UE2 TD Cytosquelette (cours E. Cornillot) Protéines d’adhérence / Jonctions intercellulaires (T. Maudelonde)
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UE2 TD Cytosquelette (cours E. Cornillot) Protéines d’adhérence / Jonctions intercellulaires (T. Maudelonde) N. Boulle Année 2015-2016 La plupart des illustrations du TD proviennent de Molecular Biology of the Cell Alberts, Johnson, Lewis et al. (5ème édition) Définition: Le cytosquelette Globulaire Fibreux 25 µm Microfilaments d’actine MF ∅ ≅ 7 nm Microtubules MT ∅ ≅ 25 nm Filaments intermédiaires FI ∅ ≅ 10 nm Caractéristiques générales du cytosquelette Cytosquelette dynamique: renouvellement ++ Permet → le changement de forme de la cellule, son mouvement, le déplacement d’organites, de molécules, l’endocytose, l’exocytose, la formation du fuseau mitotique… Cytosquelette stable: Impliqué dans certaines structures cellulaires: microvillosités, sarcomère, cils, flagelles… Caractéristiques générales du cytosquelette FI : MF, MT: Toutes les cellules eucaryotes Pas de liaison covalente entre les monomères Apparus plus tardivement au cours de l’évolution Pas de liaison covalente entre les monomères Renouvellement aux extrémités: polymérisation / dépolymérisation aux extrémités Renouvellement sur toute la longueur du filament (y compris aux extrémités) Formes globulaires (G) / Formes polymérisées (F) Sous-unités fibreuses Polymères orientés: + / - Pas d’orientation + / - Moteurs Pas de moteurs Liaison ATP/GTP – ADP/GDP Pas de liaison NTP/NDP Type de FI spécifique de tissu +++ Forme G (Globulaire) Forme libre G + Forme F (Filament) Forme polymérisée F - Polymérisation des sous-unités globulaires (MF, MT) [G] eq Polymères (F) Équilibre [G] eq ou Viscosité = Nombre et longueur des polymères [G] diminue : Concentration à l’équilibre Temps A l’équilibre, à l’extrémité, [G]eq où :V Polymérisation = V Dépolymérisation Polymérisation vs dépolymérisation? - [Sous unités globulaires] > concentration à l’équilibre ([G]eq ) → polymérisation. Formation et allongement des polymères - [Sous unités globulaires] < concentration à l’équilibre ([G]eq ) → Pas de polymères Polymérisation des sous-unités globulaires (MF, MT) In vivo, équilibre modulé par: - La modification des sous unités globulaires (G) une fois polymérisées (ATP → ADP / GTP → GDP): Fragilise le polymère Les constantes cinétiques ne sont pas les mêmes aux 2 extrémités (+ et -) des MF et des MT → [G]équilibre différentes aux 2 extrémités → Polymérisation extrémité + et dépolymérisation extrémité – - La présence de protéines de liaison, stabilisation, nucléation, coiffe… Actine et microfilaments ∅ ≅ 7 nm Rq: dans les cellules eucaryotes: [Actine G] soluble = 1000 fois [Actine G] eq → ? Cellules non musculaires: 50 % actine non polymérisée QCM1 NTP NDP QCM1 viscosité [G]eq [G] 4 3 Latence 1 1: initiation 2: nucléation 2 temps 1 2 3 4 QCM1 Microfilaments d’actine Microfilaments Tapis roulant Microtubules Microtubules « catastrophe » « sauvetage » Instabilité dynamique QCM2 Microfilaments d’actine, Microtubules Forme libre G + Forme polymérisée F - QCM3 Protéines liant l’actine (AAP) Séquestre Echange ADP / ATP (- polymérisation) (+ polymérisation) Rq: Liaison non covalente entre monomères! Protéines liant l’actine (AAP) QCM 3 A connaître! Nucléation (ext Nucléation (ext +)+) Nucléation (ext -) Séquestre Echange ADP / ATP (- polymérisation) (+ polymérisation) Protéines d’ancrage Stabilisent Dégradation (lie actine – ADP) Protéines à domaine FERM Spectrine Dystrophine Cap Z Fragmentent Gel → Solution (Ca++) Stabilisent Protéines liant l’actine (AAP) QCM 3 A connaître! Nucléation (ext Nucléation (ext +)+) Nucléation (ext -) Séquestre Echange ADP / ATP (- polymérisation) (+ polymérisation) Protéines d’ancrage Stabilisent Dégradation (lie actine – ADP) Protéines à domaine FERM Spectrine Dystrophine Cap Z Fragmentent Gel → Solution (Ca++) Stabilisent QCM 3 Protéines liant l’actine (AAP) Protéines associées à l’actine: Les protéines d'assemblage MF + α-actinine Faisceau contractile Disposition lâche permet d’intercaler la myosine II MF + fimbrine Faisceau parallèle Disposition serrée ne permet pas d’intercaler la myosine II Dimère de filamine Réseau type gel Réseau tridimensionnel mécaniquement résistant D’après cours de S. Delbecq (2012-2013) Protéines liant l’actine (AAP) QCM 3 plaquettes Contacts Focaux (intégrines) Fimbrine, villine α-actinine et Formine (ext +) Faisceau contractile antiparallèle Fibres de stress (Fibres de tension) Réseau, struct. type gel Faisceau serré parallèle filamine QCM 3 Actine et microfilaments Lamellipode lamellipode Arp2/3 à la périphérie Réseau de type gel: filamine QCM 3 2.2. Protéines associées et leurs fonctions + Stabilisation des MF - Stabilisation double hélice : tropomyosine MF Actine + Tropomyosine (dans le sillon) Tropomyosine Protéine fibreuse QCM 4 Cytosquelette et signalisation cellulaire 2.2. Protéines associées et leurs fonctions + Association aux membranes. Partie lipidique - Signalisation cellulaire -> Réorganisation et ancrage . Dérivés du phosphatidylinositol (PI) P Inositol est phosphorylé : PI -> PIP, PIP2, PIP3 Signal extracellulaire Phosphatidylinositol phosphorylé Protéine recrutée Kinase Signal intracellulaire Schéma pour information QCM 4 Cytosquelette et signalisation cellulaire 2.2. Protéines associées et leurs fonctions + Association aux membranes. - Signalisation cellulaire -> Réorganisation et ancrage Partie lipidique . Dérivés du phosphatidylinositol (PI) P Inositol est phosphorylé : PI -> PIP, PIP2, PIP3 . Petites protéines G monomériques (sous-famille Rho) Schéma pour information Protéine G inactive : GDP RhoA Signal cellulaire Protéine G active : GTP GEF Rac Cdc42 Le système des petites GTPAses monomériques Ras (signalisation), Rho (réorganisation du cytosquelette), Ran (transport nucléo-cytoplasmique) … Hydrolyse GAP Petite GTPase Pi GAP: GTPaseActivating Protéin Petite GTPase GTP GDP GTP GEF Echange GDP GEF: Guanine – nucleotide Exchange Factor QCM 4 Actine et microfilaments Dans les cellules non musculaires Assemblages permanents Ancrage à la membrane plasmique (MI) Microvillosités: MF stables! Myosine I QCM 4 Cytosquelette et signalisation cellulaire → Recrutement de protéines + Spectrine / Dystrophine + Association aux membranes. - Signalisation cellulaire -> Réorganisation et ancrage Recrutement de protéines ex: Ezrine Recrutement à la membrane plasmique Phosphorylation extrémité C-terminale Forme globulaire P Signal cellulaire P Recrutement de MF d’actine Forme allongée Microtubules ∅ ≅ 25 nm QCM 5 Tubuline et Microtubules β GT P 13 protofilaments α GT P 13 protofilaments Structure polarisée . Orientation dimères tubuline Extrémité + -> Tubuline β Extrémité – -> Tubuline α . Orientation protofilaments α GT P Dimère de tubuline Lumière Protofilament Tubuline β Extrémité + β:activité GTPase Extrémité - GTPase activée dans le microtubule Microtubule QCM 5 A connaître! 3.2. Microtubules cytosoliques 3.2.2. Instabilité dynamique des MT cytosoliques + Médicaments/drogues affectant les MT cytosoliques - Empêchent polymérisation MT Fixation sur dimères de tubuline Pervenche de Madagascar (source wikipedia) Colchicine (antigoutte), Vinblastine (anticancer), Nocodazol (en recherche) - Stabilisation MT (pas de dépolymérisation) Alcaloïdes de l’écorce d’ifs -> Interaction tubuline β Anticancéreux : Paclitaxel (TaxolTM) et Docétaxel (TaxotereTM) QCM 5 Phalloïdine → Actine Marquage du cytosquelette d’actine par la phalloïdine-AF680 (gris) Phalloïdine: Stabilisatrice (Idem Jasplakinolide) Cytochalasine B Latrunculine Bruno SAUBAMEA EA3621 –Service de Biologie Cellulaire Service Commun d’Imagerie Cellulaire et Moléculaire Université Paris Descartes http://www.etsl.fr/Doc_pdf/Imagerie_confocale_09.pdf QCM 6 Protéines motrices: kinésines / Myosines Kinésines (microtubules) Myosines (microfilaments d’actine) Activation par phosphorylation Domaine moteur Domaine moteur (ATPase) (ATPase) - Hydrolyse de l’ATP → changement conformationnel → mouvement NB: Dynéine: famille différente QCM 6 Tubuline et Microtubules Moteurs moléculaires des microtubules Exocytose, Membrane plasmique Golgi: près du noyau vésicule KINESINES ⊝ Endocytose, Mouvements des cils, flagelles Microtubule (~ myosines) ⊕ DYNEINES vésicule - RE vers le Golgi - Flux vectoriel permanent - Flux rétrograde : Golgi vers le RE QCM 6 Tubuline et Microtubules Moteurs moléculaires des microtubules Golgi: localisé près du noyau! QCM 6 Centrosome: COMT = Centre Organisateur des Microtubules Centrosome = principal COMT des cellules animales Les microtubules croissent à partir des sites de nucléation (anneaux de tubuline γ) (pas des centrioles!) QCM 7 Tubuline et Microtubules Centriole: appartient au centrosome Centriole ~ Corpuscule basal (cils, flagelles) - 9 triplets de microtubules (A, B, C) - Seul A est complet Nexine - Ponts de nexine entre les triplets - Structure protéique en «rayons de roue » reliant les microtubules A A ! Triplets B C Complexe de liaison Structure des cils / Flagelles QCM 7 Structures stables (résistants au froid, agents chimiques) - Corpuscule basal (~ centriole) – 9 triplets de microtubules qui se prolongent dans l’axonème - Axonème = 9 paires de microtubules entourés de membrane plasmique ± 2 microtubules centraux (9+0; 9+2) + nexine, dynéine... + + + Paire centrale de MT Doublet de MT périphériques ! paires Axonème = MT périphérique + Paire centrale MT Corpuscule basal Racine ciliaire Bras de dynéine externe rayon Gaine interne Nexine nexine Microtubule central (simple) Membrane plasmique Bras de dynéine interne Paire de microtubule périphérique Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) QCM 7 Cils et flagelles Nexine Dynéine ATP → ADP Hydrolyse de l’ATP (dynéine) = mouvement vers - Exercice QCM 8 Figure 1A QCM 8 A connaître! 3.2. Microtubules cytosoliques 3.2.2. Instabilité dynamique des MT cytosoliques + Médicaments/drogues affectant les MT cytosoliques - Empêchent polymérisation MT Fixation sur dimères de tubuline Pervenche de Madagascar (source wikipedia) Colchicine (antigoutte), Vinblastine (anticancer), Nocodazol (en recherche) - Stabilisation MT (pas de dépolymérisation) Alcaloïdes de l’écorce d’ifs -> Interaction tubuline β Anticancéreux : Paclitaxel (TaxolTM) et Docétaxel (TaxotereTM) QCM 8 Figure 1A Méthodologies: Transfection d’ADN → Production de protéines «recombinantes » → « Extinction » de l’expression d’un gène Cellule eucaryote Bactérie ADN (Transfection) Protéine rec. Protéine rec. Purification Lysat Western blot IP… Méthodologies: Interactions Antigène-Anticorps - TAG Anticorps anti-TAG protéine TAG TAG = GFP, GST… - Western-blot Anticorps dirigé contre la protéine d’intérêt Lysat (protéines) Bleu de coomassie PM + Gel d’électrophorèse Western-blot Méthodologies: Interactions Antigène-Anticorps - Immuno-histochimie, immunofluorescence Lysat - Immuno-précipitation Anticorps fixé sur une bille de résine Billes de résine Lavages, centrifugation (protéines) Méthodologies: Interactions protéine-protéine - « Pull –down » → Protéines purifiées ou domaines protéiques - Immuno-précipitation → Protéines produites dans la cellule QCM 9 Figure 1B QCM 9 « Mock » Figure 1B Si αadaptin QCM 10 Figure 2A: immunoprécipitation GFP Clathrine Cellules Hela Cellules Hela IP GFP Anticorps anti GFP Western-blot Qu’attrape-t-on avec α-TAT1? Western-blot → « PROIE » QCM 10 Figure 2A: immunoprécipitation GFP QCM 11 Figure 2B: GST-Pull Down QCM 11 ADN Bactérie 1 GST Ac antiGST GST 3 GST Lysat 2 Alpha-TAT1 AlphaTAT1 Alpha-TAT1 GST GST GST Cellule Hela AlphaTAT1 QCM 11 Figure 2B: GST-Pull Down GST GST Alpha-TAT1 AlphaTAT1 FI GST Alpha-TAT1 + GST AlphaTAT1 + GST GST Filaments intermédiaires ∅≅ 10 nm ~ corde QCM 12 Filaments intermédiaires: Sous-unités fibreuses Monomère Région en hélice alpha Aa Hydrophobes Dimère Même orientation Renouvellement: Tetramère - constant Décalage Dimères en orientation opposée -sur toute la longueur Orientation inverse Protofilament (protofibre): Plusieurs tétramères bout à bout Un filament intermédiaire = 8 protofilaments QCM 12 Filaments intermédiaires 4.2. Différents types de filaments intermédiaires + Classement - env. 50 protéines différentes - 6 groupes ou types de sous-unités Type I II III IV V VI Protéine Cytokératines acides Cytokératines neutres ou basiques Vimentine Desmine Protéines fibrillaires acides gliales (GFAP) Protéines de neurofilaments Lamines nucléaires Nestine Localisation / type cellulaire Cellules épithéliales Cellules épithéliales Fibroblastes, Cellules endothéliales, Muscle lisse Cellules musculaires Cellules gliales (astrocytes, …) Axones et dendrites des neurones Noyau Cellules souches neuronales et neurones immatures ! Utilisé en anatomopathologie pour identifier l’origine d’une tumeur QCM 12 MF FI QCM 12 Filaments intermédiaires Les lamines + Les lamines (Type V) - Dans les cellules animales - Localisation : le noyau Réseau sous-mb Nucléoplasme - Lamines A, B, C LMNA -> Lamines A et C LMNB1 et LMNB2 (même gène) -> Lamines B - CDK → phosphorylation des lamines → disparition de l’enveloppe nucléaire (cf S. Carillo & P. Pujol) QCM 12 Filaments intermédiaires / MT Protéines d’adhérence – Jonctions Cours T. Maudelonde Jonctions → Actine / Filaments intermédiaires Epithelium Pôle apical Cadhérines Actine (jonctions adhérentes) Filaments intermédiaires (desmosomes) Contacts focaux Intégrines Pôle basal Protéines d’adhérence QCM 13 Les protéines d’adhérence: 1- Famille des Cadhérines Ex: E-Cadhérine, Desmoglein 2- Famille des Integrines Ex: α5β1 3- Famille des Sélectines Ex: L - E - P- Sélectines 4- Famille des Immunoglobulines Ex: N-CAM 1- Les cadhérines QCM 13 Distribution des domaines dans différentes cadhérines Cadhérine T Glycosylphosphatidylinositol d’ancrage (GPI) RET Tyrosine kinase ICS Desmocolline-1a Desmogléine-1 ICS Interaction avec les filaments intermédiaires Domaine CAD ICS Cadhérine E Fixation de la caténine QCM 13 1- Les Cadhérines → Interactions cellule / cellule Interactions homophiliques le plus souvent+++ QCM 13 1- Cadhérines et jonction adhérente (Actine) (Ceinture d’adhérence / zonula adherens) α- catenine Filament bipolaire de Myosine II MF Cadhérine Actine Alpha-actinine Jonction d’adhérence Ceinture Jonction d’adhérence d’adhérence Zone d’adhérence Signalisation cellulaire QCM 13 1- Cadhérines et desmosomes (filaments intermédiaires) « boutons » Filaments intermédiaires (ex: cytokératine des cellules épithéliales) Protéines d’ancrage QCM 13 Jonctions Cellule / Matrice extracellulaire: Intégrines 2- Molécules d’adhérence - les Intégrines: Dimère α/β –Toujours hétérophilique Interactions : - Cellule / Matrice extracellulaire +++ - Cellule / Cellule - 18 chaine α - 8 chaines β Sur la membrane de toutes les cellules sauf les GR 2- Les Intégrines: Signal Dimère α/β – Activation « pince » Signal 2- Les Intégrines: Interactions Cellule / Matrice extracellulaire Actine → Contacts focaux Extracellulaire fibronectine Fibronectine Appartient à la matrice extracellulaire → Séquence RGD Actine Signaux cellulaire Intracellulaire Interactions Cellule / Matrice extracellaire Contacts Focaux (Intégrines) Fibres de stress = Fibres de tension 2-Les Intégrines: Interactions Cellule / Matrice extracellulaire Filaments intermédiaires → Hémidesmosomes Intracellulaire Cellule épithéliale Cytokératine (FI) Hemidesmosome Lame basale Cytokératine (FI) Protéines d’Ancrage Intégrines Laminine = lame basale Extracellulaire 2- Les Intégrines: Interactions Cellule / Cellule hétérophiliques Leucocyte Intégrine CAM (Immunoglobuline) Cellule endothéliale (vaisseaux) QCM 14 3- Les Sélectines: Glycoprotéines membranaires - Toujours hétérophilique Se lient aux sucres (via domaine lectine) Cellules spécialisées: E- endothéliales P- Plaquettes L- Leucocytes QCM 14 3- Les Sélectines: Sélectines Ca++ Signaux mécaniques et chimiques Exocytose Membrane plasmique Cytosol Cytosol C N C Activées par les médiateurs de l’inflammation Rôle des sélectines dans les mouvements du leucocyte leucocyte sucres E-Selectine Cellule endothéliale Leucocyte 1- Sucres (mucines) 3- Intégrine activée Cellule endothéliale 2- E-Sélectine Liaisons faibles - roulement 4- Ig-CAM Liaisons fortes ouverture jonctions/passage 4- Les Immunoglobulines Non dépendantes du Ca++ 4- Les Immunoglobulines hétérophiliques homophiliques Dans les jonctions Leucocyte Intégrine CAM (Immunoglobuline) Cellule endothéliale (vaisseaux) Jonctions intercellulaires Jonctions intercellulaires Importance des interactions: Cellule / cellule Cellule / matrice extracellulaire Jonctions cellulaires → signaux intracellulaires: survie cellulaire, division, migration… La cellule cancéreuse « s’affranchit » de ses jonctions → perturbations +++ des molécules d’adhérence Exemple: perte de E-cadhérine QCM 15 Concours 2014-2015 QCM 15 Les jonctions dans la cellule épithéliale Complexe de jonction: cellule épithéliale polarisée Jonction étanches (occludines / claudines) Jonction adhérente Desmosome (en « bouton ») Jonction communicante (connexons) Contacts focaux Hemi-desmosome actine Filament intermédiaire QCM 15 Les jonctions dans la cellule épithéliale Jonction Étanche (serrée) Jonction adhérente Desmosome QCM 15 Espace étroit: Les jonctions étanches Définit la polarité cellulaire Protéines « spécifiques »: occludines / claudines tout autour de la cellule Jonctions étanches (serrées) QCM 15 Espace étroit: Les jonctions étanches Définit la polarité cellulaire Protéines « spécifiques »: occludines / claudines Les molécules d’adhérence Ex Interactions Dépendance Homophiliques ou Ca++ hétérophilique Cytosquelette Jonctions cellulaires Adhésion cellule / cellule Filaments d’actine Jonction adhérente via les catenines (α et β) Cadhérines « classiques » E-Cadhérine Oui Homophiliques * Cadhérines des desmosomes Desmoglein, desmocollin Oui Homophiliques * Immunoglobulines N-CAM… Non Les 2 ? Oui Hétérophiliques Filaments d’actine Sélectines Cellules spécialisées: Filaments intermédiaires (cytokératine....) Desmosomes Jonctions serrées, Desmosomes … L-E- et P-sélectines Adhésion cellule / matrice Intégrines Intégrines α5β1… Oui Hétérophiliques Oui Hétérophiliques Filaments d’actine via talin, vinculin, αactinin… Filaments intermédiaires Contacts focaux Hemi-desmosomes Les Jonctions Jonctions cellulaires Molécules d’adhérence Cytosquelette Adhésion cellule / cellule Jonction adhérente Cadhérines « classiques » Desmosomes Cadhérines des desmosomes (desmoglein, desmocollines…) Jonctions étanches Occludines, Claudines, Jonctions communicantes Connexines Autres Selectine / CAM Ig / Integrine Filaments d’actine via les caténines (α et β) Filaments intermédiaires (cytokératine....) Filaments d’actine Leucocyte / endothélium (des vaisseaux) ; immunité… Adhésion cellule / matrice Points d’adhésion focaux Hemi-desmosomes Intégrines α5β1… Intégrines Filaments d’actine via talin, vinculin, αactinin… Filaments intermédiaires
