Génomique fonctionnelle appliquée chez Drosophila melanogaster

Génomique fonctionnelle appliquée chez
l’organisme modèle Drosophila melanogaster
Melano : noir / Gaster: estomac, ventre
-Mâles et femelles faciles à distinguer (dimorphisme sexuel)
-Fécondité 40 œufs/femelle/jour
- Cycle de vie court
10 jours à 25°C
20 jours à 18°C
5 days
(0,5mm)
1day
- Développement externe
- Tissus transparents
- Développement bien caractérisé
1day
2 days
(2mm)
1day
(4,5mm)
- Durée de vie de l’adulte : entre 40 et 120 jours
Dépend du régime alimentaire et du stress (idem vertébrés).
= Régime riche
(farine de maïs) = Régime strict
Courbe de survie de mouches adultes en fonction du régime alimentaire
Durée de vie diminue avec l’augmentation des carbohydrates et du cholestérol (15%sugar/yeast)
0 day = éclosion de l’adulte
- Elevage et Entretien des stocks en laboratoire simple et peu onéreux
- Pas de stockage à long terme : pas de possibilité de congélation d’embryons
- Nombreuses Bases de Données :
Ex: FlyBase : a database for drosophila genetics and molecular biology (since 1993)
Génome :
180Mb dont 120Mb d’ euchromatine (haploide)
Séquencé en 2000 : 14,000 gènes
8 Chromosomes ( 2x3 autosomes + XX ou XY)
-2007 : Séquence du génome de 12 autres espèces
(Drosophila Comparative Genome Sequencing and Analysis Consortium)
Caractérisation des éléments fonctionnels,
de leur signature évolutive
de leur changements phylogenétiques
Comparaison des génomes de 4 eucaryotes :
Levure
Nématode
Drosophile
Homme
S. cerevisiae
C.elegans
D. melanogaster
H sapiens
Taille du génome haploide (Mb)
13
100
180
3.000
Nombre de chromosomes (n)
16
6
4
23
nd
33%
44%
57%
68%
27%
18%
1,4%
2
5
9
~100
6200
19100
~14000
~25000
Fraction non codante
(fraction transcrite/ non traduite)
Fraction codante
(fraction transcrite/ traduite )
fréquence moyenne des gènes
de la fraction codante(par kb)
Nombre de gènes
Génome compact:
Au cours de l’évolution, le génome humain subit deux duplications successive d’un génome
élémentaire non redondant représenté par le génome de la Drosophile
Comparaison des protéomes prédits de 4 eucaryotes:
Levure-Nematode-Drosophile-Homme
-Drosophile vs Levure et Nematode: 20% d’ orthologues
Processus communs aux eucaryotes ( réplication, transcription, traduction, division cellulaire…)
-Drosophile vs Nematode: 35% d’ orthologues
Processus communs aux développement des organismes pluricellulaires .
Ex: interactions cellule- cellule / cellule substrat, protéines à homéodomaines, molécules
d ’adhérence cellulaire.
Familles de protéines uniques à la drosophile.
Ex: cuticule, réponse immunitaire, protéines transmembranaires de fonctions inconnues
Drosophile vs homme: plus de 50% d’orthologues
-Haut degré de conservation des voies biologiques fondamentales.
-Différences physiologiques reflétées par l’absence de protéines spécifiques.
Ex: hémoglobines (thalassémies)
réarrangement des gènes d’immunoglobuline (système immunitaire acquis)
-Parmi 289 gènes impliqués dans des pathologies sévères, 177 (60%) ont des homologues
évidents chez la drosophile.
Utilisation de la drosophile comme système modèle pour l’étude de pathologies humaines:
Cancers, Endocrines (diabète, obésité), Métaboliques (maladie de Niemann- Pick ), Croissance et
Développement (syndrome de Cornelia-Nipbl), Neurodégénaratives (Alzheimer, Parkinson,
Paraplégie spatique) , Fertilité, Glaucome, Rénales (Acidose tubulaire), Musculaires (dystrophie
musculaire
de
Duchenne
,Syndrome
hypertrophiques et dilatées, LongQT….), etc.
de
Barth),
Cardiovasculaires
(Cardiomyopathies
Utilisation de la drosophile comme modèle d’analyse de processus complexes:
Développement - Organogenèse - Comportement
Cerveau sophistiqué
Système moteur , système sensoriel
Capacité de mémoire et d’ apprentissage
Comportements complexes
Confocal image of a whole mount adult brain immunolabelled
with anti-nc82
terminals).
Bruchpilot protein enriched in active zones of synaptic
Visualisation of cortical areas in the fly brain, including:: optic lobes (OL),
antennal lobes (AL), superior protocerebrum (SP), lateral protocerebrum
(LP), mushroom bodies (MB), deuterocerebrum (D), and subesophageal
ganglion (SG).
CNS & Neurological Disorders - Drug Targets, 2010, Vol. 9.
Drosophila flight control study:
- neural control of behavior
- neuromotor flight control pathways
Swiss Federal Institute of Technology (ETH) and University of Zürich (UZH) at the Institute of Neuroinformatics (INI) and the Institute of Robotics and Intelligent systems (IRIS).
-Système trachéal : système respiratoire, développement bronches /bronchioles
Larval tracheae
-Glandes de la lymphe : Réponse immunitaire cellulaire
-Système cardiovasculaire :système circulatoire ouvert
-Hémolymphe : équivalent du sang
-Corps gras : - équivalent du foie: métabolisme des lipides
- analogue tissu adipeux: stockage des lipides)
-Tubules de Malpighi : équivalent du rein: organe sécrétoire; sécrétion des fluides
100 ans de Génétique
Batterie de mutants
Recombinaison homologue: mutation dirigée
Analyses à l’échelle du génome des le début du XXème siècle:
- Crible génétiques (forward et reverse screens)
Elément transposable P et Transgenèse
Système Gal4 UAS
RNA interference : dsDNA specific to a target gene
Génétique classique et Génétique inverse
Génétique Classique
Forward genetic
Génétique inverse
Reverse genetic
Du phénotype au(x) Géne(s)
Du (des) gène(s) au phénotype
Mutagenèse au hasard
Phénotype
Premier crible à l’échelle du génome:
1980 Nüsslein –Volhard et Wieschaus
40000 mutations
15 gènes zygotiques impliqués dans
contrôle du développement du patron
de segmentation embryonnaire
Mise en évidence du premier
réseau d’interactions génétiques
Gène
Mutagenèse dirigée
Cribles
perte de fonction
ou
gain de fonction à l’échelle du
génome
Outil Élément P
Système UAS GAL4
Ovocyte : gènes maternels
Zygote
Altération globale
du patron segmental
Antérieur , postérieur , terminal
Bicoid patron région
Délétion au niveau
d’un groupe de segment
Délétion au niveau
d’un segment sur deux
Délétion au niveau
de chaque segment
100 ans de Génétique
Batterie de mutants
Recombinaison homologue: mutation dirigée
Analyses à l’échelle du génome des le début du XXème siècle:
- Crible génétiques (forward et reverse screens)
Elément transposable P et Transgenèse
Système Gal4 UAS
RNA interference : dsDNA specific to a target gene
L’élément transposable P : outil n°1 chez la drosophile
Drosophila transgenesis.
Transposase gene
+
Germ cell precursors
white+ transgene DNA (red) is injected into generation zero
Drosophila embryos (G0) of less than 1 hour old, which have
been obtained from a parental (P) generation. The early
developmental stages of Drosophila embryos are characterized
by rapid nuclear divisions that occur without accompanying cell
divisions, creating a syncytium. Prior to cellularization, pole cells
(black) bud off at the posterior end. For germ line transmission
to occur, the transgenic DNA must be taken up into the pole
cells that are fated to become germ cells. Transgenic DNA
integrated into a pole cell (red pole cell) can be transmitted from
one generation (G0) to the next (G1 progeny). The resulting
integration events are identified using an appropriate marker,
such as as white+. When used in a mutant white– strain, this
transgene marks transgenic flies by giving them a darker eye
color.
From Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster Koen J. T. Venken
and Hugo J. Bellen Development 134, 3571-3584 (2007)
100 ans de Génétique
Batterie de mutants
Recombinaison homologue: mutation dirigée
Analyses à l’échelle du génome des le début du XXème siècle:
- Crible génétiques (forward et reverse screens)
Elément transposable P et Transgenèse
Système Gal4 UAS
RNA interference : dsDNA specific to a target gene
Study of gene function using SYSTEM GAL4 - UAS which allow:
- Ectopic and/or overexpression expression of a WT or Mutant form of a gene
(Gain of Function)
important way to obtain functional data considering that up to 60% of Drosophila genes
will have no loss-of-function phenotype
- Gene knockdown (Loss of Function): RNA interference
determine if a gene is necessary for a given fate/process
Système UAS GAL4
(different space and time)
GAIN OF FUNCTION UAS - cDNA
LOSS OF FUNCTION UAS - dsRNA
-Gene knockdown using RNA interference: !! Revoir this dia
Michael boutros et al. Genome-Wide RNAi Analysis of Growth and Viability in
Drosophila Cells.
2004 Science : 303, 832
Premier crible RNAi
specific dsDNA complementary to a target generated from a transgene containing an PCR
product able to produce by in vitro transcription an inverted repeat sequence that can form
double strand hairpins
First RNAi Screen on drosophila cells
dsRNA is cell autonomous in drosophila
:
- designed against 91% of known Drosophila gene
- dsRNA incubated in a microtiter well containing cultured Drosophila cells from 2 embryonic hemocytes lines
several days
- Quantitative assay (cell number) for proliferation/growth and survival:
-fluorescent probes specific for dying (SYTOX green) or living (HOECHST red)
-Ratio green/red (z score) :High z score suggest a defect in cell survival or cell proliferation
-Proof of concept: dsRNA against genes inhibiting apoptosis should increase cell death
>>>High z score
proliferation
A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila
Georg Dietzlet al 2007 Nature 448, 151-156
Reverse genetic screen
RNAi screen based on Conditional inactivation of gene function in specific tissues of
the intact organism.
Short gene fragment (300-400bp) cloned
as inverted repeats in vector pMF3 and
expressed using the UAS-GAL4 system
Release 4.3 of the Drosophila genome sequence.
15,072 PCR products were successfully amplified
and cloned as IRs into pMF3, representing 13,344
genes or 97% of Drosophila genome.
A genome-wide transgenic RNAi library. a, Strategy used to generate UAS-IR constructs. Restriction sites in the original PCR primers
were used to digest and ligate PCR products, followed by ligation of the inverted repeat into the pMF3 vector. pMF3 contains 10 GAL4responsive UAS elements, the basal hsp70 promoter, the 150 bp second intron of ftz and the SV40 polyadenylation signal. Most, but not all,
inverted repeats were cloned in the antisense-sense orientation using EcoRI and XbaI as indicated. IR-L and IR-R indicate the primer pairs used
to amplify the left or right halves, respectively, of the inverted repeat. P3 and P5 indicate P element ends.
Efficient and specific gene interference with ubiquitous RNAi.
Act5C-GAL4/UAS-IR
Classical loss-of-function
a, Efficiency of RNAi-mediated knock down
assessed using quantitative RT–PCR on RNA
prepared from viable Act5C-GAL4/UAS-IR
adults and controls.
Examples of morphological phenotypes :
Transformer 2 (tra2) RNAi and mutant females anatomically resemble males,
including male genitalia and abdominal pigmentation (arrowheads).
Eye absent (eya) RNAi and mutant prsent greatly reduced or absent in eyes absent
.
Stubble (Sb) RNAi and mutant have short, stubby bristles on the notum (asterisks
indicate the shortened scutellar bristles).
Tissue-specific RNAi and the enhancing effect of Dicer-2.
Examples of RNAi phenotypes in the eye and notum.
RNAi against argos results in eye roughening
RNAi against tkv leads to eyes that are both rough and reduced in size.
RNAi against flamingo (stan) leads to a defect in planar cell polarity, evident in the misorientation of microchaetae
(arrowheads
RNAi against ed results in the formation of ectopic macrochaetae (asterisks).
All of the defects shown here are enhanced by co-expression of UAS-Dcr-2 (bottom row).