cours 2 transfection de plasmides

Biocell
C. Alcaide
16/01/2012
Cours 2 - Transfection de plasmides dans des cellules
La transfection consiste juste à faire entrer de l'ADN dans une cellule. On s'en sert
énormément en biologie cellulaire pour faire des surexpressions, on va essayer d'avoir
des localisations avec des molécules étiquettées...
On prend un plasmide qu'on veut faire entrer dans une cellule, le problème est que l'ADN
est chargé négativement et la surface cellulaire aussi donc normalement ça ne peut pas
entrer.
Donc le seul et unique but de la transfection est de rendre l'ADN positif.
1) Phosphate de calcium Le calcium est chargé positivement
donc on fait un précipité de calcium
autour de l'ADN pour gainé
complètement l'ADN avec ce
calcium chargé positivement. Cette technique était très longue.
2) Liposome
Des phospholipides cationique vont s'organiser en micelles et les liposomes vont venir se
coller sur l'ADN et vont littéralement l'empacter.
Ce complexe liposomes/ADN va pouvoir être capté par endocytose par les cellules (car on
a une charge positive) en entrant en contact avec la surface cellulaire pour entrer dans la
cellule.
Les protocoles sont très simples et rapides.
Certains kits peuvent permettre de faire entrer des ARN dans les cellules.
Cependant on ne sait pas comment ces ADN qui ont subi l'endocytose et sont donc dans
des endosomes vont se retrouver au noyau.
3) Electroporation
On met des cellules dans une cuvette avec de part et d'autre deux électrodes et on va
exercer choc électrique très rapide, de l'ordre de la milliseconde, et très fort pour que la
membrane se perméabilise de manière transitoire pour ne pas que la cellule explose mais
par contre elle fait entrer le matériel à l'intérieur. On casse la membrane très rapidement
mais de façons tellement transitoire que normalement la cellule n'a pas le temps
d'exploser.
Le problème est qu'il faut régler 3 paramètres, le temps de permeabilisation, la densité du
champ électrique et la résistance. Beaucoup de cellules meurent durant ce traitement.
On se sert de cette technique quand on n'a plus d'espoir.
Pour certains types cellulaires, des appareillages spécifiques avec des milieux tampon
spécifique des cellules permettent un bon résultat pour ces lignées.
4) Efficacité de transfection
Nombre de cellules transfectées versus le nombre de cellules dans le,flacon de culture.
Ça correspond au nombre de cellules qui ont été transfectées.
Ca peut être extrêmement variable en fonction de du milieu qu'on utilise (de 0 à 95% de
cellules transfectées). Certains types cellulaires sont intransfectables, personne n'a mis au
point le protocole qui permet de les transfecter. • Comment l'évaluer? On se sert de gènes rapporteurs.
On transfecte les cellules avec de la beta-galactosidase puis on révèle par le X-Gal. Ca ne
s'utilise plus trop mais on le voit encore dans certains papier. Le plus pratique est d'utiliser la cytometrie en flux et donc la fluorescence, on transfecte
les cellules avec de la GFP et on passe directement les cellules en cytométrie en flux
(sans marquage puisque les cellules sont déjà fluorescentes) qui va nous donner le
pourcentage de cellules transfectées. Quand on a une nouvelle lignée c'est essentielle de tester les conditions de transfection.
• Transfection transitoire : Analyse de l'expression au bout de 24 a 48 heures. Le plasmide est dans le noyau mais il
n'est pas encore intégré au chromosome mais il peut être transcrit. Cependant puisqu'il
n'est pas intégré il peut être perdu au cours des divisions cellulaires.
• Expression stable: On transfecte avec un plasmide qui comporte un gène de résistance a un antibiotique et
on va mettre les cellules,en sélection dans cet antibiotique. En général on utilise la
neomycine. On met les cellules pendant 2-3 semaines dans le milieu qui comporte
l'antibiotique et seules les cellules qui vont exprimer le plasmide de façon stable vont
pousser dans ce milieu la. Il y a plein de cellules qui vont perdre le plasmide, il y a entre 1
et 10% de cellules qui vont être capable d'intégrer ce morceau de plasmide dans le
chromosome et ce sont celles la qu'on veut sélectionner. En milieu de sélection, sur le
long terme, celles qui n'ont pas intégrer le plasmide vont mourir mais celles qui ont intégré
le plasmide vont se maintenir. Ça va faire des cellules qui vont exprimer le plasmide de
façon stable. L'intérêt est que normalement toutes les cellules transfectées expriment le gène qu'on a
intégré. Le problème est que le plasmide, en s'intégrant, peut avoir subi des modifications, par
exemple on peut perdre un morceau du gêne qu'on a intégrer, une insertion en copie
multiple qui va donner une expression très importante de ce gêne, il y a des problèmes de
mutagenèse...
Quand on veut un promoteur fort ou faible, il est clair que l'endroit ou va s'intégrer le
plasmide va être important.
La transfection stable peut être un vrai problème puisqu'il peut y avoir pleins d'anomalies
d'autant plus que le plasmide en s'intégrant peut avoir en plus créer des mutations dans le
chromosome.
C'est bien car s'est supposé être stable mais cela demande beaucoup de vérification pour
voir que ce qu'on exprime bien ce qu'on veut, de la taille qu'on veut, qu'on à pas eu d'effet
bizarre dût à l'insertion, des anomalies d'expressions ou des réarrangements, des
cassures de transgènes...
5) Autres méthodologies
Pour les cellules qui sont réticentes à tout ce qu'on vient de voir, il y a quand même la
Micro injection mais il ne faut pas oublier que c'est cellule par cellule on injecte du matériel
génétique par une microseringue. En plus pour micro injecter il faut que les cellules soient
collées , si les cellules sont en suspension les cellules s'en vont quand la seringue arrive
et pour certaines cellules on a du mal à les faire adhérer à quelque chose. C'est donc en
dernier recours pour les cellules qu'on ne peut pas transfecter autrement, on à la
beaucoup de matériel et c'est généralement utilisé pour faire de l'imagerie après.
L'utilisation de virus est de plus en plus importante.