p2_ue2_merlio-methodes_d_etudes_des_cancers-1

UE2 - Biopathologie
Date : 18/10/2016
Promo : 2016/2017
Ronéistes : AIZEL Lyes
LAURET Axel
Plage horaire : 16h-18h
Enseignant : MERLIO
Méthodes d’analyses globales et ciblées en génétique et biologie
moléculaire des tumeurs
I.
Altérations génétiques
1.Gènes dont les altérations confèrent une propriété aux cellules tumorales
2.Altérations qualitatives/quantitatives de gènes
II.
Principales anomalies cytogénétiques des cancers
III. Les méthodes globales
1.La cytogénétique conventionnelle et moléculaire : Historique
2.Principe d’établissement du caryotype m-FISH ou SKY
3.Principe de réalisation de la CGH sur métaphase.
4.Principe de réalisation de la CGH sur microarrays
5.Exemples d’applications
IV. Méthodes ciblées
1.FISH : généralités
2.FISH : profils typiques
3.FISH : profils plus complexes ; applications
a) Recherche de translocations par dissociation de signaux fluorescents.
b) Recherche de changement de nombre de copies.
V.
Technique de biologie moléculaire
1.La PCR : généralités
2.Le séquençage de produits de PCR, méthode Sanger
3.PCR quantitative
4.PCR + analyse au séquenceur
5.Détection du changement de statut de méthylation de l’ADN
VI.
Conclusion
Remarque : les exemples à apprendre seront revus en ED, ce n’est donc pas la peine d’apprendre les gènes
par cœur, ce qu’il faut retenir de ce cours, ce sont les principes d’explorations :
- Exploration globale : on recherche à avoir le maximum d’informations pour définir des profils de la
tumeur (« carte d’identité de la tumeur »).
- Exploration ciblée : on sait ce que l’on cherche et on va le chercher dedans ou non.
Ce cours aborde les techniques d’analyse qui permettent de rechercher des altérations moléculaires
présentant un intérêt diagnostique ou thérapeutique dans les cancers. Ces méthodes d'étude permettent
d'analyser, soit globalement le génome tumoral, soit spécifiquement en ciblant certaines régions d'intérêt.
Ce cours va parler surtout de génétique acquise ou somatique présente dans les tumeurs et non de la
génétique constitutionnelle (qui correspond au caractère héréditaire présent au niveau de l’individu). Donc
retenir génétique acquise, altérations spécifiques de la tumeur.
I.
Altérations génétiques
Les tumeurs en particuliers les cancers (tumeurs malignes) sont des proliférations anormales qui résultent de
défaut de régulation des voies de contrôle dans la cellule :
 la division cellulaire
 la survie cellulaire
 la différenciation
Les tumeurs résultent également de l'acquisition de capacités :
- Pro-angiogéniques c’est-à-dire qu’elles vont entraîner la formation de vaisseaux (cas des tumeurs
solides),
- Invasives (à progression locale) et métastatiques (progression à distance), capacités que l’on
retrouve donc dans la progression des tumeurs malignes, qui vont finir par tuer l’individu s’il n’y a
pas de traitement.
Les capacités migratoires ne sont pas propres aux cellules cancéreuses : les cellules embryonnaires sont
capables de migrer dans l'organisme.
En principe les normales (à part les cellules sanguines) ne migrent plus sauf dans des conditions
particulières (par exemple les kératinocytes au niveau de la peau vont migrer quand il y’a une blessure pour
assurer une réparation).
Les cellules cancéreuses vont réacquérir ces propriétés migratoires mais de manière pathologique.
Dans tous les cas ces dérégulations de voies de contrôles de la cellule implique des altérations au niveau
génique (directe : modifiant la séquence du gène, épigénétique : modifiant l’expression du gène :
surexpression extinction, ou post traductionnelle : pouvant provoquer une inactivation d’un produit d’un
gène).
Ce cours ciblera les méthodes d’études permettant de regarder ces altérations génétiques.
1. Gènes dont les altérations confèrent propriétés aux cellules tumorales
Les cancers peuvent avoir une origine exogène ou endogène.
- Exogènes : les gènes viraux :
Il existe des gènes dont les altérations confèrent une propriété aux cellules tumorales. Parfois des gènes
étrangers, par exemple des gènes venant de virus. Gènes viraux. Virus qui infecte les cellules et qui peuvent
être à l’origine d’environ 15% des cancers chez l’homme.
NB : cela dépend largement de l’origine ethnique, géographique des personnes. Il y a des virus endémiques
dans certaines zones du globe et qui ne vont pas entrainer les mêmes mécanismes de tumorigénèse selon que
la personne sera caucasienne, asiatique, africaine etc.
Il y a aussi une interrelation entre le virus, voire les bactéries et l’hôte.
On estime donc 15% des cancers d’origine infectieuse. Pour retenir une origine infectieuse d’un cancer, il
faut qu’il y ait un lien d’association, la présence du virus observé par les cancers. Ceux qui ont le cancer ont
le virus ; ceux qui n’ont pas le virus ne font pas le cancer. Le virus donne plus de cancer dans la cohorte de
patients infectés, il s’agit d’un lien statistique d’association. Mais il faut aussi un lien de causalité, on doit
comprendre les mécanismes biologiques qui permettent au virus de transformer les cellules c’est-à-dire de
les rendre tumorales. Ce lien de causalité est à la fois démontré et peut être reproduit.
1- Observer l’association infection-cancer,
2- Démontrer les mécanismes biologiques de causalité,
3- Possibilité de reproduction de la pathogénicité/ tumorogénicité de l’agent infectieux.
Les papillomavirus ou HPV oncogénique sont des virus qui entraînent des cancers du col de l’utérus chez la
femme, et voir des cancers ORL. Les cancers cervicaux vaginaux sont tous liés à la présence d’une infection
par papillomavirus oncogène.
Ce sont des protéines codées par le génome viral E6 et E7 qui ont des actions sur certains gènes cellulaires
importants, comme l’inactivation de TP53 et Rétinoblastome (Rb), entrainant une division cellulaire
incontrôlée.
Le virus d’Epstein-Barr (EBV) entraîne la transfection d’ARN non codants qui joue un rôle dans la
régulation du cycle cellulaire (immortalisation et transformation des cellules). (EBERs, Epstein-Barr
Encoded RNAs et miRNA). Ce virus est à l’origine des cancers du tissu lymphoïde (lymphome B), mais
aussi des cibles non lymphoïde par exemple des carcinomes de l’estomac liés à l’infection.
- Endogènes : les gènes cellulaires :
- Proto-oncogènes, suppresseurs de tumeurs, angiogenèse, protéases, adhésion…
-Ces gènes peuvent avoir des altérations structurales (amplification, translocation) ou
fonctionnelles (c’est à dire une augmentation de la transcription)
Par exemple ils peuvent être impliqués dans :
-des translocations chromosomiques avec/sans fusion génique (pour les proto-oncogène mais
également les gènes suppresseurs de tumeurs),
- des amplifications géniques (pour les proto-oncogènes)
- des mutations génétiques ponctuelles activatrices pour les proto-oncogènes, ou in- activatrices pour
les gènes suppresseurs de tumeurs,
-des délétions pour les gènes suppresseurs de tumeurs
-des modifications épigénétiques (« ce qui est autour du génome » qui permet l’empaquetage et la
régulation du génome ; ADN, histones : méthylation/acétylation)
Ces altérations sont dans la grande majorité des cas somatiques, c’est-à-dire des altérations acquises au
niveau de l’ADN tumoral, mais absentes des autres cellules de l’organisme (notamment des lignées
germinales): ce qui se voit dans les cancers sporadiques.
Il n’y a que dans les cancers héréditaires (5-10%) qu’il y a une altération génétiques de l’ensemble des
cellules de l’individu y compris la lignée germinale. Cependant un cancer héréditaire peut aussi se
développer à partir une altération somatique (par transmission d’au moins un des deux parents puis d’une
anomalie secondaire au niveau du site d’apparition de la tumeur).
Dans le cas de cancers héréditaires, une mutation prédispose mais ne suffit pas à aboutir à un cancer. Dans
les cellules, il va forcément y avoir des mutations supplémentaires qui vont apparaître pour créer le cancer.
Par exemple, quand une mutation héréditaire touche un gène suppresseur de tumeurs, il faut un événement
somatique sur le deuxième allèle pour l'inactiver. Puis, il y aura ensuite forcément une séquence d'autres
mutations qui vont s'accumuler dans les cellules.
Les mutations germinales concernent les cas de cancers héréditaires. Donc, on a une mutation qui
prédispose, le plus souvent un gène suppresseur de tumeur à l'état hétérozygote. Du coup, il faut un
deuxième événement somatique dans quelques clones cellulaires pour aboutir à une perte de fonction. Et
d'autres mutations vont s'accumuler jusqu'à aboutir à un phénotype vraiment cancéreux. Dans le cas de
cancers héréditaires, il faut forcément des mutations supplémentaires.
(Cela touche également des proto-oncogènes mais c'est plus rare.)
L'autre exemple d'altération germinale est l'empreinte génomique parentale qui est présente chez tous les
individus. Pour certains gènes, les deux allèles ne sont pas équivalents sur le plan fonctionnel (un allèle qui
s'exprime et l'autre qui ne s'exprime pas).
Cela concerne toujours les mêmes gènes :
- soit le gène paternel s'exprime et pas le génome maternel (qui est dans ce cas-là méthylée)
- soit le gène maternel s'exprime et pas le gène paternel (qui est dans ce cas-là méthylée).
Pour un gène donné, chez toute l'humanité, ce sera toujours soit l'allèle paternel qui s'exprime ou soit l'allèle
maternel.
Quand il y a des altérations de ce phénomène, il y a donc des pathologies. Cela concerne certains gènes
suppresseurs de tumeurs haplo-insuffisants : un allèle est déjà inactivé par ce phénomène d'empreinte
génomique et il suffit dans ce cas-là, d'un seul événement pour aboutir à une perte de fonction.
Donc il y a bien dans les cancers somatiques ou héréditaires, des altérations somatiques ajoutées dans la
tumeur.
Si on effectue une analyse au niveau de la tumeur on recherchera des mutations somatiques tandis que si
l’analyse s’effectue sur une prise de sang ou d’ADN buccal, on recherche une anomalie germinale puisque
toutes les cellules de l’organisme contiennent cette anomalie.
2. Altérations qualitatives/quantitatives de gènes
Ces altérations de gènes peuvent être : qualitatives ou quantitatives
Exemples d’altérations qualitatives :
- Translocations avec fusion génique qui crée un nouveau gène anormal (car s'il s’agit d'une fusion de deux
séquence nucléotidiques normalement indissociées) et donc une protéine de fusion anormale spécifique de la
tumeur qui, qualitativement, n'existe pas dans les cellules normales.
- Mutations (changement d’un nucléotide, micro insertions, micro délétions) qui aboutissent à un
changement de la séquence protéique, soit par exemple un codon stop prématuré, soit au contraire un
changement d'amino-acide ou une duplication de certains amino-acides. On a un changement qualitatif sur la
protéine.
Exemple d’altérations quantitatives :
- Amplifications : augmentation du nombre de copies du gène (et de l'expression du gène)
- Délétions : diminution du nombre de copies du gène (et de l'expression du gène)
Une seule altération pourra modifier les profils d’expression de nombreux gènes donc avoir des
conséquences sur une voie de signalisation par exemple.
L’intérêt de détecter ces altérations :
- But cognitif : compréhension des mécanismes pathogénique.
- Diagnostic : anomalies pathognomiques (spécifique) de certaines tumeurs. Certaines anomalies seraient
caractéristiques/ spécifiques de certaines tumeurs, il est donc nécessaire de démontrer la présence de
l’anomalie génétique pour faire le diagnostic de la tumeur.
- Pronostiques : anomalies associées à l’agressivité tumorale. C’est à dire qu’elles ont un rôle dans un sousgroupe de patient qui présente l’anomalie et donc possèdent une espérance de vie différente.
- Prédictif ou Théranostic pour thérapie ciblée : certaines mutations vont constituer des critères
d’inclusion ou d’exclusion pour une thérapie particulière.
Des mutations de la cible si elles sont activatrices permettent l’inclusion dans la thérapie. Ex : mutation
EGFR et sensibilité aux ITK (inhibiteurs de la tyrosine kinase) dans le K poumon.
Les patients qui ont cette mutation activatrice vont répondre au traitement car la cellule tumorale dépend de
cette voie métabolique pour sa croissance. Du coup si on lui donne un inhibiteur de cette molécule, la cellule
va y être sensible. Au contraire, certaines mutations pour des raisons conformationnelles (la molécule
thérapeutique ne pourra pas se fixer sur la protéine mutée), peuvent conférer une résistance. Dans ce cas, le
patient ne pourra pas être traité, ce sera un critère d'exclusion (refus d'un protocole thérapeutique). Il sera
orienté vers un autre traitement.
Des mutations d’effecteurs en aval (exclusion, exemple : Ras/ciblage EGFR ; exemple : Ras muté =
insensibilité aux anticorps anti-EGFR (cancer du côlon)). Dans le cas de cancers colorectaux, on peut cibler
avec des anticorps bloquant le récepteur de l'EGF de la voie de signalisation de Ras/MAP kinase. Et si on a
une mutation en aval du gène Ras ou B-Ras (des effecteurs qui sont en aval de la voie), ça ne sert à rien de
bloquer des récepteurs de l'EGF parce que la voie est actif en aval. Par analogie, au relai 4x100m, si le
deuxième coureur n'attend pas que le premier coureur lui passe le témoin pour commencer à courir, on aura
beau arrêter le premier coureur, le deuxième court quand même. Là si on bloque le premier coureur avec un
anticorps bloquant et que le deuxième coureur «Ras» est fou à cause d'une mutation et court sans attendre le
témoin de son équipier, on aura beau essayer de bloquer l'EGFR, la course continue quand même. Dans ce
cas-là, c'est un critère d'exclusion thérapeutique.
Il existe des mutations pouvant expliquer une résistance aux thérapies générales (comme la chimiothérapie):
altérations conduisant à une chimiorésistance (MDR etc.) Par exemple, la protéine appelée MDR (Multi
Drug Resistance), de la même famille que la protéine CFTR (impliqué dans la mucoviscidose) est une
pompe qui sert à faire affluer des constituants de l'intérieur vers l'extérieure de la cellule. Elle a donc un rôle
physiologique dans les transports ioniques. Elle prend également en charge certaines molécules de
chimiothérapie : de ce fait, la molécule de chimiothérapie entre dans la cellule par diffusion mais elle est
rejetée par cette pompe vers l'extérieure et de ce fait, elle n'a pas son effet thérapeutique. Les altérations de
ce type modulent l'efficacité thérapeutique. D'où l'intérêt de détecter toutes ces anomalies pour la prise en
charge du patient.
II. Principales anomalies cytogénétiques des Cancers
Ce qu’il faut savoir c’est que nos chromosomes sont appariés, nous avons 22 paires d’autosomes, chaque
chromosome possédant avant la phase S une chromatide et après la phase S, 2 chromatides.
Le schéma a) pris de gauche à droite, permet de présenter les phénomènes de :
- polyploïdie (augmentation du stock chromosomique),
- d’aneuploïdie
osome
- de translocations réciproques (échange équilibré de matériel génétique entre 2 chromosomes non
homologues) ou non réciproque, c’est-à-dire échange de matériel génétique déséquilibré.
- d’amplification focale de séquence qui peuvent être soit des
chromosomes double minute (matériel génétique qui s’accumule en dehors du chromosome);
soit des chromosomes ayant des
régions homogènes d’amplification : HSR (homogeniously stain region) c’est à dire des
amplifications en tandem de répartition le long d’un locus/ chromosome,
- d’amplification aléatoires qu’on appelle distribuée où l’on a des insertions d’un gène dans plusieurs bras
d’un chromosome.
La polyploïdie et l’aneuploïdie sont des anomalies de nombre tandis que les translocations et les
amplifications sont des anomalies de structure.
Ce sont des anomalies quantitatives et qualitatives que l'on peut voir en cytogénétique (caryotype, FISH,
peinture chromosomique) car cela concerne des fragments de chromosomes suffisamment grands pour être
détectables.
Schéma b)
Les pertes d’hétérozygotie
Chromosome 8 paternel en rouge et 8 maternel en orange. De la même façon vous avez un 14 paternel en
bleu foncé et un 14 maternel en bleu clair. Cela veut dire que nos chromosomes portent des gènes identiques
mais il existe au niveau de ces gènes des variations de séquences qu’on appelle polymorphisme génétique
qui ne sont pas des variations pathologiques mais vont expliquer pourquoi certains gènes donnent des traits
particuliers chez tel ou tel individu de façon un peu différente de l’individu qui ne porte pas la même version
allélique de ce gène. Dans les pertes d’hétérozygotie (Loss Of Heterozygocity, LOH), vous avez peu de
déséquilibre génétique mais lors de la mitose (ou de la méiose éventuellement), vous avez une possibilité
d’échange entre deux chromosomes paternels ou maternels. Par exemple ici, vous avez le 8 paternel qui a
dupliqué son génome le long du 8 maternel et on aboutit ainsi à des gènes qui sont en double copies
maternelles ou en double copies paternelles. Cela peut se faire soit de façon très segmentaire lors d’une
recombinaison par divisions somatique, soit par perte d’un des deux chromosomes et duplication de l’autre
chromosome.
On observe des crossing over sur les chromosomes comme il y’en a au niveau de la méiose mais ici il s'agit
de crossings over somatique et de recombinaisons mitotiques. Un bout de chromosome qui a été cassé, a
été réparé en utilisant comme matrice l'autre chromosome. De ce fait, on a une recombinaison mitotique
donnant une duplication d'un allèle et une perte d'un autre allèle
S'il y a des problèmes de disjonction lors de la mitose, on peut voir ce qu'on appelle des disomies
uniparentale (ou isodisomie), c'est-à-dire, le fait d'avoir deux fois dans la cellule fille, le même
chromosome paternel ou le même chromosome maternel. Rappelons que lors d'une mitose normale, chaque
cellule fille doit avoir deux versions différentes (maternelles + paternelles) de chaque chromosome.
Ces deux mécanismes, recombinaison mitotique ou disomie uniparentale, peuvent faire passer un gène
suppresseur de tumeur de l'état hétérozygote à l'état homozygote.
Ces anomalies (qualitatives) sont visibles seulement par les approches de biologie moléculaires car ici, il n'y
a pas de changements quantitatifs. En effet, les deux chromosomes sont présents, il y a eu remplacement
d'un bout de chromosome par un autre. Non visible sur un caryotype ni en FISH.
Ce qu’il faut comprendre c’est que les anomalies cytogénétiques peuvent générer des anomalies soit
globales équilibrées soit des anomalies focales. C’est en fonction du type d’anomalie que l’on va
pouvoir sélectionner la technique à utiliser.
Il existe donc deux types d’approches pour détecter ces anomalies génomiques :
Méthodes ciblées :
- Anomalies connues, bien définies
- Anomalies uniques ou peu nombreuses.
-Très performante et plus économique.
Méthodes globales (caryotype) : permettent la recherche :
- Anomalies inconnues (première exploration d’un type tumorale)
- Anomalies variables/complexes (cas des tumeurs en instabilité génétique)
- Anomalies multiples combinées qui peuvent constituer une signature moléculaire de la tumeur.
Ces analyses ciblées ou globales peuvent être fait à différents niveaux :
- chromosomique (caryotype)
- de l’ADN / ARN / Protéine (extrait d’une tumeur broyée mais problème de mélange de l’ADN
des cellules tumorales et non tumorales).
On peut également à utiliser des méthodes appliquées in situ sur des cellules ou des coupes tissulaires afin
d’observer des anomalies chromosomiques, génétiques ou protéiques (IHC ou ICC) ou in vitro à partir
d’extrait tissulaire ou cellulaire.
Les méthodes in situ donnent une information morphologique mais ne permet pas de détecter les mutations
ponctuelles.
Toutes ces analyses dépendent du conditionnement initial du tissu.
En jaune : il s’agit du schéma le plus classique, fixation par le formol et inclusion en paraffine. Circuit
conventionnel des prélèvements.
Congélation : tumorothèque, permet une extraction optimale d’ADN, ARN et protéine pour les
techniques biomol.
Les progrès ces dernières années ont permis d’impliquer de très nombreuses techniques de biologie
moléculaires et de génétiques, à la fois globales et ciblées, aux tissus fixés par le formol et inclus en
paraffine. En conséquence les tumorothèques sont en train de perdre leurs intérêts sanitaires, n’ayant
plus qu’un intérêt pour des projets de recherche bien spécifiques.
Il est donc possible avec une bonne fixation et inclusion d’effectuer la quasi-totalité des techniques
nécessaires à la prise en charge du patient.
Ce conditionnement est donc primordial, il est nécessaire de maîtriser correctement l’ensemble des
paramètres.
Malgré cela on ne peut pas tout faire sur les tissus fixés et inclus en paraffine (ex : culture de cellules
impossible).
*FISH = hybridation in situ fluorescence
*mFISH = fish multicouleur.
Pour le caryotype, il faut une culture de cellule tumorale (on doit avoir des chromosomes à l'état
individualisé)
Pour la FISH ou mFISH, la culture de cellule n'est pas nécessaire (on peut avoir des cellules avec des
noyaux interphasiques)
A partir d'une biopsie qui va arriver au laboratoire de pathologies (moléculaires) à l'état frais, on peut mettre
les cellules en culture et obtenir des métaphases de cellules tumorales y compris pour les tumeurs solides,
pour faire du caryotype (pour lesquels on a besoin d'avoir des chromosomes à l'état individualisé) ou de la
FISH ou de la mFISH (pour la FISH, on n’a pas forcément besoin de cultures de cellules, on peut avoir des
cellules en noyaux interphasiques).
Aussi, à l'état frais, on peut également réaliser des empreintes: on prend des morceaux de tumeurs que l'on
appose sur une lame, quelques cellules vont se déposer sur la lame et réaliser une FISH. L'intérêt est d'avoir
des cellules individualisées qui ne se superposent pas contrairement aux cellules présentes sur une coupe de
tissus. En effet, pour des anomalies génétiques de type délétion ou amplification (dans les gliomes cérébrales
notamment), ces superpositions peuvent fausser l'interprétation.
Sur des biopsies congelées, on peut aussi faire des empreintes (la première couche de cellules va se
décongeler et se coller à la lame). Avec les prélèvements congelés, on peut extraire les acides nucléiques
ADN/ARN et faire de la biologie moléculaire, des puces à ADN (CGH-array). Le plus souvent, on utilise
de l'ADN en routine car il est mieux conservé. L'ARN peut présenter un intérêt mais c'est plus délicat en
routine surtout pour les tumeurs solides. En effet, on peut facilement avoir une biopsie sanguine ou de
moelle à l'état frais et la congeler rapidement pour ensuite analyser l'ARN, contrairement aux biopsies de
tumeurs solides.
Enfin, à des buts de diagnostic, on peut avoir des prélèvement fixés et inclus en paraffine pour faire des
coupes histologiques et des colorations et également des immunomarquages utiles pour le diagnostic. Sur
ces coupes, on va pouvoir faire des techniques moléculaires (IHC en routine) mais également de biologie
moléculaire (FISH).
Avec l’avancée des techniques, on peut faire un très grand nombre d’études génétiques sur une coupe fixée
en paraffine.
A partir d’une prise de sang ou d’une ponction de moelle on peut effectuer une mise en culture des cellules
leucémiques et obtenir un caryotype avec par exemple une FISH.
Approche globale : caryotype et dérivés
Le prélèvement pour un caryotype doit être à l'état frais (pas congelé) pour qu'on puisse dissocier
mécaniquement et enzymatiquement les cellules du prélèvement tissulaire, pour pouvoir les mettre en
culture et obtenir des cellules en métaphase.
Si le prélèvement tissulaire est frais pour une suspicion de lymphome, leucémie :
- On peut mettre en culture « a priori » pour obtenir des métaphases et l’on observera des anomalies
cytogénétiques I aire et II aire.
Si le prélèvement n’a pas de diagnostic :
- Le caryotype n’est généralement pas fait, absence de compétences, disponibilités, coût
- C’est une situation différente pour les hémopathies liquides (sang, moelle…)
- Refaire le prélèvement pour un caryotype
Le clinicien est impliqué dans le diagnostic de ses patients, il est donc nécessaire de savoir gérer le
prélèvement et de l’orienter soit vers la fixation, la congélation ou la mise en culture.
Lorsqu’il est possible de refaire le prélèvement on peut avoir une mise en culture. C’est le cas dans les
laboratoires d’hématologie pour les leucémies ou maladie hématologique maligne, il est facile de refaire un
prélèvement sanguin ou de moelle pour faire une mise en culture éventuellement après un premier
diagnostic. Pour les hémopathies liquides on fait très fréquemment des caryotypes alors que pour les
tumeurs solides on fait d'autres techniques mais rarement des caryotypes, il n’est généralement pas réalisé en
pratique quotidienne médicale pour le diagnostic des patients (plutôt à des fins de recherches), le reprélèvement n’est pas simple. (Mais aussi défaut de compétences, coût).
Lorsque qu’on vous fait un prélèvement d’un polype sur une tumeur du côlon, on ne va pas savoir si cette
tumeur est bénigne ou maligne et on va privilégier la fixation et l’inclusion en paraffine pour d’abord établir
un diagnostic. On ne va pas faire de mise en culture de votre prélèvement. Si demain, un patient présente
une tumeur cérébrale, on va aller prélever cette tumeur cérébrale, la fixer éventuellement dans le formol ou
la congeler mais on ne fera pas de caryotype puisqu’on n’a pas le temps, ça coûte trop cher, on n’est pas sûr
que les cellules poussent pour avoir un caryotype. Pour les maladies du sang et de la moelle, il est assez
facile d’abord d’obtenir un prélèvement pour le diagnostic (prise de sang, ponction sternale de la moelle
hématopoïétique) à partir de là, si on est sûr que le malade a une leucémie, il est important pour la prise en
charge de ce malade de compléter l’analyse par un caryotype et à ce moment-là, on revient soit par la prise
de sang soit par la ponction sternale sur le prélèvement médullaire ce que l’on ne fait pas quand on a enlevé
un bout d’intestin, de cerveau ou de thyroïde. On fait donc généralement pour ces organes des analyses sur
tissu fixé.
III. Méthodes globales
1. Cytogénétique conventionnelle et moléculaire : Historique
- Caryotype (développé en 1956 par Tjio et Levan) 23 paires de chromosomes, formule 46 XX/ 46 XY. 22
paires d’autosomes et une paire de gonosomes.
Avec l’arrivée du caryotype on a pu mettre en évidence la présence des anomalies de nombre au niveau
constitutionnel notamment avec la trisomie 21 (mongolisme) (Lejeune et coll. 1959). Mais aussi le
chromosome de Philadelphie (1960). Il s’agit de la première mise en évidence des anomalies génétiques
dans les leucémies myéloïdes.
- S’est ensuite développé le caryotype en bandes (euchromatine) (Caspersson et coll. 1969)
 Dénaturation enzymatique et coloration au Giemsa : Bande G
Dénaturation thermique + Giemsa : Bandes R (reverse) (bandes riches en gènes et inverse des
bandes G)
Tous les gènes sont localisés par rapport aux bandes et sous bandes chromosomiques (y compris sur
internet).
- FISH (hybridation in situ en fluorescence, Pinkel et coll., 1986) permettant d’hybrider, sur des
chromosomes ou des noyaux, des sondes spécifiques d’une séquence. C’est ainsi que les années 80/90 se
sont caractérisées par le clonage (isolement et l’indentification de séquence) d’un très grand nombre de
gènes bien avant les techniques de séquençage globale du génome.
- CGH : Hybridation génomique comparative
Marquage fluo différents pour les ADN normal et pathologique = co-hybridation des 2 ADN
- Sur métaphase normales : CGH classique (Kallionemi-Labo. Pinkel et coll., 1992)
- Sur micro-réseaux (microarrays) ou puces à ADN (Pinkel et coll., 1998)
Permet de quantifier le matériel génétique
- Caryotype multicolore permet de faire des approches globales caryotypiques avec des sondes spécifiques
d’un chromosome marqué par un mélange de fluorochromes.
- M-FISH (à droite sur l’image ci-dessous) (multicolore FISH, Speicher et coll., 1986) Permet de compléter
les analyses cytogénétiques conventionnelles en bande (à gauche) et de voir notamment des échanges de
matériels chromosomique, soit qui seraient passés inaperçue avec les techniques de banding
conventionnelle, soit qui seraient particulièrement complexe, comme certaine translocation impliquant
plusieurs partenaires chromosomiques.
- SKY (spectral karyotyping, Schröck et coll., 1996) qui est le développement ultime de la mFish. Un
caryotype à 24 couleurs qui permet de détecter tous les chromosomes (autosomes et chromosomes sexuels)
et (tout comme la mFISH) met en évidence des réarrangements chromosomiques complexes.
A gauche, un caryotype conventionnel et à droite, un caryotype spectral 24 couleur. Pas très utilisé en
routine, plutôt à des fins de recherches (nécessite des compétences en cytogénétique).
Grâce à ces techniques on a pu montrer la présence d’anomalies récurrentes clonales :
Clone : présence d’au moins 2 ou 3 métaphases présentant la même anomalie.
Anomalie récurrentes Primaires : quand toute les métaphases présentent la même anomalie (toute les
cellules tumorales sont touchées).
Anomalie récurrentes Secondaires : quand un certain nombre de métaphase présente l’anomalie.
2. Principe d’établissement du caryotype m-FISH ou SKY
- Caryotype multi-couleur : hybridation sur métaphase de cellules tumorale
- Chaque chromosome est hybridé par des sondes marquées : soit par un fluorochrome, soit par
recombinaison unique de fluorochromes.
- Une pseudo-couleur est ainsi attribuée à chaque chromosome.
- La m-FISH permet une meilleure visualisation des anomalies structurales complexes.
NB : Le caryotype standard est d’effectué en cytogénétique constitutionnelle, soit en cytogénétique
hématologique. Le caryotypage multi-couleur coûte cher et n’est pas réalisé en routine diagnostic.
On voit que la cytogénétique est particulièrement complexe avec des chromosomes arc en ciel lié à un
échange de matériel génétique.
En haut à droite : on peut voir des échanges de matériel génétique, parfois de toute petite taille.
On voit une translocation entre les chromosomes 1 et 22 qui est probablement difficile à voir en caryotype
conventionnel en bandes avec autant d'anomalies chromosomiques structurales complexes.
3. Principe de réalisation de l’hybridation génomique comparative (CGH) sur
métaphases.
NB : diapo typique Qcm !
On extrait l'ADN normal (contrôle) et l'ADN tumoral de préférence chez le même patient pour éviter les
problèmes de polymorphisme entre individus.
On prend un caryotype normal/sain comme support, avec chromosomes étalés sur lame de verre bloqués à la
colchicine, en métaphase normale. On va ensuite hybrider par compétition en mettant des quantités
équivalentes d’ADN tumoral marqué en vert ou d’ADN normal marqué en rouge On observe sur les
chromosomes normaux hybridés, les intensités respectives de fluorescence vertes et fluorescence rouge. On
peut donc quantifier l’ADN qu’il y avait en plus ou en moins dans le tumoral par rapport au normal. On
établit ce qu’on appelle des ratio/rapports de fluorescence vert/rouge.
Là il y aura plus de matériel tumoral, la fluorescence sera excessivement verte : ex. chromosome 8 : la
tumeur présente un gain de matériel tumoral sur tout le bras long (8q). (En réalité ici c’est du à la présence
de l’oncogène c-Myc. Activation de la voie c-Myc.)
Sur le chromosome 1, au contraire, on observe des fluorescences plutôt jaunes, on est à l’équilibre, les deux
signaux sont dits équilibrés.
Ou encore des fluorescences rouges : il y a donc un excès de l’ADN normal, c’est la fluorescence témoin
normale. On a donc une perte relative de l’ADN tumoral, ex. perte en 10q.
Cette approche cytogénétique est révolutionnaire car il n’y pas besoin de métaphases tumorales et donc pas
besoin de faires des cultures de cellules tumorales, on a juste besoin d’ADN tumoral en quantité suffisante
pour le co-hybrider avec de l’ADN normal en les marquant par deux couleurs différentes. Cette technique
permet de mettre en évidence des analyses chromosomiques numérique (perte ou gain).
Des déséquilibres de fluorescence permettent de déterminer si il y a des anomalies quantitatives (en plus
ou en moins), à partir de tissus congelé ou fixé, mais cela dépend du nombre de cellules tumorales dans le
prélèvement. On ne peut pas appliquer cette technique si il y a moins de 40 % de cellules tumorales dans le
prélèvement car le ratio ADN tumoral /ADN normal sera déséquilibré et nos résultats faussés.
Il faut que les anomalies soient assez grosses pour pouvoir les voir (résolution = 20 Mb)
4. Hybridation génomique comparative (CGH) sur microarrays (puce)
Miccroarrays : (puce à ADN) ce sont des lames où ont été distribué de L'ADN normal qui a été isolé des
chromosomes qui sont représentatives de l'ensemble du génome (densité de 205K voir 1 million de
nucléotides)
Sur la puce, chaque point correspond à une sonde qui peut être de l'ADNc (pour doser les transcrits), des
BAC (Chromosome Bactérien Artificiel pour l'analyse d'ADN) ou des oligonucléotides (ADN synthétique).
Ici sur une coordonnée particulière de la puce, se situe un gène déterminé.
Attention, dans les techniques de puces, il y a inversion des fluorescences (pour des raisons techniques).
L’ADN normal est en vert et l’ADN tumoral en rouge. On aboutit à la Co-hybridation de ces deux ADN
sur des lames support de sondes le plus souvent oligonucléotidiques (et couvrant l’ensemble du génome).
Cela nous permet d’avoir une cartographie de chaleur ou Hit-map où l’on voit les gains (en rouge), les pertes
(en vert) de matériel génétique et les équilibres en jaune.
Avec les puces la couverture du génome est plus précise. On peut mettre en évidence les amplifications, les
délétions hémizygotes/homozygotes, et donc de voir s’il y a des gains de l’ensemble d’un chromosome ou
au contraire des gains d’une région très précise d’un chromosome.
Cette technique permet de déterminer des anomalies numériques (nombres de copies en excès ou en déficit)
Avantages :
- expertise cytogénétique facultative
- analyse de tout le génome avec une résolution de 10 Kb voir moins (ordre du nucléotide) avec les
puces oligonucléotidiques (microADN synthétique)
Limites :
On n’est pas au niveau de la séquence nucléotidique et on ne détecte pas les pertes hétérozygotie par
recombinaison mitotique ou isodisomie, cad la recombinaison entre 2 chromosomes ne donnant pas
naissance à un déséquilibre de matériel génétique. (Nécessite l’analyse des STR-short tandem repeats =
microsatellites ou SNP- single nucléotide polymorphisms).
On ne détecte que des anomalies numériques (pas les anomalies structurales)
Exemple de la puce de droite:
- cancer du sein: gain du gène ERBB2
- cancer du côlon: gain du gène C-MYC
- cancer du poumon: perte du gène TP53
- individu XY sur un XX: perte du X (car XY contient un X de moins que XX) → Application aux
chromosomes sexuels ou non sexuels.
5. Exemples d’applications
Exemple 1 : Recherche d’altération d’intérêt pronostic pour les neuroblastomes.
Amplification de N-Myc dans les neuroblastomes (45 % des cas) :
On voit les courbes de survie pour les tumeurs localisées à gauche (stade1, 2) et pour les tumeurs
métastatiques à droite (stade 4). Ces courbes présentent en ordonnée, le pourcentage de patients survivants
et en abscisses, le nombre d'années à partir du diagnostic.
Pour le stade 1-2, la courbe orange représente les enfants qui n'ont pas d'amplification dans leurs tumeurs
et la survie est très bonne (90-95% après 14-15 ans). C'est un très bon pronostic pour cette tumeur. La
courbe bleue représente une amplification pour le gène N-Myc et à 2 ans on est à un peu plus de 50% de
survie.
C'est encore pire pour les tumeurs métastatiques à droite, à 7-8 ans, on a 90% de survie pour les tumeurs
métastatiques ne présentant pas d'amplification du gène N-Myc (courbe noire). Et pour la courbe orange en
bas, on voit que quand on a une amplification de N-Myc, à 1ans et demie, 90% des enfants sont morts.
Seulement 10% des enfants avec une amplification de N-Myc survivent quand ils sont métastatique
d'emblée. C'est un très mauvais pronostic pour le neuroblastome.
Néanmoins, il y a 55¨% des patients qui n'ont pas d'amplification de N-Myc malgré tout, certains d'entre eux
ont un mauvais pronostic également.
L’amplification de Myc est un mauvais pronostic et entraîne un changement d’attitude thérapeutique.
Il est nécessaire de rechercher d’autres amplifications que celle du gène N-Myc, car il peut y avoir présence
d’anomalies associées (amplifications ou délétions (NB = neuroblastome) en l’absence d’anomalie N-Myc
et présentant un mauvais pronostique, de même que la délétion 11Q.
Dans les neuroblastomes non amplifiés, l’espérance de survie est beaucoup plus importante que dans les
neuroblastomes avec une amplification de Myc, la maladie est beaucoup plus grave et à l’échelle de
quelques mois, il y a perte de la moitié des patients.
Pour les stades 4, en deux mois, tous les patients sont quasiment décédés.
Grace à la GCH array on a une cartographie beaucoup plus précise de l’ensemble de la tumeur. Les
anomalies surajoutées sont ainsi visibles contrairement aux simples approches ciblées. On constate un profil
général du déséquilibre génétique de cette tumeur présentant ici un iso 17q, cad une perte d’un bras court
du chromosome 17 avec gain d’un bras long du chromosome 17 qui s’est dupliqué. Ce phénomène
représente un mauvais pronostique car il va inactiver le gène P53 qui se trouve sur le bras court du
chromosome 17.
Ces patients présentent une amplification du locus 2p24 (donc de N-Myc). Ils sont donc associés à un
mauvais pronostic, ils vont subir une chirurgie, recevoir une greffe de moelle (cellule souche
hématopoïétique) et une chimiothérapie au haute dose. Ce sont des analyses maintenant faites pour ce type
de tumeurs, à la recherche d’altérations d’intérêt pronostique par array CGH.
Le gène est N-Myc est amplifié fortement : l'enfant est décédé 21 mois après le diagnostic malgré une
thérapie très agressive avec greffe de moelle, chirurgie, chimiothérapie...
Ici, on n’a pas d'amplification de N-Myc, en revanche on a une délétion du bras court du chromosome 1 et
du bras long du chromosome 11 qui sont des anomalies segmentaires (bout de chromosomes gagnés ou
perdus, ici perdus). C'est un très mauvais pronostic et l'enfant n'a survécu que 18 mois malgré une thérapie
assez agressive.
Ces anomalies dites « segmentaires » peuvent aussi avoir un intérêt pour comprendre la pathologie et
classer la tumeur.
Cas où, il n’y a pas amplification N-myc et le profil cytogénétique est équilibré (pas anomalie structurales
segmentaire). C'est un très bon pronostic : 10 ans après le diagnostic, l'enfant est toujours vivant et le
traitement est relativement léger : chirurgie seule ou associée à de la chimiothérapie à faible dose (selon le
stade d’extension de la tumeur) ou avec l'acide rétinoïque (qui induit la différenciation et la sénescence
tumorale).
Ceci a un intérêt pronostic et thérapeutique.
Pour les profils ne présentant pas d'amplification de N-Myc ni d'anomalie chromosomiques segmentaires, le
traitement est relativement soft. C'est intéressant pour les enfants et les nourrissons qui sont vulnérables.
C'est un exemple de la génomique qui a un intérêt direct dans la prise en charge des enfants.
(Cependant, il peut y avoir une ploïdie altérée non visible en CGH. Par exemple, on ne peut voir une
tétraploïdie parce que tout est équilibré et on a deux fois plus. On le détectera en faisant un caryotype ou de
la cytométrie de flux ou de la FISH pour certaines régions.)
A noter les différences de traitements entre les patients avec et sans amplification de N-Myc → Le profil
génétique globale d’une tumeur peut impacter sur la décision thérapeutique.
Avec ces techniques de CGH array, il est possible de valider des bras thérapeutiques différents en fonction
des résultats obtenus.
Exemple 2 : Application de l’analyse du transcriptome (ARN) sur micro arrays (principe = ADN, étape de
transcription inverse (rétro-transcriptase) : ARN / ADN) ; classification de différents types de tumeurs
embryonnaires du système nerveux central.
Les méthodes globales se sont étendues à l’étude du transcriptome. Après avoir fait les puces sur
chromosomes puis sur micro array, les développeurs se sont intéressé au transcriptome (c'est-à-dire aux
gènes exprimés dans les tumeurs), et cela a permis une classification des différents types de tumeurs :
système nerveux central, sein, côlon.
Cela permet de reconnaitre par leur signature, certains types de tumeurs. On appelle cela la carte d’identité
des tumeurs.
On peut donc déterminer le profil d’expression des tumeurs en fonction du profil d’expression des gènes
(possibilité de regroupé ces gènes = signature). Hots spots = gène surexprimé en rouge → hits map
(cartographie de chaleur)
Voici un autre exemple qui est moins applicable en routine, c'est l'analyse de puce à ADN mais pour
l'analyse du transcriptome, c'est-à-dire l'analyse de l'expression génique globale du génome globale. On
s'intéresse au nombre de copies de l'ARNm (et pas du nombre de copies du gène). Sur puce à ADN
également, le principe est à peu près le même sauf que les sondes sont généralement des sondes
complémentaires de l'ARNm seulement.
Cela présente un intérêt de diverses natures. Comme dans l'exemple ci-dessus, cela peut permettre de
classifier différents types de tumeurs embryonnaires du SNC qui seraient très difficiles à reconnaître sur des
critères purement histologiques. On voit ici des tumeurs rhabdoïdes (RAB) ou des tumeurs primitives
neuroectodermiques (PNET) ou médulloblastome (MD).
On a un profil génique qui est caractéristique de chacune de ces tumeurs. Les régions qui s'allument en
rouge sont les régions pour lesquelles les gènes sont fortement exprimés.
Une colonne correspond à un patient et une ligne correspond à un gène parmi les gènes analysés.
On a un bloc de gènes dans les médulloblastomes qui s'allume et qui ne s'allume pas dans les autres types de
tumeurs dans les autres colonnes d'à côté.
Pour les tumeurs gliales (Mglio c'est des tumeurs malignes), on n’a pas les même profils, un autre groupe de
gènes s'allume (et ainsi de suite dans les autres types tumoraux).
Donc, cela signifie qu'on a une signature moléculaire : ce ne sont pas les mêmes anomalies génétiques qui
sont présentes dans les différents types de tumeurs, ce ne sont pas les mêmes mutations génétiques et par
voie de conséquence, des mutations aboutissant à des dérégulations (de l'expression génétique)
particulières.
On voit qu'il y a des signatures d'expression géniques qui sont caractéristiques, c'est-à-dire qu'il y a des
gènes qui sont fortement exprimés dans certaines tumeurs et pas dans d'autres, et au contraire, des gènes
qui sont sous-exprimés dans certaines tumeurs et pas dans d'autres.
Exemple 3 : Application de l’analyse du transcriptome (ARN) sur microarrays ; prédiction de la capacité
métastatique et de la survie.
Dans la littérature, ont été définis un certain nombre de modèles prédictifs de l’évolution d’une tumeur.
Pour l’instant, ce type d’approche sur l’ARN est assez peu utilisé en pratique clinique.
On compte deux types de cancers pour lesquels cela pourrait potentiellement être utilisé:
Cancer du sein et cancer prostate
Objectif : Prédire l’agressivité de la tumeur
Dans le cancer de la prostate, il existe actuellement un gros débat pour savoir si l’on ne sur-traite par les
patients avec un tel cancer. En effet, certains cancers sont très faiblement évolutifs : chez quasiment tout
homme au-dessus de 80 ou 75 ans, si l’on pratique une autopsie, (après 75 ans), on trouve une proportion
élevée de cancers de la prostate mais les malades vivent avec ces cancers.
Le problème pour un malade ayant 60/65 ans et chez qui on trouve un cancer de la prostate, est de savoir si
ledit cancer va donner des métastases et tuer le patient dans les dix années à venir ou au contraire, si on le
laissait en place, si le patient pourrait continuer de vivre avec ce cancer (diagnostiqué sur biopsie) puis
mourir sans avoir été « embêté » par ce cancer de la prostate.
On peut alors espérer que les techniques de micro arrays permettront de classer les patients en patients à
risque de métastase/progression ; et patients sans risque de progression du cancer de la prostate. Mais il
peut y avoir des cas mitigés avec des risques de métastases à 50-60%...
NB : on pourrait également faire une classification chez les femmes concernant le cancer du sein. Dans ce
cancer, le problème pourrait être l’attitude thérapeutique et le « trop de précautions » des médecins,
aboutissant à un sur-traitement des patients. On retrouve ce problème dans le cancer de la prostate.
Partie gauche de la diapo :
On peut avoir d'autres types de signatures quand on compare des tumeurs primitives de différents organes à
des métastases.
Chaque colonne correspond à un patient et chaque ligne correspond à un gène.
(En haut) On voit qu'il y a des gènes qui sont exprimés (signal fluorescent rose rouge) à gauche pour les
tumeurs primaires et à droite un signal plus faible en expression (bleu).
On voit qu'il y a un tout un bloc de gènes pour la partie du haut du schéma, qui est sous-exprimée dans les
métastases et au contraire pour la partie du bas, on voit qu'il y a un groupe de gènes qui est plus représenté
(à droite) en rouge, c'est-à-dire plus exprimé dans les métastases par rapport aux tumeurs primaires (plutôt
tirées vers le bleu). Donc des gènes qui sont sous-exprimé dans les métastases en haut et surexprimés dans
les métastases en bas.
Partie droite de la diapo :
Au départ, ça a été fait sur des puces pangénomiques sur tout le génome puis on s'est dit qu'on pouvait
cibler certains gènes prédictifs. Sur les graphes de droites qui correspondent aux courbes de survies, en
ordonnée la fraction de patients survivants, les courbes noires ou les courbes rouges sont les patients qui
présentent ou qui ne présentent pas des altérations d'expression des différents gènes qui ont été trouvés sur
les différentes puces.
Au départ, c'est 128 gènes qui ont été trouvés comme prédictifs et donc vous voyez l'aspect de pronostic avec
une probabilité d'évolution métastatique de la tumeur (de l'ordre de 50% à 81 mois après le diagnostic dans
le groupe rouge alors que dans le groupe noir on est qu'à 60% : c'est donc discriminant quand même).
On peut réduire cette signature à seulement une quinzaine de gènes. On s'est rendu compte que 17 gènes sur
les 128 suffisaient à obtenir une courbe prédictive de la même nature avec un poids statistique passant de
0,009 à 0,010 (on n’a donc pas pratiquement perdu en poids statistique). L'analyse d'une quinzaine de gènes
devient réalisable en routine.
Néanmoins pour l'ARN, c'est toujours délicat parce qu’il faut toujours avoir une biopsie congelée après
l'exérèse.
La courbe du bas est à titre de contrôle pour montrer que quand on prend 10000 gènes au hasard, pour
lesquels l'expression varie fortement entre les différents échantillons (ce sont des variations qui ne sont pas
pathologiques, variations aléatoires), on voit qu'il y a aucune différence entre les courbes rouges et noires.
Les deux groupes de patients qui évoluaient plus ou moins péjorativement se retrouvent superposées. C'est
donc pas n'importe quels gènes qui sont prédictifs, c'est vraiment certains gènes spécifiques.
IV. Méthodes ciblées
iFISH (FISH
interphasique)
Visualisation, % de
cellules présentant des
anomalies (translocation,
délétion...) et donne donc
une idée de l'hétérogénéité
de la tumeur
(sur des blocs fixés ou
congelés sur lequel on n’a
pas besoin de métaphase)
PCR
- Point(s) de cassure
(translocations)
- Amplification de
l’ADN pour faire du
séquençage
RT-PCR
RT-qPCR
IHC
Transcrits
- de fusion
- de surexpression
RT-PCR : on va
détecter à l’aide de ces
techniques des
transcrits chimériques
ou anormaux de par
leur structure
(transcrits de fusion)
ou de par leur
expression) (transcrit
de surexpression
RT-qPCR : PCR
quantitative en temps
réel sur de l'ADN
génomique pour doser
des amplifications ou
Cellule anormale de
part :
- Localisation (la
cellule est anormale
car on la retrouve dans
un tissu où elle ne
devrait pas se trouver)
-Niveau (la cellule est
anormale par son
niveau d’expression)
L'IHC présente un
autre intérêt : pour
certaines situations,
on a des anticorps
spécifiques d'un
épitope mutant.
Exemple : cas de la
protéine B-Raf qui a
des délétions
une mutation très
fréquente (la
mutationV600E) qu'on
retrouve dans les
mélanomes mais
également dans
d'autres tumeurs. On a
un anticorps
spécifique de la
mutation de la
protéine B-Raf V600E.
L'IHC permet donc de
savoir s’il y a eu
mutation ou pas.
Contrairement aux méthodes globales ces méthodes « n’interrogent » pas l’ensemble du génome ou du
transcriptome mais elles vont servir à répondre à une question souvent unique (parfois des questions
peuvent être combinées) pour détecter des anomalies génétiques.
On sait ce que l’on va chercher au niveau de la tumeur, soit en ayant une approche :
- au niveau chromosomique par FISH interphasique
- au niveau de l’ADN par PCR
- au niveau de l’ARN par RT- PCR
- au niveau des protéines par immuno histo chimie (IHC)
Ces techniques ont l’intérêt de pouvoir être effectuées « a postériori » (c'est-à-dire après diagnostique par le
pathologiste ou après orientation histologique par le pathologiste).
C'est-à-dire que :
- soit elles vont aider le pathologiste à faire un diagnostique
- soit on peut les faire dans un second temps en récupérant le bloc de paraffine dans lequel la tumeur a été
enrobée.
Ces techniques peuvent être faites sur des empreintes fraiches, des tissus congelés, fixés, cellules, etc... À
peu près sur tout type de matériel (tous types de tissus).
Le pathologiste dispose donc d’une « boîte à outils » pour la détection de :
- Surexpression/ Amplification (se détecte par IHC ou FISH)
Sur la 1ère image on voit une surexpression de HER2 en IHC
Sur le 2nd cliché et le 3ème (FISH) le gène HER 2 est marqué en rouge et les centromères témoins le sont en
vert. On note (surtout sur le 3ème cliché) que HER 2 est amplifié, un ratio supérieur à 2 de signaux rouges
par rapport aux signaux verts est visible.
Ce type de test peut s’avérer important car certains malades sont sous thérapeutique anti-HER 2 (HER 2
étant une protéine ayant pour gène codant un proto-oncogène (HER 2/neu) d’où son implication dans
certains cancer).
- Translocations (se détectent par des techniques de biologie moléculaire ou par FISH=approche in situ)
- Mutations (se détectent par des techniques de biologie moléculaire comme le séquençage direct ou après
une HRM ou d’autres techniques ciblées comme la PCR ASO, sondes Taqman...)
Il n’y a pas de méthode univoque selon le type de cancer pour HER 2, ALK...
La gestion d’un tissu inclus en paraffine (approche in situ) prend compte :
-La qualité pré analytique (délai avant fixation et durée de fixation, conservation à bonne température...)
-L’économie du matériel par le pathologiste
La demande d’analyse du clinicien est traitée par le pathologiste qui peut procéder selon 2 méthodes :
•Il peut ponctionner une zone du tissu (sélection de la zone tumorale) pour la recherche de mutations.
=> Exclusion des zones nécrosées ou non tumorale
=> Estimation du pourcentage de cellules tumorales
=> (si <5% = non réalisé, <10% non contributif si wt)
•Il peut faire des coupes au microtome et les
déposer sur une lame pour faire de la recherche en
IHC/FISH (ci-dessous)
1. FISH : généralités
La FISH (Hybridation In Situ Fluorescence) : étapes
1) Obtention de la sonde (amplification d’un ADN cloné dans les bactéries) : c’est un fragment de
chromosome humain (30 000- 200 000 pb) qui est cloné dans un chromosome bactérien portant une
résistance à un antibiotique. On va sélectionner des bactéries qui portent le chromosome humain, les
amplifier, les purifier pour en extraire la partie humaine et ensuite la marquer en fluorescence.
Si on veut marquer plusieurs gènes à la fois sur un même tissu on va prendre des fluorochromes différents
(1FL / région chromosomique)
2) Marquage des sondes
3) Préparation des échantillons
- Culture et obtention de mitoses (si FISH sur métaphases)
- Coupes tissus (iFISH) souvent tissus inclus en paraffine ou congelés
- Cytospins (iFISH) on a par exemple, dans le cas du cancer bronchique, une ponction de
liquide pleurale qui va être centrifugée sur une lame. On obtient un étalement de cellules sur la lame
que l’on va hybrider sur noyaux interphasiques
4) Dénaturation de la sonde et de la cible (double brin ----> simple brin)
5) Hybridation In situ (hybridation et lavages) les sondes fluorescentes vont s’hybrider par complémentarité
de séquence sur l’ADN de la cible, lavages pour éliminer les sondes fluorescentes qui ne se sont pas
marquées.
6) Observation au microscope en fluorescence, analyse des données de manière quantitative et qualitative, et
stockage des données.
Application de la FISH : Recherche de translocations par rapprochement de signaux
fluorescents (=anomalie de structure)
(Fusion FISH : Quand les 2 régions impliquées sont constantes)
Exemple : fusion BCR-ABL dans la leucémie myéloïde chronique, détection des translocations
Position des sondes pour la FISH bicolore BCR- ABL
On a ici deux sondes : une sonde (rouge) sur le CHR 9 qui correspond aux exons 3’du gène Abelson
codant pour la tyrosine kinase et une sonde verte sur le CHR 22 (=chromosome de Philadelphie) qui
correspond aux exons 5’ du gène BCR
BCR (Break point cluster region) est un gène qui code pour une protéine. Le gène Abelson (ABL) est une
kinase (nom qui fait référence au virus d’Abelson).
A gauche: des chromosomes interphasiques d'une cellule normale
Sur une métaphase normale, on a
des chromosomes marqués en rouge
aux extrémités (CHR 9) et des
chromosomes marqués en vert aux
extrémités (CHR 22).
La sonde Abelson s’hybride sur les 2
extrémités télomériques des CHR 9:
on aura 2 signaux rouges.
La sonde BCR s’hybride avec les 2
extrémités télomeriques des CHR
22: on aura 2 signaux verts
(4 signaux dissociés au total).
A droite: translocation
Quand on a une translocation, on va
avoir un rapprochement de la sonde
BCR et de la sonde ABL. Comme on
peut le voir ici, la sonde rouge et
verte sont disposées de part et
d’autres de la translocation.
Quand il y a une translocation, il va
y avoir une " fusion génique"
(rapprochement des deux séquences
nucléotidiques des deux gènes).
A ne pas confondre avec le signal de
fusion: les deux signaux
normalement dissociés se retrouvent rapprochés l’un de l’autre donnant un signal jaune avec la superposition
du rouge et du vert.
Dans le cas de la leucémie myéloïde chronique : on retrouve le chromosome de Philadelphie 22q(chromosome raccourcit), qui a échangé du matériel génétique avec le 9q+ (chromosome rallongé).
Cela aboutit, si on utilise des sondes de fusion, à un rapprochement des deux allèles des deux couleurs rouge
et vert pour créer du jaune (=séquences recombinées), à la fois sur le 9q+ et sur le 22q- (mais on détecte rien
sur le 9q+ donc pas marqué)
On peut avoir un signal de fusion (FISH fusion) même quand le gène résultant n’est pas un gène de fusion.
2. FISH : profils typiques : t(14 ;18)(q32 ;q21) ( Lymphome folliculaire)
Deux types de sondes :
Ici on va voir un exemple ou on obtient un signal de fusion alors que le gène résultant n’est pas un gène de
fusion
- Sondes chevauchantes sur chaque locus partenaire ; sondes double couleur, double fusion (identifier les
échanges entre 2 partenaires)
Dans une cellule normale, on a 2 signaux rouges (CHR18) et 2 signaux verts (CHR14). Quand il y a une
translocation, les 2 chromosomes dérivés auront chacun un peu de vert et un peu de rouge parce que la
sonde chevauche le point de cassure. On obtient donc un signal double couleur et double fusion.
On nous montre ici, une FISH fusion mais ce n’est pas un gène de fusion car il s'agit juste d'un
rapprochement entre le gène BCL2 et la région de régulation des gènes IGH.
Le gène BCL2 va donc être sous contrôle de la région régulatrice des gènes IGH.
Ce gène BCL2 va être surexprimé mais il sera normal, il est juste localisé à un endroit aberrant.
Donc ATTENTION! On a un signal de fusion en FISH mais on n’a pas de gènes de fusion, c’est un gène qui
est juste dérégulé.
Il existe d’autres signaux de fusion si les sondes sont flanquantes comme on avait pour BCR-ABL. On aura
une simple fusion, c’est-à-dire, que le 4emc chromosome dérivé ne sera pas marqué (un signal rouge, un
signal vert et un signal jaune).
- Sondes encadrantes = break appart = split (plus intéressante dans le cas de gènes polygames comme cmyc ou bcl-2 ou EWS) : technique intéressante quand les régions impliquées sont variables, ça évite de
faire un examen spécifique de chaque chromosome partenaire, par exemple pour les gènes myc, cyclineD1,
bcl2 ou EWS.
Les sondes dites de séparation = sondes encadrantes = split = break appart : ne vont couvrir que le gène
d’intérêt qui est présent au niveau d’un des deux partenaires. Elle couvre en fait la région chromosomique
autour du point de cassure.
(Ici on part de 2 fusions en jaune et après réarrangement il ne reste qu’une fusion, un signal rouge et un
signal vert)
Attention aux possibilités d’extra signal !
3. FISH : profils plus complexes
A.
Application de la FISH : recherche de translocations par dissociation de
signaux fluorescents (break appart FISH), quand les 2 régions impliquées sont
variables.
Exemple 1 : translocations du gène EWSR1 (Ewing Sarcoma) dans les tumeurs d’Ewing :
L’intérêt de ce type de sondes encadrantes ou de séparation est que le gène EWS peut avoir plusieurs
partenaires et plusieurs fusions possibles :
 t(11 ;22)(q24 ;q12) : EWS-FLI1
 t(21 ;22)(q22 ;q12) : EWS-ERG
 t(17 ;22)(q12 ;q12) :EWS-E1AF
 t(7 ;22)(p22 ;q12) :EWS-ETV1
Dans tous les cas, dérégulation de la protéine EWS (activité transciptionnelles). Translocations
pathognomoniques de la maladie -> prise en charge adaptée
Quand il y a une translocation d’EWS, on est certain qu’il y a une tumeur d’EWING.
Il existe plusieurs zones de fusions possible, ce qui fait qu’il serait alors trop compliqué d’utiliser plusieurs
sonde pour les gènes partenaires de EWS, donc on préfère détecter toutes ces translocations en un seul
examen.
- Quel que soit le partenaire, translocations entre exons 7 et 8 de EWSR1
- Possibilité de détecter les translocations avec sondes flanquantes
Par exemple, on observe ici le point de cassure chromosomique qui se situe autour des 2 exons, entre les
exons 7 et 8 du gène EWS (gène impliqué dans le sarcome d’Ewing : Ewing Sarcoma R1).
On va prendre ces sondes encadrantes et quel que soit le partenaire de ce gène EWS, on va pouvoir voir s’il
existe ou non un réarrangement de EWS avec :
- Dans le cas des cellules normales (on peut utiliser n’importe quelle cellule somatique du corps) : 2 fusions
(puisque le gène est couvert par la sonde rouge et la sonde verte qui encadrent le point de cassure)
-Dans le cas des cellules présentant un réarrangement ou une translocation impliquant EWSR: split
(séparation= break appart) du signal rouge et du signal vert sur l’allèle transloqué.
Exemple 2 : translocations du gène ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) dans les lymphomes :
-14 partenaires identifiés pour le moment (protéines de fusion)
-Nécessité là encore d’un examen commun unique
-Même principe que pour les translocations impliquant EWSR1 (break appart)
Ce type de sonde peut être utilisé pour des gènes tels qu’EWS ou ALK dans des lymphomes ou tumeurs
pulmonaires (gènes ayant de multiples partenaires).
Ces gènes sont polygames, c'est à dire, qu’ils ont toujours les mêmes partenaires, mais au lieu d’en avoir un
seul, ils ont parfois 14 partenaires identifiés, ce qui conduit à des protéines de fusion.
Pour avoir un examen unique permettant d'identifier les 14 partenaires en même temps, on réalise une FISH.
Cette technique permet de voir s’il existe dans la tumeur un réarrangement ou non d’ALK.
B) Application de la FISH : recherche de changement de nombres de copies
(=anomalie quantitative) (les 2 sondes sont dans 2 régions différentes du même
chromosome).
Applications :
Recherche de délétion, amplification, duplication
Détection d’aneuploïdies (changements numériques de chromosomes: monosomie, trisomie)
Exemples d’applications :
 Délétions
- Gènes CDKN2A (code pour la protéine p16 impliquée dans un point de restriction du cycle
cellulaire) et CDKN2B (code pour la protéine p15) : nombreux types de cancers (la perte de ces
gènes a un impact sur le pronostic du patient relativement fort)
- Bras court du chromosome 1 (1p)* et bras long du chromosome 19 (19q)# (ces anomalies sont aussi
de mauvais pronostic)
* = Neuroblastomes, gliomes
# = Gliomes
Amplifications :
Gène N-MYC : Neuroblastomes
Gènes c-MYC et HER2/ERBB2 : Cancers du sein et cancers colorectaux
Gène HER1/EGFR : Gliomes
Gène MDM2 (dont le produit entraine la dégradation de TP53) : Sarcomes
Etc…
Exemple 1 : amplification du gène N-MYC dans les neuroblastomes (NB)
Ne pas retenir la couleur des sondes, elle change selon le fabricant.
Par rapport à la CHG-array il existe la possibilité d’étudier par FISH le locus N-MYC (marqué en vert ici),
par rapport à une sonde témoin :
- sonde témoin en rouge = sonde centromérique : 2 allèles
- sonde N-MYC (sonde spécifique du locus) dans la cellule normale, en vert (à gauche) : 2 copies
- sonde N-MYC sur cellule tumorale (à droite) pour la quantification du nombre de signaux : excès de
susceptibles d’une intensification de chimiothérapie et d’une greffe de moelle, si on observe ce profil (à
droite) au niveau d’un neuroblastome.
(On peut également définir un ratio de signal vert sur rouge pour définir un seuil à partir duquel on
considèrera que ce que l’on observe est une amplification)
Exemple 2 : délétions du bras court du chromosome 1 dans les gliomes
- Sonde centromérique témoin (fluorescence verte)
- Sonde spécifique du locus, ici 1p36 (fluorescence rouge)
- Quantification du nombre de signaux (ici diminution du nombre de signaux rouges)
On peut regarder, les délétions du 1p ou du 19q dans les tumeurs gliales (gliomes) :
- Dans la cellule normale, autant de rouge que de vert, puis :
o Soit il y a une délétion hémi zygote (une seule copie) : on voit 1 rouge et 2 verts
o Soit il y a une délétion homozygote (perte des deux allèles rouges) : on ne voit plus que les copies
vertes.
On utilise cette technique pour la détection des tumeurs des mésothéliums puisque la perte de 9p21 avec
cette technique est assez constante dans les cancers des mésothéliums donc c’est un critère diagnostique.
Test fait en routine dans les laboratoires pour environ une centaine de gliomes en analyse. Il faut faire cela
pour le bras long du chromosome 19 et pour le bras court du chromosome 1p ; ces délétions étant de
mauvais pronostic, elles vont conditionner la prise en charge de l’individu.
V. Technique de biologie moléculaire ciblée (identification
anomalie plus fine)
1. La PCR (amplification d’ADN par Réaction de Polymérisation en
chaine) : généralités.
But : amplifier de manière exponentielle une séquence donnée pour la rendre plus facilement détectable/
analysable (clonage, séquençage…)
A partir d’une petite biopsie de cellules tumorales on va extraire de l’ADN et amplifier la séquence qui nous
intéresse. L'intérêt est qu'on peut qualitativement trouver des translocations, on peut aussi faire des
séquençages pour trouver des mutations...
Point de départ :
- ADN de qualité moyenne voire médiocre (fragmentés) (En cancérologie on pourra utiliser des tissus qui
ont été dégradés ou fixés tout en ayant des amplifications de bonne qualité)
- Applicable à l’ARN après transcription inverse
- Faibles quantités (ng)
- Amorces complémentaires encadrant la région d’intérêt (synthétiques donc séquence connue)
Principe :
-Taq DNA polymérase : enzyme supportant des températures élevées
-Réaction cyclique : dénaturation, hybridation des amorces, synthèse. Permet d’amplifier la région
d’intérêt génétique.
Les principales techniques utilisées dans les plateformes génétiques somatiques des tumeurs :
- Séquençage Sanger
- Pyroséquençage
- Taqman, discrimination allélique
- HRM
- SNaPshot, et analyse fragment
- Morphologiques : IHC et FISH : lames
La quantité de séquences cibles augmente de façon exponentielle et devient alors détectable sur gel.
Applications de la PCR :
=> A remplacé les techniques de blotting* dans de nombreux cas
(* = Electrophorèse, transfert sur membrane, détection par sonde/autoradiographie)
- Southern blotting : ADN digéré par des enzymes de restriction
- Northern blotting : ARN
- Dosage
du nombre de copies de gènes (amplification, délétion)
- Mise en évidence de translocations
- Détection de l’ARN (après la transcription inverse) anormalement exprimé ou anormal (s’il y a un transcrit
de fusion)
Mesure du niveau d’expression (surexpression, inactivation)
Mise en évidence de transcrits de fusion (BCR-ABL, EWS-FLI1, NPM-ALK) dans certaines
translocations particulières qui donnent des gènes de fusion
On peut donc mettre en évidence dans des tumeurs des transcrits anormaux de fusion résultant d’une
translocation, et cela permet éventuellement de séquencer l’anomalie génétique avec un séquençage
classique dit de Sanger, en utilisant les di-désoxynucléotides.
- Etape préparatoire avant séquençage :
Mise en évidence de mutations (activatrices ou inactivatrice)
Mise en évidence de changement de la méthylation de l’ADN
2. PCR quantitative : dosage ADN/ARN (amplification en temps réel)
On observe sur la courbe ci-dessous une partie linéaire qui est proportionnelle aux nombres de copies.
A un moment donné, on arrive à un plateau où la plupart des réactifs ont été consommés.
D'autres part, au début, il y a peu d'ADN mais un excès d'amorces et à la fin au contraire on a beaucoup
d'ADN double brin et peu d'amorces.
L'intérêt de la PCR quantitative est de mesurer la fluorescence par des sondes ou des agents intercalant en
temps réels.
Plus il y a de l'ADN au départ, plus il faudra faire un nombre de cycles réduit pour détecter le seuil de
fluorescence.
Dans le cas d’une amplification d'un gène, le seuil est atteint rapidement.
Au contraire si un gène est délété, le nombre de cycle va augmenter plus lentement, donc le seuil est atteint
plus lentement.
Deux techniques sont réalisables pour la quantification :
- intercalant fluorescent qui va se lier à l’ADN double brin (avec des primers spécifiques de la séquence
d’intérêt)
- sondes spécifiques de l’allèle mutée/sauvage (lorsque l’on va rechercher une mutation)
PCR quantitative particulière : HRM (High Resolution Melting) (non traitée)
C’est une technique d’amplification de l’ADN (primer encadrant la zone suspecté de mutation). En fonction
de la cinétique d’amplification on va voir si l’ADN est de bonne qualité ou si au contraire il y a des
inhibiteurs de l’amplification à la fois en fonction de la hauteur de la courbe, de la hauteur du plateau et du
« crossing point » (montée brutale de la courbe). Cette technique va permettre de donner un indicateur de la
qualité de l’ADN en utilisant cette technique de PCR quantitative en temps réel.
Après les différents cycles de séquençage on va soumettre les séquences obtenues (ADN simple brin) à un
protocole (décrit sur la diapo ci-dessous à droite) :
Sur les graphique : - courbe rose = muté
- courbe rouge = G133F (cas particulier d’un profil Tm décalé)
Si on a un doute avec les courbes de Tm en HRM, c’est à dire que la courbe ne suit pas une courbe de
référence que ça soit pour un profil normal ou un profil pathologique de référence, on peut suspecter un
nouveau type de mutation pour la pathologie en question (donc un séquençage en aval est d’autant plus
intéressant pour détecter une nouvelle mutation impliquée dans la pathologie étudiée).
Pour résumer la HRM peut donner deux types de résultats :
- Normal => rendu du résultat non muté (pas de séquençage en aval).
- Douteux ou muté => Séquençage en aval pour voir de quel type de mutation il s’agit.
Pour l’exemple de la mutation K-Ras G12V (mauvais pronostic dans le cancer du poumon, résistance à la
thérapie) : On dispose d’un fragment de 189 bp où l’on a identifié une mutation (courbe verte).
Ensuite, il existe une application où l’on va dénaturer l’ADN et le renaturer et si il n’y a pas de
mutations, les allèles vont se renaturer ensemble (il n’y aura pas d’hétéroduplex mais que des
homoduplex) et on verra la courbe de fusion et la courbe comparaison entre une référence normale et
éventuellement l’échantillon tumoral. On pourra alors dire qu’il y a un décalage entre la courbe ici en
rose (=témoin muté) et la référence normale qui fait suspecter l’existence d’une mutation.
Pour les profils HRM normaux on vérifiera également les températures de fusion (Tm =50%
Dénaturer/ 50% simple brin) spécifiques de la séquence d’ADN donc on pourra voir si il y eu une
insertion ou une délétion dans la séquence
La HRM permet un screening des mutations de par la taille de la séquence et sa composition en base qui
permet une approche des mutations sans passer par le séquençage d’emblée. La limite de cette technique
réside en l’existence de polymorphismes individuels dans les régions. Certaines régions du génome ont des
polymorphismes non pathologique (normaux) il est évident que ces polymorphisme génétique vont entrainer
des modifications des profils HRM (on ne pourra pas étudier les régions riches en polymorphisme génétique
avec la technique d’HRM). On préfèrera dans ce cas le séquençage d’emblée ou le pyroséquençage.
- L’analyse HRM comporte trois étapes :
1 : vérification de la qualité des ADN amplifiés
(CP) : un ADN de bonne qualité a un CP compris
entre 24 et 32. (Courbe verte et bleu). Sur cette
diapo, les courbes violette et rouge représentent
des ADN en faible quantité ou inhibée).
2 : normalisation des courbes de fusion entre elles
et comparaison des différents profils de
dénaturation par rapport à la référence normale
(courbe bleu)
3 : pour les cas HRM normaux, vérification des
températures de fusion (décalage si mutation à
l’état homozygote = courbe rouge)
Rendu résultat normal (proche du zéro en
différence plot)
Sur le graphique :
- courbe bleu = Témoin
- courbe rouge = muté
HRM variant (+12 en différence plot)
Sur le graphique :
- Courbe bleu = normal
- Courbe verte = muté
Quand il y a un décalage (mutation) on fait un séquençage en aval pour détecter le type de mutation.
Le séquençage révèle une mutation G12V
3. Séquençage de produits de PCR, principe de la méthode de Sanger :
séquençage avec terminateurs de chaîne
La PCR est une technique préparatoire : on amplifie avant de séquencer.
Le principe de la réaction de Sanger est le suivant : on amplifie la région d'intérêt par PCR pour avoir une
quantité suffisante de copies et on effectue la réaction de séquence de type de Sanger (on dénature de l’ADN
pour l’hybrider avec une amorce complémentaire de la séquence qui nous intéresse).
On ajoute, par la suite, un large excès de nucléotides normaux et une petite quantité de di-désoxynucléotides
(en rouge sur le schéma ci-dessus) : ce sont des nucléotides particuliers ne présentant pas la liaison qui va
permettre d’incorporer une base à la suite. Ils jouent un rôle de terminateurs de chaine.
Lorsque qu’ils sont incorporés, la polymérisation s'arrête.
Ils seront associés à des fluorochromes différents donc 4 couleurs différentes.
Les fragments vont s’interrompre aléatoirement là où il y a un di-désoxynucléotide qui s’intercale.
La couleur observée dépendra des di-désoxynucléotides qui s’intercalent ; si c’est un T par exemple qui a
une fluorescence rouge on va lire du rouge en fluorescence et on saura qu’il y a un A en face.
On aura des fragments de tailles aléatoires en fonction de la position des di-désoxynucléotides ; on va
ensuite séparer ces fragments de différentes tailles par électrophorèse capillaire,
Un laser en sortie détectera les 4 di-désoxynucléotides qui correspondent aux 4 fluorochromes différents, le
but est donc de reconstituer la séquence.
Détection de mutations activatrices de proto-oncogènes
Exemple du cancer de la vessie avec la mutation de la tyrosine kinase (diapo ci-dessus) :
On observe une mutation à l'état hétérozygote (un C dans la séquence normale; un C et un T dans la
séquence malade en haut à gauche) et une mutation à l'état homozygotes (un G dans l'ADN normal et un T
dans la tumeur en bas à gauche) qui ont toutes pour conséquence de changer un codon.
Toutes ces mutations démontrent qu’elles ont un effet oncogénique parce qu’elles ont un effet activateur sur
l'activité de la tyrosine kinase du récepteur.
Les cystéines crées aboutissent à une dimérisation constitutive du récepteur. Les autres mutations, par ex la
K652E, au niveau du domaine tyrosine kinase mime une auto phosphorylation donc un changement
conformationel du domaine kinase et active la molécule.
On a pu montrer que c'était des mutations oncogéniques : elles présentent un intérêt bientôt mais il n’y a pas
encore de thérapies.
Ces mutations vont être sensibles aux inhibiteurs de tyrosine kinase qui ciblent le récepteur FGF récepteur
3.
Il existe des molécules en cours de développement pour traiter les tumeurs de vessie.
Il faut noter que FGFR3 est muté dans 75% des carcinomes de vessie superficiels.
Détection de mutations inactivatrice de gènes suppresseurs de tumeurs
4. PCR + analyse au séquenceur
Applications de la PCR :
- Les applications cliniques sont souvent des recherches de marqueurs de types SNP. (Par séquençage avec 4
ddNTP fluorescents) :
=> Les SNP : Single Nucleotide polymorphisms (marqueurs présents sur tous les chromosomes)
Séquençage d’une partie du génome puis détection des variants alléliques par changement d’un nucléotide.
- On peut dire si le sujet est homozygote, hétérozygote pour tel ou tel nucléotide, ou au contraire s’il a une
perte d’hétérozygotie.
L’intérêt dans ce type d’étude est de comparer la tumeur par rapport au tissu sain du patient (obtenu par
prélèvement au niveau de la zone tumorale en comparant par rapport au sang ou à la salive du patient).
NB : ce ne sont pas des analyses réalisées en routine, mais plutôt réalisées en recherche pour déterminer si
tel marqueur polymorphique est associé à une agressivité tumorale, une résistance/réponse au traitement…
- Analyses de liaison = association d’un allèle avec un phénotype : soit une agressivité tumorale, une
chimiorésistance… (C’est-à-dire un facteur pronostic)
- Applications pour l’analyse de STR (Short Tandem Repeat)= microsatellites (par analyse de taille de
fragments).
Dans les STR, on n’utilise pas de ddNTP, on fait de la PCR classique en multiplex généralement et on va
amplifier des séquences répétitives dont le nombre de répétitions varie parce qu’il peut y avoir des
dinucléotides, des trinucléotides, des tétranucléotides. Cela va être à la base de recherche d’hétérozygotie ou
d’instabilité microsatellitaire.
Ce sont des analyses accessibles à la PCR puis, après analyse sur le séquenceur, on se sert du séquenceur
pour analyser des régions répétées appelées microsatellites. Ces microsatellites sont des séquences
répétitives dispersées dans le génome dont le nombre varie d’un individu à l’autre et varie selon l’origine
paternelle ou maternelle de tel ou tel chromosome (Ex : dinucléotides (CA)n, trinucléotides,
tétranucléotides). Ce type de marqueur de type short tendem repeat (STP) sont intéressants pour les
recherches de pertes d’hétérozygoties (par exemple, si on a 2 régions qui sont hétérozygotes, c'est-à-dire
deux régions où les allèles sont différents, alors il faut supposer que l’un vient de la mère et l’autre du père.)
On va donc avec ces techniques pouvoir rechercher les pertes d’hétérozygoties (=perte d’un des allèles au
niveau de la tumeur par rapport au tissu normal).
Ces techniques peuvent être utilisées en remplacement d’autres techniques de séquençage.
En résumé, ces applications sont intéressantes pour :
- Les recherches de pertes d’hétérozygotie.
- Les instabilités microsatellitaires : phénomène où des néo-allèles vont apparaître. (Cancer colorectal
HNPCC/sporadique)
- Analyses de liaison = association d’un allèle avec un phénotype
Enfin on peut utiliser la PCR + analyses au séquenceur et analyse de fragments pour rechercher la clonalité
des réarrangements des gènes codant pour les récepteurs Ig B/ TCR (c'est-à-dire la clonicité de
lymphoprolifération B et T). Cela permet de regarder l’homogénéité d’une population lymphocytaire.
C'est-à-dire que c’est polyclonal s’il y a de multiples pics et 1 ou 2 pics dominants c’est monoclonal
(mono/bi-allélique). Cela ne vaut que pour les populations lymphocytaires qui présentent ces réarrangements
des gènes codants pour les récepteurs t ou b (cf. cours d’immunologie immuno-intervention).
/!\ Important :
Analyse de STR par PCR/Séquenceur : analyse à la fois qualitative et quantitative
Interprétation :
 Perte d’hétérozygotie :
- Hémi zygote : 1 allèle perdu (délétion, monosomie)
- Homozygote : 2 copies du même allèle (disomie uniparentale, recombinaison mitotique)
 Instabilité microsatellitaire :
- Apparition de nouveaux allèles (= erreurs de réplication de l’ADN)
Interprétation pour un short tendem repart= marqueur microsatellitaire.
Perte d’hétérozygotie :
- En haut : ADN normal hétérozygote avec 2 allèles (paternel et maternel)
- En bas : ADN de la tumeur : hémi zygotie (un des 2 allèles a été perdu car soit la région correspondant
à cet allèle a été délété dans la tumeur, soit il y a eu un phénomène d’isodisomie uni parental, c'est-àdire un crossing over entre une région chromosomique. Les 2 marqueurs viennent du même parent donc
on obtient plus qu’un seul pic.
En haut, on observe un allèle à 100 et un autre allèle à 110 tandis que dans la tumeur, l’allèle au niveau
110 est perdu. On va dire, un allèle est perdu et donc il y a peut-être deux copies du même allèle dans
les cellules tumorales.
On voit que la comparaison entre le sang (ADN normal) et la tumeur, permet de voir une disparition d’un
marqueur microsatellite, témoignant d’une perte d’hétérozygotie (un allèle perdu) ou perte homozygote (les
2 allèles sont perdus).
L’instabilité des marqueurs satellitaires (cancer colorectal) :
- Se traduirait par l’apparition de nouveaux allèles
- Signe l’inactivation des gènes de réparation et notamment du mismatch repair (MMR)
Le phénotype MSI-High (microsatellite instability) ou RER+ (replication errors) correspond :
- À une perte d’expression des protéines des gènes du MMR en IHC
- À l’apparition de plus de 2 néoallèles en étudiant des marqueurs microsatellites en PCR puis analyse de la
taille des fragments
Perte combinée de l’expression nucléaire MLH1/PMS2
Documents Dr I.Soubreyan, Inst.Bergonié
MLH1
PMS2
MSH2
MSH6
Ici, des protéines qui sont les protéines qui réparent les mismatchs dans la réplication de l’ADN (mismatch
repairs) qui fonctionnent sous forme d’hétérodimères. Ces hétérodimères sont MLH1 avec PMS2 et MSH2
avec MSH6. Les protéines ne sont stabilisées que lorsque qu’elles sont en dimères. Dans l’image du haut, on
met en évidence que dans la tumeur du malade il existe une perte d’un des deux partenaires (MLH1, PMS2 ;
généralement MLH1). On sait que c’est une perte parce qu’à gauche on observe du tissu normal contrôle du
patient qui montre l’expression normale de la protéine dans les glandes coliques qui sont à côté de ce cancer
colique. Vous avez la même image en bas pour MSH2 et vous voyez en bas tout à gauche dans le coin
l’extrémité des glandes coliques qui est tout à fait positive correspondant à des glandes coliques normales et
dans la tumeur la présence normale des protéines MSH2 et MSH6 qui se co-stabilisent en formant un
hétérodimère alors que dans la tumeur au-dessus avec des coupes (4 lames : anit-MLH1, anti-PMS2, antiMSH2, ati-MSH6) vous avez une perte des protéines de la réparation des microsatellites et ce phénomène en
biologie moléculaire s’accompagne par l’apparition de néo-allèles dans le matériel tumoral avec ici l’allèle
normal qui correspond à des répétitions de (C2A ?) et les flèches qui correspondent à l’apparition de néoallèles comme si les gènes de réappariement ne fonctionnaient pas et que ces microsatellites bégayaient en
quelque sorte et ne se réparaient pas correctement. Ces défauts de réappariement des microsatellites lors de
la réplication de l’ADN donc ce phénomène va lui-même générer des mutations dans d’autres gènes et donc
ce type de phénomène peut conduire lorsqu’on a la perte de protéines et des phénomènes moléculaires à
suspecter une maladie qu’on appelle syndrome de Lynch qui est une maladie héréditaire des cancers du
côlon que l’on voit quand par exemple le sujet a plusieurs cancers du côlon dans sa famille ou quand il
développe avant l’âge de 50 ans un cancer du côlon et on étudie à ce moment-là les cancers du côlon qui
sont développés chez le jeune par immunohistochimie et quand on voit que l’immunohistochimie est
anormale, on fait l’étude moléculaire permettant de confirmer ce phénomène et d’aller ensuite rechercher
par séquençage une mutation des gènes MLH1, PMS2, MSH2 ou MSH6. Je vous ai donc montré que la
maladie de Lynch correspond à la mutation germinale des gènes du mismatch repair qui sont au nombre de 4
avec les protéines qui fonctionnent sous forme d’hétérodimères. L’immunohistochimie va orienter vers la
perte de telle paire ou telle paire et donc va permettre de séquencer le gène. Mais avant ce séquençage, il va
falloir déterminer si au niveau de la tumeur on est dans le cadre d’une maladie de Lynch avec un phénotype
positif mais cela n’est jamais associé avec une mutation somatique du gène BRAF alors que ce phénomène
RER+ peut être observé dans 10 à 15% des cancers colorectaux sporadiques liés à la senescence avec une
méthylation et donc une inactivation de l’expression du gène MLH1 puisqu’il y a une méthylation
somatique des îlots CpG du promoteur du gène MLH1. Cette méthylation va entraîner une diminution de
l’expression de MLH1 et un phénotype de type MSI. La présence d’une mutation BRAF perme d’exclure le
caractère héréditaire.
On voit ici une perte de ces gènes de réparation en IHC que l’on voit arriver spécifiquement dans les cellules
tumorales et non pas dans les cellules normales (ces protéines agissent à l’état de dimère donc le manque
d’une des 2 protéines entraine une instabilité de l’autre protéine) alors que les 2 autres protéines de
réparation des mismatch sont présent dans les deux types de tissus (tumoral et normal).
5. Détection du changement de statut de méthylation de l’ADN
Séquençage de produits de PCR : Détection de changements du statut de méthylation de l’ADN ;
Principe de la conversion par le bisulfite de sodium :
On peut rechercher indirectement la méthylation en traitant l'ADN avec un agent qui va modifier
differentiellement l'ADN selon qu'il est méthylé ou pas.
Une base qui est méthylée ne va pas échanger. Par exemple dans le schéma ci-dessous, la cytosine ne va pas
échanger alors qu’une cytosine qui n’est pas méthylée va être désaminé et transformé en uracile (après PCR
et séquençage elle va apparaitre comme une thymine)
- ADN total (10 ng -1µg)
- Dénaturation (NaOH)
- Traitement par le bisulfite de Na (Na2S2O5) : détection après traitement par le bisulfite de NA qui va
modifié les base non méthylée,
- Lavages et purification de l’ADN
- C non méthylées
- C méthylées = non modifiées
2 possibilités d’analyse après traitement au bisulfite de Na :
- Primers dans une région sans C, PCR + séquençage ou sondes spécifiques
- Primers spécifiques non méthylés/méthylés + méthylation specific PCR
On peut utiliser des amorces de PCR complémentaire spécifique des cytosines ou des thymines pour voir si
on arrive ou pas à amplifier de l'ADN.
Si on amplifie avec des primer qui contiennent des C c'est que l'ADN est méthylée, si on amplifie avec des
primers qui contiennent des T c'est que l'ADN n’est pas méthylé.
On va observer une proportion variable de méthylation plus ou moins importante pour certains gènes et
cela peut présenter un intérêt pronostique dans certain cancer.
Par exemple dans les gliomes, la méthylation de certains gènes est pronostique de l’évolution de la maladie.
Hyper méthylation : inactivation des gènes suppresseurs de tumeurs
Hypo méthylation : hyper expression de certains gènes
La conversion par le bisulfite de sodium est une méthode permettant d’étudier la méthylation de l’ADN
(tumeurs cérébrales ou coliques) et de voir si les cytosines C sont ou ne sont pas méthylés.
Intérêt de cette technique: Il existe au niveau des promoteurs géniques des régions CGCG = îlot CPG=
répétitions de séquences CGCG, c'est-à-dire divers CPG.
La méthylation de ces régions promotrices peut être anormale dans certaines tumeurs, entrainant une
extinction du gène.
Pour faire ce type d’étude, il faut avoir de l’ADN total que l’on va dénaturer par de la soude et traiter par du
bisulfite de sodium. Ce bisulfite va avoir pour effet de convertir les bases ou résidus cytosines non méthylés
en uracile (U), alors que les cytosines méthylées ne seront pas modifiées. Si on a une séquence CGCT au
niveau du CPG non méthylé alors le bisulfite va le convertir en UGUT, ce qui fait que par amplification par
PCR, si on regarde l’ADN (car U pour l’ARN et T pour l’ADN) on va alors lire en séquençage de l’ADN :
TGTT.
Si la région est soumise à une méthylation qui va entrainer une extinction de l’expression du gène, les
cytosines méthylées avec un hypo CH3, vont être protégées contre le bisulfite, alors on lira CGUT (dans le
cas présent) ou CGTT par amplification par PCR, directement au niveau de l’ADN.
On peut regarder la méthylation dans une région sans C, ou on peut utiliser des primers spécifiques du
méthylé par rapport au non méthylé. Donc, on peut passer soit par le séquençage, soit par des techniques de
PCR pour le méthylé vs PCR pour le non méthylé.
Cela permet de définir des hyper méthylations qui vont inactiver certains gènes suppresseurs de tumeurs, ou
des hypo méthylations qui vont entrainer l’hyper expression de certains gènes.
Pour analyser la méthylation : le bisulfite convertit les cytosines non méthylées en uracile alors que les
cytosines méthylées (qui sont « éteintes » au niveau des îlots CPG par la méthylation), vont être protégées
contre le bisulfite de sodium et ne seront donc pas converties en uracile.
Ce qui fait que la méthylation va pouvoir se voir soit en lisant la séquence de l’ADN ainsi convertie (si on
retrouve un T à la place d’un C = pas de méthylation, si C à la place d’un C = il y a méthylation), permettant
ainsi de distinguer les différents états de l’ADN.
Cela permet aussi de définir s’il y a un phénomène d’inactivation génique, qui n’est pas un phénomène
génétique mais un phénomène épigénétique. C'est-à-dire que la méthylation va venir autour du génome pour
assurer la régulation de l’expression de ce génome. La méthylation iso CH3 est un phénomène épigénétique
qui vient modifier l’empaquetage du génome (comme l’acétylation des histones) et qui va entrainer une
régulation de l’expression de ce génome.
Cette méthylation, si elle se traduit au niveau des régions promotrices va « étreindre des gènes » ce qui est
important s’il s’agit de gènes suppresseurs de tumeurs.
CONCLUSION
Méthodes globales et ciblées en génétique et biologie moléculaire des tumeurs.
On peut dire que ces méthodes permettent des applications de détection des anomalies moléculaires dans les
cancers :
 S’il s’agit d’ADN : anomalies quantitatives ou qualitatives. Il s’agit d’une molécule assez stable,
donc ce sont des techniques relativement robustes que l‘on peut mettre en œuvre sur du tissu congelé
ou fixé dans du formol et enrobé dans de la paraffine.
 S’il s’agit d’ARN : c’est une molécule fragile et on préfère la congélation pour mettre en évidence
des anomalies quantitatives ou qualitatives.
 Au niveau des protéines : anomalie quantitatives ou qualitatives des protéines :
- Soit par IHC (Immuno Histo Chimie) sur tissu fixé au formol : plus ou moins quantitatif.
- Soit par western blot (blot des protéines) sur tissu congelé.
Ces analyses vont être faites :
- dans un but cognitif
- mais surtout en pratique pour un but diagnostic, pronostic, pour permettre le remboursement de thérapies
ciblées (par exemple, s’il n’y a pas de mutation du gène EGFR dans le poumon, alors pas le droit aux
médicaments qui vont cibler ce gène…) : éligibilité pour une thérapie ciblée (but théranostic) selon s’il
s’agit d’une mutation cible ou d’un effecteur (critère d’inclusion/exclusion).
En plus du but théranostic, apparaissent également des prévisions de toxicité pour une thérapie donnée =
pharmaco génomique/ pharmacogénétique où l’on peut identifier des marqueurs (STR, SNP, profils
d’expression…) prédicteurs :
 D’une bonne réponse thérapeutique
 D’effets toxiques
 De chimiorésistance.
AVENIR SEQUENCAGE NOUVELLE GENERATION (NGS) « panels » (plus ou moins 50 gènes
qu’on pourra aller analyser très finement) voire globale (permettront de séquencer tous les exons de
tous les gènes connus ou bien tout le génome y compris les introns etc…)
Dans le paysage français, l’INCA (l’institut nationale du cancer ) a permis la mise en place de plateforme
qui a la charge de ces analyses, dont celle de Bordeaux-La Réunion dont le professeur Merlio est
responsable.
Ces plateformes ont été mises en place car en 1999, par exemple, pour les cancers du poumon on savait
qu'il y avait des mutations de KRAS dans un quart des cas.
En 2004, on savait qu'il y avait des mutations d’EGF récepteurs.
Avec les progrès de l’industrie pharmaceutiques et le séquençage du génome tumoral, on a remarqué que
plusieurs médicaments ciblaient des gènes différents, d’où l’intérêt de cibler séquencer plusieurs gènes pour
cette pathologie.
Et le papier princeps pour le cancer du poumon avait été publié par Tony Mok qui montrait qu’en utilisant
un inhibiteur de l’EGFR qui s’appelle Gefitinib, on avait un allongement de survie et de la probabilité de
progression chez le sujet présentant une mutation de l’EGFR par rapport au sujet ne présentant pas cette
mutation. Le problème pour les patients étant de savoir quel patient pouvait bénéficier de ce traitement en
fonction de s’il présente ou non la mutation.
On a donc vu ces différents types de mutations soit par des techniques ciblées, soit par des techniques
globales/semi-globales
Alors comment fait-on ces analyses ?
Le clinicien va dire au pathologiste d’envoyer les prélèvements vers la plateforme, et c’est à partir de là que
mon laboratoire reçoit des prélèvements et analyses des milliers de prélèvements par an, qui arrive sous
forme bloc et de lame colorée (en bas à gauche) avec au microscope, un travail qui va nous permettre de
repérer la partie tumorale par rapport à la partie non tumorale et d’aller après forage exclure l’ADN
correspondant aux cellules tumorales.
A partir de là, on fait donc une extraction d’ADN/d’ARN qui nous permettra de faire un certain nombre de
technique moléculaire mais parallèlement on va faire, soit avant, soit après selon l’importance du matériel
tumorale, des coupes en paraffines au microtome qui vont nous permettre de faire des analyses
complémentaires morphologiques qu’on fait sur des lames c.à.d. des analyses in situ donc en bas à gauche
on a des analyses in vitro à partir des ADN/ARN extrait et à droite des analyses in situ.
Parmi ces analyses in situ, des méthodes permettant de voir l’expression des protéines tel que ALK, ROS,
MET, RET, BRAF qui sont des protéines tyrosines kinases pour lesquels nous disposons d’inhibiteurs
pharmacologiques.
Alors pourquoi est-on amené à développer du séquençage de nouvelle génération en oncologie ? C’est
parce que le problème de l’étude de tous ces gènes au niveau d’un seul prélèvement tissulaire suppose
d’avoir 1) assez d’ADN et 2) de pouvoir voir étudier de manière simultanée l’ensemble des gènes à détecter,
et donc il y a une augmentation du nombre de mutations à détecter alors que on est limité au niveau de
l’ADN d’un point de vue qualité et quantité de l’ADN qui nous sera envoyé.
On a aussi au niveau des plateformes un grand nombre de patients à analyser ce qui va amener une
nécessité de multiplexage. Y a d’autres avantages tels que la quantification et l’exhaustivité.
Principes généraux du NGS :
Pour un même patient, il va falloir étudier plusieurs mutations de différents gènes mais même pour un seul
gène, il va falloir étudier plusieurs exons parallèlement, donc ici par exemple pour EGFR, il va falloir
étudier l’ensemble des exons 18-19-20 et 21. Alors jusqu’à présent, on étudiait si vous voulez chacun de ces
exons de gènes différents dans des tubes différents. Puis après PCR sur chacun des exons, puis Sanger et on
avait le séquençage de ces exons. En NGS on a plus d’exons, voir même la nécessité de faire l’exôme en
entier, voir même le RNA séquencing qui vont nous permettre d’analyser un très grand nombre de patients
avec les techniques de séquençage à haut débit. En plus, ces techniques offrent la possibilité de quantifier la
fréquence allélique de la mutation par rapport au pourcentage des cellules tumorales et dire si la mutation
est portée par l’ensemble des cellules tumorales, ou s’il s’agit d’une sous population de cellules tumorales.
Enfin, ces techniques de NGS ouvrent la voie à l’analyse moléculaire sur la biopsie liquide avec
l’alternative de l’utiliser pour des prélèvements de plasma qui permettraient de détecter des mutations au
niveau du plasma voir des urines des patients sans faire une nouvelle biopsie de matériel tumoral.
Alors comment se fait ce séquençage de nouvelle génération ?
A partir de l’ADN du patient d’une tumeur, on va faire ce qu’on appelle une librairie c.a.d une sélection de
fragment représentatif de l’ADN à séquencer. Une fois qu’on a fait la librairie, on va générer des amplicons
de cette librairie, comme on le fait pour le Sanger, et ensuite on va passer au séquençage.
On appelle ça le séquençage nouvelle génération ou séquençage parallèle massif pour plusieurs raisons.
Premièrement, pour fabriquer la librairie, il existe deux approches : soit on sélectionne l’exon d’intérêt, soit
on fait cette librairie par PCR.
Pour faire une librairie par amplicon on va utiliser des primers qui vont permettre pour un patient donné et
dans le même tube d’amplifier en parallèle et en multiplex l’exon du gène BRAF qui est intéressant, les
exons du gène EGFR qui sont intéressant en nous fournissant des amplicons et on a à ce moment-là
différents amplicons dans le même tube que l’on va marquer pour le patient 1 pour l’identifier, on va
marquer dans le même tube pour tous les amplicons du patient 1 et on va pouvoir mélanger l’ensemble des
patients et multiplexer ça dans un même tube. Alors au lieu de se retrouver avec une multiplicité de tube, on
va marquer les amplicons en fonction des patients et on met tout dans un tube donné.
La deuxième étape c’est la stratégie d’amplification et elle peut se faire soit en émulsion, soit en support
solide et là encore, j’ai choisi de ne représenter que l’émulsion.
On a les ADN des patients qui ont été amplifié qui sont marqué. Ces molécules individuelles du génome vont
être mises en présence de billes qui vont permettre normalement d’accrocher une seule molécule du génome
grâce à une streptavidine et elles sont normalement capturées dans une gouttelette. Donc là vous voyez qu’il
y a 3 molécules qui vont permettre de générer ce qu’on appelle une amplification clonale qui est une
amplification d’un seul brin/double brin d’ADN dans les conditions optimales. On voit également ici qu’il y
a une molécule qui n’a pas le microréacteur (la bille) et une gouttelette avec le microréacteur qui est vide.
Donc on aura des gouttelettes correctes et d’autre imparfaite. La liaison des billes sur l’ADN se fait avec
complexe streptavidine – biotine. Le résultat : on aura des billes polyclonales ou vide à la surface des billes
avec des amplicons et ces amplicons si on est dans une stratégie d’amplification vont pouvoir être
secondairement séquencé.
Donc 3 étapes : la constitution de la librairie (PCR et on fait l’amplification des séquences à étudier),
deuxièmement l’amplification après constitution de la librairie des séquences pour obtenir des
amplifications clonales et puis troisièmement le séquençage proprement dit.
Ce qu’il faut alors savoir c’est qu’on va répartir les billes dans une microplaque où physiquement une seule
bille peut accéder à ces microtrous. On va uniquement séquencer les gouttelettes avec des billes qui
correspondent à de l’ADN.
On va ensuite séquencer comme on le faisait classiquement en Sanger sauf qu’au lieu de mettre un ddNTP
(on en a pas besoin) mais simplement la nécessité d’incorporer des nucléotides au fur et à mesure , et
l’appareil lit la liaison à chaque fois qu’on injecte une base et si donc on injecte la bonne base qui est le C
en complément du G, ça libère un H+ et donc l’appareil qui libère une à une les bases sait à chaque fois
quelle est la bonne base car il voit un H+ et l’analyse bioinformatique va pouvoir faire l’alignement et la
profondeur des reads.
Alors l’analyse globale de la qualité de la réaction de NGS quand on lit la plaque ça va être de regarder si y
a des puits pleins ou des puits vides, de voir si y a des puits avec de l’ADN ou des puits sans ADN, de voir
s’il y a des puits avec des billes correspondant à une seule séquence par rapport à des billes multiclonales et
à la fin on a ici une librairie qui est de l’ordre de 73% ce qui est une librairie de bonne qualité ou avec un
coefficient de l’ordre de 80% donc ici on a une perte de seulement 20% du processus ce qui est tout à fait
honorable et puissant.
Une fois qu’on a eu ça, on va avoir des données brutes qui sont la séquence qui a été lue par la machine,
puis par puits correspondant à un gène donné et un patient donnée et on va pouvoir récupérer les fichiers
fastQ qui correspondent aux données individuelles. Ces données individuelles, on va les aligner sur un
génome, ce qu’on appelle les fichiers SAM/BAM, on va pouvoir aligner les séquences avec donc des
repérages des séquences (fichier d’en-tête et d’alignement des séquences) donc ça c’est l’alignement des
séquences par rapport au gène de référence, et puis après on va faire ce qu’on appelle un fichier de
détection des variants qui vont nous permettre de retenir ou non des variations génétiques en fonction d’un
certain nombre de paramètres qui seront pré-rentrés.
Donc ici l’exemple d’un fichier variant où ici chez ce patient on avait des mutations de KIT qui était à 11%
(le vert) en fréquence, à 96% en couverture et on a aussi les positions couvertes. On a également la
variation en protéine, la variation en nucléotide et on constate que cette variation n’est pas pathogène, c’est
simplement un synonyme, un polymorphisme génétique. Par contre on a d’autre variation dans le tableau
comme par exemple ici une mutation en position 148 du gène EGFR avec une transition C->T qui est une
variation faux-sens, et ceci montre qu’il existe une mutation oncogénique du gène EGFR et on va pouvoir
interpréter par rapport à d’autres bases de données l’aspect pathogène et l’importance par rapport au
ciblage thérapeutique de ce gène EGFR (vous savez qu’il y a une autre variation faux-sens qui est la
variation K-RAS).
Les notions de couverture et de profondeur sont des notions importantes :
- La notion de couverture c’est la zone qui est couverte par au moins une lecture et ça va être exprimé en %
de lecture, par exemple on va dire que cette zone correspond à x% de read, c’est plutôt horizontale.
- La profondeur c’est un autre paramètre qui se détermine par le nombre de fois où une base est lue à une
position génomique déterminée, c’est plutôt verticale.
Globalement dans la technique de NGS, plus vous voulez couvrir le génome, plus votre machine va devoir
lire de séquence, donc la capacité du séquenceur va dépendre de la taille du génome à lire. Si vous voulez
lire l’intégralité de votre génome, vous ne pouvez pas aller en profondeur trop important.
Donc il va falloir trouver un compromis entre le nombre de zone que vous voulez couvrir en couverture et le
nombre de fois où vous voulez analyser et donc plus on est profond, plus on va détecter avec sensibilité une
mutation, plus on est en couverture, plus on va être exhaustif sur le génome. Il faut donc jongler avec ces
deux paramètres que sont la couverture et la profondeur. Vous pouvez avoir si c’est pour répondre à une
question simple une feuille de couverture : je ne vois que les exons 18-19-20-21 de EGFR mais je peux les
analyser 300, 1000, 10000 fois si je veux en profondeur.
En pratique au CHU de Bordeaux, pour le cancer du poumon, on va effectuer un séquençage massif
parallèle pour l’ensemble des gènes pour lesquels il existe une molécule avec AMM ou un essai clinique qui
est ouvert pour les patients. Par exemple, on va ensuite donner les mutations activatrices de l’EGFR voire
même les résistances et puis un certain nombre d’autre paramètres.
Quels sont les intérêts de la NGS/PCR digitale ?
C’est qu’en fait quand on voit la technique de Sanger, on va regarder une aiguille dans une botte de foin
c.a.d on va essayer de voir dans toutes ces molécules la mutation qui est portée dans ce brin d’ADN qui est
ici un T (il a remarqué qu’elle était normale en fait mais bon admettons qu’elle soit mutée), et bien une
mutation à cette position dans cette molécule va être extrêmement difficile à repérer si on utilise un Sanger
car en Sanger on lit en même temps avec l’incorporation des ddNTP.
Explication de la PCR digitale :
On est toujours dans ce principe de gouttelette où il va falloir repérer dans ces gouttelettes la mutation
individuelle ou d’une sous-population de molécules pour une position génomique donnée.
A partir du moment où vous faites de la PCR digitale, vous allez être capable dans des gouttelettes en
utilisant uniquement un système de PCR ou de PCR quantitative de type Taqman avec des sondes de faire
passer des gouttelettes devant un appareil de type cytométrique pour regarder la population qui est mutée,
la population qui est non mutée et éventuellement faire par exemple ici une dilution à 0.1% du mutant et
vous voyez qu’il n’y a plus que 6 événements. Ici vous avez une mutation à l’état hétérozygote dans une
lignée. Donc si vous voulez au lieu de faire de la réaction de PCR, on fait de la réaction de PCR en temps
réel et ensuite on analyse individuellement chaque gouttelette pour voir si elle porte soit l’allèle sauvage,
soit l’allèle mutée en fonction de l’hybridation des sondes, soit les deux avec des gouttelettes double
positives, soit rien si les gouttelettes sont vides.
Donc vous avez les gouttelettes qui sont ici en bas et donc ça nous permet par exemple ici directement de
voir la mutation de l’exon 20 du gène EGFR en position T790M alors qu’on a utilisé soit une sonde de
l’allèle sauvage, soit une sonde de l’allèle mutée.
Et donc on met une sonde verte qui correspond au sauvage, une sonde bleue qui correspond au mutée. Vous
avez donc ici la population mutée, sauvage et double positive.
Donc ces techniques de PCR digitale vont nous permettre d’analyser une à une, toujours avec le principe
des gouttelettes, les mutations individuelles des cellules.
On va donc (enfin) terminer ce cours par le principe de biopsie liquide qui jusqu’à maintenant s’intéressait
à l’étude de l’ADN pris au niveau des prélèvements tumoraux. Il y a un nouveau concept qui a été développé
ces dernières années, c’est la possibilité au niveau de cette biopsie liquide de regarder deux grands
phénomènes : soit les cellules tumorales circulantes, soit l’ADN plasmatique. Les cellules tumorales
circulantes correspondent à des cellules tumorales qui se sont détachés de la tumeur et qui migre dans la
circulation sanguine. L’intérêt de ces cellules circulantes c’est qu’elles pourraient témoigner de la
potentialité de diffusion de la maladie et qu’elles permettent de détecter, chez un patient à un stade avancé
ou sous traitement combien il y a de cellules circulantes tumorales chez ce patient. L’intérêt de prendre le
plasma c’est de détecter non plus les cellules mais les molécules d’ADN qui sont relargué par la population
tumorale ou son stroma et ces deux techniques actuellement sont en compétition ( cellule tumorales
circulantes / ADN circulant ) avec pour l’instant un avantage à l’ADN plasmatique tout simplement car il
est actuellement difficile d’avoir une méthode de purification des cellules tumorales circulantes qui soit
relativement homogène, autant pour l’ADN circulant on a la possibilité d’aller rechercher ça de la même
manière entre les différents laboratoires, autant entre les CTC c’est difficile car c’est présent en très faible
quantité ( 1-10 cellules.mm-1.L-1 ) et donc il faut une bonne sensibilité avec une combinaison de deux
étapes : l’enrichissement de ces cellules tumorales circulantes et la caractérisation de ces CTC. Alors pour
la détection de ces CTC, il y a tellement de techniques qu’il n’y a pas pour l’instant de consensus entre ces
différentes techniques, chacune étant mise en avant par leurs inventeurs. On n’a donc pas de méthode
homogène pour les CTC pour l’enrichissement. Après pour l’étude des CTC, on peut soit étudier leur
morphologie et dire qu’à l’évidence elles sont tumorales, soit utilisé des techniques de marquage en IHC ou
en FISH.
Avec ces techniques on peut par exemple réaliser des études qui ont détecté le fait qu’il y a des mutations de
l’EGFR par exemple ici dans le cancer du poumon et en déduire que chez certains patients, le traitement
marche et que s’ils arrêtent, ça récidive ou que le traitement a marché et puis au bout d’un certain temps y a
une inefficacité du traitement.
Alors l’ADN tumoral lui, il est plus facile à obtenir. Cet ADN circulant, il est présent dans le plasma et il
provient soit de la nécrose ou de l’apoptose des cellules tumorales soit des tissus normaux. L’intérêt de ces
ADN circulant c’est qu’on peut chercher des mutations sans prélèvement tumorales, c a d pour des patients
dont le prélèvement tissulaire n’est pas réalisable ou le matériel est épuisé. Par exemple si un patient a une
métastase osseuse ou cérébrale, ce sera assez lourd pour ce malade de lui dire qu’on va lui faire une biopsie
à ces niveaux. Donc il est préférable de faire une simple prise de sang et de rechercher s’il y a de l’ADN
tumoral dans le plasma. Alors ça peut servir de facteur pronostic pour distinguer les bons des mauvais
pronostics : tel malade a beaucoup d’ADN circulant donc mauvais ou alors ça peut être un suivi d’efficacité
du traitement avec une mesure de la baisse de la mutation circulante ou de la mutation de résistance.
Alors ce qui avait été dit précédemment c’est que le taux d’ADN tumorale circulant globalement il était
supérieur chez les malades par rapport aux individus sains et il augmente en fonction du nombre de
métastases. Il y a une corrélation avec l’évolution de la maladie mais ce n’est pas homogène avec tous les
cancers : il y a des cancers qui donnent beaucoup d’ADN tumoral circulant comme les cancers colo rectaux
puis il y a des cancers qui donnent peu d’ADN tumoral circulant.
Quelles sont les mécanismes de libération ? Soit les mécanismes passifs via apoptose ou nécrose des
métastases ou CTC soit des mécanismes actifs où on estime que les cellules tumorales relarguent de manière
active leur ADN lors de leur passage soit au niveau de la tumeur, ou dans la circulation. La présence d’ADN
circulant est une conséquence du passage des cellules tumorales lors de leur processus métastatiques et en
fait il y a différents types d’ADN circulant : de grandes et de petites tailles et ça a permis cette étude de
montrer que l’ADN venant des cellules tumorales était plutôt < à 200 paires de bases donc plutôt
fragmentés venant soit des exosomes, soit des corps apoptotiques.
Les problématiques sont liés aux prélèvements (matériel et technique) et donc il est clair que si l’on prend
du plasma, on a plus d’ADN tumoral dans le plasma parce que dans le sérum, on a une contamination par
de l’ADN génomique des leucocytes qui se dégradent et donc il faut prendre absolument un tube avec
anticoagulant c.à.d. avec le plasma.
Si on prend un anticoagulant de type EDTA on a une augmentation ici de la concentration d’ADN
plasmatique avec le temps y compris dans les tubes d’EDTA puisque les cellules tumorales et non tumorales
vont se dégrader et donc là on a un faux artéfact alors que si on utilise un tube particulier, on peut le garder
7 jours minimum ou éventuellement 14 jours, on peut montrer qu’il n’y a pas d’augmentation artéfactuelle
de l’ADN dans le plasma.
Donc nous avons mis en place en Aquitaine et avec la Réunion des protocoles de circuits longs ou de
circuits courts pour détecter l’ADN tumoral circulant dans des prises de sang avec effectivement soit des
tubes d’EDTA qui viennent en moins de trois heures au laboratoires, soit des tubes de préservation qui
peuvent venir en 3-4 jours c.-à-d. en moins de 7 jours en laboratoires, ça coute moins de 9 euros par tubes
et on a une fiche de prescription avec l’identification du médecin et du patient pour la raison qu’avec
prescription de cet ADN circulant, quel est le tube qui va être envoyé puis ça va être envoyé soit au
professeur Merlio à Bordeaux soit ailleurs.
Donc au total à partir de la réception de l’échantillon, l’extraction de l’ADN circulant et les amenuisements
moléculaires, il nous faut à peu près 7 jours à la réception du prélèvement.
Pour qui fait-on ces analyses ? Et bien pour le statut EGFR dans les cancers du poumon lorsque la biopsie
est non réalisable ou lorsqu’on a échoué dans le prélèvement tissulaire en raison d’une nécrose ou d’un trop
faible matériel. En deuxième intention on peut faire de l’ADN tumoral circulant pour des patients qui ont un
gène EGFR muté au niveau de leur tumeur qui ont été mis sous inhibiteur de tyrosine kinase et qui rechute
ou récidive sous ce traitement.
Alors on peut faire du NGS toujours pour l’ADN tumoral circulant avec cette possibilité de quantifier les
mutations mais ça a un coût important – 830 euro par point -. On peut pas de la PCR en temps réel avec des
sondes Taqman spécifique d’allèles, ça a un coût de 145 euros par patient, avec des techniques de type
quantitative en temps réel et avec des techniques de type Taqman, c’est ce qu’on utilise en routine de base,
et on peut faire cette PCR digitale.
Donc en pratique, au CHU de Bordeaux, si on a juste une demande de statut EGFR, on va faire la technique
Cobas plasma, si on nous dit « on veut uniquement la mutation T790M », on fera la PCR digitale, et si on
veut faire du primo diagnostic, c.-à-d. on a pas pu réaliser la biopsie, il est trop fatigué, il supportera pas
etc. on fera du NGS car le NGS par rapport à cette PCR digitale, il va pouvoir étudier l’ensemble du panel
dont je vous ai parlé. Le problème de ce NGS c’est cette notion de profondeur et de couverture, il va falloir
modifier la condition de NGS pour l’ADN circulant avec un pipeline bioinformatique spécifique pour l’ADN
circulant permettant de détecter les mutations de manière un petit peu plus différente par rapport à ce qu’on
utilise au niveau des tissus.
Voici un compte rendu biologique avec présence de mutation sur l’exon 19 qui correspond à la mutation
pour laquelle on a donné le traitement au patient et puis une mutation surajoutée T790M qui confèrent une
résistance aux inhibiteurs classiques mais qui peut répondre à certains inhibiteurs de nouvelles générations
et donc il y a un nouveau médicament qui permet après une phase de traitement avec un inhibiteur ici de
cette mutation activatrice de l’exon 19 de traiter les patients qui présentent cette mutation du gène EGFR au
niveau T790M. Donc vous voyez ici un exemple pratique où sur l’ADN circulant, on a pu dire au clinicien
« ok ce patient il avait une mutation du gène EGFR, vous l’avez mis sous inhibiteur de tyrosine kinase pour
l’exon 19 du gène EGFR mais il récidive ».
QCM 2012-2013 (J-P MERLIO)
55- Quels sont les objectifs d'une congélation d'un fragment de tumeur en tumorothèque?
(Réponses : ACDE)
A. Réaliser des techniques de biologie moléculaire
B. Améliorer la qualité morphologique des coupes
C. Pouvoir réaliser une extraction d'ARN de haut poids moléculaire
D. Pouvoir distribuer des acides nucléiques ou des protéines à des laboratoires de recherche
E. Conserver un tissu congelé du malade en vue d'une analyse moléculaire pour son diagnostic ou son
traitement
56- Parmi les tumeurs suivantes lesquelles doivent bénéficier d'une congélation sanitaire systématique
pour la prise en charge du patient (Réponses : E)
A. Condylome
B. Carcinome cutané
C. Mélanome
D. Tumeur du sein
E. Aucune des propositions ci-dessus
57- L'exérèse d'un ganglion lymphatique cervical de 2 cm de diamètre est réalisé dans le cadre d'un
plyadénopathie persistante (Réponses : AC)
A. Ce prélèvement doit rapidement être envoyé frais en environ 30 minutes au laboratoire ou dans un liquide
préservant les acides nucléiques
B. On fixera une partie par perfusion avec du formol
C. On en fixera une partie par immersion dans le formol
D. On peut réaliser des empreintes après la fixation
E. Il est recommandé d'en congeler une partie avant la fixation
58- Vous effectuez une biopsie d'un polype du rectum chez un homme de 50 ans en endoscopie
digestive basse, que devez-vous faire?
A. Fixer entièrement le ou les fragments biopsiques par immersion dans le formol
B. Faire des empreintes avant la fixation
C. Faire des empreintes après la fixation
D. Envoyer à l'était frais pour un examen extemporané et/ou congélation
E. Demander au pathologiste le stade pTNM de cette tumeur
(Feedback : La réponse était ambiguë, mais je ne sais plus pourquoi, désolé)
61- Parmi les matériels suivants quels sont ceux qui permettent de réaliser un examen par FISH pour
la détection d'une amplification du gène HER2 dans un adénocarcinome mammaire (Réponses : BC)
A. Matériel fixé et inclus en résine
B. Coupe de tissu fixé par le formol
C. ARN extrait de matériel congelé
D. ARN extrait de matériel fixé par le formol
E. Aucune des propositions ci-dessus
62- Parmi les techniques suivantes quelles sont celles qui permettent de détecter une amplification de
l'oncogène N-MYC dans les neuroblastomes (Réponses : ABC)
A. Hybridation génomique comparative sur puces (CGH-array)
B. FISH interphasique avec une sonde N-MYC par rapport à une sonde centromérique témoin
C. Dosage génique par PCR quantitative de N-MYC par rapport à un gène témoin
D. Séquençage type Sanger
E. Coloration des noyaux par un agent intercalant
QCM 2013-2014
1. L’exérèse d’un ganglion lymphatique cervical de 2 cm de diamètre est réalisée dans le cadre d’une
polyadénopathie persistante. Sélectionner la ou les proposition(s) correcte(s) :
A. Ce prélèvement doit rapidement être envoyé frais en environ 30 minutes au laboratoire ou dans un liquide
préservant les acides nucléiques.
B. On en fixera une partie par immersion dans le formol.
C. On peut réaliser des empreintes avant la fixation.
D. Il est recommandé d’en congeler une partie avant la fixation.
E. Aucune des réponses ci-dessus.
2. Quelle(s) technique(s) peut (peuvent) être réalisée(s) à partir d’une tumeur fixée par le liquide de
Bouin et conservée en paraffine ?
A. Hybridation génomique comparative sur puces (CGH-array)
B. FISH interphasique
C. Séquençage type Sanger
D. Quantification d’ARN messagers
E. Aucune des réponses ci-dessus.
QCM 2014- 2015
21. Analyse moléculaire globale des tumeurs :
A- Par rapport au caryotype en bandes, le caryotype multicouleurs permet une meilleure mise en évidence
desanomalies chromosomiques structurales complexes.
B- L’inconvénient des caryotypes est que cette approche requiert la mise en culture de cellules tumorales
etl’obtention de mitoses.
C- L’hybridation génomique comparative sur métaphases a une meilleure résolution que l’hybridation
génomiquecomparative sur micro-arrays (micro-réseaux ou puces ADN).
D- L’hybridation génomique comparative permet la détection de tous les types d’altérations
chromosomiques (quantitatives et qualitatives).
E- Aucune des réponses précédentes n’est exacte.
22. Hybridation in situ en fluorescence (FISH) :
A- En hybridation in situ avec des sondes flanquant le gène cible, une dissociation des signaux des deux sondes
indique la présence d’une translocation.
B- Certaines translocations ne sont retrouvées que dans un type de cancer.
C- La détermination du ratio entre les signaux d’un locus d’intérêt et ceux d’une sonde centromérique permet de
distinguer les aneuploïdies (monosomie, trisomie…) des délétions ou amplifications.
D- La détermination du nombre de copies d’un gène par FISH peut être le facteur décisif d’un choix thérapeutique.
E- Aucune des réponses précédentes n’est exacte.