L’identification des cyanobactéries toxiques : une question de génétique Frances Pick Université d’Ottawa 24 janvier 2008 Institut EDS, Laval Questions générales à résoudre • Qu’est-ce qui détermine si un “bloom” est toxique ou non? • Qu’est ce qui détermine la composition en toxines? • Quels sont les effets à court terme et à long terme des cyanotoxines? bioaccumulation? effets mutagéniques? • Quel est le rôle biologique des cyanotoxines? Grande diversité de cyanobactéries: ~ 1,500 ? - 4,000 ? espèces Picocyanobactéries = espèces très microscopiques ~ 1 μm Colonies macroscopiques de Rivularia atra le long des côtes du Golf de Finlande (Photo: L. M. Sihvonen) Problèmes d’identification des cyanobactéries toxiques: les contraintes de la taxonomie classique la classification chimique la classification moléculaire Notion d’espèce chez les cyanobactéries • Notion classique basée sur la morphologie: formes unicellulaires vs. coloniales (filamenteuses avec ou sans spécialisation cellulaire et non-filamenteuses) • Mais notion difficile à appliquer aux procaryotes (bactéries qui ne font pas la reproduction sexuée) 1. Identification classique d’échantillons basée sur la microscopie • Caractères phénotypiques • Certains caractères microscopiques ont une importance écologique (pigmentation, capacité de flottaison, nombre d’hétérocystes (fixation d’azote), nombre d’akinètes (dormance) • Les noms d’espèces et la classification changent suivant les études taxonomiques. • L’autorité principale: Komárek Phormidium (Gauvreau, 18 Oct. 2004) Anabaena (des Loups, Oct. 18, 2004) Woronichinia (Beamish, Oct. 18, 2004) Bloom de cyanobactéries Lac Beamish Municipalité de Chelsea, Québec 8 octobre 2004 (photo C. Allaway) Floraisons éphémères Rivière Rideau, Ontario (30 août 2001) Bloom de Microcystis aeruginosa: 667 μg/L MC-LR + 378 μg/L MC-LA (1.5 μg/L MC-LR Santé Canada) Little Lake Panache, Ontario (B. Clarke, OMOE) Lac Champlain, 2006 Cyanobactéries exotiques • Cylindrospermopsis raciborskii, origine sous-tropicale/tropicale • incident sévère d’hépatoentérite en Australie en ‘79 • expansion en Europe ‘80 -90 • expansion depuis ~’95 en Amérique, maintenant au Canada (Hamilton et al. ‘05) • hépatotoxine (cylindrospermopsine) et neurotoxines (Hamilton et al. 2005) Constance Lake Water Aerodrome (45˚24’ 10 ’’ N, 075˚ 58’ 32’’) Cylindrospermopsis raciborskii 1200 Trichomes Heterocytes Akinetes Vegetative cells 30000 25000 800 -1 1000 35000 20000 600 15000 400 10000 200 5000 0 May 0 Jun Jul Aug Date Sep Oct Density (Vegetative cells L ) -1 Density (Trichromes, Heterocytes, Akinetes, L ) Constance Lake Nov Tillmanns & Pick Anabaena density 35000 AN FLO AN LEM AN CRA 30000 Trichomes L -1 25000 20000 15000 10000 5000 0 May Jun Jul Aug Date Sep Oct Nov Tillmanns & Pick Aphanizomenon density 12000 10000 AP FLOS AP GRA AP ISS Trichomes L -1 8000 6000 4000 2000 0 May Jun Jul Aug Date Sep Oct Nov Tillmanns & Pick 2. Assiniboine R., Man. 1. Constance, Ont. 3. Erie updated from St. Amand 2002 plus Canadian sites Cylindrospermopsis in Brasil (A. Giani, Universidade Federal de Minas Gerais) 3 4 5 6 14 15 17 16 9 12 13 7 8 11 10 1. Panosso et al. (2003) 2. Silva et al. (2003) 3. Bouvy et al. (2000) 4. Mendes et al. (2003) 1 5. Giani & Pinto-Coelho (1986), 2 Branco & Senna (1991) 6. Bazza et al. (1999) 7. Giani et al. (1999), Jardim et al (2001) 8. Figueredo et al (2007) 9. Giani et al (pers. comm.) 10. Fernandes (2003) 11. Huszar et al. (2000) 12. Souza et al. (1998) 13. Gentil (2000); Tucci & Sant’Anna (2003) 14. Borges et al. (2003) 15. Komakova et al. (1999) 16. Proenca et al. (2002) 17. Proenca et al. (2002) Limites septentrionales présentes de Cylindrospermopsis en Amérique du Nord 1. Constance Lake, 1998 2. Assiniboine River, Manitoba: H. Kling, 2004 3. Lake Erie (Sandusky Bay): S. Wilhelm, 2005 Lake Michigan: Mona & Muskegon (Hong et al. 2006) - Est-ce que ces populations produisent des toxines ? (e.g. cylindrospermopsine) - Est-ce que le déplacement est dû aux changements climatiques ? Cyanobactéries toxiques • ~ 2% (?) des espèces sont considérées comme étant potentiellement toxiques (Haider et al. 2003) • mais plusieurs cyanobactéries qui forment des « blooms » comprennent des espèces toxiques – – – – – – – Microcystis (microcystins) Planktothrix (antérieurement Oscillatoria) (microcystines) Anabaena (microcystines, anatoxines) Cylindrospermopsis (cylindrospermopsine, saxitoxines) Aphanizomenon (cylindrospermopsine) Nodularia (nodularine) Lyngbya (saxitoxines) Toxicité des cyanobactéries • pas toutes les variétés d’une même espèce sont toxigéniques: la toxicité dépend de la présence de gènes particuliers • la toxicité et le profile toxique peut dépendre des conditions de croissance • les facteurs qui mènent à la dominance de variétés ou souches toxiques ne sont pas connus. 2. Identification par analyses chimiques de cyanotoxines • dans le plancton, dans l’eau, dans les sédiments, dans la chaine alimentaire • microcystines via bioessaies donnant une estimation de toxine totale (ELISA, PPIA), • séparation/analyses chimiques HPLC, LCMS/MS qui servent à identifier/quantifier des toxines spécifiques • la présence de toxines peut mener à l’identification d’espèces toxiques Hepatotoxines • microcystines (65-90 congénères): hépatotoxiques inhibition d’enzymes phosphatases • exposition à long terme cancérigène • 1 μg/L (microcystineLR, OMS) (norme canadienne: 1.5 μg/L) • DL50 = 50 -1000 μg/kg Neurotoxines • ~ 20 types « paralytic shellfish poisoning» des marées rouges et certaines cyanobactéries • alcaloïdes (bloquent canaux de Na) • DL50 = 200 - 250 μg/kg De nouvelles cyanotoxines Microcystis aeruginosa 700 600 500 Microcystin (ug/L) Différences dans les concentrations totales de microcystines: 1) entre les variétés 2) selon les conditions de croissance 400 299 300 464 300 200 100 0 High Medium Low Light LeBlanc & Pick MC-LR 120 % Total Microcystin 100 80 60 40 20 0 high medium low Light 120 100 % Total Microcystin Microcystis aeruginosa La composition en microcystines varie selon la souche mais represente une caracteristique de classification potentielle 80 60 40 20 0 High Medium Light Low LeBlanc & Pick 3. Indentification par analyse moléculaires de la présence (PCR) et quantité de gènes toxiques (QPCR) • Génome des cyanobactéries: 1.7 – 12Mb codant pour ~1,500 - 5,000 protéines • Gène qui code pour la protéine microcystine: si le gène est présent il va être exprimé en fonction du taux de croissance Corrélation entre # copies du gène et concentrations chimiques de la toxine (nodularine, Mer Baltique Golfe de Finland: Nodularia spumigena) Koskenniemi et al. 2007. Présence du gène responsable de la production de microcystines, Lac Constance. 5 /11dates. Par le biais d’amorces oligonucléotidiques (« primers ») du gène codant pour la microcystine: McyDF2R2 (Fortin, CNRC-IRB) • • • • • • • • • • • • • 1 Constance May 17 2 June 14 3 July 5 4 July 19 5 July 26 6 August 9 7 August 23 8 September 14 9 September 25 10 October 7 11 October 30 12 ‘+’ control 13 ‘-’ control 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 LeBlanc, Pick, Fortin, Bird, & Greer Résumé • L’identification des cyanobactéries responsables des toxines nécessite une combinaison d’approches microscopiques, chimiques et moléculaires. L’isolement de souches est nécessaire pour faire l’association entre la présence d’une toxine et une espèce particulière et vis versa. • Les facteurs qui mènent à la dominance de cyanobactéries toxiques restent à déterminer. Projets • Chimie analytique des cyanotoxines (R. ArandaRodriguez - Santé Canada) • Analyses moléculaires (D. Bird – UQAM et C. Greer/N. Fortin - CNRC Montréal) projet CNRSG stratégique • Potentiel mutagénique (P. White - Santé Canada) • Développement de standards et matériaux de référence certifiés (M. Quilliam – CNRC Halifax) projet - M. de l’Environnement Ontario