detected. and a combined bone-marrow/renal allograft. All developed a transient multi-lineage chimerism. Whereas one patient lost the allograft by acute humoral rejection 10 days post transplantation, four out of the five patients, treated with a combination of immunosuppressive drugs for up to 14 months, maintained renal function for up to 1400 days thereafter. Renal biopsies showed normal tissue for three of these patients, with some minor signs of chronic rejection for the fourth. In vitro studies suggested specific absence of T cell-responses to directly presented alloantigens. However, two out of the four patients later developed alloantibodies, one showing complement depositions in the graft (Porcheray et al., 2009). It needs to be emphasized that T cell reactivity to indirectly presented donor antigens is required for alloantibody-production by host B-lymphocytes. The apparent absence of T cell response to directly presented alloantigens and the production of alloantibodies are therefore not in contradiction. Combined, these studies suggested that long-term acceptance of (though not genuine immunological tolerance to) kidney allografts can be obtained by a therapy including induction of transient hematopoietic chimerism and therefore represented a major step forward in transplantation medicine. Less promising results were obtained in a study in which HLAmismatched pancreatic islets were transplanted into type I diabetes patients (Mineo et al., 2008). The conditioning regimen used Frontiers in Immunology | Immunological Tolerance was very mild but nevertheless led to transient hematopoietic chimerism. However, all four patients that initially adhered to immunosuppressive therapy lost graft-function rapidly after drug weaning. A ROLE FOR REGULATORY T CELLS IN HEMATOPOIETIC CHIMERISM-ASSOCIATED TOLERANCE? At this point, one might wonder if more work is warranted to obtain tolerance to (and therefore permanent acceptance of) organ allografts. When considering the very promising results obtained with kidney allografts in humans, one has to keep in mind that this organ might represent a special case. The human islet study failed, and the monkey and swine studies gave substantially less satisfying results with skin and heart allografts than with renal transplants. Moreover, in miniature swine it was shown that kidney allografts induced tolerance to heart allografts (Madsen et al., 1998). The thymus and Treg may play a role in this phenomenon (Yamada et al., 1999; Mezrich et al., 2003a). To induce genuine immunological tolerance to donor tissues, hematopoietic chimerism needs to persist in the long term to continuously induce tolerance of newly developing lymphocytes in primary lymphoid organs. Indeed, if hematopoietic chimerism is only transient, mature allospecific lymphocytes will develop and, in the absence of dominant tolerance mechanisms, will eventually destroy the graft. Long-term hematopoietic chimerism has December 2011 | Volume 2 | Article 80 | 6 Pasquet et al. Hematopoietic chimerism, Treg, and transplantation tolerance Table 2 | Combined bone-marrow and organ transplantation in large animals and non-human primates. Species “Cattle” Organ Conditioninga Immuno- Hematopoietic Allograft suppression chimerismc survivald Reference Skin Co-twins None Persistent 30% at 2 years Stone et al. (1971) Body Co-twins None Persistent 0/10 at day 68 Emery and McCul- skin lagh (1980) Auricular 5/12 > day 60 skin Dog Heart Kidney Miniature TLI, donor BM ALS, donor BM ±ATG, ±MTX, N/A 0/29 at day 329 Strober et al. (1984) None N/A >14b , >17b , >38b , >78b Caridis et al. (1973) ±CsA d, ≤ 4/24 Kidney ALS, donor BM None N/A Kidney Lethal TBI ± CP None Persistent αCD3-DT; TBI; TI; donor 30 days CsA Persistent 45, 50, >50, >235 days Huang et al. (2000) 30 days CsA Persistent >300, 45 days Fuchimoto swine Skin 0/13 at day 300 Hartner et al. (1986) >200, >200, >200, >200, Guzzetta et al. (1991) 75 BM Skin αCD3-DT; TI; donor PBSC Kidney Rhesus >120, >180, >100 days, Fuchimoto “long term” (2000, 2001) et al. ATG, donor BM None N/A 20% at day 240 Thomas et al. (1983, Kidney ATG; TBI; TI; 4 weeks CsA Transient >3478, >2569, >834e , Kawai et al. (1995), >771e , >405e , 260, Kimikawa >198e , >196e , >137e , 72, (1997b), Kawai et al. 44, 40, 37, 40, 37 days (2002, 2004) 1987) monkey splenectomy; donor BM Heart N/D 14, 175 days Transient 509, 428, 138 days N/D 56, 43 days Kidney ATG; TBI; TI; donor BM 4 weeks CsA Transient 117, 95, 43 Kidney ATG; TBI; TI; donor BM; 4 weeks CsA Transient >1710, >1167, 755, 206, aCD154 a al. Kidney monkey Cynomolgus et (2000) et al. Kawai et al. (2004) 837, 401, 373, 58 α, antibody to; αCD3-DT, anti-CD3 antibody coupled to diphtheria toxin; ALS, anti-lymphocyte serum; ATG, antithymocyte globulin; BM, bone marrow; CP, cyclophos- phamide; PBSC, peripheral blood stem cells; TBI, total body irradiation; TI, thymic irradiation; TLI, total lymphoid irradiation. b Renal allografts that were not rejected but were lost for other reasons. c N/A, not analyzed; N/D, not detected. d Animals that rejected their allografts are indicated in bold. e Renal allografts that were not rejected but were lost for other reasons. been achieved with very aggressive conditioning regimens inducing total host T cell depletion. However, the level of toxicity and the severe immunosuppression associated with this type of treatment do not allow their use in the clinic. Alternative conditioning regimens have been envisaged to avoid rejection of donor bone marrow while allowing for survival of part of the host T cells. They included the injection of non-depleting antibodies to block T cell co-stimulatory pathways and the injection of antibodies specific for some T cell markers upregulated upon activation. As described throughout this review, these methods gave very promising results in rodents. However, induction of a permanent chimerism was far more difficult to achieve in large animals. This observation might be largely responsible for the less satisfying results obtained www.frontiersin.org with heart and skin allograft in miniature swine and primates. Moreover, antibody-based therapies can also generate unpredicted side effects that complicate translation into the clinic. For example, the use of anti-CD154 antibody in a non-human primate renal allograft model led to severe thromboembolic complications (Kawai et al., 2000; Koyama et al., 2004) due to CD154 expression on activated platelets and to CD40 expression on the vascular endothelium (Henn et al., 1998; Slupsky et al., 1998). The use of anti-CD154 has also been associated with impaired humoral immunity against influenza in a heart allograft model (Crowe et al., 2003). Antibodies targeting other T cell surface markers also present limitations as targeted molecules can be expressed by other populations, e.g., CD25 on Treg. While inhibiting the allogeneic December 2011 | Volume 2 | Article 80 | 7 Pasquet et al. Hematopoietic chimerism, Treg, and transplantation tolerance Table 3 | Combined bone-marrow and organ transplantation in humans. Organ Kidney (HLA-matched) Kidney Conditioninga ALG; CP ALG; CP; donor BM Donor BM Immuno- Hematopoietic Allograft suppressiona chimerismc survivalb Maintenance CsA; N/A 13/54 rejected 3/57 rejected Barber et al. (1991) azathioprine; prednisone 2 weeks Persistent 21/23 at 1 year (but McDaniel et al. (1994) microchimerism “chronic rejection”) ALG + maintenance Kidney TBI, ARA-C, CP, ATG (haplocompatible) (splenectomy) Kidney (related Not specified, prior BM donors) transplantation to treat Kidney CP; ATG; TI; donor BM Reference Transient/ND 1/7 at 1 year 10 months CsA, Pred Persistent >15 months Sorof et al. (1995) None Persistent >15, >30, >3 months Butcher et al. (1999) 2 months CsA Transient/persistent hematological disorders (HLA-matched) >7.3, >5.3, >4.3, >3.5, Spitzer et al. (1999), >2.8, >2 years Buhler et al. (2002), >34 months Scandling et al. (2008) Fudaba et al. (2006) Kidney ATG; TLI; donor PBSC 6 months CsA Persistent CP; αCD2; TI; donor BM ≤14 months CsA/Rapa Transient 1 year “Edmonton” Transient (HLA-matched) Kidney (HLA-mismatched) >1932, >1666, 10 days, Kawai et al. (2008), >1050, >707 days; Porcheray et al. (2009) donor-specific antibodies Pancreatic islet High dose HSC (HLA-mismatched) Liver a (FK506, Rapa) ATG; CP; donor HSC 28–90 days FK506, Rapa 451, 480, 178, 471, 158, Mineo et al. (2008) 510 days Transient/ND >240, >290 Donckier et al. (2004) α, antibody to; ALG, anti-lymphocyte globulin; ARA-C, arabinofuranosyl cytidine; ATG, antithymocyte globulin; BM, bone marrow; CsA, cyclosporin A; CP, cyclophos- phamide; HSC, CD34+ hematopoietic stem cells; PBSC, peripheral blood stem cells; Pred, prednisone; Rapa, Rapamycin; TBI, total body irradiation; TI, thymic irradiation; TLI, total lymphoid irradiation. b Patients that rejected their allografts are indicated in bold. c N/A, not analyzed; N/D, not detected. response, such approaches could therefore prevent the establishment of regulatory mechanisms important for graft survival. They also non-specifically inhibit T cell-dependent immunity, including protective responses against pathogens. Finally, most of the protocols used in large animals or currently tested in the clinic require strong initial immunosuppressive treatments that induce major qualitative and quantitative modifications of the immune system that last for years. In conclusion, while highly promising, these strategies still need to be optimized before going into the clinic. To overcome the issues listed above, several laboratories embarked on studies to evaluate the potential of Treg to promote allograft protection (reviewed by Li and Turka, 2010). The capacity of naturally occurring Treg to control allogeneic responses was already highlighted by Sakaguchi et al. (1995) landmark paper. Using in vivo activated polyclonal Treg with irrelevant specificity, Karim et al. (2005) first induced tolerance to allogeneic skin graft in lymphopenic Rag-deficient hosts reconstituted with naïve CD45RBhigh CD4+ T cells (Karim et al., 2005). Similar results were obtained in another lymphopenic system with in vitro expanded donor-specific Treg (Golshayan et al., 2007). Interestingly, this approach also significantly prolonged skin allograft survival in unmanipulated wild-type hosts. In a transplantation-model across minor histocompatibility antigens, another group protected male skin Frontiers in Immunology | Immunological Tolerance graft from rejection by syngeneic female hosts using Foxp3transduced male antigen-specific TCR transgenic CD4+ T cells (Chai et al., 2005). In another study, a genetically manipulated Treg population with direct and indirect alloantigen-specificity substantially prolonged skin allograft survival and delayed chronic rejection of heart allografts when co-injected with anti-CD8 antibody (Tsang et al., 2008). More recently, prevention of transplant arteriosclerosis and long-term survival of skin allograft were achieved with in vitro expanded naturally occurring CD127low CD25+ CD4+ human Treg in a chimeric humanized mouse system (Issa and Wood, 2010; Nadig et al., 2010). Combined, these reports demonstrated the capacity of Treg to delay rejection processes. Based on the large body of literature on transplantation tolerance through hematopoietic chimerism and on the immunosuppressive potential of Treg, several laboratories decided to combine Treg infusion with bone-marrow transplantation (Figure 1). This method is expected to allow the establishment of complementary tolerance mechanisms, thus mimicking the complex network of checkpoints and regulatory systems naturally involved in maintenance of self-tolerance (Figure 2). Moreover, in addition to their general modulatory effects on the reactivity of the immune system, Treg expressing the transcription factor Foxp3 have the capacity to establish an immune-privileged niche for allogeneic hematopoietic stem cells after transplantation into non-irradiated recipients December 2011 | Volume 2 | Article 80 | 8 Pasquet et al. FIGURE 1 | A regulatory T cell/hematopoietic chimerism-based protocol for induction of transplantation tolerance. (1) The allograft (e.g., heart) will be transplanted with concomitant infusion of donor BM or HSC into conditioned hosts. Rejection of the grafts will temporarily be prevented using an immunosuppressive regimen. (2) Donor (a) and host (b) BM will be cultured in vitro under conditions allowing for differentiation of DC. Host DC will be pulsed with donor antigen to assure indirect presentation of (Fujisaki et al., 2011). The co-injection of Treg with allogeneic bone-marrow should therefore promote its engraftment. Administration of donor-specific Treg prevented rejection of bone-marrow allografts in preconditioned mice (Joffre et al., 2004; Joffre and van Meerwijk, 2006). Promising results were later obtained using polyclonal donor Treg (Hanash and Levy, 2005). However, similar protocols failed to substantially prolong survival of skin and heart allografts (Joffre et al., 2008; Tsang et al., 2008; Pilat et al., 2010). In contrast, when combined with bone-marrow transplantation, administration of a single dose of Treg fully prevented rejection of skin and heart (Joffre et al., 2008). Whereas Treg specific for directly presented donor-antigens allowed for survival of bonemarrow allografts, they failed to prevent chronic rejection of skin and heart. In contrast, Treg specific for indirectly presented donorantigens fully prevented chronic heart and skin allograft rejection (Joffre et al., 2008). These results firmly demonstrated the clinical potential of Treg infusion in induction of bone-marrow chimerism www.frontiersin.org Hematopoietic chimerism, Treg, and transplantation tolerance these antigens. Thus generated DC will then be co-cultured with host-derived Treg (c), allowing for expansion of Treg specific for directly and indirectly presented donor antigens. (3) Thus generated donor-antigen-specific Treg will then be infused into the host. Immunosuppression may temporarily be continued using drugs that do not affect Treg (e.g., Rapamycin). Using this protocol, full tolerance to donor-tissue will be achieved and chronic rejection effectively prevented. and in the subsequent prevention of acute and chronic allograft rejection. TREG AND HEMATOPOIETIC CHIMERISM-BASED STRATEGIES: SOME LIMITATIONS TO OVERCOME The data described above constitute a proof of principle that combining Treg and bone-marrow infusion can lead to subsequent tolerance to allogeneic tissues, even in very stringent donor/host combinations and for highly immunogenic tissues such as the skin. However, 5 Gy total body irradiation was required in that protocol (Joffre et al., 2008). This dose appears not suitable for clinical use as it is associated with severe temporary leukopenia. Interestingly, the group of Wekerle recently induced hematopoietic chimerism in mice using a comparable approach, but without or with very limited cytoreductive conditioning (Pilat et al., 2010, 2011). Treatment with costimulation-blocking agents, a short course of rapamycin, and injection of polyclonal Treg allowed for December 2011 | Volume 2 | Article 80 | 9 Pasquet et al. FIGURE 2 | Tolerance mechanisms induced by the proposed regulatory T cell/hematopoietic chimerism-based protocol for induction of transplantation tolerance. (1) Hematopoietic cells (e.g., DC) derived from the grafted BM will colonize the recipient’s thymus and induce deletion and anergy (i.e., “recessive tolerance”) of developing donor-specific host T lymphocytes. DC may also promote limited differentiation of donor-specific Treg that will contribute to transplantation tolerance. (2) Donor DC will also induce recessive tolerance of mature peripheral donor-specific T lymphocytes. These induction of hematopoietic chimerism. Skin grafts transplanted on these mice survived for more than 160 days, without signs of rejection or appearance of donor-specific antibodies (Pilat et al., 2010). More recently, this group raised similar conclusions using polyclonal host CD4+ lymphocytes previously transduced with a retroviral vector containing Foxp3 and a drug-free conditioning regimen where 1 Gy total body irradiation replaced the short course of rapamycin (Pilat et al., 2011). These protocols represent a major step forward to the clinic. However, they still rely on anti-CD154 treatment and this antibody is presently not usable in patients (see above). Different non-mutually exclusive strategies can be envisaged to avoid co-stimulatory-blockade. The use of hematopoietic or mesenchymal stem cells instead of bonemarrow cells could be an option, as this will significantly reduce the immunogenicity of the graft. Another strategy would be to improve the efficiency of the immunosuppression by injecting donor-specific Treg. Alloantigen-specific T cells survived longer and in several transplantation models gave substantially better results than polyclonal Tregs with irrelevant specificity (Joffre et al., 2004, 2008; Nishimura et al., 2004; Golshayan et al., 2007). Another aspect that still needs to be tested before translating Treg-based strategies into the clinic is represented by the Frontiers in Immunology | Immunological Tolerance Hematopoietic chimerism, Treg, and transplantation tolerance cells may, to a limited extent, directly induce donor-specific Treg. However, the dominant tolerance (i.e., Treg) induce by hematopoietic chimerism in (1) and (2) appears insufficient to durably prevent most notably chronic allograft rejection. (3) Infusion of donor-specific Treg will aid in engraftment of grafted donor BM/HSC (a) and inhibit the reactivity of mature peripheral donor-specific T lymphocytes (b), thus favoring graft-acceptance. They will also allow the differentiation of donor-specific conventional T lymphocytes into Treg (c), thus assuring persistence of tolerance and preventing chronic allograft rejection. antigen-specificity of the treatments. Indeed, if Treg activation is antigen specific, these cells exert their suppressor effector function in a non-antigen-specific-manner in vitro (Thornton and Shevach, 2000). If true in vivo, infused Treg may therefore inhibit protective immunity. However, it has been shown that hematopoietic chimerism/Treg-based therapy against allograft rejection is (at least) donor specific. A related issue is that tolerance to donorantigen may be broken by (e.g., viral) infection (Welsh et al., 2000; Williams et al., 2001; Forman et al., 2002). It therefore also needs to be verified to what extent Treg-based therapies are resistant to infection. Experimental work will need to be performed to clarify these important issues. Finally, infused Treg do not necessarily survive indefinitely and tolerance may therefore wane away with time. In other transplantation models, however, it was shown that a tolerant T cell population can render naïve T cells tolerant and even tolerogenic (Waldmann, 2010). Very recently it was shown that this so-called “infectious tolerance” depends on Treg that induce novel Treg required for persistence of tolerance to allografts (Kendal et al., 2011). Even if it remains to be shown that also infused Treg can cause infectious tolerance, it appears therefore that Treg can induce life-long tolerance to allografts. December 2011 | Volume 2 | Article 80 | 10 Pasquet et al. Hematopoietic chimerism, Treg, and transplantation tolerance CONCLUSION The data discussed here indicate that induction of persistent hematopoietic chimerism combined with infusion of Treg with appropriate specificity efficiently leads to life-long tolerance to allografts in experimental animal models (Figure 1). Thus, and not very surprisingly so, the mechanisms involved in the maintenance of tolerance to self antigens also appear required for tolerance to donor antigens (Figure 2). More work will need to be performed REFERENCES Adams, A. B., Durham, M. M., Kean, L., Shirasugi, N., Ha, J., Williams, M. A., Rees, P. A., Cheung, M. C., Mittelstaedt, S., Bingaman, A. W., Archer, D. R., Pearson, T. C., Waller, E. K., and Larsen, C. P. (2001). Costimulation blockade, busulfan, and bone marrow promote titratable macrochimerism, induce transplantation tolerance, and correct genetic hemoglobinopathies with minimal myelosuppression. J. Immunol. 167, 1103–1111. Alard, P., Matriano, J. A., Socarras, S., Ortega, M.-A., and Streilein, J. W. (1995). Detection of donor-derived cells by polymerase chain reaction in neonatally tolerant mice. Transplantation 60, 1125–1130. Anderson, G., Partington, K. M., and Jenkinson, E. J. (1998). 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Citation: Pasquet L, Joffre O, Santolaria T and van Meerwijk JPM (2011) Hematopoietic chimerism and transplantation tolerance: a role for regulatory T cells. Front. Immun. 2:80. doi: 10.3389/fimmu.2011.00080 This article was submitted to Frontiers in Immunological Tolerance, a specialty of Frontiers in Immunology. Copyright © 2011 Pasquet , Joffre, Santolaria and van Meerwijk. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non Commercial License, which permits non-commercial use, distribution, and reproduction in other forums, provided the original authors and source are credited. December 2011 | Volume 2 | Article 80 | 15 REFER ENC ES B IB LIOGRAPHIQUE S 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Porritt, H.E., Gordon, K. & Petrie, H.T. Kinetics of steady-state differentiation and mapping of intrathymic-signaling environments by stem cell transplantation in nonirradiated mice. J Exp Med 198, 957-962 (2003). 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