» Cellules tumorales et ADN libre circulant

Cellules tumorales
et ADN libre circulant
dossier
thématique
Les cellules tumorales circulantes :
place actuelle et perspectives
en oncologie thoracique
Circulating tumor cells: current state and perspectives
in thoracic oncology
Paul Hofman*
génotypique des cellules tumorales circulantes (CTC) chez les
patients atteints d’un cancer du poumon représentent actuellement
un enjeu majeur en oncologie thoracique. En effet, outre son intérêt
pronostique, ceci devrait permettre d’optimiser le monitoring de
ces patients et d’adapter le traitement selon leur présence et/ou la
détection d’altérations génomiques en leur sein. Toutefois, malgré
l’engouement dans ce domaine, ces analyses ne sont pas encore
appliquées en pratique clinique quotidienne. Nous décrivons ici
l’intérêt de ce champ d’application en oncologie thoracique et les
contraintes d’une telle approche.
Summary
RÉSUMÉ
» La mise en évidence et la caractérisation phénotypique et
Mots-clés : Cancer du poumon – Pronostic – Cellules tumorales
circulantes – Thérapie ciblée.
M
* Laboratoire de
pathologie clinique et
expérimentale, hôpital
Pasteur, centre hospitalo­
universitaire de Nice et
Institute for Research on
Cancer and Aging (IRCAN),
Inserm U1081 CNRS/
UMR CNRS 7284, centre
de lutte contre le cancer
Antoine­Lacassagne,
université de Nice Sophia
Antipolis.
168
algré les progrès thérapeutiques récents
réalisés dans le cadre de la prise en charge
des cancers pulmonaires, le pronostic de ces
tumeurs reste sombre à 5 ans tous stades confondus.
Parmi les raisons pouvant expliquer ce mauvais pronostic, on peut citer le fait que ces cancers longtemps
asymptomatiques sont diagnostiqués dans la majorité
des cas à un stade métastatique, que le monitoring
“biologique” de ces tumeurs chez les patients ayant
été opérés ou bien sous traitement médicamenteux est
difficile et que des altérations génomiques responsables
de résistances thérapeutiques secondaires sont souvent
détectées trop tard, voire pas du tout. Ainsi, il est urgent
d’identifier de nouveaux biomarqueurs spécifiques et
sensibles, aisément détectables et de façon répétée.
C’est dans ce cadre que l’isolement et la caractérisation
des cellules tumorales circulantes (CTC) dans le sang
des patients atteints d’un cancer du poumon prennent
toute leur importance. Compte tenu des progrès technologiques récents visant à mettre en évidence ces CTC,
et de l’émergence croissante de nouvelles thérapies
The detection and the phenotypic and genotypic
characterisation of the circulating tumor cells (CTCs) in lung
cancer patients are currently major challenges in thoracic
oncology. This approach should help in prognosis evaluation
and optimization of patients monitoring and allow to adapt
the treatment according to the presence of CTCs and/or to the
detection of genomic alterations in CTCs. However, despite
the strong interest in this domain, these analyses are not
applied in a daily routine practice. Here, we describe the main
current interests and some of the constraints of this approach
in thoracic oncology.
Keywords: Lung cancer – Prognosis – Circulating tumor cells
– Targeted therapy.
ciblées sur des anomalies moléculaires et des voies de
signalisation activées au sein des cellules cancéreuses,
ce champ d’investigation devient un challenge majeur
en oncologie thoracique. Le nombre croissant des publications (notamment de revues générales) sur ce sujet
traduit parfaitement cet engouement (1-6).
Physiopathologie des cellules tumorales
circulantes et cancer du poumon
La dissémination métastatique des carcinomes bronchopulmonaires se fait via la progression dans les
vaisseaux de cellules tumorales issues de la tumeur
primitive. Ce passage se fait progressivement, même
en cas de tumeur pulmonaire de très petite taille
et avant toute résection chirurgicale (7). Lors d’une
intervention chirurgicale, un grand nombre de cellules
tumorales peut passer dans la circulation sanguine
sans que la responsabilité de ces cellules tumorales
ainsi relarguées dans le futur développement de méta-
Correspondances en Onco-Théranostic - Vol. II - n° 4 - octobre-novembre-décembre 2013
Les cellules tumorales circulantes : place actuelle et perspectives en oncologie thoracique
stases soit réellement démontrée (8). Le passage dans
le sang est associé, pour un grand nombre de cellules
tumorales, à une modification phénotypique, à la perte
plus ou moins complète des marqueurs épithéliaux
(notamment des cytokératines et de l’e-cadhérine)
et à l’apparition des marqueurs mésenchymateux,
en particulier de la vimentine (9, 10). Ce phénomène
de transition épithéliomésenchymateuse permet aux
cellules tumorales d’avoir une plus grande plasticité,
d’augmenter leur capacité migratoire et invasive, et
aussi, probablement, de mieux se protéger de la pression existant dans le flux sanguin. Les cellules tumorales
circulantes résistent aussi au phénomène d’anoïkis
grâce à ces modifications phénotypiques. Chez un
patient atteint d’un cancer pulmonaire, certaines CTC
migrent dans le flux circulatoire de façon groupée et
sous forme de microemboles, ce qui semble favoriser
leur survie (11). Le profil phénotypique de ces cellules
tumorales associées aux microemboles montre que
certaines d’entre elles n’expriment plus le phénotype
épithélial mais un phénotype mésenchymateux, ce
qui peut permettre une migration collective. Une fois
arrivées sur le site métastatique, les CTC acquièrent à
nouveau un phénotype épithélial dans un phénomène
dit de transition mésenchymatoépithéliomateuse. Fait
marquant, il a été démontré récemment que les CTC
peuvent venir recoloniser le site tumoral primitif d’où
elles se sont détachées (12).
Les méthodes de détection des CTC
en oncologie thoracique
Les méthodes de détection des CTC chez les patients
atteints d’un cancer du poumon sont très nombreuses,
mais peu d’entres elles sont actuellement applicables
en routine ou dans les laboratoires hospitaliers, soit à
cause de leur coût, soit parce que leur sensibilité et leur
spécificité n’ont pas été validées (10). Aucune technique
n’a encore fait définitivement la preuve de sa supériorité pour une utilisation clinique quotidienne, toutes
les méthodes rapportées présentant des avantages
et des inconvénients (4, 10, 13, 14). Que doit apporter
une méthode de détection des CTC par rapport à une
méthode d’analyse tissulaire sur la tumeur primitive
ou sur la tumeur métastatique ? Cette méthode doit
être aussi sensible et spécifique et doit, idéalement,
permettre de caractériser les différentes altérations
génomiques accessibles aux nouvelles thérapeutiques.
Même s’il n’existe pas actuellement de méthode idéale
répondant à ces critères, des progrès technologiques
récents laissent entrevoir ces possibilités à court terme.
Parmi les méthodes directes ou indirectes développées
pour la mise en évidence des CTC chez les patients
atteints d’un cancer du poumon, les 2 techniques le plus
souvent utilisées par les investigateurs sont la méthode
CellSearch® et la méthode ISET® (10) [figure, p. 170]. La
méthode CellSearch® repose sur la détection de cellules circulantes exprimant des marqueurs épithéliaux.
Deux pièges sont alors possibles. Premièrement, des
cellules épithéliales bénignes circulantes peuvent être
détectées ; deuxièmement, des cellules n’exprimant
plus les cytokératines du fait d’une transition épithéliomésenchymateuse peuvent ne pas être isolées (10)
[figure, p. 170]. La méthode ISET® permet de caractériser les cellules “circulantes non hématologiques” par
leur morphologie, et des critères cytologiques de malignité peuvent être ainsi attribués aux cellules isolées
sur des filtres munis de pores (figure, p. 170). Lorsque
ces 2 méthodes sont utilisées pour détecter des CTC
dans une même cohorte de patients, on constate que
le nombre des CTC comptabilisées est différent selon
la méthode utilisée (15). Ceci amène à faire plusieurs
commentaires. Les principaux critères d’évaluation de
ces méthodes doivent intégrer, bien sûr, leur spécificité
et leur sensibilité (paramètres essentiels), mais aussi leur
coût, la faisabilité d’une mise en place dans le cadre
d’une pratique clinique, et la qualification technique et
médicale requise pour que le personnel puisse réaliser
et interpréter les résultats obtenus. L’un des paramètres
essentiels à évaluer actuellement est la possibilité de
réaliser sur les CTC isolées des examens complémentaires (biologie moléculaire et/ou immunocytochimie)
visant à identifier des biomarqueurs accessibles à des
thérapies ciblées. Ainsi, certaines techniques sophistiquées ou certaines approches ont été ou sont développées actuellement et permettent de caractériser
sur des CTC différentes altérations génomiques (mutations de l’EGFR, réarrangement du gène EML4-ALK) ou
d’autres molécules d’intérêt par biologie moléculaire
ou immunocytochimie (16-18). Ces techniques doivent
maintenant être validées sur des cohortes de patients
larges et indépendantes de façon à s’assurer de leur
reproductibilité dans plusieurs établissements de soins.
Impact pour l’évaluation du pronostic
Quelle que soit la technique employée (CellSearch® ou
ISET®), le nombre des CTC isolées est corrélé au pronostic (survie et/ou récidive métastatique) des patients
atteints d’un cancer du poumon, soit aux stades précoces de la maladie (stades I à IIIA), soit aux stades
tardifs (stades IIIB à IV) [7, 15]. Ainsi, la mise en évidence
Correspondances en Onco-Théranostic - Vol. II - n° 4 - octobre-novembre-décembre 2013
169
Cellules tumorales
et ADN libre circulant
dossier
thématique
C
A
B
D
E
Figure. Détection des cellules “circulantes non hématologiques” chez les patients atteints d’un cancer du poumon par la
méthode ISET®.
A. Équipement permettant la filtration sanguine et le recueil des cellules non hématologiques. B. Filtre poreux présentant
10 spots colorés par la coloration de May-Grünwald Giemsa (MGG) pouvant être analysés en microscopie optique. C. Cellules
“circulantes non hématologiques” montrant des critères cytologiques de malignité. D. Cellules “circulantes non hématologiques”
montrant des critères cytologiques de malignité incertaine. E. Cellules “circulantes non hématologiques” montrant des critères
cytologiques de bénignité. (C, D, E : cellules isolées en préopératoire chez des patients ayant un adénocarcinome pulmonaire
de stade II ; MGG, grossissement × 800 ; flèches : pores de 8 μm).
des CTC en phase préopératoire a été associée à un
risque plus élevé de récidive postopératoire et à une
survie diminuée (7). De la même façon, l’efficacité de la
chimiothérapie a pu être corrélée à une chute rapide du
nombre de CTC (19). Plusieurs études indépendantes
utilisant des techniques de détection différentes ont
ainsi clairement établi que la présence des CTC est un
facteur de mauvais pronostic indépendant chez les
patients atteints d’un cancer pulmonaire non à petites
cellules (4, 7, 15, 19).
Impact pour la prédiction
de la réponse thérapeutique
L’un des enjeux majeurs en oncologie thoracique est
de pouvoir prédire la réponse thérapeutique (en particulier, l’efficacité des thérapies ciblées) après analyse
et caractérisation des CTC. Des études récentes ont
montré que les mutations du gène de l’EGFR identi-
170
fiées sur les CTC des patients atteints d’un cancer du
poumon en phase métastatique étaient identiques à
celles visibles au niveau tissulaire, en particulier sur la
tumeur primitive (17). De la même façon, il y a une très
bonne concordance entre un réarrangement d’ALK (mis
en évidence par une analyse en FISH et/ou par immunocytochimie) présent sur les CTC et les tumeurs (16,
18). Ceci laisse présager plusieurs orientations :
✓ la mise en place d’une médecine stratifiée selon les
résultats obtenus à partir d’une analyse sanguine (en
particulier pour des patients dont le site à biopsier est
difficile d’accès, en cas de récidive tumorale ou chez
des patients fragilisés) ;
✓ la recherche systématique, sur un échantillon sanguin, des altérations génomiques sensibles aux ciblages
thérapeutiques (les CTC isolées étant le reflet probable
de l’ensemble des altérations génomiques présentes
sur tous les sites tumoraux) ;
✓ le développement des méthodes de “screening”
mutationnel à haut débit (PCR multiplexe ; séquençage
Correspondances en Onco-Théranostic - Vol. II - n° 4 - octobre-novembre-décembre 2013
Les cellules tumorales circulantes : place actuelle et perspectives en oncologie thoracique
nouvelle génération, analyse de type “mass array” par
un Sequenom) afin d’identifier de nouvelles mutations
ou l’association de plusieurs altérations génomiques.
Au-delà de l’intérêt théranostique, la caractérisation
moléculaire des CTC peut également aider à déterminer l’origine primitive du cancer, notamment chez des
patients atteints d’un cancer pulmonaire occulte, non
encore détectable par l’imagerie. Cette approche nécessite des analyses moléculaires dites “à haut débit”, qui
ne sont pas encore applicables en routine clinique (20).
Impact pour le diagnostic
Le pronostic des cancers du poumon est lié au diagnostic précoce de la maladie, qui permet une résection chirurgicale complète. Se pose alors la question
d’un dépistage précoce et systématique de ce cancer
dans une population ciblée et à haut risque (patients
fortement exposés au tabac, patients porteurs d’une
bronchopneumopathie chronique obstructive). En effet,
hormis une approche par imagerie de type tomodensitométrie de dernière génération (technique coûteuse
non applicable systématiquement dans une large population), il n’existe pas de biomarqueur suffisamment
spécifique et sensible permettant un dépistage précoce des cancers du poumon. L’analyse par technique
ISET® a montré que des patients atteints d’un cancer
du poumon de stade IA pouvaient avoir des CTC, ce qui
témoigne d’une dissémination précoce de la maladie
avant toute résection chirurgicale (7). Ceci confirme
bien certaines observations expérimentales objectivant une circulation très précoce des CTC à partir de
nodules tumoraux de très petite taille. Reste à définir
une technique assez sensible et assez spécifique pour
pouvoir isoler, chez des patients asymptomatiques et
à risque, des CTC issues d’une tumeur primitive de très
petite taille. Ainsi, si une telle méthode se développe ou
se confirme, on peut envisager un “pré-screening” dans
une population à haut risque et, en cas d’isolement de
CTC, un examen radiologique (ce dernier pouvant être
éventuellement répété).
Entre le doute et l’espoir
Alors que les publications s’intéressant aux CTC en oncologie thoracique sont de plus en plus nombreuses, il
n’y a toujours pas d’applications en pratique clinique,
et donc pas d’amélioration de la prise en charge. Ceci
tient certainement à différentes raisons. La première
est liée au fait que la technique CellSearch® (seule
méthode ayant obtenu l’autorisation de la Food and
Drug Administration aux États-Unis et étant considérée comme la méthode “gold standard”) a été validée
uniquement dans le cadre du suivi des patients atteints
d’un cancer du côlon, de la prostate ou du sein en phase
métastatique, et qu’elle semble moins facile à utiliser
dans le cadre des cancers du poumon métastatiques.
Le niveau de spécificité et de sensibilité des méthodes
ne semble pas satisfaire encore totalement les oncologues. De plus, la multiplicité des techniques rend
difficile leur “bonne lecture” par ces derniers, d’autant
que beaucoup de résultats publiés tardent à être validés
sur de larges cohortes de patients dans le cadre de
projets multicentriques. La technique ISET®, séduisante
par son approche cytomorphologique, nécessite pour
l’instant le traitement rapide de l’échantillon sanguin
après le prélèvement, ce qui peut apparaître comme
une contrainte si le patient est loin du laboratoire. En
France, peu de projets de recherche clinique intégrant la
détection des CTC dans les cancers du poumon ont reçu
un écho favorable lors des différents appels à projets
et sont exceptionnellement soutenus de façon institutionnelle. La grande majorité des techniques déployées
est aussi relativement coûteuse, imposant une grande
maîtrise technologique et une bonne expertise. Enfin,
d’autres approches utilisant des échantillons sanguins
sont actuellement en concurrence avec la recherche
des CTC dans les cancers du poumon, comme l’analyse de l’ADN tumoral libre plasmatique ou celle des
microARN plasmatiques (21). Toutefois, l’émergence et
l’amélioration des méthodes d’isolement et de caractérisation des CTC, la nécessité de mieux “monitorer”
sur le plan biologique les patients sous traitement, la
notion de plus en plus soulignée, dans la littérature,
d’hétérogénéité tumorale et l’apparition de mutations
de résistance sous traitement ciblé doivent permettre
à ce champ d’application de l’oncologie thoracique de
se développer assez vite, et ceci au bénéfice de l’offre
de soins aux patients.
Conclusion
La détection et la caractérisation des CTC chez un
patient atteint d’un cancer du poumon laissent persister
plusieurs interrogations en 2013 : est-ce que les cellules tumorales isolées actuellement par les différentes
techniques mises en place sont réellement les cellules
les plus agressives ? Ne passe-t-on pas à côté d’une
population cellulaire non détectée par ces méthodes
mais ayant un potentiel très invasif ? Peut-on assimiler
systématiquement les altérations génomiques détec-
Correspondances en Onco-Théranostic - Vol. II - n° 4 - octobre-novembre-décembre 2013
171
Cellules tumorales
et ADN libre circulant
dossier
L’auteur déclare ne pas
avoir de liens d’intérêts
concernant cet article.
thématique
tées dans les CTC à celles présentes au sein de la tumeur
primitive ou de ses métastases ? Les techniques utilisées
sont-elles reproductibles, suffisamment sensibles et
spécifiques pour qu’on puisse les utiliser en routine ?
Comment réduire le volume sanguin prélevé lors des
tests afin de pouvoir réaliser un monitoring régulier
des patients ? Comment prendre en charge sur le plan
économique ces examens biologiques et leur remboursement ? Au-delà de ces questions se pose la pertinence de développer de telles approches, connaissant
la faible quantité de matériel tumoral ainsi isolée dans
le sang des patients et les nombreux pièges pouvant
survenir lors des phases préanalytiques et analytiques.
Certaines perspectives peuvent répondre au moins
partiellement à ces questions. L’isolement des CTC non
fixées, “viables” et pouvant se multiplier est maintenant possible. Ces CTC “viables” pourraient alors être
implantées chez la souris, comme une xénogreffe, et
leur potentiel néoplasique ainsi que leur comportement in vivo pourraient être plus facilement étudiés.
Le développement d’analyses multicentriques utilisant la même technique ou, de façon comparative, les
différentes techniques pourrait permettre de mieux
appréhender l’apport de ce champ d’application dans
le cadre de l’offre de soins et ses conséquences socioéconomiques.
■
Références
1. Carter L, Metcalf R, Blackhall FH, Dive C, Krebs MG. Biology
logy method. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2007;55(5):189-92.
2. Fusi A, Metcalf R, Krebs M, Dive C, Blackhall F. Clinical utility of
tumor cells in patients with non-small cell lung cancer using
epithelial marker-dependent and -independent approaches.
J Thorac Oncol 2012;7(2):306-15.
and clinical relevance of circulating tumour cells. J Thorac
Dis 2012;4(5):453-5.
circulating tumour cell detection in non-small-cell lung cancer.
Curr Treat Options Oncol 2013 Aug 31. [Epub ahead of print]
3. Ma PC, Blaszkowsky L, Bharti A et al. Circulating tumor
cells and serum tumor biomarkers in small-cell lung cancer.
Anticancer Res 2003;23(1A):49-62.
4. Hofman V, Ilie I, Long E et al. Detection of circulating tumor
cells from lung cancer patients in the era of targeted therapy:
Promises, drawbacks and pitfalls. Curr Mol Med 2013. Sous
presse.
5. O’Flaherty JD, Gray S, Richard D et al. Circulating tumour
cells, their role in metastasis and their clinical utility in lung
cancer. Lung Cancer 2012;76(1):19-25.
9. Krebs MG, Hou JM, Sloane R et al. Analysis of circulating
10. Paterlini-Brechot P, Benali NL. Circulating tumor cells (CTC)
detection: clinical impact and future directions. Cancer Lett
2007;253(2):180-204.
11. Hou JM, Krebs MG, Lancashire L et al. Clinical significance
and molecular characteristics of circulating tumor cells and
circulating tumor microemboli in patients with small-cell lung
cancer. J Clin Oncol 2012;30(5):525-32.
12. Comen E, Norton L, Massagué J. Clinical implications
of cancer self-seeding. Nat Rev Clin Oncol 2011(6):369-77.
13. Hofman VJ, Ilie MI, Bonnetaud C et al. Cytopathologic
6. Young R, Pailler E, Billiot F et al. Circulating tumor cells in
lung cancer. Acta Cytol 2012;56(6):655-60.
detection of circulating tumor cells using the isolation by size
of epithelial tumor cell method: promises and pitfalls. Am J
Clin Pathol 2011;135(1):146-56.
7. Hofman V, Bonnetaud C, Ilie MI et al. Preoperative circulating
14. Hofman V, Long E, Ilie M et al. Morphological analysis
tumor cell detection using the isolation by size of epithelial
tumor cell method for patients with lung cancer is a new prognostic biomarker. Clin Cancer Res 2011;17(4):827-35.
8. Sawabata N, Okumura M, Utsumi T et al. Circulating tumor
cells in peripheral blood caused by surgical manipulation of
non-small-cell lung cancer: pilot study using an immunocyto-
of circulating tumour cells in patients undergoing surgery
for non-small cell lung carcinoma using the isolation by
size of epithelial tumour cell (ISET) method. Cytopathology
2012;23(1):30-8.
15. Hofman V, Ilie MI, Long E et al. Detection of circulating
tumor cells as a prognostic factor in patients undergoing radi-
E-JOURNAL
et
World Conference
on Lung Cancer
Retrouvez le e-journal et le diaporama sur :
➡ www.edimark.fr/ejournaux/WCLC/2013
➡ www.edimark.fr/diaporamas/WCLC/2013
Sous l’égide de
172
16. Ilie M, Long E, Butori C et al. ALK-gene rearrangement: a
comparative analysis on circulating tumour cells and tumour
tissue from patients with lung adenocarcinoma. Ann Oncol
2012;23(11):2907-13.
17. Maheswaran S, Sequist LV, Nagrath S et al. Detection of
mutations in EGFR in circulating lung-cancer cells. N Engl J
Med 2008; 359(4):366-77.
18. Pailler E, Adam J, Barthélémy A et al. Detection of circulating tumor cells harboring a unique ALK rearrangement
in ALK-positive non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol
2013;31(18):2273-81.
19. Krebs MG, Sloane R, Priest L et al. Evaluation and prognostic significance of circulating tumor cells in patients with
non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol 2011;29(12):1556-63.
20. Cassatella MC, Zorzino L, Sandri MT. Single circulating
tumor cell profiling: a new perspective for targeted therapy?
Future Oncol 2012;8(10):1253-6.
21. Sanfiorenzo C, Ilie MI, Belaid A et al. Two panels of plasma
microRNAs as non-invasive biomarkers for prediction of recurrence in resectable NSCLC. PLoS One 2013;8(1):e54596.
DIAPORAMA
Les actualités sur le cancer du poumon
d’après le congrès du 15th WCLC
cal surgery for non-small-cell lung carcinoma: comparison of
the efficacy of the CellSearch Assay™ and the isolation by size of
epithelial tumor cell method. Int J Cancer 2011;129(7):1651-60.
COORDONNATEUR
Denis Moro-Sibilot (Grenoble)
EXPERTS
Bruno Coudert (Dijon)
Éric Dansin (Lille)
Pierre Fournel (Saint-Etienne)
Nicolas Girard (Lyon)
Pierre-Jean Souquet (Lyon)
Gérard Zalcman (Caen)
Sydney,
27-30 octobre 2013
MÉDECIN JOURNALISTE
Nathalie Charbonnier (Paris)
Directeur de la publication : Claudie Damour-Terrasson
Rédacteur en chef : Pr Jean-François Morère (Bobigny et Villejuif)
Attention, ceci est un compte-rendu de congrès et/ou un recueil de résumés de communications de congrès dont l’objectif est de fournir des
informations sur l’état actuel de la recherche ; ainsi, les données présentées sont susceptibles de ne pas être validées par les autorités de
santé françaises et ne doivent donc pas être mises en pratique.Le contenu est sous la seule responsabilité du coordonnateur, des auteurs
et du directeur de la publication qui sont garants de son objectivité.
Avec le soutien institutionnel de
Correspondances en Onco-Théranostic - Vol. II - n° 4 - octobre-novembre-décembre 2013