Etude des récepteurs TonB-dépendants et d`un nouvel effecteur de

UNIVERSITE TOULOUSE III – PAUL SABATIER
U.F.R. Sciences de la Vie et de la Terre
THÈSE
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ TOULOUSE III
Discipline :
Microbiologie
« Microorganismes, du génome aux interactions avec l’hôte »
Présentée et soutenue par
Servane BLANVILLAIN
Le 23 Novembre 2007 à 14h00
Etude des récepteurs TonB-dépendants et d’un nouvel
effecteur de type III de la bactérie phytopathogène
Xanthomonas campestris pv. campestris
JURY
Nicole HUGOUVIEUX COTTE-PATTAT, Directeur de Recherche, CNRS, Lyon, Rapporteur
Ralf KOEBNIK, Directeur de Recherche, IRD, Perpignan, Rapporteur
Philippe NORMAND, Directeur de Recherche, CNRS, Lyon, Examinateur
Claude GUTIERREZ, Professeur de l’Université Paul Sabatier, Toulouse, Examinateur
Matthieu ARLAT, Professeur de l’Université Paul Sabatier, Toulouse, Directeur de thèse
Emmanuelle LAUBER, Chargée de Recherche, CNRS, Toulouse, Co-Directeur de thèse
Recherches effectuées au Laboratoire des Interactions Plantes-Microorganismes,
UMR CNRS / INRA 2594 / 441
24, Chemin de Borde Rouge BP 52627
31 326 Castanet Tolosan cedex, France
REMERCIEMENTS
Tout d’abord, je souhaite remercier chacun des membres du jury pour avoir accepté d’évaluer ce
travail de thèse et pour leur flexibilité sur la date de soutenance. Je remercie particulièrement
Nicole Cotte-Pattat et Ralf Koebnik pour avoir rédigé leur rapport dans les plus brefs délais.
Un grand Merci
Merci à…
Matthieu, pour m’avoir grand ouvert les portes de ton équipe et pour tout ce que tu m’as apporté
au cours de ces années de recherche, sur les plans scientifique et humain. Malgré tes fines blagues
récurrentes sur Xantho ou « les gens de l’INSA », on m’a souvent envié mon chef et je le
comprends. Merci pour tes encouragements précieux tout au long de ma thèse, merci d’avoir
supporté mon caractère têtu et obstiné (je sais que ça n’a pas été facile tous les jours !...) et
d’avoir contribué à élargir ma « culture de l’à-peu-près » (je t’entends déjà dire qu’il y a encore du
travail…) !
Manue, pour la confiance que tu m’as toujours témoignée, pour ton aide et tes conseils avisés
pour les manips (y compris les précautions d’hygiène & sécurité !), et pour tous les bons moments
passés ensemble au cours de ces 3 années. « Vous et votre projet de recherche m’ont beaucoup
intéressée »… J’espère que tu décrocheras toujours aussi vite quand je téléphonerai au labo dans
le futur, que tu continueras à aimer « tous les trucs dégueus » de la cantine et à fréquenter des
« homme-grenouilles »… Peut-être un jour viendras-tu me voir à Cologne en A380 (prononcer A
Trois Cent Quatre Vinnnnnnnnnnngt) ?....
Claudine, pour m’avoir transmis ta passion pour la molécule d’ADN et tous tes petits « trucs » si
pratiques qui vont avec. Je penserai toujours à toi quand je cramerai les bulles sur les boîtes de
Pétri au bec-bunsen ! Désolée de t’avoir si souvent infligé Radio Nostalgie (entre deux dédicaces
sur Santana ou Imagine) et cassé plusieurs öses de platine…« ça n’arrive qu’à ceux qui
travaillent », non ? Merci aussi pour les bonbons en permanence dans le labo…Grâce à toi
toutes les drôles de dames ont « quelques plaques de beurre » à éliminer !
Martine, ma môman du labo. Merci pour ta gentillesse de chaque jour, ton amitié et ta
disponibilité pour papoter de choses et d’autres. C’était bien agréable de partager avec toi les
ragots quotidiens du labo et de bavarder sur les mésaventures de tes fils. En plus de tous les
coups de main que tu as pu me donner pour les manips, j’ai appris énormément à tes côtés, sur
des thèmes aussi variés que la chanson française des années 60-80 ou la charcuterie normande.
C’est sûrement pour toutes ces raisons que tu es une star lors des mondanités de microbiologistes
toulousains !… J’espère surtout que tu seras encore ma copine si un jour je zozote ou si j’ai un
bec de lièvre.
Alice, ma grognasse préférée. On a traversé ensemble bien des galères (les conjugs cre-lox ou les
trous dans les arabettes, pour ne citer que cela…), et c’est souvent bien appréciable d’avoir
quelqu’un avec qui partager ses difficultés. Tu as toujours été disponible pour donner les coups
de patte cruciaux de dernière minute et pour les discussions de filles autour d’un café ou d’un
citron vert. Merci aussi pour les rigolades de tous les jours autour de la paillasse, et pour les
craquages du vendredi-c’est-permis, aussi impitoyables qu’inoubliables !....
Nickette et Guitoune, qui sont venus renforcer la partie masculine de l’équipe, ont subi les
rituels d’intronisation et s’en sont sortis vivants… Nickette, merci pour ta gentillesse et pour les
coups de main « broyage d’arabettes » le dimanche ! Guitoune, c’était vraiment un très grand
plaisir de travailler avec toi pendant ces quelques mois, merci pour ta bonne humeur de tous les
jours, pour les fou-rires en salle 14C lors des vidages de cochon bleu, ou lors des séries infernales
de 200 β-Gal dans la journée… au prix où sont les xylo-oligosaccharides de nos jours, on n’avait
pas intérêt à trop « bader », mais on s’en est bien sortis, nom d’un caribou… Je suis bien
contente de te confier mes « bébés », n’oublie pas de bien homogénéiser tes échantillons avant de
les « pooler », et tu deviendras à ton tour un vieux baroudeur avec toutes les maniaqueries de
rigueur….
Une affectueuse pensée pour Jacques qui nous a quittés cet été.
Laure et Maud, mes copines du labo, un grand merci pour votre amitié et pour tous les bons
moments passés ensemble, au labo ou ailleurs. Maud, merci pour les petits apéros, pour les soirées
mouillées à Odyssud et pour les vacances en Italie en Fiat Panda ! Laure, depuis nos premiers
fous-rires à Aussois, merci pour les petites bouffes et les petits thés, prétextes de discussions fort
agréables de choses et d’autres, et merci surtout pour ton immense soutien et ton écoute lors des
coups durs que la vie réserve parfois…De gros bisous d’esquimau pour tout ça !
J’espère que vous viendrez toutes les 2, avec vos petites familles, me voir souvent à Cologne !
Même toi, Maud…on fera des bonhommes de neige sous la pluie, tu vas adorer !
Merci aussi au déserteur, l’helvète Ben Gou, animal à sang froid qui a tout le temps faim le soir
vers 19 heures, pour quelques bons souvenirs à Aussois et en Italie.
Je tiens à remercier toutes les personnes du LIPM qui ont fait de mes 3 années au labo une
grande aventure. Merci pour votre aide, vos conseils techniques, votre gentillesse, vos sourires.
Une mention toute particulière pour l’équipe de Dominique Roby (Claudine, Olivier, Carine,
Amandine, Solène…), Sylvie C. et Sandra M., toutes les personnes de la laverie, de la serre, les
informaticiens et le personnel administratif et financier, surtout Madeleine pour qui les devis de
la COREP n’ont pas été faciles à digérer tous les jours.
Loin du labo, il y a les amis. Ceux de Toulouse, ceux de Blois (mes Poulz adorées), ceux de Paris,
mais aussi les Crevinois, les Aixois, les Stéphanois et les autres à travers le monde. Il n’y a pas de
mot pour décrire tout ce que vous m’apportez chaque jour. Même si vous avez souvent trouvé
que je vous délaissais pour le travail, tous les moments que l’on passe ensemble me sont plus chers
que tout et m’apportent toute la joie, la bonne humeur, l’énergie et le courage parfois nécessaires
pour tenir le coup tout au long d’une thèse. A tous et toutes, du fond du cœur, merci. Et y’aura
toujours moy’ d’aller pétanquer et camper en Allemagne, on a bien survécu à la Chavanne
Nordique !… Je vous dégoterai des yurtes mongoles et des citrons verts même dans la Ruhr !...
A mon Papa et ma Maman. Des kilomètres nous séparent au quotidien mais je tiens à vous
remercier pour votre soutien de chaque instant tout au long de cette thèse. Merci pour les
consultations téléphoniques (c’est grâce au téléphone que j’ai gardé le moral et la santé pendant
3 ans !) et merci pour tous les moments forts passés ensemble, qu’ils soient heureux, et il y en a eu
beaucoup, ou douloureux, il y en a eu aussi. Ce que je vous dois à tous les deux pour cette thèse et
pour le reste et depuis si longtemps ne peut s’exprimer. A part peut-être sur le site de PLoS
ONE, j’y réfléchis !...
A Antoine et Elodie. Merci à vous aussi pour votre soutien et pour la joie que l’on a de se
retrouver, à Blois, à Paris, à Toulouse ou à Lyon. Qu’il y ait dans le futur plein d’autres petits
week-ends retrouvailles, avec Cologne comme possible lieu de rendez-vous à l’avenir… Elo,
merci pour la joie immense que m’a procurée au cours de cette thèse la naissance de Lilou, ma
nièce préférée que j’ai tant de plaisir à voir grandir.
A mes mamies, à Françoise qui me manque tellement, et à Charlanita pour votre affection et
pour tous les bons moments passés ensemble. Les week-ends à Fouras avec bêtes à pinces et jus
de canne en terrasse ou devant la cheminée m’ont bien souvent permis de recharger les
batteries !…
Enfin, last but not least, Sylvestre. Ce n’était pas tous les jours faciles de partager la vie d’une
petite thésarde... Merci d’avoir accepté sans rien dire (ou presque !) les dimanches raccourcis par
quelques cultures à lancer ou quelques plantes à arroser. Merci d’avoir pris si bien soin, surtout
pendant les longs mois de rédaction. Et pour tout le reste qui ne peut être décrit avec des mots
mais qui pourrait bien s’appeler le bonheur, un immense merci.
Au petit pois…
Liste des abréviations
ABREVIATIONS
aa
ABC
ADN
ADNc
AMPc
ARN
ATP
Avr
CAZy
CDS
CLP
CUT
Da
DKI
DKII
DSF
ECF
EI
EII
EPS
ET
FUR
GA
GAX
GPH
HGA
HNS
HPr
HR
Hrc
Hrp
JA
kb
Kd
kDa
KDG
LPS
LRR
MFS
MSD
NB / NBS
OMP
ORF
PAMP
PEG
pb
PGA
PG
PGIP
acide aminé
ATP Binding Cassette
Acide Deoxy-ribo-Nucléique
ADN complémentaire
Adénosine Monophosphate cyclique
Acide Ribo-Nucléique
Adenosine Triphosphate
Avirulence
Carbohydrate Active Enzymes
Coding DNA Sequence
cAMP receptor Like Protein
Carbohydrate Utilization containing TBDR
Dalton
5-keto-4-deoxyuronate
2,5-diketo-3-deoxygluconate
Diffusible Signal Factor
Extracellular Cytoplasmic Function
Enzyme I
Enzyme II
Exopolysaccharides
Ethylène
Ferric Uptake Regulator
Acide Galacturonique
Glucuronoarabinoxylane
Glycoside Pentoside Hexuronide
Homogalacturonane
Histone-like protein
Histidine containing protein
Hypersensitive Response
Hrp conserved
Hypersensitive response and pathogenicity
Jasmonic Acid
kilobase
Constante de dissociation
Kilodalton
2-keto-3-deoxygluconate
Lipopolysaccharides
Leucine rich repeat
Major Facilitator Superfamily
Membrane Spanning Domain
Nucleotide Binding Site
Outer Membrane Protein
Open Reading Frame
Pathogen Associated Molecular Pattern
Polyethylène Glycol
paires de bases
Acide Polygalacturonique
Polygalacturonase
Polygalacturonase Inhibiting Protein
Liste des abréviations
PL
PAE
PME
PR
PRR
PTS
pv.
QS
R
RGI
RGII
RLK
RLP
ROS
Rpf
SA
SAR
SBP
SNP
sp.
SSS
SUMO
TBDR
TIR
TTSS
Pectate Lyase
Pectine Acétyl Estérase
Pectine Méthyl Estérase
Pathogenesis-Related
Pattern Recognition Receptor
Phosphotransferase System
pathovar
Quorum Sensing
Résistance
Rhamnogalacturonane I
Rhamnogalacturonane II
Receptor-Like Kinase
Receptor-Like Protein
Reactive Oxygen Species
Regulation of pathogenicity factors
Salicylic Acid
Systemic Acquired Resistance
Solute Binding Protein
Single Nucleotide Polymorphism
species
Sodium Solute Symporter
Small Ubiquitin-like Modifier
TonB-Dependent Receptor
Toll / Interleukine1 Receptor domain
Système de Sécrétion de Type III
Liste des figures
LISTE DES FIGURES
Introduction générale :
Figure Int-1 : Les principaux organismes phytopathogènes.
Figure Int-2 : Symptômes de pourriture noire sur chou provoqués par Xanthomonas
campestris pv. campestris.
Figure Int-3 : Colonies de Xanthomonas campestris pv. campestris sur milieu solide
riche et bactéries enchassées dans leur matrice exopolysaccharidique.
Figure Int-4 : Représentation schématique du cycle de vie de Xanthomonas campestris
pv. campestris.
Figure Int-5 : Illustration des interactions entre Xanthomonas campestris pv. campestris
et une plante-hôte.
Figure Int-6 : Modèle d’activation de la synthèse de facteurs de virulence chez
Xanthomonas campestris pv. campestris.
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10
10
12
13
Chapitre I :
Figure I-1 : Les différents types de transporteurs de nutriments organiques à travers les
membranes externe et interne des bactéries à Gram négatif.
Figure I-2 : La translocation de groupe par le système PTS, mode de transport actif de
carbohydrates à travers la membrane interne des bactéries à Gram négatif.
Figure I-3 : Exemple de transport secondaire de type symport couplé à un antiport, à
travers la membrane interne d’une bactérie à Gram négatif.
Figure I-4 : Les différentes classes de sidérophores et leur structure chimique.
Figure I-5 : Structure-fonction des récepteurs TonB-dépendants.
Figure I-6 : Structure primaire des récepteurs TonB-dépendants.
Figure I-7 : Structure tridimentionnelle de 5 des 7 récepteurs TonB-dépendants
cristallisés à l’heure actuelle
Figure I-8 : Topologie transmembranaire du domaine β-barrel du récepteur TonBdépendant FhuA et des 3 protéines du complexe TonB/ExbB/ExbD
Figure I-9 : Le modèle « Tunnel » du tranfert d’énergie entre la protéine TonB et le
récepteur TonB-dépendant FepA.
Figure I-10 : Les systèmes d’acquisition du fer de la bactérie modèle Escherichia coli.
Figure I-11 : Les particularités du systèmes TonB de deux bactéries phytopathogènes :
Xanthomonas campestris pv. campestris et Ralstonia solanacearum.
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33
34
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Chapitre II :
Figure II-1 : Représentation schématique et simplifiée de la structure pariétale d’une
cellule végétale et des sous-couches qui la constituent.
Figure II-2 : Vue d’ensemble de la structure de la paroi végétale primaire et de ses
principaux constituants.
Figure II-3 : Structure moléculaire des constituants de la paroi primaire des cellules
végétales.
Figure II-4 : Structure de la pectine, de ses chaînes linéaires et de ses ramifications.
Figure II-5 : Symptômes de la pourriture molle causés par la bactérie Erwinia
chrysanthemi.
Figure II-6 : Etapes extracellulaires, périplasmiques et cytoplasmiques de la pectinolyse
chez Erwinia chrysanthemi.
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86
86
87
90
93
Liste des figures
Figure II-7 : Schéma simplifié de la régulation de la pectinolyse chez la bactérie
Erwinia chrysanthemi.
Figure II-8 : Représentation schématique du locus XCC0117-XCC0122 de Xanthomonas
campestris pv. campestris.
Figure II-9 : Dosage de l’activité β-glucuronidase des mutants d’insertion portant le
plasmide suicide pVO155 dans les gènes TBDR XCC0119 et XCC0120.
Figure II-10 : Niveau d’expression du gène XCC0119, mesuré par RT-PCR quantitative.
Figure II-11 : Etude par dosage de l’activité β-galactosidase de fragments d’ADN en
amont du gène XCC0119 de Xanthomonas campestris pv. campestris.
Figure II-12 : RT-PCR sur la région intergénique entre les gènes XCC0119 et XCC0120.
Figure II-13 : Etude par dosage de l’activité β-galactosidase de la régulation du gène
XCC0119 par le régulateur XCC0150 de Xanthomonas campestris pv. campestris.
Figure II-14 : Etude par dosage de l’activité β-galactosidase de la régulation du gène
XCC0119 par différents régulateurs de Xanthomonas campestris pv. campestris.
Figure II-15 : Représentation schématique du locus XCC1748 - XCC1759 de la souche
ATCC33913 de Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), et de la région
correspondante chez la souche 8004 de Xcc.
Figure II-16 : Dosage de l’activité β-glucuronidase des mutants d’insertion du plasmide
pVO155 dans le gène TBDR XCC1749 et dans le pseudogène TBDR XCC1750-1751 de
Xanthomonas campestris pv. campestris.
Figure II-17 : Dosage de l’activité β-glucuronidase des mutants d’insertion du plasmide
pVO155 dans les TBDR du locus chez les souches ATCC33913 et 8004 de
Xanthomonas campestris pv. campestris.
Figure II-18 : Etude de la régulation par le régulateur XCC1748 du gène TBDR
XCC1749 et du pseudogène TBDR XCC1750-1751 de Xanthomonas campestris pv.
campestris.
Figure II-19 : Etude par dosage de l’activité β-galactosidase de fragments d’ADN en
amont du gène TBDR XCC1749 et du pseudogène TBDR XCC1750-1751 de
Xanthomonas campestris pv. campestris.
Figure II-20 : Etude par dosage de l’activité β-galactosidase de la régulation du gène
TBDR XCC1749 et du pseudogène TBDR XCC1750-1751 par différents régulateurs de
Xanthomonas campestris pv. campestris.
Figure Ar-1 : Genetic organization of the Xanthomonas campestris pv. campestris
XCC4120, XCC2828 and XCC4101 loci.
Figure Ar-2 : Regulation by XCC4101 of the genes of the 3 loci, measured by
quantitative RT-PCR.
Figure Ar-3 : Expression of the Xanthomonas campestris pv. campestris XCC2828 and
XCC4120 TBDR genes in the presence of different xylose concentrations.
Figure Ar-4 : Expression of the Xanthomonas campestris pv. campestris XCC2828 and
XCC4120 TBDR genes in the wild-type strain and in a pVO155 insertion mutant in
XCC4101, in the presence of xylose or xylan.
Figure Ar-5 : Expression of the Xanthomonas campestris pv. campestris XCC2828 and
XCC4120 TBDR genes in the wild-type strain and in a pVO155 insertion mutant in
XCC4101, in the presence of xylo-oligosaccharides.
Figure Ar-6 : Expression of the Xanthomonas campestris pv. campestris XCC4118 to
XCC4122 genes in the presence of xylo-oligosaccharides.
Figure Ar-7 : [14C]xylose transport into Xanthomonas campestris pv. campestris wildtype and mutant strains.
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123
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124
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Liste des figures
Figure Ar-8 : Expression kinetics of the Xanthomonas campestris pv. campestris
XCC4120 TBDR gene in the presence of xylotriose.
Figure Ar-9 : Conservation of the Xanthomonas campestris pv. campestris XCC4115 to
XCC4122 locus in Xanthomonas ozyzae pv. ozyzae strain KACC10331.
Figure Ar-10 : In silico prediction of the Xanthomonas campestris pv. campestris xylan
utilization pathway.
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129
131
Chapitre III :
Figure III-1 : Les principaux PAMPs (Pathogen-Associated molecular patterns) d’une
bactérie à Gram négatif.
Figure III-2 : Les défenses basales des plantes.
Figure III-3 : Représentation schématique de l’appareil de sécrétion de type III des
bactéries phytopathogènes et de son ancrage dans les structures membranaires végétales.
Figure III-4 : Les pili hrp de différentes bactéries phytopathogènes : Pseudomonas
syringae DC3000, Ralstonia solanacearum GMI1000 et Xanthomonas axonopodis pv.
vesicatoria.
Figure III-5 : Organisation du cluster hrp et de ses régions flanquantes chez la bactérie
Ralstonia solanacearum.
Figure III-6 : Structure schématique des protéines d’avirulence AvrBs3 et AvrBs4 de
Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria.
Figure III-7 : Structure schématique de la protéine d’avirulence AvrBs2 de
Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria et des domaines nécessaires à la sécrétion et à
la reconnaissance par la protéine de résistance correspondante, Bs2, du poivron.
Figure III-8 : Les protéines de la famille AvrBs3 et leur mécanisme d’action putatif
dans la modulation de l’expression des gènes de la plante.
Figure III-9 : Le modèle gène-pour-gène ou la reconnaissance R/Avr.
Figure III-10 : Modèle décrivant l’activation des défenses gène-spécifiques.
Figure III-11 : Production de molécules lors de la réaction hypersensible.
Figure III-12 : Structure des principales protéines de résistance (protéines R) végétales.
Figure III-13 : Modes d’action des effecteurs de type III dans la suppression des
défenses basales et/ou gène-spécifiques.
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Liste des tableaux
LISTE DES TABLEAUX
Introduction générale :
Tableau Int-1 : Nombre de génomes d'organismes phytopathogènes séquencés ou en
cours de séquençage.
Tableau Int-2 : Liste des organismes phytopathogènes dont le génome est entièrement
séquencé, et maladies provoquées par ces organismes.
Tableau Int-3 : Caractéristiques générales et comparaison des 2 génomes de
Xanthomonas campestris pv. campestris séquencés.
8
8
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Chapitre I :
Tableau I-1 : Porines de Xanthomonas campestris pv. campestris potentiellement
impliquées dans le transport de nutriments organiques.
Tableau I-2 : Porines spécifiques caractérisées à l'heure actuelle chez les bactéries,
principales caractéristiques structurales et orthologues putatifs.
Tableau I-3 : Structure de quelques systèmes ABC d'Escherichia coli impliqués dans le
transport de sucres, de complexes fer-sidérophore ou de la vitamine B12 à travers la
membrane interne.
Tableau I-4 : Systèmes de transport ABC putatifs de Xanthomonas campestris pv.
campestris.
Tableau I-5 : Classification et description de quelques systèmes PTS de bactéries à
Gram négatif, de leur(s) substrat(s) et des gènes codant pour les différents domaines de
ces systèmes.
Tableau I-6 : Classification des principaux transporteurs actifs secondaires bactériens et
exemples représentatifs de ces différentes classes.
Tableau I-7 : Transporteurs de la famille MSF (Major Facilitator Superfamily) de
Xanthomonas campestris pv. campestris.
Tableau I-8 : Récepteurs TonB-dépendants d'Escherichia coli (souche K12) et leurs
fonctions dans le transport de complexes fer-sidérophore, d'antibiotiques, la perception
de bactériophages et/ou de colicines.
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Chapitre II :
Tableau II-1 : Contribution au pouvoir pathogène de différentes protéines (enzymes,
transporteurs, régulateurs) impliquées dans la pectinolyse chez Erwinia chrysanthemi.
Tableau II-2 : Expression et régulation des gènes codant pour les enzymes
pectinolytiques d'Erwinia chrysanthemi.
Tableau II-3 : Les enzymes pectinolytiques de Xanthomonas campestris pv. campestris.
Tableau II-4 : Couples d'amorces utilisés dans cette étude pour le clonage des
promoteurs, la mutagénèse et la RT-PCR sur les régions intergéniques.
Table Ar-1 : List of plasmids and bacterial strains used or generated in this study.
Table Ar-2 : Oligonucleotide primer pairs used for promoter or gene cloning and for
insertion or deletion mutagenesis.
Table Ar-3 : Candidate X-boxes identified in the promoter regions of Xanthomonas
campestris pv. campestris.
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101
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Liste des tableaux
Table Ar-4 : In silico analysis of the putative Xanthomonas campestris pv. campestris
enzymes present in the XCC4120, XCC2828 and XCC4101 loci, and of the other
enzymes widespread in the genome and putatively involved in xylan utilization.
Table Ar-5 : β-1,4-xylanase activity of Xanthomonas campestris pv. campestris wildtype and mutant strains on minimal medium plates containing 0,1% RBB-xylan.
Table Ar-6 : Occurrence of the Xanthomonas campestris pv. campestris genes of the
XCC4120, XCC2828 and XCC4101 loci in the Xcc 8004 strain, in other Xanthomonas
species and in Xylella fastidiosa.
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Chapitre III :
Tableau III-1 : Classification des protéines PR (Pathogenesis-Related).
Tableau III-2 : Nombre de protéines putatives du génome d’Arabidopsis thaliana
présentant un domaine NBS (Nucleotide Binding Site) et/ou des LRR (Leucin Rich
Repeats).
Tableau III-3 : Liste des gènes d'avirulence pour lesquels un gène de résistance a été
identifié chez une plante.
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Sommaire
SOMMAIRE
INTRODUCTION GENERALE ET PRESENTATION DE NOTRE MODELE D’ETUDE ...............5
I. INTRODUCTION A LA PHYTOPATHOLOGIE ...............................................................................................5
I.1. LES PLANTES SONT SOUMISES A DES STRESS BIOTIQUES ET ABIOTIQUES .................................................5
I.2. LES MICROORGANISMES PHYTOPATHOGENES ...........................................................................................6
I.2.A. Les champignons et les oomycètes .......................................................................................................6
I.2.B. Les bactéries, les mycoplasmes et les spiroplasmes..............................................................................6
I.2.C. Les virus et les viroïdes .........................................................................................................................7
I.2.D. Les nématodes.......................................................................................................................................7
I.3. VERS UNE MEILLEURE COMPREHENSION DES INTERACTIONS PLANTES-MICROORGANISMES...................8
II. LA BACTERIE XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS ..................................................................9
II.1. PLANTES HOTES INFECTEES ET SYMPTOMES PROVOQUES PAR LA BACTERIE ..........................................9
II.2. DESCRIPTION DE LA BACTERIE.................................................................................................................9
II.3. LE CYCLE DE VIE DE XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS ........................................................10
II.4. LE GENOME DE XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS.................................................................11
II.5. QUELQUES DETERMINANTS PARTICULIERS DU POUVOIR PATHOGENE DE XANTHOMONAS CAMPESTRIS
PV. CAMPESTRIS ..............................................................................................................................................11
II.5.A. La production d’exopolysaccharides .................................................................................................12
II.5.B. La régulation de la production des EPS et des enzymes extracellulaires chez Xanthomonas
campestris pv. campestris .............................................................................................................................13
III. INTRODUCTION AU TRAVAIL DE THESE................................................................................................13
CHAPITRE I : ETUDE SYSTEMATIQUE DES RECEPTEURS TONB-DEPENDANTS DE
XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS.............................................................................15
INTRODUCTION : L’ACQUISITION DES NUTRIMENTS CHEZ LES BACTERIES A GRAM
NEGATIF.....................................................................................................................................................15
I. LE TRANSPORT DES COMPOSES ORGANIQUES CHEZ LES BACTERIES A GRAM NEGATIF .....................15
I.1. LE PASSAGE DE LA MEMBRANE EXTERNE PAR « DIFFUSION PASSIVE FACILITEE ».................................16
I.1.A. Les canaux protéiques non spécifiques ...............................................................................................16
I.1.B. Les canaux protéiques sélectifs ...........................................................................................................18
I.2. LE PASSAGE ACTIF DE LA MEMBRANE INTERNE ......................................................................................20
I.2.A. Le transport actif primaire...................................................................................................................21
I.2.A.a. Les transporteurs ATPasiques, ou « transporteurs ABC » ...............................................................21
I.2.A.b. La translocation de groupe, ou « système PTS » .............................................................................23
I.2.B. Le transport par gradient chimique, ou transport actif secondaire, via des « perméases »..................26
II. LES RECEPTEURS TONB-DEPENDANTS, LE SYSTEME TONB ET LEUR ROLE DANS L’ACQUISITION DU
FER CHEZ LES BACTERIES A GRAM NEGATIF .............................................................................................27
II.1. LA DISPONIBILITE EN FER : LES PROTEINES SOURCES DE FER ET LES SIDEROPHORES............................27
II.2. L’ACQUISITION DES COMPLEXES FER-SIDEROPHORE PAR LE SYSTEME TBDR-TONB-EXBBD.............29
II.2.A. Les Récepteurs TonB-dépendants......................................................................................................29
II.2.B. La protéine TonB et les autres protéines du système TonB...............................................................31
II.2.C. Le passage de la membrane externe...................................................................................................32
1
Sommaire
II.2.D. Le passage de la membrane interne ...................................................................................................34
II.3. LA REGULATION DE L’ACQUISITION DU FER ..........................................................................................35
II.3.A. La protéine régulatrice Fur ................................................................................................................35
II.3.B. La cascade de signalisation transducer / facteur anti-sigma / facteur sigma......................................37
III. LES AUTRES FONCTIONS CONNUES DU SYSTEME TONB......................................................................39
III.1. SITE D’ADHESION POUR LES COLICINES ET LES BACTERIOPHAGES ......................................................39
III.2. ROLE DU FER ET/OU DU SYSTEME TONB DANS LES INTERACTIONS BACTERIES-PLANTES ...................40
III.2.A. Importance du fer dans le pouvoir pathogène ..................................................................................40
III.2.B. Xanthomonas campestris pv. campestris : un système TonB différent ............................................40
III.2.C. Ralstonia solanacearum : PrhA et la signalisation du pouvoir pathogène .......................................41
III.2.D. Bradyrhizobium japonicum et la symbiose fixatrice d’azote ...........................................................41
III.3. DES TBDR POTENTIELLEMENT IMPLIQUES DANS LE TRANSPORT DE CARBOHYDRATES .....................42
III.3.A. TBDR de bactéries ubiquistes ..........................................................................................................42
III.3.B. TBDR de bactéries symbiotiques ou pathogènes de l’Homme ........................................................43
III.3.C. TBDR de bactéries de l’environnement terrestre .............................................................................43
III.3.D. TBDR de bactéries aquatiques et/ou marines...................................................................................44
RESULTATS : ETUDE SYSTEMATIQUE DES RECEPTEURS TONB-DEPENDANTS DE
XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS.............................................................................45
CHAPITRE II : ETUDE DE LOCI IMPLIQUES DANS LE METABOLISME DE
POLYSACCHARIDES DE LA PAROI VEGETALE CHEZ XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV.
CAMPESTRIS..............................................................................................................................................85
INTRODUCTION : L’UTILISATION DE LA PAROI VEGETALE PAR LES BACTERIES .........85
I. STRUCTURE DE LA PAROI VEGETALE ......................................................................................................85
I.1. DESCRIPTION GENERALE .........................................................................................................................85
I.2. ARCHITECTURE MOLECULAIRE DE LA PAROI PRIMAIRE ..........................................................................86
I.2.A. La cellulose .........................................................................................................................................86
I.2.B. Les hémicelluloses ..............................................................................................................................86
I.2.C. Les pectines .........................................................................................................................................87
I.2.D. Autres constituants..............................................................................................................................88
II. L’UTILISATION DES PAROIS VEGETALES PAR LES BACTERIES .............................................................88
III. LA PECTINOLYSE ET SA REGULATION CHEZ LES BACTERIES DU GENRE ERWINIA ............................90
III.1. LES ENZYMES DE DEGRADATION DE LA PECTINE D’ERWINIA CHRYSANTHEMI ......................................91
III.2. LE TRANSPORT DES PRODUITS DE DEGRADATION DE LA PECTINE ........................................................93
III.3. LE CATABOLISME INTRACELLULAIRE DE LA PECTINE ..........................................................................94
III.4. LA REGULATION DE LA PECTINOLYSE ..................................................................................................94
III.4.A. Paramètres influençant l’expression des enzymes pectinolytiques ..................................................94
III.4.B. Les protéines spécifiques de la régulation de la pectinolyse ............................................................95
III.4.B.a. KdgR..............................................................................................................................................95
III.4.B.b. Le couple PecS - PecM..................................................................................................................96
III.4.B.c. PecT ...............................................................................................................................................98
III.4.B.d. ExpR ..............................................................................................................................................98
III.4.B.e. HNS ...............................................................................................................................................98
III.4.B.f. Pir ...................................................................................................................................................99
III.4.B.g. ExuR ..............................................................................................................................................99
2
Sommaire
IV. LA DEGRADATION DU PGA CHEZ RALSTONIA SOLANACEARUM ........................................................100
V. ET CHEZ XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS ? ...................................................................101
RESULTATS : ETUDE DE LOCI IMPLIQUES DANS LE METABOLISME DE
POLYSACCHARIDES DE LA PAROI VEGETALE CHEZ XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV.
CAMPESTRIS............................................................................................................................................101
I. ETUDE DE LOCI POTENTIELLEMENT IMPLIQUES DANS L’UTILISATION DE LA PECTINE CHEZ
XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS ..........................................................................................102
I.1. LE LOCUS XCC0117-XCC0122 .............................................................................................................102
I.2. LE LOCUS XCC1748-XCC1759 .............................................................................................................107
I.3. DISCUSSION DES RESULTATS OBTENUS SUR CES 2 LOCI ........................................................................112
II. ETUDE DE LOCI POTENTIELLEMENT IMPLIQUES DANS L’UTILISATION DU XYLANE CHEZ
XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS ..........................................................................................114
ARTICLE PRELIMINAIRE :.............................................................................................................................115
CHAPITRE III : ETUDE DE L’EFFECTEUR DE TYPE III AVRACXcc8004 .....................................132
INTRODUCTION : LES BASES DE L’INTERACTION PLANTE-MICROORGANISME...........132
I. LA DEFENSE BASALE, OU IMMUNITE INNEE DES PLANTES ...................................................................133
I.1. LA DETECTION DU PATHOGENE .............................................................................................................133
I.2. LES COMPOSANTES DE LA DEFENSE BASALE .........................................................................................134
II. LE SYSTEME DE SECRETION DE TYPE III ET SES EFFECTEURS ...........................................................136
II.1. ROLE DU SYSTEME DE SECRETION DE TYPE III ....................................................................................136
II.2. STRUCTURE DU TTSS ..........................................................................................................................137
II.3. ORGANISATION ET REGULATION DES GENES HRP ................................................................................138
II.3.A. Particularités dans la régulation des gènes hrp chez Ralstonia solanacearum................................139
II.3.B. La régulation des gènes hrp chez les bactéries du genre Xanthomonas...........................................140
II.4. LES HARPINES, DES PROTEINES DE COOPERATION AVEC LE TTSS ?....................................................140
III. LES SUBSTRATS DU SYSTEME DE SECRETION DE TYPE III ................................................................142
III.1. CONSERVATION DE SEQUENCES ET DOMAINES PARTICULIERS ...........................................................142
III.2. ROLE DANS LE POUVOIR PATHOGENE SUR PLANTE HOTE ...................................................................144
III.3. LES EFFECTEURS DE TYPE III SONT CAPABLES DE SUPPRIMER LES DEFENSES BASALES DE LA PLANTE
.....................................................................................................................................................................144
III.4. LES EFFECTEURS DE TYPE III SONT CAPABLES DE MODULER L’EXPRESSION DES GENES DE LA PLANTE
.....................................................................................................................................................................146
IV. LA DEFENSE GENE-SPECIFIQUE ..........................................................................................................147
IV.1. LE CONCEPT « GENE POUR GENE » ....................................................................................................147
IV.2. LES COMPOSANTES DE LA RESISTANCE GENE-SPECIFIQUE.................................................................148
IV.2.A. La Réaction Hypersensible.............................................................................................................148
3
Sommaire
IV.2.B. La Résistance Systémique Acquise ................................................................................................148
IV.3. LES PROTEINES R VEGETALES ET LES PROTEINES AVR BACTERIENNES .............................................149
IV.3.A. Les protéines de résistance.............................................................................................................149
IV.3.B. Les protéines d’avirulence..............................................................................................................150
IV.4. LA RECONNAISSANCE R/AVR .............................................................................................................152
IV.5. FONCTIONS BIOLOGIQUES DES PROTEINES D’AVIRULENCE ................................................................153
IV.6. CERTAINS EFFECTEURS DE TYPE III SONT CAPABLES DE SUPPRIMER LES DEFENSES GENE-SPECIFIQUES
DE LA PLANTE ..............................................................................................................................................155
PRE-REQUIS : LES DETERMINANTS D’AVIRULENCE DE LA BACTERIE XANTHOMONAS
CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS ..........................................................................................................156
RESULTATS : ETUDE DE L’EFFECTEUR DE TYPE III AVRACXCC8004 .......................................157
ARTICLE.......................................................................................................................................................158
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES................................................................................207
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................................................215
4
INTRODUCTION GENERALE ET
PRESENTATION DE NOTRE
MODELE D’ETUDE
A
B
C
D
E
Figure Int-1 : Les principaux organismes phytopathogènes.
(A) Infection d’une cellule végétale par un champignon
(photo : http://www.mpizkoeln.mpg.de/downloads/schulzelefertParker/Genetics_02_02_20006_part2.pdf)
(B) L’insecte Spodoptera exigua (photo : pestdata.ncsu.edu/.../docs/kypeppers.html)
(C) Le virus TMV (Tobacco mosaic virus) (photo : www.brown.edu/Courses/BI0020_Miller/dh/tmv.jpg)
(D) La bactérie Ralstonia solanacearum (photo de Jacques Vasse, LIPM)
(E) Le nématode Globodera pallida (photo : www.ars-grin.gov/.../stpp/burelle/nematode.html)
Introduction générale
INTRODUCTION GENERALE ET PRESENTATION DE NOTRE MODELE
D’ETUDE
I. Introduction à la Phytopathologie
I.1. Les plantes sont soumises à des stress biotiques et abiotiques
Les plantes sont, plus que tout autre organisme vivant, soumises à de très nombreux stress
environnementaux, qu’ils soient biotiques ou abiotiques. Contrairement aux animaux qui ont la
capacité de se déplacer lorsque les conditions de vie ne leur sont plus favorables, les plantes
doivent mettre en oeuvre des stratégies d’adaptation complexes, souvent au détriment de leur
croissance. Le manque ou l’excès d’eau, la salinité des sols, la pollution de l’air, les températures
extrêmes et les vents sont les principales contraintes abiotiques auxquelles les végétaux doivent
faire face. De plus, des conditions défavorables du sol telles que les carences ou les excès en
nutriments minéraux, ainsi que les polluants, peuvent induire chez les végétaux des maladies
appelées non parasitaires [pour revues, voir (Shao et al., 2007 ; Vierling & Kimpel, 1992)].
Par ailleurs, dans leur environnement, les plantes sont en permanence en contact avec de
nombreux parasites, dans la mesure où elles constituent d’excellents écosystèmes pour ces
organismes. Ces bio-agresseurs phytopathogènes sont capables d’infecter les plantes et d’entraîner
des maladies responsables de pertes importantes pour les récoltes. Les microorganismes
phytopathogènes incluent des champignons, des bactéries, des mycoplasmes, des spiroplasmes,
des virus, des viroïdes, des nématodes et des protozoaires (Figure Int-1).
Les symptômes induits par ces différents organismes sont très variés, et incluent la nécrose
(mort de cellules ou de tissus), la chlorose (jaunissement), le flétrissement (affaissement des
feuilles et de la tige), le pourrissement, le nanisme, la tuméfaction (formation de galle ou enflure
localisée), le brunissement, la fonte des semis (tombée rapide de la plante), etc.
Les microorganismes phytopathogènes peuvent être véhiculés par des insectes, les
éclaboussures de pluie ou le vent, mais la main de l’homme, par certaines pratiques culturales
(bouturage, utilisation d’outils blessants…) et par l’irrigation, contribue aussi largement à leur
dispersion.
5
Introduction générale
I.2. Les microorganismes phytopathogènes
I.2.A. Les champignons et les oomycètes
Ces organismes eucaryotes pluricellulaires et filiformes sont pourvus de structures de
reproduction appelées spores. Des milliers de champignons causent quelques 100 000 maladies
chez les plantes, dont la rouille (Puccinia sp.), le charbon (Ustilago sp.), la pourriture grise
(Botrytis cinerea), l'anthracnose du haricot (Colletotrichum lindemuthianum), la cladosporiose de
la tomate (Cladosporium fulvum), la pyriculariose du riz (Magnaporthe grisea), l'oïdium
(Erysiphe graminis), l'ergot des céréales (Claviceps purpurea), etc.
Les oomycètes ne sont pas des champignons mais ont longtemps été classés comme tels car
ils possèdent, de manière frappante, une morphologie et un mode de vie très similaires. Les
oomycètes sont responsables de maladies dévastatrices telles que le mildiou de la pomme de terre
et de la tomate (Phytophthora infestans), la pourriture noire du collet du tabac (Phytophthora
parasitica), le mildiou duveteux des crucifères (Hyaloperonospora parasitica), le mildiou
poudreux des céréales (Blumeria graminis), etc.
Les champignons et les oomycètes sont responsables de la plus grande partie des pertes
agricoles causées par des microorganismes pathogènes, dans toutes les régions du monde et sur
tous les types de cultures. Dans un passé récent, les champignons ont été à l'origine d'épidémies
aux effets dévastateurs : pour ne citer qu'un seul exemple, l'émigration irlandaise vers l'Amérique
du Nord au XIXe siècle a résulté de la famine due à une épidémie de mildiou ayant affecté la
pomme de terre, principale ressource alimentaire des campagnes. Si les recherches sur les
champignons phytopathogènes connaissent depuis quelques années un regain d’intérêt et des
avancées considérables, elles ont longtemps souffert du manque d’outils génomiques disponibles
sur ces organismes. Ainsi, les bactéries phytopathogènes, de petite taille et pratiques à manipuler,
représentent depuis toujours de bons modèles d’études en phytopathologie.
I.2.B. Les bactéries, mycoplasmes et spiroplasmes
Les bactéries sont des organismes procaryotes unicellulaires, qui se reproduisent
habituellement par division cellulaire. Quelques centaines d'espèces de bactéries attaquent les
plantes et leur importance économique est donc majeure ; nous donnerons de nombreux exemples
de bactéries phytopathogènes tout au long de ce manuscrit (voir aussi Tableau Int-IIA). A l’heure
actuelle, on dispose pour ces organismes de toute une gamme d’outils génomiques nécessaires à
l’appréhension des mécanismes moléculaires qui régissent les processus adaptatifs entre les
microorganismes phytopathogènes et leurs hôtes.
6
Introduction générale
Les mycoplasmes sont des formes simples de bactéries, dépourvues de paroi cellulaire. Les
spiroplasmes sont des cellules semblables aux mycoplasmes, mais de structure spiralée. Dans la
nature, les mycoplasmes et les spiroplasmes sont essentiellement propagés par les insectes appelés
cicadelles.
I.2.C. Les virus et les viroïdes
Ils représentent la forme la plus simple des organismes parasitaires. Les virus sont constitués
d’une molécule d'acide nucléique entourée d’une capside protéique, et les viroïdes d'une molécule
d’acide nucléique libre. On considère les virus et les viroïdes comme des parasites moléculaires
qui utilisent les composants de leur hôte pour la réplication de leur acide nucléique infectieux.
Quelques centaines de virus phytopathogènes causent des maladies comme la mosaïque du choufleur (CaMV, Cauliflower Mosaic Virus), du tabac (TMV, Tobacco Mosaic Virus), du concombre
(CMV) ou de la tomate (ToMV), l'enroulement des feuilles de la pomme de terre (PLRV, Potato
Leaf Roll Virus), la tache annulaire du framboisier (RRV, Raspberry Ringspot Virus), ou le
nanisme jaune de l'orge (BYDV, Barley Yellow Dwarf Virus).
Les viroïdes sont responsables de pathologies végétales telles que le viroïde du tubercule de
la pomme de terre en fuseau (PSTVd, Potato Spindle Tuber Viroid), la décoloration des fruits du
concombre (CPFVd, Cucumber Pale Fruit viroid), le rabougrissement du houblon (HSVd, Hop
Stunt Viroid) et du chrysanthème (CSVd, Chrysanthemum Stunt Viroid). Les viroïdes et certains
virus sont transmis par contact. Un grand nombre de virus sont disséminés dans la nature par des
arthropodes vecteurs, tels que les pucerons, les cicadelles, les thrips, les mouches blanches, les
aleurodes et les acariens. Certains sont aussi transmis par des nématodes et des champignons du
sol.
De façon intéressante, des travaux récents menés à l’Institut du Génome de Singapour ont
constaté que de très nombreux virus phytopathogènes provenant de notre alimentation sont
présents dans les excréments humains (Zhang et al., 2006). Utiliser ces excréments comme
engrais pourrait favoriser leur propagation à de nouvelles cultures.
I.2.D. Les nématodes
Ce sont des animaux invertébrés filiformes et non segmentés. Les anguillules et les
microvers, par exemple, sont des nématodes. La plupart des nématodes parasitaires des plantes
causent des galles et des lésions au niveau des racines, les font pourrir et/ou peuvent retarder
sérieusement leur croissance. Certains nématodes se nourrissent des plantes qu'ils parasitent au
7
Tableau Int-1 : Nombre de génomes d'organismes phytopathogènes séquençés ou
en cours de séquençage. Source : Comprehensive Phytopathogen Genome
Warehouse au TIGR (The Institute for Genomic Research, www.tigr.org/)
Groupe taxonomique
Complets
"Drafts" disponibles En cours de séquençage
Bactéries
25
11
14
Champignons
0
11
11
Nématodes
0
0
0
Virus
624
0
0
Viroïdes
36
0
0
Total
685
22
25
Introduction générale
moyen de leur stylet, ou dard. De plus, les nématodes sont des vecteurs très efficaces pour de
nombreux virus de plantes.
I.3.
Vers
une
meilleure
compréhension
des
interactions
plantes-
microorganismes
La maîtrise des interactions entre les plantes et leurs agresseurs microbiens est une clef
indispensable à une meilleure qualité sanitaire des cultures. La mise en place de stratégies de lutte
durables, plus efficaces et plus respectueuses de l'environnement, passe donc nécessairement par
une connaissance plus complète des processus biologiques et biochimiques complexes nécessaires
au développement des cycles infectieux des microorganismes phytopathogènes.
Ces dernières années, l’acquisition des connaissances relatives aux agents pathogènes et le
décryptage du dialogue entre ces microorganismes et les plantes ont été prodigieusement accélérés
par le séquençage intégral de nombreux génomes. Actuellement, les génomes de 3 plantes sont
intégralement séquencés : celui de la plante modèle Arabidopsis thaliana (Adam, 2000 ; Dennis &
Surridge, 2000 ; Walbot, 2000), et ceux du riz (Oryza sativa) et du peuplier (Populus
trichocarpa). Le séquençage du génome de la légumineuse modèle Medicago truncatula et de
celui de la vigne (Vitis vinifera) sera très bientôt achevé et les données libérées dans le domaine
public.
Du côté des microorganismes phytopathogènes, les scientifiques disposent des séquences
complètes d’un très grand nombre de génomes. La base de donnée CPGR (Comprehensive
Phytopathogen Genomics Resource) du TIGR (The Institute for Genomic Research) met à
disposition ces séquences génomiques (http://cpgr.tigr.org/cgibin/warehouse/cpgr_warehouse.cgi).
La Tableau Int-1 dénombre les organismes phytopathogènes dont le génome est séquencé ou
en cours de séquençage. La Tableau Int-2 liste de façon plus exhaustive les bactéries
phytopathogènes dont le génome est entièrement séquencé, ainsi que les champignons dont une
version préliminaire (« draft ») du génome entier est disponible. Comme le montre ce tableau, les
bactéries phytopathogènes à Gram négatif se répartissent dans 3 groupes phylogénétiques : les αProtéobactéries (genres Agrobacterium et Liberobacter), les β-Protéobactéries (genres
Burkholderia et Ralstonia), et enfin les γ-Protéobactéries, groupe qui contient la majorité des
espèces de bactéries phytopathogènes (genres Pseudomonas, Xanthomonas, Xylella, Erwinia et
Pantoea).
8
Tableau Int-2 : Liste des organismes phytopathogènes dont le génome est entièrement séquencé, et maladies provoquées
par ces organismes. (A) Bactéries et phytoplasmes. (B) Champignons dont une version préliminaire du génome est
disponible. La traduction anglaise du nom de la maladie est donnée entre parenthèses.
A. Bactéries ou Phytoplasmes
Taille du génome
(MégaBases)
Groupe
Espèce
Maladie
Gram α−proteobactéries
Agrobacterium tumefaciens str. C58
galle du collet (crown gall)
5.67
Burkholderia cenocepacia AU 1054
pourriture aigre (sour skin) de l'oignon - pathogène sur patients
atteints de fibrose kystique
7.25
Burkholderia cenocepacia HI2424
pourriture aigre (sour skin) de l'oignon - pathogène sur patients
atteints de fibrose kystique
8.09
Burkholderia cenocepacia J2315
pourriture aigre (sour skin) de l'oignon - pathogène sur patients
atteints de fibrose kystique
8.07
Ralstonia solanacearum GMI1000
flétrissement bactérien (bacterial wilt)
5.81
Erwinia carotovora subsp. atroseptica SCRI1043
pourriture molle (soft rot) et jambe noire (blackleg) de la pomme
de terre
5.06
Pseudomonas aeruginosa PAO1
pourriture molle (soft rot) - pathogène sur patients atteints de
fibrose kystique
6.26
Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14
pourriture molle (soft rot) - pathogène sur patients atteints de
fibrose kystique
6.53
Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448A
graisse à halo du haricot (halo blight of bean)
6.11
Pseudomonas syringae pv. syringae B728a
graisse du haricot (brown spot)
6.09
Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000
moucheture bactérienne (bacterial speck) de la tomate
6.54
Xanthomonas axonopodis pv. citri str. 306
chancre des agrumes (citrus canker)
5.27
Xanthomonas campestris pv. campestris str. 8004
pourriture noire (black rot) des crucifères
5.15
Xanthomonas campestris pv. campestris str. ATCC 33913
pourriture noire (black rot) des crucifères
5.08
Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria str. 85-10
tache bactérienne (bacterial spot) de la tomate et du poivron
5.42
Xanthomonas oryzae pv. oryzae KACC10331
rouille des feuilles (bacterial blight) du riz
4.94
Xanthomonas oryzae pv. oryzae MAFF 311018
rouille des feuilles (bacterial blight) du riz
4.94
Xylella fastidiosa 9a5c
chlorose variégée des agrumes (citrus variegated chlorosis)
2.73
Xylella fastidiosa Temecula1
maladie de Pierce (Pierce's disease) du raisin
2.52
Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus
pourriture annulaire (ring rot) de la pomme de terre
3.38
Leifsonia xyli subsp. xyli str. CTCB07
rabougrissement des repousses (ratoon stunting) de la canne à
sucre
2.58
Streptomyces scabies 87-22
gale commune (scab) de la pomme de terre
10.15
Aster yellows witches'-broom phytoplasma AYWB
jaunisse de l'aster (aster yellows) avec symptôme en balai de
sorcière (witches' broom)
0.72
Onion yellows phytoplasma OY-M
jaunisse de l'oignon
0.86
Espèce
Maladie
Alternaria brassicicola ATCC 96866
tache noire (black spot) des crucifères
Botrytis cinerea B05.10
pourriture grise de la vigne (gray mold rot)
42.66
Gibberella moniliformis 7600 (Fusarium verticillioides)
pourriture fusarienne de l'épi et du grain de maïs (kernel and ear
rot of maize)
41.98
Gibberella zeae PH-1 (Fusarium graminearum)
pourriture pédonculaire de l'avocat - pourriture de la couronne de
la banane (fusarium head blight)
36.09
Gram β-proteobactéries
Gram γ-proteobactéries
Gram +
Phytoplasmes
B. Champignons
Taille du génome
(MégaBases)
30
Magnaporthe grisea 70-15
pyriculariose du riz (rice blast)
39
Nectria haematococca MPVI (Fusarium solani)
Pourriture fusarienne des racines et du collet (stem and root rot)
40
Phaeosphaeria nodorum SN15 (Stagonospora nodorum )
septoriose du blé (glume blotch)
Phanerochaete chrysosporium RP-78
pourriture blanche (white rot)
Puccinia graminis f. sp. tritici CRL 75-36-700-3
rouille des tiges du blé (wheat stem rust)
81.5
Sclerotinia sclerotiorum 1980
sclérotinia sur un large spectre de plantes
38.33
Ustilago maydis 521
charbon du maïs (corn smut)
19.68
37.24
30
A
B
C
D
E
F
G
H
I
Figure Int-2 : Symptômes de pourriture noire sur chou provoqués par Xanthomonas
campestris pv. campestris (Xcc) : les lésions chlorotiques et/ou nécrotiques en bordure
des feuilles (photos C, D et E), ainsi que le noircissement des vaisseaux du xylème
(photos G et H) sont les symptômes caractéristiques de la maladie. La photo I
représente les symtpômes causés par Xcc suite à une infection non pas par les
hydathodes mais par une blessure au niveau de la feuille.
A, H, I : Photos de IPM (Integrated Pest Management,
http://ipm.uiuc.edu/vegetables/diseases/black_rot/index.html).
B : Photo de University of Georgia – Plant Pathology Department
http://www.plant.uga.edu/Extension/plants/Vegetable/Cabbage/cabblkrot.html
C: Photo de Ohio State University
http://ohioline.osu.edu/hyg-fact/3000/3125.html
D: Photo du Système d’information pour la protection des plantes - Slovénie
http://www.fito-info.bf.uni
E: Photo de Gardener’s supply Company
http://www.gardeners.com/Black-Rot-Control/default/5353.page
F: Photo de l’INRA
www.inra.fr/hyp3/pathogene/6xacaca.htm.
G: Photo de source inconnue
Introduction générale
II. La bactérie Xanthomonas campestris pv. campestris
II.1. Plantes hôtes infectées et symptômes provoqués par la bactérie
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), le modèle d’étude de notre groupe, est la
bactérie responsable de la maladie des crucifères la plus préjudiciable partout dans le monde : la
pourriture noire, ou nervation noire des crucifères. Toutes les crucifères maraîchères sont
sensibles à cette maladie (le chou, le chou de Bruxelles, le chou-fleur, le brocoli, le navet, le radis,
la moutarde, le canola et le rutabaga), sauf certains cultivars de radis et de chou frisé, qui sont
moins facilement infectés. Au laboratoire, Xcc est également capable d’infecter la crucifère
modèle Arabidopsis thaliana, ce pathosystème ayant été initialement identifié et caractérisé dans
les années 80 (Bent et al., 1992 ; Lummerzheim et al., 1993 ; Meyer et al., 2005 ; Parker et al.,
1993 ; Simpson & Johnson L.J. , 1990 ; Suji & Somerville, 1988).
La bactérie contamine les graines de crucifères lors de la production des semences (Schaad
et al., 1980). Les jeunes plants cultivés à partir de graines contaminées sont souvent infectés de
façon systémique ; par temps chaud, ils tournent au jaune pâle et dépérissent. Sur les plantes plus
âgées, l'infection débute à l'extrémité des nervures, en bordure des feuilles, et provoque
l'apparition de chloroses en forme de V (Figure Int-2), devenant brunes et nécrosées au fil de leur
progression vers la base des feuilles. Les nervures et les faisceaux vasculaires des feuilles, des
tiges et des racines infectées noircissent au fur et à mesure de la multiplication et du
développement des bactéries (Figures Int-2 G et H).
II.2. Description de la bactérie
Xcc est une bactérie à Gram négatif appartenant à la classe des γ-protéobactéries, au genre
Xanthomonas, à la famille des Xanthomonadaceae et à l'ordre des Xanthomonadales. Dans les
années 90, le genre Xanthomonas fut classé selon une taxonomie particulière, basée sur le pouvoir
pathogène : les espèces furent subdivisées en plus de 140 « pathovars » (pv.) sur la base de leur
spectre d’hôtes (Young et al., 1978). Les progrès en matière de génotypage moléculaire ont
ensuite permis une reclassification du genre, plus représentative de la diversité génomique et des
relations à l’intérieur du genre (Vauterin et al., 1995). Celui-ci compte aujourd’hui 20 espèces,
chacune étant subdivisée en un nombre plus restreint de pathovars. L’espèce Xanthomonas
campestris présente ainsi 6 pathovars, chacun ayant été isolé de crucifères : aberrans, armoraciae,
barbareae, campestris, incanae et raphani (Vauterin et al., 1995).
9
A
B
0,5 µM
C
0,5 µM
Figure Int-3 : Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). (A) Colonies sur milieu
solide riche. (B) Bactéries enchassées dans leur matrice exopolysaccharidique. (C)
Souche mutante de Xcc, déficiente dans la synthèse d’exopolysaccharides. (B) et (C)
Photos de microscopie électronique de Jacques Vasse, LIPM.
Introduction générale
Xcc est une bactérie en bâtonnet (0,7 à 1,8 µm de long et 0,4 à 0,7 µm de large), aérobie,
pourvue d’un flagelle unique (Guerrero, 2001). Sur milieu solide riche en sucres, Xcc forme des
colonies jaunes et très muqueuses (Figure Int-3A). La couleur jaune est due à la synthèse d’un
pigment lipophile lié à la membrane externe appelé xanthomonadine ; ce pigment aurait des
propriétés protectrices et antioxydantes (Rajagopal et al., 1997). La mucosité des colonies est due
à la production massive d’un exopolysaccharide (EPS) appelé gomme xanthane (Figure Int-3B).
II.3. Le cycle de vie de Xanthomonas campestris pv. campestris
Xcc, dont le cycle de vie est représenté sur la Figure Int-4, est une bactérie principalement
épiphyte, c'est-à-dire qu’elle vit la plupart du temps à la surface des feuilles des plantes. Si Xcc
peut pénétrer dans la plante par les stomates ou les blessures au niveau des feuilles et/ou des
racines, ces sites d’infection ne constituent pas les points d’entrée naturels et privilégiés de Xcc :
chez une plante hôte, Xcc est capable de pénétrer à l’intérieur des tissus végétaux par des
structures particulières situées en marge des feuilles, à l’aboutissement des vaisseaux du xylème
(Cook et al., 1952) (Figure Int-4). Ces structures, appelées hydathodes, sont des stomates
aquifères qui permettent la transpiration des plantes. Dans des conditions d’humidité élevée, et
notamment très tôt le matin, les hydathodes exsudent des gouttelettes d’eau ; les bactéries sont
alors incorporées dans ces gouttelettes et pénètrent dans les tissus vasculaires lorsque les gouttes
sont réabsorbées. L’entrée par les hydathodes est caractéristique de Xcc : d’autres pathovars de
Xanthomonas campestris pathogènes sur les crucifères, tels que Xc pv. armoraciae, entrent dans
les tissus végétaux par les stomates et les blessures uniquement (Hugouvieux et al., 1998 ; Hunter
et al., 1987). Par comparaison entre différents modes d’inoculation des bactéries, il a été postulé
que les propriétés intrinsèques des hydathodes pourraient déterminer la résistance de certains
Brassicaceae à Xcc (Shaw & Kado, 1988). En développant un système d’inoculation par les
hydathodes d’Arabidopsis thaliana, Hugouvieux et ses collaborateurs ont pu montrer que la
pénétration de Xcc par les hydathodes ne dépend pas de son système de sécrétion de type III (Voir
Chapitre III) et que des réponses de défense précoces sont déclenchées dans les hydathodes suite à
une infection (Hugouvieux et al., 1998).
Après pénétration par les hydathodes, Xcc envahit les vaisseaux du xylème et déclenche les
symptômes de la maladie (Bretschneider et al., 1989).
Le sol constitue pour Xcc une autre niche écologique : après une infection, les bactéries sont
capables de survivre sur les débris végétaux enfouis et les graines (Schultz & Gabrielson, 1986).
Elles adoptent alors un mode de vie saprophyte, cette phase du cycle pouvant durer plusieurs
10
hydathode
Vaisseau du xylème
Vie épiphyte
In
fe
ct
io
n
*
**
Tr D
an is
sm sém
i
gr ssio inat
ai n io
ne p n
s ar
le
s
Colonisation
***
Vie saprophyte
dans le sol
Développement des
symptômes
Mort de la plante
Figure Int-4 : Représentation schématique du cycle de vie de Xanthomonas
campestris pv. campestris (Xcc), ici dans le cas d’une interaction avec la plante
modèle Arabidopsis thaliana. Xcc est une bactérie principalement épiphyte, c’est-àdire qu’elle vit la plupart du temps à la surface des feuilles de la plante hôte. Dans
certaines conditions, elle pénètre à l’intérieur des tissus végétaux par les hydathodes,
envahit les vaisseaux du xylème et induit les symptômes de la maladie. Enfin, la
bactérie est également capable de survivre dans le sol et sur les débris végétaux
après l’infection. La dissémination des bactéries s’effectue par le vent, la pluie, les
insectes, mais aussi et surtout par le transport et l’utilisation de graines contaminées.
* Vue en microscopie d’un hydathode d’Arabidopsis thaliana (Photo de Jacques
Vasse, LIPM)
** Xcc exprimant le gène GUS constitutivement (D’après Hugouvieux et al., 1998). On
voit ici les bactéries au niveau des hydathodes
*** Xcc exprimant le gène de la luciférase (Lux) constitutivement (D’après Meyer et al.,
2005). Cette photo illustre la colonisation des vaisseaux du xylème par les bactéries.
Tableau Int-3 : Caractéristiques générales et comparaison des 2 génomes de Xanthomonas campestris pv.
campestris (Xcc ) séquencés. CDS, Coding DNA Sequences ; SNP, Single Length Polymorphism ; IS,
Séquences d'insertion. (D'après Qian et al ., 2005).
Xcc 8004
Xcc ATCC33913
a
Caractéristiques générales
Taille du génome (pb)
Pourcentage en GC
5 148 708
5 076 187
64.94%
65.00%
b
4273 (87)
4181
Nombre de CDS avec fonction assignée
2671 (1)
2708
Nombre de CDS codant de putatives protéines conservées
1523 (27)
1276
79 (59)
198
3467c
3408
Nombre de gènes identiques, de même taille, avec SNP
498
500c
Nombre de gènes identiques avec insertions ou délétions
200
211c
Nombre de gènes spécifiques de la souche
108
62
Taille moyenne des CDS (pb)
1023
1030
Nombre de séquences d'insertion (IS)
115
109
Nombre total de séquences codantes (CDS)
Nombre de CDS codant des protéines hypothétiques
Différences de séquences dans les CDS
Nombre de gènes parfaitement identiques
a
Données de da Silva et al . (2002) et GenBank (accession n° AE008922).
Les nombres entre parenthèses indiquent le nombre de CDS possédant une protéine identique chez Xcc ATCC33913 mais non
annotés par da Silva et al. (2002).
c
Traduit l'existence de duplications de CDSs.
b
Introduction générale
années. Enfin, la pluie, le vent et les insectes contribuent à la dispersion de Xcc dans
l’environnement. Les semences infectées représentent la source majeure de dissémination et de
développement de la maladie au champ ; l’usage de semences indemnes est donc la principale
méthode prophylactique recommandée pour lutter contre la pourriture noire des crucifères. Mais
la lutte contre les insectes, ainsi que de bonnes pratiques culturales, évitant notamment l’irrigation
par aspersion, demeurent également de bonnes armes.
II.4. Le génome de Xanthomonas campestris pv. campestris
Les génomes de deux souches de Xcc ont été entièrement séquencés et sont disponibles
publiquement (Tableau Int-2) : celui de la souche ATCC33913 (LMG568), séquencé au Brésil (da
Silva et al., 2002), et celui de la souche 8004, séquencé en Chine (Qian et al., 2005). Le génome
de la souche B100, très récemment séquencé en Allemagne (The Xanthomonas campestris pv.
campestris genome project, Université de Bielefeld) n’est pas disponible pour le moment.
De façon intéressante, les souches ATCC33913 et 8004 présentent de légères différences
dans leur pouvoir pathogène sur différentes plantes ; en particulier, la souche ATCC33913 serait
un peu moins agressive sur certains cultivars de chou et de radis (Qian et al., 2005). Les deux
génomes sont constitués d’un chromosome unique et sont dépourvus de plasmides ; leurs
caractéristiques générales, ainsi que leurs différences, sont exposées dans le Tableau Int-3.
Comparée à la souche ATCC33913, la souche 8004 présente 92 séquences codantes putatives
(CDS) supplémentaires, ainsi qu’un nombre plus élevé de gènes souche-spécifiques (108 contre
62). Si le degré de conservation de séquence et la colinéarité entre les deux génomes sont
globalement très forts, des SNP (Single Nucleotide Polymorphism) sont toutefois observés dans
12% des CDS, et des réarrangements génomiques significatifs (translocations, inversions,
insertions et délétions) différencient les deux souches (Qian et al., 2005).
II.5.
Quelques
déterminants
particuliers
du
pouvoir
pathogène
de
Xanthomonas campestris pv. campestris
Les déterminants majeurs du pouvoir pathogène des bactéries phytopathogènes seront
décrits tout au long de ce manuscrit, et notamment dans le chapitre III. La Figure Int-5 présente
une vue d’ensemble de ces déterminants chez Xcc. L’adhérence, la mobilité, la chimiotaxie, la
sécrétion de phytotoxines ou de phytohormones, la production d’enzymes de dégradation de la
paroi végétale, et enfin le système de sécrétion de type III et ses substrats, sont les principales
11
Figure Int-5 : Illustration des interactions entre Xanthomonas campestris pv. campestris et une plante-hôte.
EPS, Exopolysaccharides ; FAAH, Fatty Acid Hydroxylase ; hrp, hypersensitive response and pathogenicity genes ; LPS,
Lipopolysaccharides ; ROS, Reactive Oxygen Species ; R-protein, Resistance protein ; Xps, Xanthomonas protein
secretion. (D’après Qian et al., 2005).
Introduction générale
propriétés des bactéries phytopathogènes, apportant une contribution plus ou moins importante à
leur pouvoir pathogène. Quelques particularités de Xcc sont intéressantes à mentionner :
II.5.A. La production d’exopolysaccharides
Les EPS jouent des rôles multiples dans la virulence des bactéries phytopathogènes : tout
d’abord, ils favorisent la survie bactérienne en formant une barrière physique protectrice contre les
stress (Denny, 1995), et en favorisant l’adhésion des bactéries à la surface des feuilles ou d’autres
surfaces végétales (Dharmapuri & Sonti, 1999 ; Yang et al., 1998). Mais les EPS jouent
également un rôle de facteur de virulence à proprement parler, dans la mesure où cette matrice
polysaccharidique serait capable de dissimuler les bactéries, donc de limiter l’induction des
réponses de défense basale de l’hôte végétal (Sutherland, 1993). Enfin, synthétisés massivement,
les EPS sont capables d’obstruer les vaisseaux du xylème, compromettant la circulation de la sève
brute et entraînant le flétrissement des parties aériennes chez les plantes infectées par Ralstonia
solanacearum (Kao et al., 1992).
Toutes les souches virulentes de Xanthomonas produisent un exopolysaccharide appelé
« gomme xanthane », qui est un polymère de résidus D-glucoses liés en β-1,4 substitués par des
chaînes trisaccharidiques (2 résidus mannose et 1 résidu acide glucuronique) attachées à la chaîne
principale au niveau de l’atome C3 des résidus glucose. Chez Xcc, la biosynthèse d’EPS est prise
en charge par les produits des gènes gum (gumB à gumM). L’étude de mutants dans différents
gènes de ce cluster a permis de montrer que la sécrétion d’EPS joue chez Xcc un rôle important
dans le pouvoir pathogène de la bactérie, qu’une altération de la structure de cet EPS entraîne une
diminution du pouvoir pathogène, mais que la production d’une petite quantité d’EPS est
suffisante pour le développement des symptômes (Becker et al., 1998 ; Katzen et al., 1996; Tseng
et al., 1999 ; Vojnov et al., 1998). Outre le cluster gum, un autre cluster de trois ORF a été
récemment identifié comme étant impliqué dans la biosynthèse d’EPS chez Xcc (Lu et al., 2007).
Ces ORF codent pour des produits homologues à des protéines impliquées dans la synthèse du
LPS (Lipopolysaccharide) mais les auteurs n’ont pas pu établir de lien entre ce cluster et la
synthèse du LPS.
Xcc est exploitée par de nombreuses industries pour la production de xanthane, car cet EPS
présente des propriétés d’agent épaississant, viscosant et stabilisant : ainsi, il entre dans la
composition de nombreux produits alimentaires (sauces, soupes, crèmes dessert…), cosmétiques
(dentifrices, shampoings, crèmes en tous genres) ainsi que dans des matériaux de construction
(ciment, plâtre, céramique, béton…) (Becker et al., 1998 ; Sutherland, 1998).
12
DSF
Zur
RpfF
Clp
RpfC
RpfG
c-di-GMP
GMP
FhrR
Capture du fer
Cycle de Krebs
Respiration aérobie
Résistances multiples
Détoxification
Protéines du flagelle
TTSS
Protéines ribosomales
Enzymes extracellulaires
Synthèse d’EPS
Métabolisme des protéines
Protéines membranaires
Formation de biofilms
Figure Int-6 : Modèle d’activation de la synthèse de facteurs de virulence chez
Xanthomonas campestris pv. campestris. Le DSF (Diffusion Signal Factor) est une
petite molécule qui agit en synergie avec les produits du cluster rpf (regulation of
pathogenicity factors) et les régulateurs Clp, Zur et FhrR. Ce réseau complexe régule
notamment la biosynthèse des exopolysaccharides (EPS) et des enzymes
extracellulaires, mais également un grand nombre de processus cellulaires mentionnés
sur la droite de la figure. TTSS, Type Three Secretion System. (D’après He et al., 2007).
Introduction générale
II.5.B. La régulation de la production des EPS et des enzymes extracellulaires chez
Xanthomonas campestris pv. campestris
Chez Xcc, la synthèse des EPS ainsi que des enzymes extracellulaires est soumise à une
régulation fine et coordonnée. Il s’agit en réalité d’un véritable mécanisme de communication
cellulaire de type quorum sensing, orchestré par une petite molécule appelée DSF (Diffusible
Signal Factor) (Barber et al., 1997). La nature chimique du DSF a été identifiée : il s’agit de
l’acide cis-11-methyl-2 dodecenoïque (Wang et al., 2004). Chez Xcc, le DSF est également
impliqué dans la régulation d’autres fonctions cellulaires, telles que la formation de biofilms et la
survie bactérienne (Dow et al., 2003) ; son régulon est en réalité très large, incluant des gènes
impliqués dans l’acquisition du fer, la résistance aux toxines, la détoxification, la construction du
flagelle ou du système de sécrétion de type III (He et al., 2006).
La production, la détection et la réponse au DSF dépendent d’un cluster de gènes appelé rpf
(regulation of pathogenicity factors) (Barber et al., 1997 ; Dow & Daniels, 1994 ; Dow et al.,
2000 ; Tang et al., 1990 ; Vojnov et al., 2001). La protéine RpfF est une enoyl-CoA hydratase
impliquée dans la synthèse du DSF, et RpfC et RpfG constituent un système régulateur à 2
composants impliqué dans la perception et la transduction de ce signal diffusible (Barber et al.,
1997 ; Slater et al., 2000 ; Wang et al., 2004). De plus, des signaux nucléotidiques jouent un rôle
dans les voies de régulation DSF-dépendantes : RpfG est impliqué dans la dégradation du c-diGMP (cyclic dimeric Guanosine MonoPhosphate) en GMP (Ryan et al., 2006). Enfin, les
régulateurs transcriptionnels Clp (cAMP receptor-like protein), Zur (Zinc uptake regulator) et
FhrR (Regulator of Flagellar proteins, hrp genes and ribosomal proteins) interviennent en aval de
la cascade de régulation déclenchée par la perception du DSF, et régulent un très large ensemble
de gènes (He et al., 2007) (Figure Int-6).
III. Introduction au travail de thèse
La disponibilité des séquences de deux génomes de Xcc, ainsi que sa capacité d’infecter
Arabidopsis thaliana, plante modèle dont le génome est lui aussi séquencé, font de Xcc un modèle
de choix en phytopathologie. Ce pathosystème permet l’étude des bases moléculaires de
l’interaction entre une plante et une bactérie.
De plus, la disponibilité de la séquence génomique de quatre autres Xanthomonas (deux
souches de Xanthomonas oryzae pv. oryzae, pathogène du riz, une souche de Xanthomonas
axonopodis pv. citri, pathogène des agrumes, et une souche de Xanthomonas axonopodis pv.
vesicatoria, pathogène du poivron et de la tomate) (Tableau Int-2) permettent des analyses de
13
Introduction générale
génomique comparative à même de fournir des éléments clés pour la compréhension du pouvoir
pathogène des Xanthomonas.
Les deux souches de Xcc 8004 et ATCC33913 sont étudiées dans notre équipe et ont été
utilisées au cours de mon travail de thèse.
Avant mon arrivée au laboratoire, l’équipe avait entrepris l'étude systématique des gènes
régulateurs et récepteurs de Xcc, afin d'identifier les fonctions permettant la colonisation des
plantes hôtes (épiphytie et pouvoir pathogène) et leur survie en dehors de la plante dans des niches
écologiques pouvant servir de réservoir d'inoculum. L’analyse in silico du protéome de la souche
Xcc ATCC33913 avait permis d’identifier 503 protéines potentiellement impliquées dans la
perception et la régulation des signaux. Ces protéines se répartissent comme suit : 121 protéines
appartenant à des systèmes régulateurs à deux composants, 218 régulateurs appartenant à d’autres
familles, 57 protéines impliquées dans la transduction du signal, 23 facteurs sigma et protéines
associées (anti-sigma et anti-anti-sigma), 76 récepteurs TonB-dépendants et 8 protéines TonB. Les
protéines de perception/régulation représentent ainsi environ 12% des protéines putatives de Xcc,
cette proportion étant globalement supérieure à la moyenne calculée chez les bactéries dont les
génomes sont disponibles. Cette observation est en accord avec les résultats d'une étude portant
sur 105 espèces procaryotes dont les génomes sont séquencés, montrant qu’il existe une relation
directe entre le nombre de protéines appartenant à des systèmes à 2 composants et la complexité
des modes de vie des bactéries, les pathogènes de plantes (Xcc inclus) présentant le plus grand
nombre moyen de ces protéines par génome (Ashby, 2004). Ces observations soulignent
l’extraordinaire pouvoir adaptatif des bactéries phytopathogènes.
Mon travail de thèse s’est inscrit dans le cadre de cette étude systématique des gènes
régulateurs et récepteurs de Xcc, et s’est principalement axé sur l’étude fonctionnelle des
récepteurs TonB-dépendants de cette bactérie, protéines sur-représentées chez cette bactérie. Les
résultats obtenus seront exposés au travers des chapitres I et II de ce manuscrit. Au cours de ma
thèse, j’ai également participé à la caractérisation d’un nouvel effecteur de type III de Xcc, en
collaboration avec l’équipe du Professeur Tang (Key Laboratory of Subtropical Bioresources
Conservation and Utilization - Guangxi University - Nanning, Chine). Les résultats concernant cet
effecteur seront présentés dans le chapitre III. Enfin, ce manuscrit s’achèvera par une discussion
générale des travaux effectués au cours de cette thèse et par les perspectives ouvertes par ce
travail.
14
CHAPITRE I : ETUDE
SYSTEMATIQUE DES RECEPTEURS
TONB-DEPENDANTS DE XCC
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
CHAPITRE I : ETUDE SYSTEMATIQUE DES RECEPTEURS
DEPENDANTS DE XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS
TONB-
Mes travaux de thèse ont principalement porté sur l’étude des récepteurs TonB-dépendants
(TBDR) de Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). Nous avons pu mettre en évidence un
rôle de ces récepteurs dans le transport de nutriments d’origine végétale ainsi qu’une contribution
au pouvoir pathogène de la bactérie. Les TBDR, bien connus pour leur rôle dans le transport de
complexes fer-sidérophore, représentent donc également une voie métabolique d’entrée de
composés organiques.
Avant de présenter les résultats obtenus sur les TBDR de Xcc, je me propose de décrire les
systèmes de transport de nutriments à travers les membranes externe et interne des bactéries à
Gram négatif, ainsi que le système TonB et son rôle dans l’acquisition du fer.
INTRODUCTION : L’acquisition des nutriments chez les bactéries à Gram négatif
I. Le transport des composés organiques chez les bactéries à Gram
négatif
Par souci de concision, cette partie se limite à la description des protéines impliquées dans
l’import de nutriments organiques. D’excellentes revues synthétisent l’état des connaissances sur
les sujets qui ne seront pas traités dans ce chapitre : les aquaporines (Kruse et al., 2006 ; Takata et
al., 2004 ; Tanghe et al., 2006), les canaux ioniques (Miller, 2000 ; Saimi et al., 1999 ; Sansom,
1998), les protéines membranaires structurales (Galdiero et al., 2007 ; Kleinschmidt, 2006)
(porine OmpA en interaction avec le peptidoglycane), les récepteurs de colicines (Cao & Klebba,
2002 ; Pilsl et al., 1999) (OmpW), les canaux d’efflux et de détoxification (Andersen, 2003 ;
Poole, 2007 ; Zgurskaya & Nikaido, 2000), et la relation entre les porines et la résistance aux
antibiotiques (Pagès, 2004).
Les activités de canal membranaire associées aux protéines décrites dans la suite de cette
partie ont été caractérisées par différentes méthodes : cinétiques d’accumulation de composés
radiomarqués ou fluorescents, mesures de diffusion dans des liposomes contenant la porine
purifiée, expériences de compétition utilisant des produits bloquant le canal, mesures
physicochimiques déterminant la conductance, la sélectivité et la sensibilité au potentiel des
canaux après reconstitution de la protéine dans des bicouches lipidiques…
15
Carbohydrate
Porine
trimérique
Carbohydrate
Complexe fer-sidérophore
Porine
monomérique
Récepteur TonB-dépendant
ME
Carbohydrate
Carbohydrate
Carbohydrate
Périplasme
Carbohydrate
MI
Domaines
MSD
Modules ABC
Carbohydrate
SBP
β
β’
α
α’
ATP
Complexe fer-sidérophore
ADP+Pi
Carbohydrate
Transporteur ABC
EIIC
Carbohydrate
phosphorylé
EIIB
EIIA
EE
II
H+
Carbohydrate
HPr
Système PTS
Transporteur IIaire
Figure I-1 : Les différents types de transporteurs de nutriments organiques à travers les membranes externe et interne des
bactéries à Gram négatif. Au niveau de la membrane externe, on trouve tout d’abord des transporteurs passifs : les porines
trimériques ou monomériques, qui peuvent être capables d’importer toutes sortes de nutriments (porines non-spécifiques), ou
bien spécifiques d’une classe de molécules bien particulières (maltodextrines, oligogalacturonides…). Les récepteurs TonBdépendants sont quant à eux connus pour le transport actif de complexes fer-sidérophore, de sidéromycines ou de vitamine
B12. Au niveau de la membrane interne, on trouve des systèmes de transport actif primaire (transporteurs ABC et systèmes
PTS), qui utilisent l’énergie issue respectivement de l’hydrolyse d’ATP ou de phosphoenolpyruvate (PEP), ainsi que des
transporteurs actifs secondaires, ou perméases, qui utilisent les flux ioniques pour le transport de nutriments. ME, Membrane
Externe ; MI, Membrane Interne ; SBP, Substrate Binding Protein ; EI, Enzyme I du système PTS ; EII, Enzyme II du système
PTS ; HPr, Histidine containing Protein.
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
La Figure I-1 illustre les systèmes de transport à travers les membranes externe et interne
des bactéries à Gram négatif. Les porines, transporteurs ABC et systèmes PTS sont décrits dans la
partie I, les récepteurs TonB-dépendants dans la partie II.
I.1. Le passage de la membrane externe par « diffusion passive facilitée »
On parle de « diffusion » lorsque le passage d’une membrane s’accompagne d’une variation
négative d'enthalpie libre. Les substances non polaires et liposolubles diffusent directement à
travers les bicouches lipidiques lorsque leur concentration dans le milieu extracellulaire est
supérieure à celle du milieu intracellulaire. Ces substances comprennent l’oxygène, le gaz
carbonique, les acides gras et l’alcool. On parle alors de « diffusion simple ». En revanche, la
plupart des particules hydrosolubles ne peuvent pas diffuser simplement, parce qu’elles sont
repoussées par la partie interne de la membrane, formée de chaînes hydrocarbonées non polaires.
La membrane externe est rendue perméable au passage de ces molécules par la présence de
protéines appelées porines. Cette « diffusion facilitée » suppose un changement de conformation
de la protéine, et se caractérise par un phénomène de saturation.
I.1.A. Les canaux protéiques non spécifiques
Les porines générales sont des trimères protéiques qui constituent des pores perméables aux
substances hydrophiles de faible poids moléculaire (< 600 Da). Cette famille inclut les porines
PhoE, OmpF et OmpC d’Escherichia coli, et a été étendue aux protéines homologues en séquence
et en activité, comme OmpD de Salmonella enterica serovar Typhimurium, OmpK36 de
Klebsiella pneumoniae, Omp35 et Omp36 de Enterobacter aerogenes. La quasi-totalité des
bactéries à Gram négatif possèdent de telles porines trimériques, appelées porines « classiques »
ou « générales » (Nikaido, 2003) (Figure I-1).
Les porines générales peuvent avoir des préférences de charge ou de taille : pour exemples,
OmpF et OmpC ont une légère préférence pour les cations, PhoE pour les anions. OmpF permet le
passage de solutés légèrement plus larges que OmpC (Nikaido, 2003). Toutefois, les petits solutés
sont transportés plus efficacement à travers OmpF : ainsi, le maltose (342 Da) pénètre à travers
OmpF deux fois plus lentement que le glucose (180 Da) (Nikaido & Rosenberg, 1981).
La résolution de la structure 3D de nombreuses porines trimériques par diffraction
électronique ou cristallographie aux rayons X (Chalcroft et al., 1987 ; Cowan et al., 1995 ; Hirsch
et al., 1997 ; Kreusch & Schulz, 1994 ; Michels et al., 2002 ; Weiss & Schulz, 1993 ; Zeth et al.,
2000) a permis d’importants progrès dans l’étude des porines. Un monomère a une structure en
16
Tableau I-1 : Porines de Xanthomonas campestris pv. campestris potentiellement impliquées dans le
transport de nutriments organiques. Cette analyse a été réalisée grâce à la base de donnée TCDB
(Transport Classification Database).
Numéro de la Transport
Commission
Famille a
Domaine pfam Identification du gène
Nom de la protéine b
XCC0320
TC 1.B.5
Famille OprD
PF07396
XCC1529
OprO
XCC2589
OprO
XCC3347
OprO
XCC3353
OprO
XCC0758
XCC0935
MopB
XCC1436
TC 1.B.6
Famille OpmA
PF00691
XCC1451 (tronqué)
XCC1890
MotB
XCC3017
OmpP6
XCC3654
MotB
XCC3712
TC 1.B.9
Famille FadL
PF03349
XCC0017
OmpP1
TC 1.B.19
Famille OprB
PF04966
XCC2373
RpfN
TC 1.B.25
Famille Opr (Outer
membrane Porin)
PF03573
XCC3241
TC 1.B.33
Famille OmpIP (Outer
membrane protein Insertion Porin)
PF01103
TC 1.B.39
Famille OmpW
XCC1365
Oma
XCC4085
PF03922
a
D'après la TCDB (Transport Classification Database) (www.tcdb.org/).
b
D'après da Silva et al ., 2002.
XCC0539
OmpW
XCC3194
OmpW
XCC3195
Omp21
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
tonneau transmembranaire appelée « β-barrel », formée d’un feuillet de 16 ou 18 brins
antiparallèles. Les segments transmembranaires sont connectés par de courts coudes
(« short turns ») du côté périplamique, et par de longues boucles (« loops ») à la surface extérieure
exposée au solvant.
Dans les bicouches lipidiques, les porines peuvent prendre deux conformations : une
conformation ouverte et une conformation fermée ; différents paramètres, tels que le pH,
l’osmolarité ou les carences, peuvent faire passer la porine d’une conformation à une autre. L’état
« ouvert » d’une porine semble tout de même privilégié dans des cellules intactes d’Escherichia
coli (Delcour, 1997 ; Delcour, 2003 ; Nikaido, 2003 ; Sen et al., 1988).
Pseudomonas aeruginosa ne possède pas de membres de la famille des porines trimériques
« classiques » ou « générales ». La principale porine non spécifique de P. aeruginosa, OprF, est
monomérique, existe sous les deux conformations ouverte et fermée, et permet une diffusion très
lente de petits solutés comme les monosaccharides, mais également de composés plus larges (disaccharides) qui ne pourraient pas passer par les porines classiques (Hancock et al., 1979 ; Khalid
et al., 2006 ; Nestorovich et al., 2006 ; Sugawara et al., 2006). La porine OmpG d’E. coli
ressemble à OprF puisqu’elle existe en tant que monomère (Fajardo et al., 1998), et permet le
passage d’oligosaccharides plus larges que les porines classiques. La structure tridimentionnelle
de OmpG, dans sa conformation ouverte et fermée, a été récemment résolue (Yildiz et al., 2006).
La plupart des souches d’E. coli, dont K-12 et B, sont incapables de métaboliser des trisaccharides. Cependant, d’autres souches sont capables d’utiliser le raffinose, un tri-saccharide de
595 Dalton, grâce à la porine non spécifique RafY (50,7 kDa), suffisamment large pour l’influx de
tels composés (Nikaido, 2003).
En plus de nombreux canaux d’export et de canaux ioniques, Xanthomonas campestris pv.
campestris présente dans son génome 22 porines potentiellement impliquées dans le transport de
nutriments organiques. Le Tableau I-1 liste ces protéines ainsi que les différentes familles
auxquelles elles appartiennent. Cette analyse a été réalisée à l’aide de la base de donnée TCDB
(Transport Classification Database), disponible sur le site web (http://www.tcdb.org/). A l’heure
actuelle, une seule porine trimérique de Xcc a été purifiée et caractérisée sur le plan physicochimique, et dénommée Omp37 en raison de sa masse moléculaire de 37 kDa (Wang et al., 2002).
On ignore toutefois quel gène code pour cette protéine.
17
Tableau I-2 : Porines spécifiques caractérisées à l'heure actuelle, principales caractéristiques structurales et orthologues putatifs. ND, non déterminé.
Orthologues putatifs
Organisme
Escherichia
coli
Nom de la
protéine
Poids moléculaire
(kDa)
Structure
quaternaire
Nombre de
brins β
LamB
44
Trimère
18
divers oses maltodextrines
60 µM (pentaose, hexaose,
heptaose)
Garavito et al., 1984
Charbit, 2003
ScrY
58
Trimère
18
divers oses saccharose
maltodextrines
13 à 50 µM (saccharose)
0,3 mM (maltopentaose)
Schmid et al., 1991
Schülein et al., 1991
Forst et al., 1993
BglH
58
Trimère
1 à 3 mM
Andersen et al. , 1999
Tsx
31,4
Oligomère
FadL
Klebsiella
oxytoca
46
CymA
KdgM
24,688
Substrat(s)
β-aryl-D-glucosides
Référence
ND
Heuzenroeder et Reeves,
1981
Benz et al., 1998
20
acides gras à longues
chaines
0,2 µM
Black, 1990
van den Berg et al., 2004
ND
cyclodextrines
28 µM
Orlik et al ., 2003
14
nucléosides
Monomère
Monomère
Monomère
Affinité
14
oligogalacturonides
34 mM
(acide trigalacturonique)
Blot et al., 2002
Pellinen et al., 2003
Erwinia
chrysanthemi
Organisme
26,02
Monomère
ND
oligogalacturonides
ND
Substrat(s)
ScrY
saccharose
maltodextrines
TbuX
XylN
CymD
CumH
SalD
toluène
m-xylène
p-cymène
cumène
salicylate ester
Escherichia coli
YjhA, YshA
ND
Yersinia pestis
KdgM, KdgN
ND
Samonella
Ralstonia picketii
Pseudomonas putida
Pseudomonas putida
Pseudomonas fluorescens
Acinetobacter
Yersinia pseudotuberculosis
ND
Klebsiella pneumoniae
ND
Pseudomonas syringae pv.
tomato
ND
Salmonella typhimurium
KdgN
Nom de la
protéine
OrfM, YiiY, YshA
ND
OrfM, YiiY
ND
AlyVGIII
ND
Condemine et al., 2007
Salmonella paratyphi
Vibrio halioticoli
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
I.1.B. Les canaux protéiques sélectifs
Certaines porines permettent un transport spécifique de certaines classes de nutriments
(acides aminés, sucres, nucléosides, etc). Ces protéines sont particulièrement importantes pour les
bactéries évoluant dans des environnements pauvres en nutriments, dans lesquels la perméabilité
de la membrane externe devient le facteur principal limitant la croissance bactérienne (Nikaido &
Vaara, 1985). Le Tableau I-2 liste les principales porines spécifiques caractérisées à l’heure
actuelle.
LamB, une porine d’Escherichia coli impliquée dans le transport de maltodextrines :
Certaines porines classiques telles que OmpF et OmpC permettent le transport de maltose.
Cependant, les taux de diffusion à travers les porines sont proportionnels aux différences de
concentrations de part et d’autre de la membrane. Si un nutriment est présent à très faible
concentration (de l’ordre du millimolaire), son taux de diffusion sera donc très faible, et cet effet
sera d’autant plus drastique que le nutriment en question est volumineux, ce qui est le cas du
maltose. Dans son habitat naturel, l’intestin, E. coli dégrade l’amidon en maltodextrines grâce à
une amylase. Pour l’entrée de ces sources de carbone particulièrement importantes pour elle, E.
coli a besoin d’une voie spécifique. Ainsi, LamB est une maltoporine trimérique, dont l’affinité
pour différentes maltodextrines varie : l’affinité pour le maltose est assez faible (Kd = 10 mM),
tandis que l’affinité pour le maltopentaose, hexaose ou heptaose est meilleure (Kd ∼ 60 µM) (Benz
et al., 1987 ; Garavito et al., 1984 ; Szmelcman et al., 1976).
LamB n’est pas une porine véritablement spécifique des maltodextrines : la spécificité de
LamB envers différents monosaccharides est faible et augmente avec la taille de
l’oligosaccharide. LamB facilite l’import de nombreux monosaccharides et disaccharides tels que
le trehalose (glucose-glucose, liés en α-1,1) et le mélibiose (galactose-glucose, liés en α-1,6). En
revanche, le saccharose (glucose-fructose, liés en α-1,2) n’est pas transporté par LamB (Luckey &
Nikaido, 1980). Cette porine devient presque complètement spécifique des maltodextrines à partir
de 3 résidus : la diffusion du maltotriose est 100 fois plus rapide que celle d’autres tri-saccharides
(Nikaido & Vaara, 1985). Les éléments structuraux contribuant à la fixation du substrat au niveau
du site actif de LamB, ainsi que le mécanisme de transport, sont synthétisés dans la revue
(Charbit, 2003).
18
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
ScrY, une porine impliquée dans le transport de sucres chez les entérobactéries :
ScrY est une porine trimérique exprimée à partir d’un plasmide présent chez certaines
souches d’E. coli et de Salmonella, qui permet à la bactérie d’utiliser le saccharose comme source
de carbone (Hardesty et al., 1991). En plus du saccharose, d’autres sucres tels que le glucose, le
fructose, l’arabinose, le maltose, le lactose, le raffinose ou les maltodextrines peuvent transiter à
travers SrcY. Cette porine a même plus d’affinité avec le maltose (Kd = 7 mM) et les
maltodextrines (Kd compris entre 0,2 et 2 mM) qu’avec le saccharose (Kd = 50 mM). Cette affinité
augmente avec le nombre de résidus maltose, puis se stabilise à 0,2-0,3 mM à partir de 5 résidus
(maltopentaose) (Andersen et al., 1998 ; Forst et al., 1993 ; Schmid et al., 1991 ; Schülein et al.,
1991).
BglH, une porine d’E. coli impliquée dans le transport de β-glucosides :
BglH présente de fortes homologies de séquences avec LamB et ScrY. Par ailleurs, tout
comme elles, elle forme un trimère dans la membrane externe et permet la diffusion de
carbohydrates. Elle présente un maximum d’affinité pour des aryl-β-glucosides tels que l’arbutine
ou la salicine (Kd compris entre 1 à 3 mM), ainsi qu’avec la gentibiose et la cellopentaose (Kd
compris entre 4 à 8 mM). Contrairement à LamB ou ScrY, BglH a très peu d’affinité avec les
maltodextrines (Andersen et al., 1999).
KdgM et KdgN, deux porines impliquées dans le transport d’oligogalacturonides chez
Erwinia chrysanthemi :
Contrairement à beaucoup d’autres porines, KdgM est monomérique, et son β-barrel est
formé de 14 brins β (Pellinen et al., 2003). Cette porine est spécifique des oligogalacturonides
(oligomères d’acide galacturonique), qui constituent le squelette de la pectine de la paroi végétale.
Le gène kdgM appartient à un opéron impliqué dans la dégradation de la pectine (pelW-togMNABkdgM-paeX), dont l’expression est spécifiquement induite par la présence de pectine ou de ses
produits de dégradation (acide galacturonique ou polygalacturonique). Un mutant dans le gène
kdgM est affecté dans sa croissance sur des oligogalacturonides supérieurs au trimère, ce qui
indique que le monomère, le dimère et le trimère peuvent passer par des porines non spécifiques.
De façon intéressante, ce mutant est également affecté dans son pouvoir pathogène sur feuilles
d’endive. Des protéines très similaires à KdgM existent chez Yersinia pestis mais également chez
de nombreuses autres bactéries. OmpL, également appelée YshA, est l’orthologue de KdgM chez
E. coli (Blot et al., 2002).
19
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
KdgM définit une nouvelle famille de porines spécifiques, qui comporte également la porine
d’E. coli NanC, spécifique du transport de l’acide sialique (Condemine et al., 2005).
Récemment, une deuxième porine spécifique de la même famille a été identifiée chez E.
chrysanthemi. Cette porine, appelée KdgN, présente 60% de similarité avec KdgM. KdgN
transporte du trigalacturonate, mais contrairement à KdgM, le canal de KdgN n’est pas bloqué par
ce composé. La régulation de kdgN est très différente de celle de kdgM (cf. introduction du
Deuxième Chapitre). Il est possible que les deux porines aient une spécificité pour des
oligogalacturonides de tailles différentes (Condemine & Ghazi, 2007).
Les porines de Pseudomonas aeruginosa :
A la différence d’autres organismes à Gram négatif tels que E. coli, qui possèdent un grand
nombre de porines générales et très peu de porines spécifiques, les espèces du genre Pseudomonas
n’utilisent quasiment que des porines spécifiques pour le passage des nutriments à travers leur
membrane externe. La porine générale de P. aeruginosa, OprF, est de petite taille et ne suffit pas à
l’entrée des nutriments dans la bactérie. Les porines spécifiques de P. aeruginosa caractérisées à
l’heure actuelle incluent les porines spécifiques du phosphate et du polyphosphate, respectivement
OprR et OprO, et la porine spécifique du vanillate, OpdK. Par ailleurs, on trouve chez cette même
bactérie une famille de porines (la famille OprD), formée de 19 membres, dont certains ont été
montrés comme intervenant dans l’acquisition d’acides aminés : OprD est la porine spécifique des
acides aminés basiques arginine et lysine, OpdD est spécifique de la glycine et du glutamate,
OpdC de l’histidine, OpdB de la proline, OpdT de la tyrosine, OpdH du cis-aconitate, et OpdO du
pyroglutamate (Tamber et al., 2006).
Enfin, P. aeruginosa possède une porine impliquée dans l’import de sucres, OprB. Plus
exactement, OprB permet le passage lent et non spécifique de solutés de poids inférieur à 300 Da,
mais le transport de sucres tels que le glucose ou le xylose est nettement plus efficace (Trias et al.,
1988).
I.2. Le passage actif de la membrane interne
Etant donnée la grande diversité des transporteurs de la membrane interne chez les bactéries
à Gram négatif, leur classification soit par mécanisme de transport, soit par spécificité de substrat,
est très difficile. Une classification exhaustive des différents transporteurs membranaires du
Vivant a été proposée (Saier, 2000). Afin de rester au plus près des travaux effectués au cours de
cette thèse, je me limiterai ici à la description du transport des sucres chez les bactéries à Gram
négatif.
20
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
I.2.A. Le transport actif primaire
I.2.A.a. Les transporteurs ATPasiques, ou « transporteurs ABC »
Qu'ils soient chargés ou non, les solutés peuvent être activement transportés contre leur sens
spontané de diffusion, c'est-à-dire contre leur gradient chimique ou électrochimique, par couplage
avec une réaction chimique exergonique. On parle alors de transport actif primaire. Le plus
souvent, c'est l'hydrolyse d’ATP qui fournit l'énergie nécessaire au transport. Ainsi, les
transporteurs dits « ABC » (ATP-Binding Cassette) couplent directement l'énergie issue de
l’hydrolyse d'ATP au transport de molécules telles que des sucres, des acides aminés, des
peptides, des polyamines, ou des ions métalliques.
Chez les bactéries, les transporteurs ABC présentent une remarquable conservation de
séquence et d’organisation structurale : ils sont constitués d’une protéine périplasmique et d’un
complexe transmembranaire de 4 domaines.
La protéine périplasmique, appelée SBP (Solute Binding Protein), conduit le substrat vers le
transporteur de la membrane interne. Les SBP confèrent au transporteur ABC son
unidirectionnalité, sa grande affinité ainsi que sa spécificité pour un substrat donné ; elles jouent
un rôle majeur dans la chimiotaxie. Enfin, les SBP stimulent l’activité ATPase du transporteur
(Davidson et al., 1992 ; Liu et al., 1997). Le transport ABC du maltose requiert chez E. coli la
protéine périplasmique MBP (Maltose Binding Protein), qui possède de nombreux sites
fonctionnels d’interaction avec le complexe transmembranaire. De façon intéressante, MBP
présente de l’affinité pour le maltose, mais aussi pour des maltodextrines linéaires ou cycliques
[pour revue, voir (Fetsch & Davidson, 2003)].
Le complexe ABC proprement dit est constitué de deux domaines transmembranaires
hydrophobes appelés domaines MSD (Membrane Spanning Domains) ou domaines β, formant le
site de reconnaissance du substrat, et de deux domaines hydrophiles, les modules ABC ou
domaines α (Figure I-1). Ces modules protéiques "énergétiques" d'environ 200 acides aminés
interviennent dans la fixation et l’hydrolyse de l'ATP. Des expériences de cristallographie ont
montré que la formation du dimère de modules ABC requiert la fixation de 2 molécules d’ATP
(Davidson & Chen, 2004).
Dans la plupart des cas, les deux domaines protéiques transmembranaires β et β’ du
transporteur ABC sont codés par deux gènes homologues, tandis que les domaines ABC sont
formés par un dimère protéique de la même ATPase α, codée par un seul gène. On parle alors
d’une structure α2ββ’. C’est le cas du transporteur ABC du maltose d’E. coli (MalFGK2),
21
Tableau I-3 : Structure de quelques systèmes ABC d'Escherichia coli impliqués dans le transport de sucres,
de complexes fer-sidérophore ou de la vitamine B12 à travers la membrane interne.
Substrat du transporteur ABC
Structure ATPase (a)
Protéine
transmembranaire (β)
Protéine périplasmique
(SBP)
Maltose
α2ββ'
MalK
MalF, MalG
MalE
Galactose
α2β2
MglA
MglC
MglB
Ribose
α-α' β2
RbsA
RbsC
RbsB
Arabinose
α2β2
AraG
AraH
AraF
Fer-enterobactine
α2ββ'
FepC
FepD, FepG
FepB
Fer-hydroxamate
α2 β-β'
FhuC
FhuB
FhuD
Fer-dicitrate
α2ββ'
FecE
FecC, FecD
FecB
Vitamine B12
α2β2
BtuD
BtuC
BtuF
Sucres
Complexes
Fersidérophore
Autre
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
constitué des 2 protéines transmembranaires homologues MalF et MalG, et d’un dimère de la
protéine fixatrice d’ATP MalK. Contrairement au domaine MSD de la plupart des transporteurs
ABC bactériens, qui est formé de 6 hélices α formant 6 segments transmembranaires, MalF
possède 8 segments transmembranaires. MalG en possède 6 de façon classique (Ehrmann et al.,
1998 ; Steinke et al., 2001).
En fonction des gènes codant pour les différents domaines protéiques, on trouve dans une
moindre mesure des transporteurs ABC de structure αα’ββ’, α2β2 ou αα’β2 (Nikaido & Hall,
1998). Enfin, les deux domaines MSD ou ABC peuvent être constitués par une seule chaîne
polypeptidique issue de la fusion entre deux sous-unités dissimilaires désignées α-α’ ou β-β’. Par
exemple, chez E. coli, le transporteur ABC du ribose est de type α-α’ββ’ et le transporteur de ferhydroxamate FhuBCD de type α2β-β’. Ce dernier n’est fonctionnel que si le gène fhuB est coupé
en 2 parties presque égales, les régions N-terminale et C-terminale étant exprimées
indépendemment à partir de ces 2 fragments (Tam & Saier, 1993). Le Tableau I-3 résume la
structure de quelques complexes ABC impliqués dans l’import de sucres ou de complexes fersidérophore (cf. partie II) chez E. coli.
Il est donc très net que des événements de duplication, d’épissage et de fusion sont
intervenus fréquemment dans l’évolution des transporteurs ABC, conduisant à une grande
diversité structurale de ces transporteurs dans la nature.
Le mécanisme de transport à travers un complexe ABC se décompose selon le modèle
suivant : une fois associée à son substrat, la SBP se fixe à la surface périplasmique du
transporteur, ce qui induit un changement de conformation de celui-ci. Ce changement de
conformation se répercute au niveau des modules ABC, de sorte de permettre l’hydrolyse d’ATP.
Afin de stabiliser le complexe dans sa forme non énergisée, il y a translocation du substrat de
l’autre côté de la membrane plasmique (Boos & Lucht , 1996).
Les génomes bactériens comptent un nombre variable de transporteurs ABC, qui dépend de
la niche écologique de l’espèce bactérienne considérée : ainsi, les bactéries de l’environnement et
les bactéries extracellulaires, qui doivent faire face à des conditions très changeantes, possèdent
beaucoup plus de transporteurs ABC que les bactéries intracellulaires (Garmory & Titball, 2004).
Xanthomonas campestris pv. campestris présente dans son génome un grand nombre de gènes
codant pour de potentiels transporteurs ABC, listés dans le Tableau I-4. Les clusters de gènes
présentés dans ce tableau ne codent pas tous pour un système ABC « complet » (comportant au
moins une SBP, une protéine transmembranaire, ou perméase, et une protéine fixatrice d’ATP).
22
Tableau I-4 : Systèmes de transport ABC putatifs de Xanthomonas campestris pv.
campestris (Xcc ), identifiés grâce à la base de données TCDB (www.tcdb.org/) et en
effectuant une recherche par mots clés dans le génome de Xcc.
Identification du gène
Nom de la protéine a
Fonction putative a
XCC0164
XCC0165
XCC0565
XCC0566
XCC0567
XCC0568
XCC0633
XCC0634
XCC0635
XCC0772
XCC0773
XCC0774
XCC0777
XCC0940
XCC0941
XCC0942
XCC0943
XCC1499
XCC1501
XCC1524
XCC1525
XCC1526
XCC1527
XCC1528
XCC2204
XCC2205
XCC2206
XCC2219
XCC2220
XCC2221
XCC2230
XCC2231
XCC2338
XCC2339
XCC2340
XCC2344
XCC2766
XCC2767
XCC2768
XCC3200
XCC3201
XCC3202
XCC3629
XCC3630
XCC3659
XCC3660
XCC3774
XCC3775
XCC3968
XCC3969
XCC3976
XCC3978
YehX
YehZ
YbjZ
YbjZ
YcfV
YbjY
ATP-binding protein
perméase
perméase
ATP-binding protein
ATP-binding protein
perméase
perméase ?
ATP-binding protein
perméase
perméase
ATP-binding protein
Substrate-binding protein
ATP-binding protein
Substrate-binding protein
perméase
perméase
Substrate-binding protein
ATP-binding protein
perméase
ATP-binding protein
perméase
perméase
Substrate-binding protein
Substrate-binding protein
perméase
perméase
Substrate-binding protein
ATP-binding protein
perméase
perméase
ATP-binding protein
ATP-binding protein
perméase
perméase
ATP-binding protein
Substrate-binding protein
perméase
ATP-binding protein
perméase
Substrate-binding protein
perméase
ATP-binding protein
perméase
ATP-binding protein
perméase
ATP-binding protein
?
ATP-binding protein
perméase
ATP-binding protein
ATP-binding protein
perméase
YrbF
YrbE
NrtB
NrtCD
FtsE
SBP
CysU
CysW
CysA
NodI
BtuE
PstB
PstA
PstC
PstS
PhoX
LacG
LacF
MalE
CcmA
CycW
CycZ
CydC
StrW
PotI
PotH
PotG
PotF
YnhE
YnhD
YnhC
ModA
ModB
ModC
YaeE
ABC
YadH
YadG
FtsX
FtsE
NatB
NatA
YadG
a
D'après da Silva et al. , 2002.
b
D'après l'annotation d'un ou plusieurs gènes du système ABC considéré.
Substrat putatif b
Acide aminé
?
?
?
Sulfate
Vitamine B12
Phosphate
Sucre
Hème
?
Putrescine / Polyamine
?
Molybdate
?
?
?
?
Sodium
(i) Structure 1
système PTS du mannitol
(ii) Structure 2
système PTS du glucose
(iii) Structure 3
système PTS du mannose
S
C
S
P
B
A
S
P
S
EIIABC
C
Réaction 5
B
C
D
EIICD
EIIBC
B
Réaction 4
EIIAB
P
S
MI
A
EIIA
A
Réaction 3
S
P
HPr
HPr
Réaction 2
EEII
PEP
Pyruvate
S
EEI I
Réaction 1
P
Figure I-2 : La translocation de groupe par le système PTS, mode de transport actif de
carbohydrates à travers la membrane interne des bactéries à Gram négatif. Cette figure
illustre les 3 structures différentes de l’enzyme EII et leur exemple représentatif chez
Escherichia coli. La figure schématise également le mécanisme du transport, qui
procède par une succession de 5 réactions chimiques au cours desquelles le groupe
phosphore du phosphoenolpyruvate (PEP) est transféré au carbohydrate via des
intermédiares phosphorylés de EI (Enzyme I), HPr (Histidine containing Protein), EIIA
(Enzyme IIA) et EIIB (Enzyme IIB). MI, Membrane Interne. (D’après Postma et al., 1993).
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
Par ailleurs, de nombreux autres constituants de systèmes ABC putatifs, et notamment des
protéines fixatrices d’ATP, sont présents de façon isolée dans le génome. Aucun de ces
transporteurs ABC n’a à ma connaissance été caractérisé chez Xcc ; en revanche, le transporteur
ABC ModABC, impliqué dans l’import de molybdate et d’anions tungstate, a été caractérisé chez
Xanthomonas axonopodis pv. citri et la protéine périplasmique ModA récemment cristallisée
(Balan et al., 2006 ; Santacruz et al., 2006).
I.2.A.b. La translocation de groupe, ou « système PTS »
Ce processus utilise l’énergie du métabolisme pour transporter un substrat en passant par
une étape de modification chimique. Le système le plus connu est le système PTS
(PhosphoTransferase System), qui permet le passage de sucres (mannitol, glucose, fructose,
saccharose, N-acetylglucosamine, cellobiose…), couplé à leur phosphorylation. L’énergie
nécessaire au transport est fournie par hydrolyse du PEP (PhosphoEnolPyruvate), un intermédiaire
de la glycolyse.
On peut considérer que le PEP est une unité énergétique équivalente à l’ATP, dans la
mesure où, au cours de la glycolyse, une molécule d’ATP est synthétisée à partir d’une molécule
de PEP lors de la réaction catalysée par la Pyruvate Kinase. Le transport d’un monosaccharide par
des voies différentes du système PTS requiert plus d’une molécule d’ATP, et est donc plus
coûteux pour la bactérie.
Outre le transport de carbohydrates, le système PTS joue un rôle majeur dans la chimiotaxie
envers ses substrats (Stock et al., 1989), et dans la régulation du métabolisme des sucres
(Deutscher et al., 2006). Ces aspects ne seront pas traités ici.
Mécanisme de la translocation de groupe par le système PTS :
Le système PTS catalyse la réaction suivante :
P-enolpyruvate(int) + carbohydrate(ext)
où
(int)
et
(ext)
pyruvate(int) + carbohydrate-P(int)
désignent respectivement le cytoplasme et le périplasme de la bactérie, et P un
groupement phosphate.
Cette réaction peut se décomposer de la manière suivante, illustrée Figure I-2 :
23
Tableau I-5 : Classification et description de quelques systèmes PTS de bactéries à Gram négatif, de leur(s) substrat(s) et des gènes codant pour les différents
domaines de ces systèmes. D'après Postma et al., 1993.
Classe PTS
Nom du système PTS a
Nom abrégé
Substrat(s) b
Gène(s) c
Domaines c
Escherichia coli
Glucose
Glc
Glc, GlcN, Sor, αMG, 5TG, Atl,
Rtl, Man, 2DG
ptsG , crr
IICB, IIA
Escherichia coli
Maltose
Mal
Mal, Glc
malX , crr
IICB, IIA
Escherichia coli
Trehalose
Tre
Tre
treB , crr
?, IIA
Escherichia coli
N-acetylglucosamine
Nag
Nag, Stz, αNag
nagE
IICBA
Sucrose
Scr
Scr, Glc
scrA , crr
IIBC, IIA
Bgl
Bgl, Glc
bglF
IICBA
Asc
Arb, Sal, Cel
ascF , ?
IIBC, ?
Arb
Bgl
arbF
IIBCA
Organisme
Classe Glucose
Enterobacteriacae
Escherichia coli
Escherichia coli
β-Glucosides
Erwinia chrysanthemi
Classe Mannitol
Classe Lactose
Escherichia coli
Mannitol
Mtl
Mtl, Gut, Atl, 2DA
mtlA
IICBA
Escherichia coli
Fructose
Fru
Fru, Xtl, Glc, Sor, Man
fruF, fruA
FPr (domaine N-terminal EIIFru et
domaine C-terminal HPr-like), IIBC
Xanthomonas campestris
Fructose
Fru
Fru
fruB, fruA
EIIA, HPr et EI, IIBC
Escherichia coli
Cellobiose
Cel
Cel
celA, celB, celC
IIB, IIC, IIA
Escherichia coli
Mannose
Man
Man, Nag, GlcN, Fru, 2DG,
Glc, Tre, αMG
manX, manY, manZ
IIAB, IIC, IID
Klebsiella pneumoniae
L-Sorbose
Sor
Sor, Fru, Glc
sorF, sorB, sorA, sorM
IIA, IIB, IIC, IID
Glucitol
Gut
Gut, 2DA, Mtl, Atl
gutA, gutB
II(CB), IIA
Classe Mannose
Sans classification
a
Escherichia coli
Nom du système PTS déterminé par son substrat principal.
Abréviations : Asc, Arb Sal Cel ; Arb, arbutine ; Sal, salicine ; Cel, cellobiose ; Atl, arabinitol ; αNag, methyl-2-deoxy-a-D-glucoside ; αMG, methyl a-glucoside ; Bgl, β-glucoside ; Fru,
fructose ; Glc, glucose ; GlcN, glucosamine ; Gut, Glucitol ; Mal, maltose ; Mtl, mannitol ; Man, mannose ; Nag, N-acetylglucosamine ; Rtl, ribitol ; Scr, sucrose ; Sor, sorbose ; Stz,
streptozotocin ; Tre, trehalose ; Xtl, xylitol ; 2DG, 2-deoxyglucose ; 2DA, 2-deoxyarabinohexitol ; 5TG, 5-thioglucose.
b
c
?, inconnu.
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
(Réaction 1) P-enolpyruvate + Enzyme I (EI)
(Réaction 2) P-EI + HPr
P-EI + pyruvate
P-HPr + EI
(Réaction 3) P-HPr + Enzyme II A (domaine ou protéine EIIA)
P-EIIA + HPr
(Réaction 4) P-EIIA + Enzyme II B (domaine ou protéine EIIB)
P-EIIB + EIIA
(Réaction 5) P-EIIB + carbohydrate(ext)
EIIC
EIIB + carbohydrate-P(int)
La fixation du substrat à la perméase membranaire EII (fixation de très forte affinité)
entraîne le transfert du groupe phosphate du PEP au carbohydrate, via des intermédiares
phosphorylés de EI, HPr, EIIA et EIIB : l’autophosphorylation de EI (Réaction 1) a lieu au niveau
d’un résidu Histidine (His-189 chez E. coli). P-EI phosphoryle ensuite la protéine HPr (Histidine
containing Protein) (Réaction 2), également au niveau d’un résidu Histidine (His-15 chez E. coli).
Le groupe phosphate est ensuite transféré à EIIA (Réaction 3), puis à EIIB (Réaction 4), au niveau
d’un résidu Cystéine dans le cas de EIIBGlc et EIIBMtl des systèmes PTS d’E. coli du Glucose et du
Mannitol, respectivement. Ceci engendre un changement conformationnel de EIIC, permettant la
translocation du substrat vers le cytoplasme. Enfin, il y a phosphorylation du substrat par P-EIIB
(Réaction 5), puis dissociation du carbohydrate phosphorylé dans le cytoplasme (Postma et al.,
1993) (Figure I-2).
Structure protéique du système PTS :
EI et HPr sont les « protéines générales » du système PTS ; elles sont solubles et
cytoplasmiques. EI est fonctionnelle sous la forme d’un dimère, et HPr est une petite protéine
monomérique. EIIC (et éventuellement EIID) constitue le canal membranaire de translocation, et
est spécifique d’un substrat. Cette spécificité permet de définir 4 classes de systèmes PTS, décrites
dans le Tableau I-5. Ce tableau présente également les membres représentatifs de ces classes ainsi
que les gènes codant pour les différentes protéines.
Le complexe EII peut exister sous 3 formes différentes (Figure I-2) :
(i) une protéine membranaire constituée de 3 domaines A, B et C. C’est le cas de EIIABCMtl du
système PTS du mannitol d’E. coli.
(ii) une protéine cytoplasmique soluble (EIIA) et un complexe de 2 protéines dont au moins une
est ancrée dans la membrane plasmique (EIIC, ou EIIBC). C’est le cas de EIIBCGlc-EIIAGlc du
système PTS du glucose d’E. coli.
(iii) une chaîne polypeptidique soluble issue de la fusion des domaines A et B (EIIAB), et deux
protéines transmembranaires EIIC et EIID. C’est le cas de EIIABMan EIICMan EIIDMan du système
PTS du mannose d’E. coli.
24
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
Ces trois cas englobent la très grande majorité des systèmes PTS bactériens, mais on trouve
également quelques variations : dans le système PTS de la cellobiose d’E. coli, les fonctions de
canal membranaire (EIICCel) et de phosphorylation (EIIACel et EIIBCel) sont assurées par 3
protéines indépendantes. Dans le système PTS du fructose d’E. coli ou de Salmonella
typhimunium, la protéine HPr, appelée FPr (Fructose-specific HPr), combine les fonctions de
EIIAFru et de HPr (Geerse et al., 1989 ; Hanson & Anderson, 1968 ; Saier & Roseman, 1976).
Chez Rhodobacter capsulatus, seul le fructose est transporté par un système PTS (Wu et al.,
1990). Cela explique peut-être le fait que, chez cette bactérie, EIIAFru, HPr et EI sont constitués
par une seule et même protéine (Postma et al., 1993). C’est également le cas chez Xanthomonas
campestris pv. campestris (Xcc), bactérie chez laquelle le système PTS du fructose a été
caractérisé : FruB est une Multiphosphoryl Transfer Protein (MTP) et FruA est la perméase
spécifique du fructose. La protéine FruB présente 3 domaines distincts, correspondant aux
fonctions EIIA, HPr et EI du système PTS (de Crécy-Lagard et al., 1995).
Organisation des gènes codant pour les protéines du système PTS :
Chez plusieurs bactéries entériques, les gènes codant pour les protéines générales du
système PTS (ptsH pour HPr et ptsI pour EI) sont co-transcrits avec le gène crr codant pour la
protéine EIIAGlc, formant l’opéron ptsHIcrr, ou opéron pts. Par ailleurs, les gènes codant pour les
protéines EII peuvent être co-transcrits avec les gènes codant pour des enzymes de dégradation de
ce sucre. L’opéron est alors désigné par un code de 3 lettres (opéron man, cel, fru, mtl…). Par
exemple, le système PTS scr du saccharose d’E. coli, de Salmonella thompson, de Klebsiella
pneumoniae ou de Vibrio alginolytocus, est codé par 2 opérons, scrK et scrYAB. Le gène scrK
code pour une fructokinase ATP-dépendante, scrY code pour une porine spécifique, scrA pour
EIIScr et scrB pour une invertase, enzyme de dégradation du saccharose. Dans la majorité des cas,
le substrat principal d’un système PTS est inducteur de l’expression de cet opéron.
Chez Xcc, les deux protéines du système PTS du fructose, FruB et FruA, sont codées par les
gènes XCC2370 et XCC2372. Le gène qui les sépare, XCC2371, code pour FruK, une 1Phosphofructokinase impliquée dans la phosphorylation intracellulaire du fructose-1-phosphate
produit par le système PTS en fructose-1,6-diphosphate (de Crécy-Lagard et al., 1991). Des
mutants dans ces gènes sont incapables d’utiliser le fructose, mais aussi le mannose, le saccharose
et le mannitol, suggérant l’existence d’un « nœud » commun dans le métabolisme de ces
carbohydrates (de Crécy-Lagard et al., 1991).
25
Tableau I-6 : Classification des principaux transporteurs actifs secondaires bactériens et exemples représentatifs de ces différentes classes. MFS, Major Facilitator
Superfamily ; GPH, Glycoside Pentoside Hexuronide.
Exemples représentatifs
Sous-famille
Famille
Numéro
1
Famille
MFS
5
7
Famille
GPH
Nom
Sugar Porter
Oligosaccharide/H+
symporter
Fucose-galactoseglucose/H+ symporter
Abréviation
SP
OHS
FGHS
Substrats
monosaccharides
(hexoses, pentoses),
disaccharides, quinate,
organo-cations, inositols
di- et dri-saccharides
L-fucose, glucose,
galactose
glucuronides,
isoprimeverose, lactose,
melibiose, pentosides,
raffinose, sucrose
Mécanisme
Symport Soluté/H+
Protéine
Organisme
Sucre transporté
Numéro de la
"Commission
Transport" (TC)
AraE
Escherichia coli
Arabinose
2.A.1.1.2
XylE
Escherichia coli
Xylose
2.A.1.1.3
GalP
Escherichia coli
Galactose
2.A.1.1.1
CscB
Escherichia coli
Sucrose
2.A..1.5.3
LacY
Escherichia coli
Lactose
2.A.1.5.1
MelY
Enterobacter cloacae
Melibiose
RafB
Escherichia coli
Raffinose
2.A.1.5.2
FucP
Escherichia coli
L-Fucose
2.A.1.7.1
GluP
Brucella abortus
Galactose/glucose
2.A.1.7.2
MelB
Escherichia coli
Melibiose
2.A.2.1.1
UidB
Escherichia coli
Glucuronides
2.A.2.3.1
Symport Soluté/H+
Symport Soluté/H+
Symport Soluté/H+
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
On trouve dans le génome de Xcc un autre cluster de gènes correspondant à un ou deux
systèmes PTS putatifs : d’après leur séquence, les gènes XCC2804 à XCC2809 pourraient coder
pour des constituants EI, HPr et EIIA. Cependant, ce cluster n’a pas été étudié à l’heure actuelle.
I.2.B. Le transport par gradient chimique, ou transport actif secondaire, via des
« perméases »
On parle de transport actif secondaire lorsqu'un soluté est pompé (contre son gradient
électrochimique) grâce à un gradient de concentration ionique.
Lors du transport actif par les transporteurs ABC, la déphosphorylation d’ATP crée des
distributions ioniques asymétriques de part et d’autre de la membrane interne. Ces gradients
électrochimiques en sodium, potassium, etc., peuvent être utilisés pour le transport lent de petits
solutés. Le gradient de proton, ou force proton-motrice, est le plus largement utilisé : pour
maintenir le potentiel transmembranaire, la pompe à proton fait entrer et sortir des protons. Le
transport d’une substance peut alors se faire dans le même sens que celui de l’entrée de protons,
on parle alors de symport soluté/H+, ou bien dans le sens inverse à la sortie de protons, on parle
alors d’antiport soluté/H+. La protéine permettant le transport porte le nom de « perméase
soluté/H+ » (Saier, 2000).
La famille MFS (Major Facilitator Superfamily) (TC 2.A.1) contient la très grande majorité
des perméases soluté/H+ transporteuses de sucres. Chez E. coli, 30% des transporteurs secondaires
appartiennent à la famille MFS.
Une classification des transporteurs MFS en 17 sous-familles a été proposée (Pao et al.,
1998). Les transporteurs de sucres appartiennent aux sous-familles 1, 5 et 7, dont les principales
caractéristiques sont résumées dans le Tableau I-6. D’autres perméases de sucres appartiennent à
la famille GPH (Glycoside Pentoside Hexuronide) (TC 2.A.1) (Tableau I-6). Xcc présente 40
transporteurs MFS d’après la base de données TCDB (Tableau I-7), et ne présente pas de
transporteur de type GPH.
Enfin, certains symporteurs soluté/H+ de sucres ne présentent aucune similarité de séquence
ou de motifs avec les familles MFS ou GPH et définissent donc des familles distinctes : c’est le
cas du transporteur de gluconate GntP d’E. coli et de Bacillus subtilis (TC 2.A.8), du transporteur
de L-Rhamnose RhaT d’E. coli (TC 2.A.7) et du transporteur de 2-keto-3-deoxygluconate KdgT
d’Erwinia chrysanthemi (TC 2.A.10) (Saier, 2000). Xcc ne possède pas d’homologues de ces
transporteurs.
26
Tableau I-7 : Transporteurs de la famille MSF de Xanthomonas campestris pv.
campestris (Xcc ), identifiés grâce à la base de données TCDB (www.tcdb.org/).
Domaine PFAM
PF00083 (Sugar Transporter)
PF07690 (MFS_1)
a
D'après da Silva et al., 2002.
Identification du gène
Nom de la protéine a
XCC0083
XCC1759
XCC4172
XCC0288
XCC0302
XCC0349
XCC0493
XCC0495
XCC1113
XCC1316
XCC1400
XCC1508
XCC1685
XCC1783
XCC2006
XCC2040
XCC2236
XCC2253
XCC2342
XCC2352
XCC2356
XCC2362
XCC2466
XCC2660
XCC2672
XCC2832
XCC2845
XCC3034
XCC3053
XCC3243
XCC3357
XCC3413
XCC3487
XCC3845
XCC4071
XCC4078
XCC4119
XCC4121
XCC4156
XCC4227
ProP
XylE
KgtP
OpdE
YnfM
VanK
Aas
Bcr
AraJ
PmrB
FucP
ProP
NasA
CynX
TetV
RmrB
YhjE
YhjX
YieO
Suc1
AraJ
EmrA
YcaD
YceE
ExuT
SuxC
GluP
RmrB
AmpG
FucP
YnaJ
ExuT
XylP
TetA
TtuB
Na+
Substrat
Périplasme
H+
MI
Antiporteur
H+
SSS
Na+
Antiport
Cytoplasme
Symport
Figure I-3 : Exemple de transport secondaire de type symport couplé à un antiport, à
travers la membrane interne d’une bactérie à Gram négatif. Au cours du transfert
d’électrons, des protons sont pompés vers le périplasme. Le gradient de protons créé
conduit à l’expulsion d’un ion sodium par un mécanisme d’antiport. Cet ion va alors se
fixer à la perméase (dite SSS, Sodium Solute Symporter), ce qui induit un changement
de conformation du site de fixation du substrat, puis de la protéine entière. L’ion sodium
est ainsi expulsé du périplasme vers le cytoplasme, en même temps que le substrat. MI,
Membrane Interne.
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
Il arrive parfois que le symport soit couplé avec un antiport : le gradient de protons entraîne
l’exclusion d’ions sodium par un antiporteur (Na+/H+), ce qui crée un gradient de sodium. La
fixation du sodium à la perméase induit un changement de conformation de la protéine, permettant
la fixation du substrat. Celui-ci est alors conduit dans le cytoplasme par symport avec les ions
sodium (Figure I-3). La perméase est dite de type SSS (Sodium Solute Symporter) (TC 2.21). Les
protéines de cette famille ne possèdent pas véritablement de spécificité de substrat, et peuvent
ainsi transporter des sucres, des acides-aminés, des vitamines, des nucléosides, des inositols et des
ions organiques ou inorganiques (Saier, 2000).
II. Les récepteurs TonB-dépendants, le système TonB et leur rôle
dans l’acquisition du fer chez les bactéries à Gram négatif
II.1. La disponibilité en fer : les protéines sources de fer et les sidérophores
Chez les bactéries comme chez l’ensemble des organismes vivants, le fer participe en tant
que co-facteur à de nombreux processus métaboliques essentiels, tels que la synthèse des
désoxyribonucléotides, la phosphorylation oxydative ou le transport d’électrons. Pourtant, il est
présent à de très faibles concentrations (10-9 M dans le sol et dans l’eau), et sous la forme d’ions
ferriques Fe3+ presque totalement insolubles. Ainsi, la concentration en fer disponible est de
l’ordre de 10-18 M dans des conditions physiologiques normales (Ferguson & Deisenhofer, 2002).
Cependant, les microorganismes requièrent une concentration en fer d’au moins 10-6 M pour
survivre. Les bactéries associées à un hôte eucaryote ont la possibilité de capter le fer
biologiquement disponible dans certaines protéines de l’hôte au cours de l’infection ou de la
symbiose. Pour capter le fer, les bactéries peuvent également utiliser des sidérophores produits par
eux-mêmes ou par d’autres microorganismes présents dans leur environnement.
Les protéines eucaryotes sources de fer pour les bactéries sont les protéines de stockage
du fer (transferrine, lactoferrine et ferritine) ainsi que les hémoprotéines. Ces dernières, également
appelées hémophores, sont porteuses d’un groupe prosthétique, appelé porphyrine, formé d'une
structure aromatique renfermant au centre un atome de fer. Ce cofacteur, appelé hème, est présent
dans l’hémoglobine, le complexe hémoglobine-haptoglobine, l’albumine et l’hémopexine. Chez
les plantes et les animaux, il existe d’autres hémoprotéines dans lesquelles l’hème n’est pas liée de
façon covalente à la protéine, telles que la myoglobine, la leghémoglobine, la catalase et le
27
A
B
Ferrichrome
Coprogène
Ferrioxamine
Aérobactine
Entérobactine
2,3-Dihydroxylbenzoylsérine
OH
O
H
N
OH
O
OH
C
Dicitrate
D
OH
Pyoverdine (Pseudomonas sp.)
Peptide
Figure I-4 : Les différentes classes de sidérophores et leur structure chimique. (A) Classe
des Hydroxamates. (B) Classe des Catécholates. (C) Classe des carboxylates. (D) La
pyoverdine, sidérophore fluorescent produit et utilisé par les espèces du genre
Pseudomonas.
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
cytochrome de type b (Wandersman & Delepelaire, 2004). Par souci de concision, les récepteurs
bactériens impliqués dans la reconnaissance de ces hémoprotéines ne seront pas décrits dans cette
thèse.
Les sidérophores sont des composés chimiques de faible poids moléculaire (500-1500 Da)
produits par les bactéries et les champignons, capables de fixer le fer et d’être importés dans les
cellules sous la forme de complexes fer-sidérophore ; cette capture nécessite un système
spécifique de transport actif impliquant notamment les récepteurs TonB-dépendants pour le
transport de ces complexes à travers la membrane externe. Ces récepteurs peuvent également être
utilisés pour le transport d’antibiotiques sous la forme de complexes fer-sidérophore-antibiotique
appelés sidéromycines : le complexe fer-sidérophore a pour fonction de véhiculer l’antibiotique.
Ainsi, le TBDR FhuA est capable de transporter l’albomycine, analogue structural du ferrichrome,
liée au sidérophore phenylferricrocine (Ferguson et al., 2000) ; FhuA transporte également un
dérivatif de la rifamycine appelé CGP 4832 (Ferguson et al., 2001). La membrane externe ne
constitue plus alors une barrière sélective pour l’entrée de ces antibiotiques, mais facilite et
augmente leur taux d’entrée grâce à ce transport actif. La concentration minimale inhibitrice de
ces antibiotiques peut ainsi être réduite de plusieurs centaines de fois (Braun & Braun, 2002) !
Dans des conditions de carence en fer, la majorité des bactéries secrètent au moins un
sidérophore, mais elles sont également capables d’utiliser les sidérophores sécrétés par les autres
microorganismes de leur environnement (champignons ou bactéries). On parle alors de
« crossfeeding ».
Il existe 3 classes de sidérophores, qui se distinguent par leur structure chimique : les
catécholates, les hydroxycarboxylates et les hydroxamates (Figure I-4). Tous forment avec le fer
un complexe d’une affinité extraordinaire, de constante de formation comprise entre 1023 et 1049
M (Ferguson & Deisenhofer, 2002). E. coli ne produit qu’un seul sidérophore de type catécholate,
l’entérobactine, mais est capable d’utiliser le ferrichrome produit par le champignon Ustilago
sphaerogena, ainsi qu’un grand nombre d’autres sidérophores (Figure I-4 et Tableau I-8).
Les bactéries du genre Pseudomonas produisent un sidérophore particulier, fluorescent,
appelé pyoverdine ; cette molécule est constituée d’un chromophore (1S-5-amino-2,3-dihydroxy1H-pyrimido[1,2-a]quinoline-1-carboxylic acid) responsable de la couleur de la molécule, lié à
une chaîne peptidique (6 à 12 acides aminés) et à un acide ou un amide dicarboxylique
(Budzikiewicz, 1993) (Figure I-4).
28
A
600-800 acides aminés
séquence
signal
extension
N-terminale
site de
clivage
B
β-barrel
plug
TonB-Box
12 aa formant un feuillet β
d’ancrage - dernier aa aromatique
Vue latérale
Vue de l’extérieur
(côté solvant)
boucles extracellulaires
β-barrel
plug
coudes périplasmiques
TonB-box
C
Complexes fer /siderophore
E
ExbB
ExbD
Transporteur
ABC
Fe2+
Fur
TonB
TBDR
Antisigma
σ ECF
ARN Polymerase
Fur
Box
Gènes impliqués dans
l’acquisition du fer
Figure I-5 : Structure-fonction des récepteurs TonB-dépendants (TBDR). (A) Structure
schématique de la structure primaire d’un TBDR. Un contour en pointillés signifie que le
domaine n’est pas présent dans tous les TBDR. (B) Structure cristallographique
tridimentionnelle de FepA d’Escherichia coli (Figure de Ferguson et Deisenhofer, 2002).
(C) Modèle décrivant l’acquisition des complexes fer-sidérophore chez les bactéries à
Gram négatif et sa régulation par la protéine Fur. Certains TBDR présentant une
extension N-terminale sont par ailleurs capables d’interagir avec un facteur anti-sigma et
d’activer une cascade de régulation conduisant à la régulation de leur propre expression.
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
II.2. L’acquisition des complexes fer-sidérophore par le système TBDR-TonBExbBD
II.2.A. Les Récepteurs TonB-Dépendants (TBDR)
Comme mentionné précédemment, le passage actif des complexes fer-sidérophore et des
sidéromycines à travers la membrane externe des bactéries à Gram négatif est pris en charge par
des récepteurs particuliers, les TBDR. Ces protéines sont spécifiques d’un sidérophore et ont pour
lui une très grande affinité (Kd de l’ordre de 0,1 µM) (Ferguson & Deisenhofer, 2002). En
revanche, le flux du transport à travers un TBDR est relativement lent comparé à la vitesse du
transport à travers les porines (Nikaido & Saier, 1992).
Structure primaire d’un TBDR :
Comme le montre la Figure I-5A, les récepteurs TonB-dépendants sont formés de plusieurs
domaines caractéristiques : de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C-terminale, on trouve une
séquence signal, suivie éventuellement d’une « extension N-terminale », puis le domaine plug
(encore appelé « cork », « hatch » ou « globular domain »), d’environ 150 résidus, et enfin le « βbarrel », grand domaine d’environ 600 résidus.
La séquence signal, qui sera clivée au cours de la maturation de la protéine, est un petit
peptide qui permet l’adressage des protéines de la membrane externe et des protéines
extracellulaires au-delà de la membrane interne de la bactérie.
Le plug est un domaine « bouchon » qui empêche le passage direct des nutriments dans le
périplasme (Figure I-5B). Au début de la séquence de ce domaine, on trouve la TonB-box, courte
séquence 5 ou 6 acides aminés [chez E. coli : TXXV(S/T), où X est un acide aminé hydrophobe]
(Lundrigan & Kadner, 1986), qui permet l’interaction entre le TBDR et la protéine TonB, ancrée
dans la membrane interne (cf. § II.2.B.). Le domaine β-barrel correspond au domaine structural du
TBDR, qui donne à la protéine sa forme de tonneau ancré dans la membrane externe. Les 12
derniers acides aminés de la séquence du barrel forment un brin β qui permet l’ancrage de la
protéine dans la membrane externe ; le dernier acide aminé est aromatique (Tryptophane ou
Phénylalanine) (Struyvé et al., 1991).
L’extension N-terminale est un domaine d’environ 70 acides aminés qui n’existe que chez
une petite proportion de TBDR. Les TBDR FecA d’E. coli et FpvA de P. aeruginosa en possèdent
une. Par interaction avec un facteur anti-sigma, ce domaine a pour rôle de signaler la présence du
complexe fer-sidérophore à un facteur sigma approprié, permettant la régulation de l’expression
des gènes impliqués dans l’utilisation du fer (cf. § II.3.B. et Figure I-5C). Ces récepteurs
29
A. Récepteur TonB-dépendant conventionnel
plug
β-barrel
B. Récepteur TonB-dépendant « transducer » conventionnel
extension
N-terminale
plug
β-barrel
C. Récepteur TonB-dépendant « transducer » de type Oar
extension
N-terminale
Oar
plug
β-barrel
D. Récepteur TonB-dépendant de type Oar
Oar
plug
β-barrel
Figure I-6 : Structure primaire des récepteurs TonB-dépendants (TBDR). Les
différents arrangements protéiques possibles définissent 4 sous-classes de TBDR,
en fonction de l’absence ou de la présence d’une extension N-terminale et/ou d’un
domaine Oar en plus des 2 domaines caractéristiques de la famille des récepteurs
TonB-dépendants : le plug et le β-barrel. (D’après Koebnik, 2005).
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
particuliers sont appelés OMTN (Outer Membrane Transporters with an N-terminale extension)
(Schalk et al., 2004) ou « transducers » (Koebnik, 2005). Par ailleurs, l’identification d’un motif
supplémentaire dans certains TBDR de l’espèce Bacteroides fragilis a permis la classification des
TBDR en 4 sous-groupes (Figure I-6B) : (i) les TBDR présentant une structure conventionnelle,
comprenant un β-barrel et un domaine plug (Figure I-6A). (ii) les TBSR qui possèdent en plus une
extension N-terminale, et sont donc des récepteurs TonB-dépendants « transducers »
conventionnels (Figure I-6B). De façon intéressante, les 26 tranducers conventionnels de B.
fragilis sont associés à des gènes codant pour un facteur sigma et à un facteur anti-sigma,
suggérant fortement un rôle dans la signalisation. (iii) les TBDR présentant une seconde extension
N-terminale, en sandwich entre l’extension N-terminale conventionnelle et le domaine plug. Ce
domaine est homologue au domaine N-terminal de la protéine Oar de Myxococcus xanthus, chez
qui le domaine est impliqué dans un processus de morphogénèse au cours de la formation de
myxospores. Ces récepteurs sont dits de type « Oar ». On trouve des membres de cette sous-classe
chez les genres Bacteroides, Xylella, Xanthomonas, Idiomarina et Leptospira, mais leur fonction
n’est pas connue à l’heure actuelle. Chez les protéines membres de la sous-classe Oar, l’extension
N-terminale conventionnelle peut être présente (on parle alors de récepteurs TonB-dépendants
« transducers » de type Oar (Figure I-6C), ou absente (on parle alors de récepteurs TonBdépendants de type Oar) (Koebnik, 2005).
Structure tridimentionnelle d’un TBDR :
La structure tridimentionnelle de 7 TBDR seuls ou fixés à leur sidérophore a été résolue par
cristallographie aux rayons X : FhuA (Ferguson et al., 1998 ; Locher et al., 1998), FepA
(Buchanan et al., 1999), FecA (Ferguson et al., 2002 ; Yue et al., 2003), BtuB (Chimento et al.,
2003) et Cir d’E. coli (Buchanan et al., 2007), ainsi que FpvA (Cobessi et al., 2005a) et FptA
(Cobessi et al., 2005b) de Pseudomonas aeruginosa (Figure I-7 et Tableau I-8).
Le β-barrel (en vert sur la Figure I-5) forme un tonneau hydrophobe ancré dans la
membrane externe, d’une hauteur approximative de 55 à 70 Å. Le pore formé par le barrel a une
largeur de 35 à 40 Å. Le barrel entretient avec les lipopolysaccharides membranaires des
interactions électrostatiques et des liaisons de Van der Walls. Le barrel est formé d’un tonneau de
22 brins β transmembranaires, orientés à 45° par rapport à l’axe du barrel, et qui s’étendent audelà des limites de la membrane externe. Ces brins β sont connectés par 11 longues boucles
(« loops ») du côté extracellulaire, et par 10 courts coudes (« short turns ») du côté périplasmique
(Figures 5B et 8A) (Ferguson & Deisenhofer, 2002 ; Wiener, 2005). Le TBDR BtuB d’E. coli, qui
ne transporte pas de complexe fer-sidérophore mais une molécule de vitamine B12 également
30
Tableau I-8 : Récepteurs TonB-dépendants d'Escherichia coli (souche K12) et leurs fonctions dans le transport de complexes fer-sidérophore, d'antibiotiques et dans la
perception de bactériophages et/ou de colicines.
Nom du TBDR
Classe de
sidérophore
Sidérophore
Organisme(s) produisant
ce sidérophore
Antibiotiques
transportés
Colicines
Bactériophages
albomycine, CGP 4832
(dérivatif de rifamycine)
Colicines M, J25
T1, T5, φ80, et
UC-1
Structure tridimentionnelle
Locher et al ., Cell, 1998;
Ferguson et al ., Science, 1998
FhuA
Ferric hydroxamate
uptake
Ferrichrome
Ustilago sphaerogena,
Aspergillus sp.
FhuE
Ferric hydroxamate
uptake
Coprogène
Neurospora crassa,
Alternaria cassiae,
Penicillium chrysogenum
?
?
?
non résolue
Streptomyces pilosus
?
?
?
non résolue
certaines souches d'E. coli,
Aspergillus fumigatus
?
?
?
non résolue
lui-même
?
Hydroxamate
FoxA
Ferrioxamine
transporter
Ferrioxamine B
IutA
Iron uptake transporter
Aérobactine
FepA
Ferric enterobactin
receptor protein
Enterobactine (=
Enterochéline)
Cir
Colicin I receptor
Fiu
Ferric iron uptake
FecA
Ferric citrate transporter
BtuB
B twelve uptake
Catécholate
Carboxylate
Dihydroxybenzoylsérine
produit de dégradation de
l'enterobactine
Céphalosporines
Dihydroxybenzoylsérine
produit de dégradation de
l'enterobactine
Céphalosporines
Dicitrate
Bradyrhizobium japonicum
Cobalamine / Vitamine B12
Colicines B et D,
Microcines M,
H47 et E492
Colicines Ia et Ib,
Microcines M,
H47 et E492
H8
Buchanan et al ., Nat Struct Biol,
1999
Buchanan et al ., EMBO, 2007
Microcines M,
H47 et E492
non résolue
?
?
?
Ferguson et al ., Science, 2002;
Yue et al., J Mol Biol, 2003
?
Colicine E
BF23
Chimento et al ., Acta Crystallogr
D Biol Crystallogr., 2003
Figure I-7 : Structure tridimentionnelle de 5 des 7 récepteurs TonB-dépendants
(TBDR) cristallisés à l’heure actuelle, par ordre de publication : (a) FhuA, (b) FepA,
(c) FecA et (d) BtuB d’Escherichia coli. (e) FpvA de Pseudomonas aeruginosa. De
gauche à droite, les colonnes représentent la vue de face du TBDR, le β-barrel seul,
le domaine plug seul, et le TBDR vu du côté extracellulaire. (D’après Wiener, 2005).
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
appelée cobalamine, présente des boucles extracellulaires plus petites (Figure I-7d), ce qui
faciliterait l’accès à son volumineux substrat (Fuller-Schaefer & Kadner, 2005).
Le domaine plug (en rouge sur la Figure I-5) forme un bouchon qui bloque le passage direct
du complexe fer-sidérophore. Ce domaine délimite donc 2 poches au sein du β-barrel, l’une
extracellulaire exposée au solvant, et l’autre exposée au périplasme. Il est lié au barrel par des
liaisons hydrogène. Il est constitué d’un cœur hydrophobe de 4 brins β parcouru d’hélices α, et de
3 boucles apicales du côté extracellulaire, qui contribuent à la fixation du substrat (Ferguson &
Deisenhofer, 2002 ; Wiener, 2005). De façon surprenante, des mutants de FhuA et FepA délétés
du domaine plug sont encore capables de transporter le complexe fer-sidérophore : l’interaction
entre la protéine membranaire TonB et le TBDR suffit à relarguer le complexe fer-sidérophore de
sa poche de fixation, et à réaliser sa translocation (Braun et al., 1999 ; Scott et al., 2001). Par
ailleurs, des protéines chimériques entre FhuA et FepA, dans lesquelles les domaines plug
(exprimés séparément du domaine barrel) ont été échangés, sont fonctionnelles. Ces protéines sont
alors spécifiques du substrat normal du β-barrel (Scott et al., 2001).
II.2.B. La protéine TonB et les autres protéines du système TonB
Contrairement à la membrane interne, il n’existe pas de force proton-motrice au niveau de la
membrane externe, ni de nucléotides triphosphate dans le périplasme. L’énergie nécessaire au
passage de cette membrane à travers les pores formés par le TBDR est apportée par la protéine
TonB, ancrée dans la membrane interne. Si les bactéries présentent plusieurs récepteurs TonBdépendants (9 chez E. coli), en revanche elles ne possèdent qu’un nombre limité de protéines
TonB (une seule chez E. coli).
De forme cylindrique, la protéine TonB est constituée de 2 monomères entrelacés. Bien que
la structure de la protéine TonB intacte ne soit pas connue, 3 structures différentes du domaine Cterminal ont été résolues : à partir des résidus 155 à 239, Chang et ses collaborateurs ont obtenu la
structure d’un dimère finement entrelacé (Chang et al., 2001) ; à partir des résidus 148 à 239,
Ködding et ses collaborateurs ont obtenu la structure d’un dimère relâché (Ködding et al., 2005) ;
enfin, à partir des résidus 103 à 239, Sean Peacock et ses collaborateurs ont obtenu la structure
d’un monomère (Sean Peacock et al., 2005). Un domaine C-terminal monomérique est constitué
de 2 hélices α, positionnées du même côté d’un feuillet β formé de 3 brins antiparallèles. Plus
récemment, TonB (résidus 33 à 239) a pu être cristallisée en complexe avec FhuA (résidus 1 à
725) (Pawelek et al., 2006) ; de la même manière, Shultis et ses collaborateurs ont obtenu la
structure de TonB (résidus 147 à 239) en complexe avec BtuB (Shultis et al., 2006). Dans les 2
cas, TonB occupe environ la moitié de la surface du TBDR exposée au périplasme.
31
A
ME
Périplasme
B
MI
TonB
ExbB
ExbD
Figure I-8 : (A) Topologie transmembranaire du domaine β-barrel du récepteur
TonB-dépendant FhuA, avec ses 22 segments transmembranaires, ses longues
boucles (L) exposées au solvant ainsi que ses coudes (T pour « turns »)
périplasmiques (D'après Ferduson et Deisenhofer, 2002).
(B) Topologie des 3 protéines du complexe TonB/ExbB/ExbD : TonB présente un
domaine transmembranaire et l’essentiel de la protéine est périplasmique ; ExbB
possède 3 segments transmembranaires et l’essentiel de la protéine est
cytoplasmique ; enfin, ExbD présente une topologie proche de celle de TonB. ME,
Membrane Externe ; MI, Membrane Interne. (D’après Postle et Kadner, 2003).
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
La protéine TonB interagit physiquement avec le TBDR au niveau de la TonB-box, petit
domaine du plug du TBDR, localisé dans la poche périplasmique. Il y a formation de ponts
disulfure entre des résidus cystéines de la TonB-box et des résidus de la région aromatique de 4
acides aminés (F180, F202, W213 et Y215) entourant l’acide aminé 160 de la protéine TonB de E.
coli (Cadieux & Kadner, 1999 ; Ghosh & Postle, 2004).
Par ailleurs, TonB doit sa stabilité et sa fonction biologique à son association avec 2 autres
protéines de la membrane interne, ExbB et ExbD (Figures I-5C et I-8B). Le domaine N-terminal
de ExbB est localisé dans le périplasme, 3 segments sont transmembranaires et l’essentiel de la
protéine est cytoplasmique. En revanche, tout comme TonB, ExbD est ancrée dans la membrane
interne par son domaine N-terminal et possède un domaine transmembranaire unique, l’essentiel
de la protéine étant périplasmique (Figure I-8B). En l’absence de ExbB et ExbD, les bactéries sont
résistantes aux colicines et bactériophages, et présentent une réduction de 90% du transport TonBdépendant ; dans ce cas, le transport résiduel est dû à la présence de 2 analogues fonctionnels à
ExbB et ExbD : TolQ et TolR (Postle & Kadner, 2003).
II.2.C. Le passage de la membrane externe
Le complexe TonB-ExbB-ExbD exploite la force proton-motrice de la membrane
cytoplasmique pour énergiser la membrane externe. La fixation du sidérophore à la poche
extracellulaire du TBDR induit une transition allostérique qui se propage jusqu’à la TonB-box,
signalant ainsi l’occupation du récepteur au complexe TonB-ExbB-ExbD, et facilitant
l’interaction entre TonB et le TBDR. Le complexe est alors relargué de sa poche de fixation,
initialisant sa translocation. Cependant, malgré les nombreuses études cristallographiques menées
sur différents TBDR, les modèles décrivant le passage du substrat restent à l’heure actuelle très
spéculatifs, comme attesté par la présence d’un paragraphe « Unanswered Questions » à la fin de
nombreuses publications.
Le mécanisme du transfert d’énergie entre le complexe TonB/ExbB/ExbD et le TBDR est
décrit dans le modèle « Tunnel » (Postle & Kadner, 2003). Selon ce modèle, TonB adopte de
façon cyclique 3 conformations différentes, schématisées sur la Figure I-9 : la conformation nonchargée, la conformation chargée et la conformation déchargée. En conformation initiale nonchargée, TonB est associée à ExbB et ExbD au niveau de la membrane plasmique. ExbB/D
utilisent la force proton-motrice pour faire passer TonB en conformation chargée ; les 167 acides
32
Figure I-9 : Le modèle « Tunnel » du tranfert d’énergie entre la protéine TonB et le
récepteur TonB-dépendant (TBDR) FepA.
Le passage d’un complexe fer-sidérophore à travers un TBDR nécessite une
interaction et un transfert d’énergie entre le complexe TonB-ExbB-ExbD, localisé
dans la membrane interne, et le TBDR. Pour cela, la protéine TonB adopte de façon
cyclique 3 conformations différentes : la conformation non-chargée, la conformation
chargée, et la conformation déchargée. Dans sa conformation chargée, TonB
s’associe à la membrane externe, ce qui induit un changement de conformation du
TBDR permettant la translocation du complexe fer-sidérophore. (D’après Postle et
Kadner, 2003).
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
aminés N-terminaux de la protéine TonB sont particulièrement importants pour cette étape
(Larsen et al., 1999). Le domaine C-terminal de TonB entre alors en contact avec la membrane
externe, puis le domaine N-terminal se dissocie de ExbB/D pour aller s’attacher à la membrane
externe (Figure I-9). Cela explique que TonB ait été retrouvée dans des fractions de membranes
internes, mais aussi externes, au cours de plusieurs expériences de fractionnement sur gradient de
saccharose. TonB reste en conformation chargée au niveau de la membrane externe jusqu’à la
fixation du complexe fer-sidérophore au récepteur. Celle-ci entraîne un changement de
conformation du TBDR, très net pour FhuA et FecA (Ferguson et al., 1998 ; Locher et al., 1998) ;
une hélice α particulière du plug (la « switch helix ») se détend, entraînant l’interaction de la
TonB-box avec l’acide aminé 160 de TonB (Cadieux & Kadner, 1999). C’est cette interaction
entre TonB et le TBDR qui relargue l’énergie stockée par TonB sous la forme d’une force
mécanique, faisant passer TonB en conformation déchargée. Enfin, TonB est recyclée au niveau
de la membrane interne par ExbB/D, et retrouve sa conformation initiale non chargée. C’est
précisément cette étape qui constitue l’objection majeure au modèle « Tunnel » : en effet, la
réinsertion du segment transmembranaire de TonB dans la membrane interne est une étape
thermodynamiquement défavorable. Il est donc possible que TonB ne se réinsère pas dans la
bicouche lipidique, et que seules les interactions avec ExbB et ExbD subsistent in vivo.
La nature de la source d’énergie premettant la tunnélisation de TonB est la boîte noire de ce
modèle. En l’absence de ExbB/D et de TolQ/R, TonB est trouvée exclusivement associée à la
membrane externe (Letain & Postle, 1997). Par conséquent, il est peu probable que seule la force
proton-motrice permette les changements de conformation de TonB et sa tunnélisation entre les 2
membranes. Ainsi, le mécanisme de transduction d’énergie pourrait hypothétiquement mettre en
jeu une hydrolyse d’ATP, ainsi qu’une protéine mystère qui transfèrerait l’énergie issue de cette
hydrolyse d’ATP à ExbB (en effet, ExbB ne possède pas dans sa séquence de motif de fixation à
l’ATP). Cependant, cette hypothèse n’a jamais été démontrée.
Les études cristallographiques menées sur différents TBDR suggèrent fortement que le
domaine plug doit être déplacé pour faire place à un canal d’au moins 10 Å et permettre ainsi le
passage du complexe fer-sidérophore, mais plusieurs théories mécanistiques co-existent encore à
l’heure actuelle : selon V. et M. Braun, il est peu probable que ce domaine soit intégralement
relargué du β-barrel, car cela impliquerait la rupture de plus de 60 liaisons hydrogène entre les 2
domaines (Braun & Braun, 2002). D’après ces auteurs, des changements structuraux coopératifs
suffiraient à déplacer légèrement le plug, permettant le passage du complexe fer-ferrichrome à
travers FhuA et FepA.
33
ME
Périplasme
MI
Cytoplasme
Figure I-10 : Les systèmes d’acquisition du fer de la bactérie modèle Escherichia coli. Au
niveau de la membrane externe (ME), les récepteurs TonB-dépendants sont spécifiques
d’un sidérophore donné ; en revanche, les transporteurs ABC, responsables du passage
de la membrane interne (MI), et notamment les protéines périplasmiques de ces
systèmes, peuvent transporter plusieurs types de complexes fer-sidérophore.
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
Cette théorie n’est pas exlue par Usher et ses collaborateurs, mais ces derniers envisagent
aussi fortement que le domaine plug intact soit expulsé dans le cytoplasme lors du transport à
travers FepA (Usher et al., 2001). Cette expulsion du domaine plug de FepA a été récemment
démontrée sous le nom de théorie « ball-and-chain » (Ma et al., 2007).
FepA serait-il le seul à procéder par un mécanisme d’expulsion du plug ? Un tel mécanisme,
à l’origine, permettait d’expliquer le passage de grosses molécules telles que l’ADN de
bactériophages. Mais on sait à l’heure actuelle que, par exemple, le TBDR FhuA sert de site
d’adhésion au phage T5 mais que la molécule d’ADN double-brin ne passe pas à travers FhuA
(Böhm et al., 2001 ; Plançon et al., 2002). Enfin, l’éjection totale du plug laisserait un pore ouvert
de plus de 35 Å de diamètre dans la membrane externe, ce qui augmenterait dangereusement la
perméabilité membranaire. Concernant FhuA, il a été proposé que des molécules d’eau à
l’interface entre le barrel et le plug faciliteraient l’éjection totale ou partielle du plug : ces
molécules lubrifiantes fourniraient de nouveaux sites pour les liaisons hydrogène, abaissant ainsi
la quantité d’énergie nécessaire à la dissociation du domaine plug (Faraldo-Gómez et al., 2003).
Pourtant, les données récentes de structure de TonB en complexe avec FhuA ou BtuB ont montré
qu’il se forme, entre la TonB-box du TBDR et le domaine C-terminal de TonB, un feuillet β
interprotéique qui résulte en un dépliement local du plug, vraisemblablement suffisant pour le
passage du complexe fer-sidérophore (Pawelek et al., 2006 ; Shultis et al., 2006). Des expériences
dynamiques menées récemment sur BtuB confirment qu’un dépliement complexe du domaine
plug a lieu plutôt que son éjection dans le périplasme (Gumbart et al., 2007).
II.2.D. Le passage de la membrane interne
Pour le passage de la membrane interne, les complexes fer-sidérophore sont pris en charge
par un transporteur ABC (cf. § I.2.A. et Figure I-5C). La protéine SBP (Solute Binding protein) du
complexe ABC est spécifique d’un type de sidérophore (catécholate, carboxylate ou
hydroxamate), contrairement au TBDR qui est spécifique d’un sidérophore donné. Par
conséquent, un même transporteur ABC peut transporter différents types de complexes fersidérophore, ayant été conduits dans le périplasme par différents TBDR (Ferguson & Deisenhofer,
2004). La Figure I-10 illustre les systèmes de transport des différents complexes fer-sidérophore
chez Escherichia coli. La protéine SBP assure l’unidirectionnalité du transport, retenant le
complexe fer-sidérophore dans le périplasme.
Plusieurs études suggèrent que le mécanisme du passage de complexes fer-sidérophore à
travers un transporteur ABC diffère de celui des sucres ou des acides aminés. La protéine
périplasmique FhuD peut fixer à sa surface tous les sidérophores de type hydroxamate
34
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
(ferrichrome, ferrioxamine B, coprogène ou aérobactine). Elle conduit ces substrats à la protéine
membranaire FhuB en complexe avec l’ATPase FhuC (Figure I-10). La structure
cristallographique de FhuD en complexe avec différents sidérophores a été déterminée (Clarke et
al., 2000 ; Clarke et al., 2002), et suggère que FhuD s’insère profondément dans le pore formé par
FhuB, jusqu’au site de fixation des domaines ABC de FhuC. Il est donc très probable que
l’hydrolyse d’ATP résulte d’un contact entre FhuD et FhuC, qui peut être direct ou facilité par un
petit domaine de FhuB. Ce mécanisme diffère de celui du transporteur ABC du maltose d’E. coli,
dans lequel c’est la transduction d’un signal transmembranaire qui conduit à l’hydrolyse d’ATP.
Dans le cytoplasme, le fer se dissocie du sidérophore par un mécanisme encore mal connu à
l’heure actuelle. Les ions ferriques Fe3+ sont réduits en ions ferreux Fe2+ par des donneurs
d’électrons intracellulaires (NADH et NADPH), ou par des réductases spécifiques de
sidérophores. La dissociation du complexe a alors lieu spontanément, car l’affinité du sidérophore
est bien plus faible pour les ions ferreux. La première démonstration de l’existence de réductases
spécifiques de sidérophores de type hydroxamate a permis de montrer que, chez E. coli, FhuF est
une protéine cytoplasmique impliquée dans la dissociation des complexes fer-coprogène, ferferrichrome et fer-ferrioxamine B (Matzanke et al., 2004).
Après dissociation, le sidérophore peut être recyclé ou bien hydrolysé par des enzymes
spécifiques. Par exemple, la protéine Fes d’E. coli est une estérase entérobactine-spécifique, qui
hydrolyse ce sidérophore trimérique cyclique en trimères linéaires, dimères et monomères de 2,3dihydroxybenzoylsérine (Brickman & McIntosh, 1992). Chez Erwinia chrysanthemi, une enzyme
Fes-like est impliquée dans l’acquisition des complexes fer-chrysobactine (Rauscher et al., 2002).
II.3. La régulation de l’acquisition du fer
II.3.A. La protéine régulatrice Fur
Bien que le fer soit indispensable aux bactéries, un excès en fer peut en revanche être
toxique : la réduction du fer ferrique en fer ferreux en présence de péroxyde d’hydrogène H202
s’accompagne de la production d’espèces réduites de l’oxygène, de radicaux superoxydes O2°- et
hydroxyles OH° selon le mécanisme suivant (Braun, 1997) :
Fe2+ + H2O2
Fe3+ + OH° + OH- (Réaction de Fenton)
Fe3+ + O2°-
Fe2+ + O2
O2°- + H2O2
O2 + OH° + OH- (Réaction de Haber-Weiss)
35
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
C’est notamment le radical hydroxyle qui est très toxique, pouvant entraîner des
modifications de différents composants cellulaires tels que l’ADN, les protéines, les lipides et les
glucides. Le dilemme est donc le suivant : les bactéries doivent acquérir suffisamment de fer pour
subvenir à leurs besoins vitaux, mais elles doivent également éviter une trop forte accumulation de
fer pour empêcher tout effet toxique.
L’homéostasie cellulaire du fer chez les bactéries à Gram négatif est contrôlée par la
protéine Fur, un régulateur transcriptionnel qui utilise les ions Fe2+ comme co-répresseurs. Si le
fer est présent en quantité suffisante dans le cytoplasme de la bactérie, Fur s’associe aux ions Fe2+,
ce qui induit un changement de conformation de la protéine et sa fixation, sous la forme d’un
dimère, aux promoteurs des gènes régulés par le statut en fer, au niveau d’un motif nucléique très
conservé appelé Fur-box (Bagg & Neilands, 1987) (Figure I-5C). En revanche, dans des
conditions de carence en fer, la protéine Fur reste libre, l’opérateur est donc accessible, ce qui
permet la transcription des gènes impliqués dans l’acquisition et le stockage du fer. Le domaine Cterminal de Fur est impliqué dans la dimérisation de la protéine, et le domaine C-terminal dans la
fixation à l’ADN (Stojiljkovic & Hantke, 1995).
La Fur-box est un motif de 19 paires de bases, de séquence palindromique
[GATAATGATAATCATTATC] chez E. coli (Calderwood & Mekalanos, 1988 ; de Lorenzo et
al., 1988), plus ou moins conservée chez les différentes espèces bactériennes. La structure de la
Fur-box peut être interprétée de différentes façons : une séquence palindromique de type 9-1-9 ou
une triple répétition d’un hexamère (6-6-6) chez E. coli, ou encore deux séquences chevauchantes
répétées inversées (7-1-7) chez Bacillus subtilis (Baichoo & Helmann, 2002 ; Lavrrar &
McIntosh, 2003).
En fonction des bactéries, le régulon de Fur est constitué de 50 à 100 gènes, principalement
impliqués dans l’acquisition du fer et de l’hème (Wandersman & Delepelaire, 2004). Les
récepteurs TonB-dépendants impliqués dans le transport du fer sont sous le contrôle de la protéine
Fur, qu’il soient « transducters » ou non (Schalk et al., 2004).
La principale activité de Fur est donc la répression. Une régulation positive directe par Fur
n’a été rapportée que dans le cas des gènes norB, pan1 et nuoA de la bactérie Neisseria
meningitidis, codant pour des protéines impliquées dans la respiration aérobie et anaérobie ; la
protéine se fixe dans ce cas au niveau de sites opérateurs distincts de la Fur-box (Delany et al.,
2004). De nombreux gènes positivement régulés par Fur ont pu être identifiés par
transcriptomique, mais il s’agit dans la grande majorité des cas d’effets indirects que de telles
approches globales sont incapables de différencier des effets directs.
36
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
Dans des conditions de stress oxydatif, E. coli réprime ses systèmes d’acquisition du fer via
une activation de Fur par les régulateurs OxyR et SoxRS (Zheng et al., 1999).
Le régulon de Fur en présence de fer a été déterminé chez de nombreuses espèces
bactériennes ; ces travaux ont permis de montrer l’implication de ce régulateur dans des processus
cellulaires très variés tels que la réponse au stress oxydatif, la production de facteurs de virulence,
la résistance au choc acide (Baichoo & Helmann, 2002 ; McHugh et al., 2003 ; Vasil & Ochsner,
1999), certaines voies métaboliques (Hantke, 1987 ; Stojiljkovic et al., 1994), la chimiotaxie
(Karjalainen et al., 1991), la régulation de la réponse aux espèces réactives de l’azote (D'Autreaux
et al., 2002), ou encore le swarming (McCarter & Silverman, 1989). L’importance quantitative et
qualitative du régulon de Fur chez les bactéries explique en partie que cette protéine participe à la
virulence de nombreuses espèces pathogènes d’animaux (Litwin & Calderwood, 1993) ou de
végétaux telles qu’Erwinia chrysanthemi (Franza et al., 1999).
Chez les Rhizobia (terme générique regroupant les genres bactériens Rhizobium,
Sinorhizobium, Mesorhizobium, Bradyrhizobium et Burkholderia), la régulation de l’utilisation du
fer est partiellement différente, dans la mesure où d’autres régulateurs viennent compléter ou
remplacer l’action de Fur : RirA (qui n’appartient pas à la famille Fur), Irr et Mur (deux membres
de la famille Fur) régulent de façon positive ou négative de nombreux gènes impliqués dans
l’acquisition du fer. Ainsi, chez Sinorhizobium meliloti, Fur ne régule qu’un petit nombre de
gènes, parmi lesquels seul l’opéron sitABCD est impliqué dans le transport de métaux (fer et
manganèse), avec une affinité vraisemblablement meilleure pour le manganèse. Cette protéine
Fur-like a donc été renommée Mur (Manganese uptake regulator) (Rudolph et al., 2006).
Chez Bradyrhizobium japonicum, Fur peut se fixer sur 2 séquences régulatrices : une Furbox classique (sur laquelle se fixent 2 dimères de Fur), ainsi qu’une autre séquence très différente
localisée dans le promoteur du gène codant pour le régulateur Irr. Dans les 2 cas, la protéine
reconnaît 2 séquences répétées directes. Au niveau du promoteur de irr, Fur se fixerait sous la
forme d’un dimère, d’un tétramère ou encore de 2 dimères (Friedman & O'Brian, 2003).
II.3.B. La cascade de signalisation transducer / facteur anti-sigma / facteur sigma
Comme mentionné dans le § II.2.A., il existe une sous-classe de TBDR possédant une
extension N-terminale. Ces récepteurs sont des transporteurs, mais sont également impliqués dans
la signalisation transmembranaire, d’où leur dénomination de « TonB-dependent transducers »
(Koebnik, 2005). Parmi les TBDR dont la structure cristallographique est disponible, FpvA de P.
aeruginosa et FecA d’E. coli appartiennent à cette classe particulière.
37
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
Chez E. coli, le gène fecA est précédé des gènes fecI et fecR, transcrits en opéron. Le gène
fecI code pour un facteur sigma de la famille ECF (Extracellular Cytoplasmic Function), le gène
fecR pour un facteur anti-sigma. La fixation du complexe fer-dicitrate au TBDR induit une
interaction entre l’extension N-terminale du TBDR et le senseur transmembranaire FecR.
L’occupation du récepteur est alors signalée à la membrane interne. FecR va ensuite interagir avec
le facteur sigma FecI, ce qui va activer ce dernier. FecR ne peut donc pas être considéré comme
un facteur anti-sigma classique dans la mesure où il active FecI. Le facteur sigma FecI, en retour,
s’associe à l’enzyme cœur de l’ARN polymérase, permettant la transcription de l’opéron
fecABCDE, codant pour le TBDR et le transporteur ABC du complexe fer-dicitrate (Braun et al.,
2003). Le mécanisme général de cette cascade de signalisation est illustré sur la Figure I-5C. De
façon intéressante, le transport du complexe n’est pas nécessaire à l’activation de cette cascade de
signalisation (Härle et al., 1995), mais celle-ci suit tout de même un mécanisme actif et TonBdépendant (Kim et al., 1997). En présence de fer, fecI et fecR sont également régulés par la
protéine Fur. En condition de carence en fer, l’opéron fecIR est déréprimé, donc transcrit, mais
l’opéron fecABCDE reste en attente. L’induction de la transcription de ces gènes nécessite la
fixation du substrat adéquat (diferric dicitrate) au TBDR FecA (jusque-là exprimé à un niveau de
base), via la cascade de signalisation FecR/FecI (Braun & Endriß, 2007).
Plusieurs études antérieures tendaient à montrer que seuls les récepteurs de la famille
« Transducers » étaient capables de fixer leur sidérophore dans sa forme non liée au fer (« aposidérophore »). La fluorescence de la pyoverdine avait notamment été exploitée pour démontrer
que, en condition de carence en fer, 100% des récepteurs FpvA présents à la surface de la bactérie
étaient fixés à de la pyoverdine non liée à des ions Fe3+ (Schalk et al., 2001). De même, Yue et ses
collaborateurs avaient montré qu’en condition de limitation en fer, FecA était fixé au dicitrate non
lié au fer (Yue et al., 2003). Dans les 2 cas, il était tout de même prouvé que seule la forme fersidérophore pouvait être transportée par le TBDR.
Plus récemment, il a été montré que cette propriété était en réalité partagée par les TBDR
conventionnels FhuA d’E. coli et FptA de P. aeruginosa (Hoegy et al., 2005), l’affinité du
récepteur pour la forme apo-sidérophore étant toutefois inférieure à l’affinité pour la forme liée au
fer. Comment le récepteur, dans son état normal fixé à son apo-sidérophore, fixe-t-il le fer ? Deux
possibilités sont envisageables : (i) le sidérophore se désolidarise du TBDR et va rivaliser avec les
autres sidérophores du milieu extracellulaire pour la fixation au fer. Ce mécanisme a été décrit
dans le cas du complexe FpvA/pyoverdine. (ii) Le complexe TBDR/sidérophore fixe directement
le fer.
38
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
Le fait que des TBDR conventionnels partagent la capacité de fixer une forme aposidérophore prouve donc que cette propriété n’est pas impliquée dans l’activation de la cascade de
signalisation/régulation précédemment décrite, mais la signification biologique précise de cette
propriété n’est pas connue à l’heure actuelle.
Une analyse globale des récepteurs TonB-dépendants de type « transducers » chez 208
espèces bactériennes à Gram négatif a révélé que, sur 84 génomes contenant des TBDR,
seulement 26 possèdent des transducers, et de façon minoritaire (1 à 6 par protéome). De plus, il
existe une corrélation entre le nombre de transducers et le nombre de facteurs anti-sigma du
génome. Dans 90% des cas, les facteurs sigma et anti-sigma sont codés par des gènes adjacents.
Dans les 10% restant, on trouve entre le facteur sigma et le facteur anti-sigma des gènes codant
pour des systèmes ABC ou des gènes impliqués dans la biosynthèse de sidérophore (Koebnik,
2005).
III. Les autres fonctions connues du système TonB
III.1. Site d’adhésion pour les colicines et les bactériophages
Certains agents infectieux tels que les bactériophages ont développé le moyen de parasiter le
système TonB bactérien. Le premier TBDR largement étudié aux balbutiements de la biologie
moléculaire, FhuA, avait été initialement nommé TonA (pour phage T one), car une mutation dans
le gène correspondant, tonA, conférait à la bactérie la résistance au phage T1. Le second locus
présentant la même caractéristique a été appelé tonB (Braun & Braun, 2002).
Des mutants dans le système TonB sont dans certains cas résistants à des bactériophages
et/ou à un groupe de toxines connues sous le nom de colicines (Cao & Klebba, 2002). Le TBDR
FhuA, par exemple, sert de récepteur à la colicine M, la toxine peptidique J25, ainsi qu’aux
phages T1, T5, φ80 et UC-1. Les colicines sont des protéines toxiques produites par certaines
souches d’Escherichia coli, dirigées contre des souches sensibles de cette bactérie. Leur structure,
leur biosynthèse et sa régulation, leur sécrétion et leur import sont synthétisés dans la revue
(Cascales et al., 2007). Le Tableau I-8 liste les TBDR pour lesquels la propriété de récepteur de
phages et/ou de colicines a été rapportée.
39
A
Xanthomonas campestris
pv. campestris
Ralstonia solanacearum
Signal Plante
TonB
ExbB
ExbD
TonB
PrhA
ExbB
ExbD2
ExbD1
TBDR ?
B
PrhR
HR
Acquisition du fer
Maladie
HR
Découplage
Acquisition
du fer
Réaction
Hypersensible
PrhI
ARN Pol
PrhJ
HrpG
HrpB
Souche hrpB::gfp en coculture avec des cellules
d’Arabidopsis thaliana
HrpB
PIP-box
hrpII-box
gènes hrp,
effecteurs…
Figure I-11 : Les particularités du systèmes TonB de deux bactéries phytopathogènes :
(A) Xanthomonas campestris pv. campestris. Cette bactérie présente deux copies du
gène exbD : exbD1 et exbD2. Le gène exbD2 n’est pas important pour l’acquisition du
fer ni la mise en place du pouvoir pathogène, mais est indispensable à l’induction d’une
Réaction Hypersensible (HR) sur une plante non-hôte ou une plante résistante. (B)
Ralstonia solanacearum. Chez cette bactérie, PrhA est un récepteur TonB-dépendant
spécifiquement impliqué dans la perception d’un signal de la plante. Le contact entre les
bactéries et des cellules végétales déclenche une cascade de signalisation conduisant
à l’induction des gènes hrp codant pour le système de sécrétion de type III, déterminant
majeur du pouvoir pathogène de la bactérie.
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
III.2. Rôle du fer et/ou du système TonB dans les interactions bactéries-plantes
III.2.A. Importance du fer dans le pouvoir pathogène
En tant que co-facteur de nombreux processus cellulaires, le fer contribue à l’adaptation de
la bactérie au cours de son cycle de vie et a donc un rôle indirect dans le pouvoir pathogène. En
particulier, le fer peut être un facteur limitant la croissance de la bactérie dans les fluides
apoplastique et vasculaire de la plante (Expert et al., 1996). Ainsi, des pathogènes animaux et
végétaux altérés dans leurs outils génétiques de production de sidérophores, d’acquisition des
complexes fer-sidérophore ou de régulation de la capture du fer, sont hypovirulents.
Chez Erwinia chrysanthemi, des mutants non producteurs de chrysobactine ou
d’achromobactine (deux sidérophores produits par la bactérie) sont très affectés dans leur pouvoir
pathogène (Enard et al., 1988 ; Franza et al., 2005). Par ailleurs, l’expression de gènes codant
pour certaines pectates lyases (pelB, C, D et E) d’E. chrysanthemi, facteurs de virulence majeurs
de la bactérie, est induite lors d’une carence en fer, et réprimée par la protéine Fur en présence de
fer dans le milieu (Franza et al., 1999 ; Franza et al., 2002). Ce couplage entre deux fonctions
essentielles au pouvoir pathogène de la bactérie, la production d’enzymes pectinolytiques et
l’acquisition du fer, confère un avantage à la bactérie au cours du processus d’infection. Enfin,
comme mentionné précédemment, un mutant fur d’ E. chrysanthemi est affecté dans son pouvoir
pathogène (Franza et al., 1999).
III.2.B. Xanthomonas campestris pv. campestris : un système TonB différent
Chez Xcc, le système TonB est particulier car la bactérie possède 2 copies du gène exbD :
exbD1 et exbD2. Une telle structure n’a à l’heure actuelle jamais été identifiée chez une autre
espèce bactérienne. Les protéines codées par ces 2 gènes présentent 38,2% d’identité et 71,3% de
similarité. Les protéines TonB, ExbB et ExbD1 sont toutes 3 importantes pour l’acquisition du fer,
la virulence et la croissance des bactéries dans une plante hôte (le chou-fleur), tandis que la
protéine ExbD2 ne l’est pas (Wiggerich & Pühler, 1997 ; Wiggerich et al., 2000). En revanche, et
de façon très intéressante, les 4 protéines sont nécessaires à l’induction d’une réaction
hypersensible (HR) sur une plante non-hôte, le poivron. Chez Xcc, la présence du gène exbD2
élargit donc le spectre de rôles du système TonB et révèle que la fonction de capture du fer et la
HR sont des processus indépendants (Figure I-11A).
40
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
III.2.C. Ralstonia solanacearum : PrhA et la signalisation du pouvoir pathogène
La bactérie phytopathogène Ralstonia solanacearum possède 15 récepteurs TonBdépendants. L’un d’entre eux, PrhA (Plant regulator of hrp genes), a été particulièrement étudié :
le gène prhA est situé en amont du cluster hrp codant pour le système de sécrétion de type III de la
bactérie, mais n’est pas régulé par la protéine régulatrice HrpB. PrhA contrôle les interactions
compatibles et incompatibles, dans la mesure où un mutant dans le gène prhA est hypoagressif sur
la plante hôte Arabidopsis thaliana et produit une HR très réduite sur une plante non-hôte, le
tabac. Par ailleurs, l’induction spécifique des gènes hrp lors d’une co-culture avec des cellules
d’A. thaliana requiert la présence de PrhA. Cette régulation est strictement dépendante de la
présence des cellules végétales, dans la mesure où PrhA n’est pas nécessaire à l’induction des
gènes hrp en milieu minimum, sensé mimer les conditions rencontrées in planta par les bactéries
(Marenda et al., 1998) (Figure I-11B).
La protéine PrhA possède une extension N-terminale, et appartient donc à la sous-famille
des TBDR de type transducers. L’induction des gènes hrp lors d’un contact avec des cellules
végétales résulte de l’interaction de PrhA avec le facteur anti-sigma PrhR et le facteur sigma PrhI,
par un mécanisme de signalisation similaire à FecA/FecIR (Brito et al., 1999) (Figure I-11B).
Grâce à l’utilisation de fusions transcriptionnelles entre des gènes hrp et la protéine GFP (Green
Fluorescent Protein), il a été montré que l’expression de ces gènes est induite lors d’un contact
entre la bactérie et la cellule végétale (Figure I-11B) (Aldon et al., 2000). Pour résumer, le contact
et la présence de PrhA sont tous deux nécessaires à l’induction spécifique des gènes hrp chez R.
solanacearum. Bien qu’il semble que PrhA soit dévoué à une fonction signalétique, le transport de
molécules végétales à travers ce TBDR ne peut pas être tout à fait exclu.
III.2.D. Bradyrhizobium japonicum et la symbiose fixatrice d’azote
Chez les rhizobia de l’espèce B. japonicum, FegA est un TBDR co-transcrit avec FegB, une
protéine inconnue de la membrane interne. Cet opéron est nécessaire à l’utilisation du ferrichrome
chez cette bactérie, mais aussi et surtout à l’efficacité de la symbiose : en effet, l’inoculation de
plants de soja avec un mutant fegAB résulte en l’apparition de nodules dépourvus de
leghémoglobine et non fixateurs d’azote. Ces phénotypes sont complémentés par apport de la
protéine FegA seule, soulignant l’importance de ce TBDR dans l’établissement de la symbiose.
Dans la mesure où le ferrichrome est un sidérophore fongique probablement absent des nodules,
les auteurs suggèrent fortement que ce TBDR pourrait avoir un rôle in planta distinct du transport
de ferrichrome. Ainsi, ce TBDR (qui possède une extension N-terminale) pourrait intervenir en
amont d’une étape critique pour l’établissement de la symbiose, dans la perception d’un composé
41
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
végétal de façon similaire à PrhA de R. solanacearum (Benson et al., 2005). Ces résultats
suggèrent que le système TonB pourrait avoir un rôle important dans le processus de la symbiose
fixatrice d’azote ; toutefois, cette hypothèse n’est pas clairement démontrée à l’heure actuelle.
III.3. Des TBDR potentiellement impliqués dans le transport de carbohydrates
Depuis 2004, de nombreuses études, menées chez des espèces bactériennes très différentes
les unes des autres, suggèrent l’implication de TBDR dans des voies de signalisation ou des
processus métaboliques très différents de l’acquisition du fer.
III.3.A. TBDR de bactéries ubiquistes
Les Sphingomonades sont des bactéries très largement présentes dans la nature, ayant été
isolées de différentes niches écologiques terrestres, aquatiques et humaines. Ces bactéries sont
surtout connues pour leur capacité à dégrader un très grand nombre de composés de
l’environnement, notamment des polluants tels que les Polyethylène Glycols (PEGs), polymères
très utilisés dans l’industrie en tant que surfactants ou lubrifiants. L’opéron pegBCDAE de
Sphingopyxis macrogoltabida code pour un TBDR (PegB), une PEG-aldéhyde deshydrogénase,
une perméase, une PEG-déshydrogénase et une acyl-CoA ligase. L’expression de l’opéron peg est
activée par des polymères d’éthylène glycols de 4000 à 20000 Da, mais pas par les glycols à
courte chaîne (monomère à tétramère). De plus, cet opéron est réprimé par le régulateur PegR, de
la famille AraC (Tani et al., 2007). Le rôle du TBDR dans le transport de PEG est postulé mais
non démontré.
Les Sphingomonades diffèrent des autres bactéries à Gram négatif par la structure de leur
membrane externe, dans laquelle les lipopolysaccharides (LPS) sont remplacés par des
glycosphingolipides. La souche Sphingomonas sp. A1 assimile l’alginate via une sorte de puits ou
d’entonnoir de 0,02 à 0,1 µM, appelé « pit » ou « super-channel », qui n’est visible à sa surface
qu’en présence d’alginate dans le milieu. Une étude protéomique a permis d’identifier 8 protéines
surexprimées dans la membrane externe lors d’une culture en présence d’alginate : 4 TBDR, 2
flagellines, une lipoprotéine et une « granule-binding protein ». Les auteurs proposent que les
TBDR pourraient jouer un rôle structural majeur au sein du « pit ». De plus, des mutants dans
chacun des 4 gènes TBDR correspondant sont affectés dans la croissance sur alginate, suggérant
un rôle dans l’utilisation de cette molécule (Hashimoto et al., 2004 ; Hashimoto et al., 2005a ;
Hashimoto et al., 2005b).
42
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
III.3.B. TBDR de bactéries symbiotiques ou pathogènes de l’Homme
Le génome de la bactérie symbiotique du colon humain Bacteroides thetaïotaomicron
comporte un vaste ensemble de gènes codant pour des protéines de dégradation des polymères de
glucose, l’amidon notamment. Le cluster sus est transcrit en 2 opérons distincts (susA et susB-G),
et ces 2 opérons sont régulés positivement par les régulateurs SusR (D'Elia & Salyers, 1996) et
MalR (Cho et al., 2001). Ce cluster comporte 4 protéines de la membrane externe (SusC, SusD,
SusE et SusF), et 3 enzymes de dégradation de l’amidon (SusA, SusB et SusG). Les auteurs
qualifient SusC de porine, mais il s’agit en réalité d’un TBDR qui en possède tous les domaines
caractéristiques. Un mutant dans le gène susC pousse difficilement sur maltose et maltotriose, et
ne pousse plus du tout sur des maltodextrines de degré de polymérisation (DP) supérieur à 2,
suggérant que ce TBDR serait impliqué dans le transport de maltodextrines (Reeves et al., 1996).
L’expression de ce TBDR et de la protéine réceptrice SusD est spécifiquement induite par
l’amidon et il a été montré que les 3 protéines SusC, SusD et SusE interagissent dans la membrane
externe, permettant la fixation de l’amidon (Shipman et al., 2000). Le cluster sus est partiellement
conservé chez le pathogène opportuniste Bacteriodes fragilis ; le TBDR fait partie d’un locus de 4
gènes, osuABCD, activé par le régulateur OsuR situé juste en amont du locus. Il a été montré que
ce locus est impliqué dans l’utilisation de l’amidon chez B. fragilis, mais aussi dans la réponse au
stress oxydatif (Spence et al., 2006).
Chez la bactérie pathogène de la cavité bucale Porphyromonas gingivalis, l’opéron ragAB
code pour un TBDR (RagA) et un antigène immunodominant (RagB). Ces 2 protéines présentent
de fortes homologies avec les protéines SusC et SusD de B. thetaïotaomicron. De façon
intéressante, un mutant polaire dans ragA est considérablement affecté dans sa virulence sur la
souris ; il en est de même pour un mutant dans le gène ragB, chez qui le phénotype est toutefois
moins marqué. Les auteurs concluent sur une possible implication de ces protéines dans le
transport d’une macromolécule inconnue nécessaire à la survie ou à la dissémination des bactéries
dans la souris (Shi et al., 2007).
III.3.C. TBDR de bactéries de l’environnement terrestre
Chez Azospirillum irakense, espèce fixatrice d’azote de la rhizosphère, l’opéron salCAB
code pour un récepteur TonB-dépendant (SalC) et deux β-glucosidases (SalA et SalB), dont au
moins une est nécessaire à l’utilisation par la bactérie d’un β-glucoside particulier, la salicine.
L’opéron salAB est sous le contrôle du régulateur SalR, membre de la famille des régulateurs
transcriptionnels LacI. Les auteurs (Faure et al., 2001) proposent un modèle dans lequel SalC
43
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
interviendrait dans le transport de la salicine à travers la membrane externe de la bactérie, mais
aucun résultat démontrant ce modèle n’a été publié à l’heure actuelle.
Chez la bactérie saprophyte du sol Pseudomonas putida, le cluster ats-sft comporte des
gènes codant pour un transporteur ABC (atsRBC), un régulateur de la famille LysR (sftR), une
alkylsulfatase oxygénolytique (atsK), une arylsulfotransferase (astA) et un TBDR (sftP). La
protéine SftR régule les 3 opérons atsBC, atsRK et sftP–astA. Il a été montré que la biosynthèse
du TBDR SftP est induite par la présence d’hexylsulfate et que la protéine est bien localisée dans
la membrane externe des bactéries (Kahnert et al., 2002). Une fois encore, les auteurs proposent
que ce TBDR pourrait être impliqué dans le transport d’esters sulfatés, mais cela n’est pas
démontré à l’heure actuelle.
III.3.D. TBDR de bactéries aquatiques et/ou marines
Récemment, Yang et ses collaborateurs ont étudié les voies de régulation de l’utilisation de
la N-acétylglucosamine chez la bactérie marine Shewanella oneidensis par génomique
comparative (Yang et al., 2006). Cette étude in silico a conduit à l’identification de 3 régulateurs,
NagC, NagR et NagQ, ainsi qu’à la prédiction de motifs de régulation dans certains promoteurs et
à la caractérisation des régulons putatifs. Ainsi, un ou plusieurs TBDR pourraient appartenir à ces
régulons, et par conséquent intervenir dans des voies d’utilisation de chito-oligosaccharides chez
S. oneidensis ainsi que chez d’autres espèces appartenant aux groupes des Alteromonadales (telles
que Colwellia psycherythraea) ou des Xanthomonadales (telles que Xanthomonas axonopodis).
Chez la bactérie aquatique et oligotrophique Caulobacter crescentus, des études de
transcriptomique ont montré que 9 TBDR sont spécifiquement induits par le xylose, un composant
de la paroi des végétaux. Il est suggéré que ces récepteurs pourraient participer à l’import de
débris végétaux présents dans le milieu aquatique dans lequel évolue la bactérie (Hottes et al.,
2004).
La première étude démontrant sans ambiguïté le transport par un TBDR de composés autres
que les complexes fer-sidérophore, certains antibiotiques ou la vitamine B12, a été publiée au
cours de cette thèse par l’équipe de V. Braun : chez Caulobacter crescentus, le TBDR MalA
transporte des produits de dégradation de l’amidon. Par protéomique, les auteurs ont montré que la
protéine est présente dans la membrane externe de la bactérie, et que sa biosynthèse est induite par
l’amidon. Un mutant dans le gène malA est partiellement affecté dans sa croissance sur
maltodextrines, cette altération étant totale pour un degré de polymérisation (DP) supérieur ou
44
Chapitre I : Etude systématique des récepteurs TonB-dépendants de Xcc
égal à 5. Par ailleurs, des expériences de transport utilisant des molécules marquées au Carbone 14
ont permis de montrer que MalA transporte le maltose et les maltodextrines de DP≥5 par un
mécanisme actif, ExbB-D dépendant et TonB indépendant (Neugebauer et al., 2005).
RESULTATS : Etude systématique
Xanthomonas campestris pv. campestris
des
récepteurs
TonB-dépendants
de
L’étude approfondie du génome de Xcc a permis d’identifier 72 gènes codant pour des
récepteurs TonB-dépendants. Ce nombre est très élevé par comparaison avec les autres bactéries
dont les génomes sont séquencés. Nous avons donc entrepris l’analyse fonctionnelle de ces 72
TBDR, avec l’hypothèse qu’ils pourraient jouer un rôle dans l’import de nutriments organiques.
Nous avons ainsi pu montrer que, chez Xcc, seulement 9 gènes TBDR sont surexprimés en
condition de carence en fer, et que ces 9 gènes sont réprimés par la protéine régulatrice Fur. En
revanche, l’expression de plusieurs gènes TBDR est spécifiquement induite par des molécules
d’origine végétale telles que le saccharose, un sucre majeur chez les végétaux, ou encore des
constituants complexes de la paroi végétale. Parmi ces gènes, certains sont présents dans le
génome au sein de clusters potentiellement impliqués dans le transport et la dégradation de ces
molécules végétales ; ces observations nous ont conduit à définir un nouveau concept, celui de
« CUT loci » (Carbohydrate Utilization containing TBDR loci). Notre étude montre la
fonctionnalité d’un CUT locus, désigné sux (sucrose utilization in Xanthomonas), impliqué dans le
métabolisme du saccharose, au sein duquel le TBDR transporte ce sucre à travers la membrane
externe de la bactérie avec une efficacité remarquable. De façon très intéressante, le locus sux
contrôle le pouvoir pathogène de Xcc sur Arabidopsis thaliana, suggérant que l’acquisition de
saccharose à très haute affinité constitue une étape critique dans le cycle infectieux de cette
bactérie.
Enfin, nous avons réalisé une analyse du génome de 226 bactéries à Gram négatif. Les
résultats obtenus montrent que certains CUT loci de Xcc sont partiellement conservés chez
différentes bactéries de l’environnement, qui présentent également une sur-représentation du
nombre de TBDR. Ces analyses suggèrent fortement que les récepteurs TonB-dépendants
pourraient jouer un rôle majeur dans le transport de différentes molécules chez des bactéries en
interaction avec les plantes, mais également chez d’autres bactéries aux modes de vie très
différents.
Ces travaux sont regroupés dans un article récemment publié, et présenté ci-après.
45
Plant Carbohydrate Scavenging through TonBDependent Receptors: A Feature Shared by
Phytopathogenic and Aquatic Bacteria
Servane Blanvillain1., Damien Meyer1.¤a, Alice Boulanger1, Martine Lautier1,2, Catherine Guynet1¤b, Nicolas Denancé1¤c, Jacques Vasse1,
Emmanuelle Lauber1.*, Matthieu Arlat1,2.*
1 Laboratoire des Interactions Plantes-Microorganismes, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)/Institut National de la Recherche
Agronomique (INRA) UMR2594/441, Castanet-Tolosan, France, 2 Université Paul Sabatier, Toulouse III, Toulouse, France
TonB-dependent receptors (TBDRs) are outer membrane proteins mainly known for the active transport of iron siderophore
complexes in Gram-negative bacteria. Analysis of the genome of the phytopathogenic bacterium Xanthomonas campestris pv.
campestris (Xcc), predicts 72 TBDRs. Such an overrepresentation is common in Xanthomonas species but is limited to only
a small number of bacteria. Here, we show that one Xcc TBDR transports sucrose with a very high affinity, suggesting that it
might be a sucrose scavenger. This TBDR acts with an inner membrane transporter, an amylosucrase and a regulator to utilize
sucrose, thus defining a new type of carbohydrate utilization locus, named CUT locus, involving a TBDR for the transport of
substrate across the outer membrane. This sucrose CUT locus is required for full pathogenicity on Arabidopsis, showing its
importance for the adaptation to host plants. A systematic analysis of Xcc TBDR genes and a genome context survey suggested
that several Xcc TBDRs belong to other CUT loci involved in the utilization of various plant carbohydrates. Interestingly, several
Xcc TBDRs and CUT loci are conserved in aquatic bacteria such as Caulobacter crescentus, Colwellia psychrerythraea,
Saccharophagus degradans, Shewanella spp., Sphingomonas spp. or Pseudoalteromonas spp., which share the ability to
degrade a wide variety of complex carbohydrates and display TBDR overrepresentation. We therefore propose that TBDR
overrepresentation and the presence of CUT loci designate the ability to scavenge carbohydrates. Thus CUT loci, which seem to
participate to the adaptation of phytopathogenic bacteria to their host plants, might also play a very important role in the
biogeochemical cycling of plant-derived nutrients in marine environments. Moreover, the TBDRs and CUT loci identified in this
study are clearly different from those characterized in the human gut symbiont Bacteroides thetaiotaomicron, which allow
glycan foraging, suggesting a convergent evolution of TBDRs in Proteobacteria and Bacteroidetes.
Citation: Blanvillain S, Meyer D, Boulanger A, Lautier M, Guynet C, et al (2007) Plant Carbohydrate Scavenging through TonB-Dependent Receptors: A
Feature Shared by Phytopathogenic and Aquatic Bacteria. PLoS ONE 2(2): e224. doi:10.1371/journal.pone.0000224
undertook a global analysis of receptors and regulators of
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), the causal agent of black
rot of crucifers. This pathogen infects a wide range of Brassicaceae
plants of economic interest, including cabbage, cauliflower and
radish as well as the model plant Arabidopsis thaliana. This epiphytic
INTRODUCTION
Bacteria are able to colonize a wide variety of habitats, including
the most extreme environments and even living organisms. This
remarkable feature likely reflects a high degree of adaptability and
the presence of specific genetic programs devoted to the exploitation of nutrients present in these diverse habitats. The bacterial
ability to use defined carbohydrates to support cell survival or
growth implies the availability of these substrates in their habitat.
Moreover, it requires the recognition of these molecules and the
coordinated induction of particular uptake systems and of
metabolic enzymes [1,2]. Characterization of the repertoire of
genes involved in signal perception or transduction and in
carbohydrate utilization, in conjunction with analysis of the
regulation of their expression, is likely to provide key information
about the interaction and adaptation of bacteria with their
environment [3].
The analysis and comparison of complete genomic sequences of
numerous bacteria from diverse phylogenies and habitats have
shown a relationship between the ecological niches that a bacterium occupies and the proportion of genes involved in signal
perception and transduction. Bacteria that inhabit stable environments (extremophiles, obligate parasites or symbionts), which
generally have small genomes, possess fewer sensory and
regulatory genes than free-living bacteria found in complex and
changing environments such as those living in soil or in association
with plants [2]. Therefore, it was proposed that sensors and
regulators can be used as ‘‘descriptors of bacterial lifestyle’’ [2].
With the aim to study the molecular mechanisms controlling
adaptation of phytopathogenic bacteria to their host-plants, we
PLoS ONE | www.plosone.org
Academic Editor: Rosemary Redfield, University of British Columbia, Canada
Received December 20, 2006; Accepted January 26, 2007; Published February 21,
2007
Copyright: ß 2007 Blanvillain et al. This is an open-access article distributed
under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits
unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the
original author and source are credited.
Funding: S. Blanvillain, D. Meyer and A. Boulanger were supported by grants from
the Ministère de la Recherche et de l’Enseignement Supérieur. We gratefully
acknowledge financial support from the Département Santé des Plantes et
Environnement de L’Institut National de la Recherche Agronomique.
Competing Interests: The authors have declared that no competing interests
exist.
* To whom correspondence should be addressed. E-mail: elauber@toulouse.
inra.fr (EL); [email protected] (MA)
. These authors contributed equally to this work.
¤a Current address: UMR PaVe, Centre INRA, Beaucouze, France
¤b Current address: Laboratoire de Microbiologie et Génétique Moléculaires,
Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) UMR5100, Toulouse, France
¤c Current address: Signalisation chez les Végétaux, Pole de Biotechnologie
Végétale, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) UMR5546,
Castanet-Tolosan, France
1
February 2007 | Issue 2 | e224
46
TBDRs and Carbohydrate Uptake
(HMMs), PF00593 and PF07715, corresponding to these two
domains, are available in the Pfam database [28]. Seventy-six
proteins carrying one or both domains were detected in the
proteome of the Xcc ATCC33913 strain (Table S1). Among these
proteins, 64 possess both domains. The remaining 12 proteins,
which possess only one of the two domains, can be divided into
three groups: 3 proteins (XCC2208, XCC4131 and XCC4132)
which do not seem to have a canonical plug domain, one protein
(XCC2497) which has no domain detected by the PF00593 HMM,
and finally 8 proteins (XCC0304-0305, XCC1750-1751, XCC32153216 and XCC3270-3271) which are truncated and correspond to
4 pseudogenes having a frame-shift in their coding region (Table
S1). Each of these 4 pseudogenes was thereafter studied as a unique
entity.
Other conserved features of TBDRs were then used to further
characterize these identified proteins. In the N-terminal part of the
plug domain, TBDRs display a conserved sequence, the TonBbox, that interacts with the TonB protein [26,27,29]. A TonB-box,
with the Xcc consensus sequence tLDXVXV (lower case indicates
less highly conserved amino acid, X indicates any amino acid) was
detected in all studied proteins (Table S1). The localization of
TBDRs in the outer membrane implies their transport across the
inner membrane and thus the presence of a signal peptide at their
N-terminal end. The proteins were therefore analyzed for the
presence of such a motif. TBDRs which were not predicted to
possess a signal peptide in the annotation proposed by da Silva and
colleagues [14] were manually re-annotated, thus revealing
putative signal peptides (Table S1). Out of 72 proteins, 1 TBDR
(XCC2385) does not have a signal peptide. Finally, the 12 Cterminal amino acids of outer membrane proteins (OMPs) form
a membrane anchoring b-sheet with the last residue being
aromatic (F in the vast majority of OMPs) [30,31]. The 12
C-terminal amino acid of 55 of the proteins studied here are
predicted to form a potential b-sheet, ending with an aromatic
residue (Table S1). Among the TBDRs which did not display
a typical C-terminal sequence, 8 have a b-sheet ending with an
aromatic amino acid followed by a short extension of 1 to 4 amino
acids (Table S1).
Taking all this information together, 48 proteins possess all
typical features of TBDRs in Xcc ATCC33913 and were thus
considered as putative functional TBDRs. The other proteins
lacking or having degenerated TBDR domains were also included
in our study and then named Ps-TBDRs (for Pseudo-TBDRs)
(Table S1).
Finally, some TBDRs contain a N-terminal extension, located
between the signal peptide and the plug domain [32]. Two types of
N-terminal extension have been identified: the transducer and the
Oar-like extensions [33]. In Xcc, among the 9 TBDRs having an
N-terminal extension, one is a member of the TBDR-transducer
subclass, seven are in the Oar-like subclass and one displays a
N-terminal extension that does not correspond to the two types
already identified (Table S1). Among these TBDRs, only two have
all canonical features of TBDRs.
bacterium naturally infects host plants via wounds in the leaves or
hydathodes which are specialized pores on the leaf margins of
higher plants that connect to the vascular system. Then bacteria
multiply and progress in vascular tissues [4,5]. During the past two
decades, classical molecular and genetic studies led to the
characterization of several determinants controlling pathogenicity
of Xcc, such as secretion of extracellular plant cell wall degrading
enzymes [6–8], cell-cell signaling [9,10], biofilm formation [11]
and hrp genes coding for a type III secretion system [12,13]. The
characterization of new virulence factors should now be greatly
facilitated by the availability of complete genome sequences of two
Xcc strains (strain ATCC33913 [14] and strain 8004 [15]).
Moreover, comparative genomics would improve the analysis of
virulence and host adaptation in Xanthomonas, since the genomic
sequences of four other Xanthomonas strains displaying different
host specificities and representing three other species are also
available, i.e. Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), the causal agent
of citrus canker [14], Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv), the
causative agent of bacterial spot disease on pepper and tomato
plants [16], and Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) (strain
Kacc10331 [17] and strain MAFF311018 [18]), the causal agent
of bacterial blight of rice. Thus, the Xanthomonas genus, which
affects two major model plants (Arabidopsis and rice), constitutes
a very attractive model to study plant-pathogen interactions.
Our analysis of the Xcc (ATCC33913) genome revealed an
overrepresentation of a particular family of receptors, named
TonB-dependent receptors (TBDRs). These proteins are located in
the outer membrane of Gram-negative bacteria and are mainly
known to transport iron-siderophore complexes and vitamin B12
into the periplasm [19]. In most cases, the expression of the genes
encoding these receptors is under the control of the Fur (Ferric
uptake regulator) repressor and activated under conditions of iron
starvation [20]. In contrast to diffusion through porins, transport
via TBDRs requires energy which is provided by the inner
membrane energy-coupling TonB-ExbB-ExbD protein complex
[21].
The exploration of complete genome sequences of 226 Gram
negative bacteria showed that the overrepresentation of TBDRs is
restricted to a small proportion of these bacteria, but is a common
trait of all sequenced Xanthomonas species. Interestingly, most of the
bacteria displaying this particularity have diverse lifestyles and
belong to different taxonomical lineages, but they all share the
ability to exploit complex carbohydrates. Therefore, we postulated
that some Xcc TBDRs might be involved in the transport of plantderived molecules. This hypothesis was recently reinforced with
the characterization of a TBDR, named MalA, in the oligotrophic
aquatic bacterium Caulobacter crescentus, which transports maltodextrins [22].
A systematic study of Xcc TBDRs, based on mutagenesis,
expression analyses and transport assays identified one Xcc TBDR
involved in the transport of sucrose, a major plant sugar. This
TBDR gene is required for full virulence on Arabidopsis and is
associated with genes required for sucrose metabolism, thus
forming a ‘‘sucrose utilization locus’’. Our study also suggests the
existence of other TBDR-containing loci involved in the utilization
of plant cell wall compounds which are conserved in a wide range
of bacteria displaying TBDR overrepresentation.
TBDRs are overrepresented in Xanthomonas spp.
and in bacteria scavenging complex carbohydrates
A survey of TBDRs was performed in 226 eubacterial completely
sequenced genomes, by identifying proteins detected by both
PF07715 and PF00593 HMMs. This analysis showed that most
bacteria (71%) hold less than 14 TBDRs per proteome, whereas
the remaining bacteria have a very broad variation in TBDR
number, ranging from 14 to 120 (Figure 1 and Table S2). In fact,
27% of the bacteria studied here have no TBDR proteins and
RESULTS
Identification of Xcc TBDRs
TBDR proteins consist of two domains, with a C-terminal
membrane embedded b-barrel domain that is sealed by the
N-terminal plug domain [23–27]. Hidden Markov models
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February 2007 | Issue 2 | e224
TBDRs and Carbohydrate Uptake
Figure 1. Occurrence of TonB-dependent receptor (TBDR) genes in 226 completely sequenced Gram negative bacterial genomes, in ecological (A) or
phylogenetic (B) contexts. TBDRs were detected by screening the Pfam database and the UniprotKB protein knowledge database using the two Pfam
HMMs (PF07715, Plug; PF00593, TonB_dep_Rec). Only proteins displaying the two Pfam domains were considered. The habitat of bacteria (A) and
their phylogeny (B) are represented by colour codes (see the legend boxes).
doi:10.1371/journal.pone.0000224.g001
syringae pathovars or Erwinia carotovora subsp. Atroseptica belong to
the intermediary class.
43% possess between 1 and 13 TBDRs. Only a very small
proportion of bacteria (15.5%) possesses more than 30 TBDRs,
thus forming a particular class in which TBDRs seem to be over
represented. It is worth noting that most bacteria in this class
either belong to the a or c-Proteobacteria classes or to the
Bacteroides genus (Figure 1 and Table S2). The ratios between the
number of TBDRs found in each proteome and the genome size
or the number of annotated coding sequences (CDS) displayed
a very similar distribution pattern (Table S2), thus showing that
there was no major bias due to annotation. Therefore, the TBDR/
Mbp ratio was used to define several bacterial classes: bacteria
displaying a ratio higher than 5 were considered as members of
a class showing TBDR overrepresentation, while those having
a ratio ranging from 3 to 5 belong to an intermediary class. The 4
Xanthomonas species whose genomes have been sequenced belong
to the class displaying TBDR overrepresentation (Table S2). It is
worth noting that phytopathogenic bacteria, such as Pseudomonas
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Seven Xcc TBDR and two Ps-TBDR genes are Furregulated
As TBDRs are mainly known to be involved in iron uptake, it was
important to determine how many of these receptors are assigned
to this function in Xcc. In most cases, the expression of genes
encoding TBDRs involved in iron transport is regulated by the
iron status in the medium. These genes are activated under iron
depletion conditions and repressed under iron repletion conditions
via the Fur repressor (Ferric-uptake regulator), that binds to
a specific DNA sequence element called the ‘‘Fur-box’’, which is
found in the target promoters of iron-regulated genes [20,34,35].
These features led us to analyze the regulation by the iron status
for all identified Xcc TBDR and Ps-TBDR genes.
3
February 2007 | Issue 2 | e224
48
TBDRs and Carbohydrate Uptake
not shown). It is worth noting that the fur mutant is unable to
induce any disease symptoms (data not shown), as already reported
in Xoo [39].
We then compared by qRT-PCR analysis the relative
expression of the TBDR and Ps-TBDR genes induced by iron
starvation, in the wild-type strain versus a fur mutant, in an ironcontaining medium. As presented in Figure 2B, the expression of
all these genes was repressed by the Fur protein. However, the
repression level of the 2 Ps-TBDR genes was low (less than
twofold). We confirmed that the deregulation phenotype of the fur
mutant was the result of mutation in the fur gene by
complementation experiments: the repression by iron of the 7
TBDR and the 2 Ps-TBDR genes was restored by providing the
wild-type Fur protein on the pL-XCC1470 plasmid (see Materials
and Methods) in the fur mutant (Figure 2B).
The 76 Xcc TBDR and Ps-TBDR genes were mutated by
insertion of the suicide plasmid pVO155 [36], leading to
transcriptional fusion with the promoterless uidA reporter gene.
Two insertions (in XCC1990 and XCC3209) were found unstable.
Thus, we constructed deletion-mutations in these genes using the
cre-lox system [37,38]. In order to analyze the expression of these 2
deleted TBDR genes, their promoter regions were cloned
upstream of a promoterless lacZ gene in a reporter plasmid (see
Materials and Methods), and these constructions were introduced
into the wild-type strain. Using b-glucuronidase or b-galactosidase
expression assays, we monitored the expression of all Xcc TBDRs
and Ps-TBDRs in iron-repleted and -depleted media. Seven genes
(XCC0158, XCC0768, XCC1391, XCC2772, XCC3050, XCC3518,
and XCC4162) and 2 Ps-TBDR genes (XCC3216-3215 and
XCC3595) are induced by iron starvation, compared to ironreplete conditions (Figure 2A). With the exception of Ps-TBDR
XCC3216-3215, this regulation pattern was confirmed by
quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain
reaction (qRT-PCR) in a wild-type background (data not shown).
We then checked whether these genes are under the control of the
Fur regulator. XCC1470, the orthologue of the Fur regulator
identified in Xoo [39] and in Xanthomonas campestris pv. phaseoli (Xap)
[40], was mutated using the manganese method (see Materials and
Methods). A point mutant in this latter gene was obtained (fur1). As
expected for a fur mutation, this mutant produced more
siderophores than the wild-type strain and this production
remained unaffected in response to increased iron levels (from 1
to 50 mM), as determined by using the chrome azurol S assay (data
The 9 Fur-regulated TBDR/Ps-TBDR genes, but not
the other Xcc TBDR genes, possess a putative Furbox
The DNA regions located upstream of the 9 Fur-repressed TBDR
and Ps-TBDR genes were analyzed using the MotifSampler
program [41,42] to identify putative Fur-boxes. For genes
arranged in putative operons (XCC3050 and XCC0768), the
DNA region located upstream of the first gene of the putative
operon was also studied. XCC3595, which belongs to the TBDR
transducer subclass, is preceded by two genes displaying significant
similarities with the fecI (XCC3593) and fecR (XCC3594) genes,
Figure 2. Expression levels of 9 Xanthomonas campestris pv. campestris TonB-dependent receptor genes. (A) b-glucuronidase assays, performed in at
least two independent experiments with pVO155 insertion mutant strains, cultivated in minimal medium supplemented with iron (100 mM FeSO4) or
containing an iron chelator (100 mM 2,29-dipyridyl; DPD). (B) Real-time quantitative RT-PCR (qRT-PCR), performed in at least three independent
experiments, on RNA extracted from the wild-type strain, a fur mutant strain (fur1) or from a complemented strain [fur1 (pL-fur)], cultivated in minimal
medium containing 100 mM FeSO4. Calculation of relative expression includes normalization against the endogenous control gene 16S RNA.
doi:10.1371/journal.pone.0000224.g002
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4
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TBDRs and Carbohydrate Uptake
upstream region of XCC3593 (fecI). For XCC0768, two motifs were
identified: one in the upstream region of XCC0767 and one in the
coding region of this gene (Table 1). This motif (AATGAgAATcATTctCATT; lower case indicates less highly conserved) only
showed a weak similarity with the E. coli 19 bp Fur-box consensus
sequence (GATAATGATAATCATTATC) [44]: it matched this
sequence in 10 bp positions out of 19 (52% identity). However, the
conservation was significantly higher with Fur-box consensus
sequences identified in Shewanella oneidensis (AATGATAATAATTATCATT; 84% identity) [45] and Bacillus subtilis (aaTGAtAATnATTaTCAtt; 84% identity) [46]. Interestingly, a multiple
alignment of these 4 Fur-box consensus sequences showed that
although the E. coli consensus sequence seems more divergent, it
perfectly matches the 3 other sequences after a 3 bp shift (Figure 3B
and C). These results suggest that the palindromic motif identified
in this study might correspond to a possible Xcc Fur-box. We then
explored DNA sequences located upstream of the other Xcc TBDR
or Ps-TBDR genes as well as the entire Xcc genome sequence to
detect putative Fur-boxes, using the MotifScanner program [42]
or the PatScan pattern matcher software [47]. No putative Furbox was detected in the promoter region of any other TBDR gene.
These analyses identified more than 20 genes having candidate
Fur-boxes in the region from 2300 to +20 relative to the start of
translation (data not shown). Several of these genes are orthologs
or homologs of genes regulated by Fur in other bacteria, such as
feoA (XCC1834) [48] and bfd (XCC0481) [49], or involved in iron
storage such as piuB (XCC3955) [50], thus reinforcing the validity
of our Fur-box consensus sequence. Altogether, this analysis
suggests that only 7 TBDR and 2 Ps-TBDR are directly associated
with iron uptake in Xcc. The role of the other TBDRs remained to
be deciphered.
Figure 3. Palindromic consensus Fur-box sequence identified upstream
of 9 Xanthomonas campestris pv. campestris Fur regulated TonBdependent receptor genes. (A) Sequence logos generated by WebLogo
(http://weblogo.berkeley.edu/, [123]) of the Xcc Fur-box motif as
predicted by the MotifSampler program [41,42]. (B and C) Multiple
alignement generated with Multalin program [116] with previously
proposed Fur-box consensus sequences of Bacillus subtilis [46],
Shewanella oneidensis [45], X. campestris pv. campestris and Escherichia
coli [44] (B) and after a 3 bp shift of the E. coli sequence (C).
doi:10.1371/journal.pone.0000224.g003
...................................................................
coding for a sigma factor of the ECF subfamily and its anti-sigma
factor, respectively. In most cases, the FecI/FecR system is
associated with a TBDR of the transducer subclass and is involved
in iron signaling and transport by regulating the expression of the
TBDR gene and other ‘‘iron-associated’’ genes (for review see
[33,43]). We thus also analyzed the DNA regions upstream of
these two genes. This analysis allowed the identification of a single
significant 19-bp palindromic motif (9-1-9 inverted repeat) in the
upstream region of most genes or operons studied here (Figure 3A,
Table 1). For XCC3595, the palindromic motif was detected in the
Two TBDR genes belong to the hrp regulon of Xcc
During the study of TBDR gene promoters, we identified a pip/
hrpII box in the promoter of 2 TBDR genes: XCC1041 and
XCC1719. In Xanthomonas, hrp genes coding for a TTSS, as well as
other functions related to pathogenicity are positively regulated by
hrpG/hrpX regulatory genes [51]. HrpG regulates the expression of
hrpX, which controls the expression of genes possessing a pip-box
(TTCGCN15TTCGC) or a hrpII-box (TTCGN16TTCG) [52,53].
By qRT-PCR experiments, we showed that XCC1041 and
Table 1. Candidate Fur-boxes identified in the promoter regions of Xanthomonas campestris pv. campestris Fur regulated TonBdependent receptor (TBDR) genes, TBDR containing operons and the XCC3593 FecI sigma factor gene.
..................................................................................................................................................
Gene ID
XCC0158
a
Name
fpvA
XCC0767
a
Putative function
a
Putative Fur box sequences
b
No. of
matches/total
Distance from the
start codon (bp) c
136
ferripyoverdine receptor
AACGATAACGATTTACATT
14/19
conserved hypothetical protein
AATGAGAATGGCTCTTGAT
13/19
7
XCC0768
phuR
outer membrane hemin receptor
AATGAGAATGGTTATTATT
15/19
374
XCC1391
fhuA
iron receptor
TTTGATAACCATTCCCATT
14/19
9
XCC2772
fhuA
TonB-dependent receptor
AAGAAGAATGATTTGCATT
14/19
244
XCC3049
mphE
4-hydroxy-2-oxovalerate aldolase
CTTGATAATCATTCCCATC
14/19
41
XCC3216
XCC3518
fpvA
XCC3593
fecI
XCC4162
outer membrane receptor
AATGTGAATCATTCCCATT
17/19
102
ferripyoverdine receptor
AATAATATTCATTCTCACT
15/19
53
RNA polymerase sigma factor
AATGAGATCCATTCTCATT
17/19
48
ferrichrome-iron receptor 3
GATAAGAATCGTTATCATT
15/19
12
a
Gene identification (ID), name and putative function from Xanthomonas campestris pv. campestris strain ATCC33913 as previously reported [14].
Matches to the Fur consensus sequence AATGAgAATcATTctCATT, determined in this study, appear in boldface.
Distance after start codon reannotation (see Table S1).
doi:10.1371/journal.pone.0000224.t001
b
c
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TBDRs and Carbohydrate Uptake
of Xcv, Xac, Xoo and Xf, although its surrounding genes are
conserved in syntenic regions in all these strains (Table S3). On the
other hand, XCC1041 is present in all Xanthomonas species (but
absent in Xf) and encodes a TBDR with an atypical N-terminal
extension.
Xcc TBDRs and plant interactions: XCC3358 plays
a major role in pathogenicity
In order to assess whether Xcc TBDRs control the interaction with
plants, we tested the 76 TBDR mutants constructed in this study
for pathogenicity on the Arabidopsis thaliana Sf-2 ecotype. Among
these mutants, 17 were altered in symptom development (data not
shown). However, the alteration was weak and was not reproducible in all the tests we performed, suggesting either that
their involvement is not crucial or that functional redundancy
mask their individual contribution. However, the XCC3358
insertion mutant was clearly and reproducibly altered in
pathogenicity, showing a clear delay in symptom development in
comparison to the wild-type strain (Figure 5A). The XCC3358
gene is likely to form an operon with the downstream gene,
XCC3359 (Figure 6). The ortholog of the XCC3359 gene, named
suh, has been characterized in Xanthomonas axonopodis pv. glycines
(Xag), the causal agent of bacterial pustule disease on soybean. This
gene codes for a sucrose hydrolase, SUH, which plays a major role
in sucrose metabolism in Xag. A mutant in this gene is moderately
affected in pathogenicity on soybean [54]. This prompted us to
construct a non polar deletion-mutation in XCC3358
(XCC3358D1, see Materials and Methods and Figure 6). A
deletion-mutant was also generated into XCC3359 (XCC3359D1,
see Materials and Methods and Figure 6). These two mutants
showed an altered phenotype, i.e. delayed symptom development,
similar to that observed with the pVO155 insertion mutant in
XCC3358 (Figure 5B). The non polar mutation in XCC3358 was
complemented by introducing the plasmid pL-XCC3358, which
carries a functional XCC3358 gene, into XCC3358D1 mutant
(Figure 5B). This result confirms that the XCC3358 TBDR plays
a role in virulence. Similarly, the deleted mutant in XCC3359 was
complemented by a plasmid carrying this gene (Figure 5B).
Figure 4. Regulation of Xanthomonas campestris pv. campestris TonBdependent receptor genes XCC1041 and XCC1719 by hrp regulators. The
relative expression was analyzed by real-time quantitaive RT-PCR (qRTPCR), perfomed on RNA extracted from the wild-type strain and hrpG or
hrpX insertion mutants (strains XP082 and XP083, respectively).
Experiments were repeated at least three times. Calculation of relative
expression includes normalization against the endogenous control
gene 16S RNA.
doi:10.1371/journal.pone.0000224.g004
XCC1719 TBDR genes are activated by HrpG and HrpX
(Figure 4). Interestingly, a mutant in the XCC1719 TBDR gene
is weakly affected in pathogenicity (data not shown, see below).
This gene seems to be specific to Xcc as it is absent in the genomes
Figure 5. Quantitative analysis of the interaction between Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) and Arabidopsis thaliana Sf-2 plants. (A)
Pathogenicity tests with the Xcc wild-type strain and the XCC3358 insertion mutant (XCC3358::pVO). (B) Pathogenicity and complementation tests
with the Xcc wild-type strain, the XCC3356 and XCC3357 insertion mutants (XCC3356::pVO and XCC3357::pVO, respectively), the XCC3358 and XCC3359
deleted mutants (XCC3358D1 and XCC3359D1, respectively) and their corresponding complemented strains [XCC3358D1 (pL-XCC3358) and
XCC3359D1 (pL-XCC3359), respectively]. Disease symptoms were scored 5 to 8 days after inoculation. Each inoculated leaf was individually scored as:
no symptom = 0; weak chlorosis surrounding the wound sites = 1; strong V-shaped chlorosis = 2; developing necrosis = 3; leaf death = 4. The
represented average disease scores and the standard deviations were calculated from the values of four plants with four inoculated leaves per plant.
doi:10.1371/journal.pone.0000224.g005
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TBDRs and Carbohydrate Uptake
mutants in these two genes, presuming that they are monocistronic
(Figure 6). These insertions lead to transcriptional fusions with the
promoterless uidA reporter gene. The insertion mutant in
XCC3357 showed an altered phenotype on the A. thaliana Sf-2
ecotype, resembling that using XCC3358 or XCC3359 mutants,
whereas the insertion mutant in XCC3356 was not affected in
pathogenicity (Figure 5B). These results suggest that XCC3357,
XCC3358 and XCC3359 are required in the same process related
to sucrose metabolism and/or transport. The phenotype of
a mutant in XCC3356 was not surprising since this gene encodes
a putative repressor, which might negatively control the expression
of the other genes of the locus. A mutation in this gene should
induce the constitutive expression of the other genes without
affecting their function (see below).
Figure 6. Genetic organization of the Xanthomonas campestris pv.
campestris sux locus. Location of mutations are indicated above the
map: arrowheads indicate pVO155 insertions and deleted sequences
are represented by horizontal dotted bars. Regions cloned in plasmids
are indicated below the map: horizontal thick black bars indicate
sequences used for plasmid constructions.
doi:10.1371/journal.pone.0000224.g006
The XCC3356-3359 locus is required for sucrose
utilization
Insertion mutants in XCC3357, XCC3358 and XCC3359 and the
deletion mutant XCC3359D1 grew like the wild-type strain on
minimal medium containing glucose or fructose (data not shown),
but were all affected in growth on sucrose (20 mM) (Figure 7A).
The growth of the insertion mutant in XCC3356 and the
XCC3358D1 mutant was not impaired in minimal medium
containing sucrose. The fact that the insertion mutant in
XCC3358 was impaired in growth on sucrose whereas the deletion
mutant in the same gene was not, suggested that the phenotype of
the insertion mutant was due to a polar effect of the insertion on
XCC3359 gene expression. This hypothesis was confirmed by
complementation experiments. The growth of insertion mutants in
XCC3358 and XCC3359 on sucrose media was restored when
XCC3358 TBDR belongs to a locus required for full
pathogenicity
In Xcc genome, XCC3358 and XCC3359 are preceded by two
other genes that might be related to sugar metabolism: XCC3356
codes for a putative transcriptional repressor of the LacI/GalRfamily and XCC3357 encodes a putative sugar transporter of the
major facilitator family, allowing the transport of substrate
molecules through the inner membrane. We constructed insertion
Figure 7. Growth of Xanthomonas campestris pv. campestris wild-type strain and mutants in minimal medium containing 20 mM sucrose. (A) Bacterial
growth of insertion mutants XCC3356::pVO to XCC3359::pVO or deletion mutants XCC3358D1 and XCC3359D1, compared to the wild-type strain. (B)
Growth of strains carrying plamids pL-XCC3358 or pL-XCC3359 allowing the constitutive expression of XCC3358 and XCC3359 genes, respectively. Bars
represent standard deviations from 3 independent experiments.
doi:10.1371/journal.pone.0000224.g007
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52
TBDRs and Carbohydrate Uptake
were reduced to 10.5 and 7% respectively (Table 2). Moreover, the
addition of unlabelled fructose or glucose (sucrose degradation
sub-products) slightly affected sucrose transport; a 200-fold excess
of these carbon sources reduced the sucrose transport to about
80% of the control level (Table 2).
The involvement of the SuxA TBDR in sucrose transport was
then checked by comparing the uptake rate of [14C]sucrose into
the wild-type strain and into a suxA non polar mutant (DsuxA).
Sucrose transport was much lower in the DsuxA strain, compared
to the wild-type strain (Figure 8B and Table 2): after 8 minutes, it
reached only 3.5% of the transport rate into the wild-type strain.
When suxA was supplied in trans on a constitutive expression
plasmid, sucrose transport was more efficient and rapid, with
a transport rate value at 8 minutes corresponding to 484% of that
of the wild-type strain. This result confirms that SuxA is required
for sucrose entry into Xcc.
We then studied sucrose transport in suxR and suxC insertion
mutants (suxR::pVO and suxC::pVO, respectively), and in a suxB
deletion mutant (DsuxB). When the inner membrane transporter
encoded by suxC was absent, the sucrose transport rate reached
only 2.1% of the value obtained for the wild-type strain. Thus, this
protein is necessary for sucrose entry into Xcc. On the contrary,
sucrose transport was greatly enhanced in the suxR repressor
mutant and in the DsuxB amylosucrase mutant (488% and 241%
respectively of the value obtained for the wild-type strain after
8 minutes) (Figure 8C and Table 2). These results confirm the
repressor function of SuxR (see below) and suggest that SuxB also
has a repressor activity on suxA expression. When suxB was
supplied in trans in the DsuxB mutant, the sucrose transport was
reduced to about the same level as the wild-type strain (76.4% of
the transport rate level of the wild-type strain).
Concentration-dependent sucrose transport experiments
showed a biphasic kinetics (Figure 9), with a fast rate between
XCC3359 was supplied in trans on the expression plasmid pLXCC3359, which allows constitutive expression of the XCC3359
gene. No complementation was observed when the XCC3358 gene
was supplied in trans in the XCC3358 insertion mutant (Figure 7B).
These results confirmed that XCC3358 and XCC3359 form an
operon. They also pointed out that this putative operon and the
entire locus is important for sucrose utilization in Xcc. Thus, we
renamed this locus sux, for sucrose utilization in Xanthomonas. For
the purpose of this study, the TBDR-amylosucrase operon was
renamed suxAB, the putative sugar transporter gene, suxC, and the
putative regulatory gene, suxR (see Figure 6). However, the role of
the TBDR SuxA in sucrose utilization remained elusive: this
transporter gene was not required for growth on sucrose, but a non
polar mutant in this gene was altered in pathogenicity, like suxB
and suxC insertion mutants. This observation suggested that this
suxA gene might have a particular function.
SuxA and SuxC allow sucrose uptake
To clarify the role of the SuxA TBDR, we investigated its
involvement in sucrose transport, by performing sucrose uptake
experiments using [14C]sucrose.
First, the uptake rates into the Xcc wild-type strain were compared
after an overnight preculture in the presence (induced) or absence
(uninduced) of sucrose. As shown in figure 8A, induced cells took-up
[14C]sucrose quicker than uninduced cells, but the values obtained
after 2 hours of incubation were lower for induced cells. For further
experiments, we worked with uninduced cells, in order to study the
effect of different mutations on the transport induction.
Competition experiments were performed to test transport
specificity. A 10-fold excess of unlabelled sucrose reduced the
transport rate to 52% of the level obtained without unlabelled
sucrose, and with a 100-fold or 200-fold excess, the transport rates
Figure 8. [14C]sucrose transport into Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). (A) Transport of [14C]sucrose over 120 minutes into the Xcc wildtype strain precultured in minimal medium without sugar (uninduced) or supplemented with 20 mM sucrose (induced). (B and C) Transport of
[14C]sucrose over 8 minutes into the Xcc wild-type strain, the insertion mutants in suxR and in suxC (suxR::pVO and suxC::pVO, respectively), the
deleted mutants in suxA and suxB (DsuxA and DsuxB, respectively) and their corresponding complemented strains [DsuxA (pL-suxA) and DsuxB (pLsuxB), respectively]. Cells were grown in minimal medium without sucrose. Transport was measured using 0.5 mM [14C]sucrose.
doi:10.1371/journal.pone.0000224.g008
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53
8
February 2007 | Issue 2 | e224
.................................................................................................................................................
TBDRs and Carbohydrate Uptake
Table 2. [14C]sucrose transport rates related to uninduced Xanthomonas campestris pv. campestris wild-type strain (Xcc568).
..................................................................................................................................................
Xcc strains
a
Genotype
Xcc568
Xcc568
d
Xcc568
XP084
suxR::pVO
Transport experiment conditions
b
Time (min)
c
% Transport
–
5
100.0
CCCP 20 mM
5
1.1
–
8
100.0
–
8
488.0
XP085
suxC::pVO
–
8
2.1
XP087
DsuxA
–
8
3.5
241.3
XP088
DsuxB
–
8
XP091
DsuxA (pL-suxA)
–
8
484.3
XP094
DsuxB (pL-suxB)
–
8
76.4
XP100
tonB; XCC0008::pVO155
–
8
139.1
XP101
tonB2; XCC1592::pVO155
–
8
99.0
XP102
tonB3; XCC1593::pVO155
–
8
89.6
XP103
tonB4; XCC2081::pVO155
–
8
94.4
XP104
tonB5; XCC2612::pVO155
–
8
90.6
XP105
tonB6; XCC2927D1
–
8
118.4
XP106
tonB7; XCC3205::pVO155
–
8
82.6
XP107
tonB8; XCC3967::pVO155
–
8
91.1
–
120
100.0
XP085
suxC::pVO
–
120
2.5
XP087
DsuxA
–
120
9.5
Xcc568
Sucrose 0,5 mM
120
90.2
Xcc568
Sucrose 5 mM
120
51.9
Xcc568
Sucrose 50 mM
120
10.5
7.1
Xcc568
Xcc568
Sucrose 100 mM
120
Xcc568
Fructose 0,5 mM
120
87.3
Xcc568
Fructose 5 mM
120
86.4
Xcc568
Fructose 50 mM
120
90.6
Xcc568
Fructose 100 mM
120
86.2
Xcc568
Glucose 100 mM
120
80.9
Xcc568
–
240
100.0
XP085
suxC::pVO
–
240
6.9
XP087
DsuxA
–
240
23.0
a
Xcc568: wild type strain.
Compound added prior to the addition of 0.5 mM [14C]sucrose.
c
Time after [14C]sucrose addition.
d
Cells were incubated for 10 minutes at 30uC with 20 mM carbonyl cyanide 3-chlorophenyl-hydrazone (CCCP) prior to the addition of [14C]sucrose.
doi:10.1371/journal.pone.0000224.t002
b
0.01 and 0.1 mM sucrose (Kd = 0.033 mM), and a slow rate
between 0.25 and 5 mM sucrose (Kd = 0.59 mM). This biphasic
pattern is very similar to those observed in energy coupled
transports of vitamin B12 into E. coli through the BtuB TBDR
[55,56] and more recently of maltose transport into C. crescentus
through the MalA TBDR [22]. In both systems, it was concluded
that the first phase reflects binding of the transported molecule to
the OM TBDR and that the second slower phase reflects binding
to a cytoplasmic membrane transporter. Thus, we presume that
the low Kd value (0.033 mM) mainly reflects binding to SuxA and
that the higher Kd value (0.59 mM) binding to SuxC.
Altogether, these data indicate that both SuxA and SuxC are
required for sucrose transport. It is worth noting that if the DsuxA
mutant and the suxC insertion mutant have a different phenotype
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regarding their growth ability in presence of sucrose (see figure 7A),
both mutants show a very similar alteration in sucrose transport rate
after 8 minutes. However, after 240 minutes, sucrose transport rate
in the suxA-deleted mutant reached almost 23% of the value
obtained for the wild-type strain, whereas in the suxC insertion
mutant, this rate was less than 7% of that of the wild-type strain. This
result suggested the existence of two sucrose uptake pathways, an
active and a passive pathway, both requiring transport through
SuxC. The active transport pathway depends on SuxA for
translocation through the outer membrane, whereas the passive
pathway does not. It is assumed that the sucrose uptake rate observed
into the suxA-deleted mutant is determined by slow and passive
diffusion of sucrose across the outer membrane, which is sufficient to
support growth in the presence of 20 mM sucrose in the medium.
9
February 2007 | Issue 2 | e224
54
TBDRs and Carbohydrate Uptake
The expression of sux genes is induced by sucrose
and repressed by SuxR
Sucrose uptake is energy-dependent
Active iron transport through TBDRs depends on the proton
motive force (PMF) [56,57]. Thus, we performed sucrose transport
experiments in the presence of a PMF inhibitor, carbonyl cyanide
3-chlorophenyl-hydrazone (CCCP). Addition of 20 mM CCCP
inhibited [14C]sucrose transport rate to 1.13% of the transport rate
in the absence of CCCP (Table 2), demonstrating that sucrose
transport through SuxA and/or SuxC is dependent on the proton
motive force and does not occur by facilitated diffusion. These
experiments did not permit us to conclude whether SuxAmediated transport depended on the PMF, since SuxC belongs
to the Na+-melibiose cotransporter and H+ cotransporters family,
which require the transmembrane potential for transport across
the cytoplasmic membrane. We then tested whether TonB was
required for sucrose uptake. Eight genes coding for proteins
displaying significant similarities to TonB are predicted in the
genome of Xcc (Table 2). These 8 genes were mutated by insertion
of the pVO155 plasmid. As the insertion in XCC2927 was found to
be unstable, we constructed a deletion mutant in this gene
(Materials and Methods). Sucrose transport was not significantly
impaired in the 8 putative tonB mutants (Table 2). This result
suggests a complete or partial functional redundancy between at
least two Xcc TonB proteins. Such a redundancy has already been
observed in various other bacteria, e.g. Serratia marcescens [58],
Vibrio cholerae [59] and Pseudomonas aeruginosa [60,61].
PLoS ONE | www.plosone.org
55
Table 3. Relative expression ratios of suxR, suxC, suxA and suxB
in the wild-type strain, in minimal medium containing 20 mM
sucrose vs minimal medium without sucrose.
......................................................................
....................................................
Figure 9. Concentration-dependent [14C]sucrose transport into wildtype Xanthomonas campestris pv. campestris. Cells were grown in
minimal medium without sucrose and transport was measured for
15 sec at the indicated [14C]sucrose concentrations. The insert shows
the Scatchard transformation of the binding data.
doi:10.1371/journal.pone.0000224.g009
..................................................
Using qRT-PCR analyses, we observed that the expression of
suxR, suxC and suxAB is specifically induced by the presence of
sucrose in the medium (Table 3).
As SuxR has a high degree of similarity with members of the
LacI/GalR family of transcriptional repressors [62,63], we tested
whether this protein regulates the expression of sux genes by
comparing their expression by qRT-PCR in the suxR insertion
mutant and in the wild-type strain, cultivated in minimal medium
with or without sucrose. suxAB, suxC and suxR were over-expressed
in a suxR mutant as compared to the wild-type strain in the
absence of sucrose (Table 4), suggesting a negative and effectordependent control of sux genes by SuxR.
We also studied the expression of the suxAB operon in the
presence of different sucrose concentrations. For this purpose, the
promoter region of this operon was cloned upstream of the
promoterless LacZ gene in a reporter plasmid (see Materials and
Methods). This plasmid, named pPr-suxA, was introduced into the
Xcc wild-type strain, the suxR and suxC insertion mutants
(suxR::pVO and suxC::pVO, respectively), and the suxA and suxB
deletion mutants (DsuxA and DsuxB, respectively).
These strains were used to perform b-galactosidase assays after
6 hours growth in minimal medium containing a range of sucrose
concentrations (Figure 10A). Induction of the expression of the
reporter gene was detected for sucrose concentrations ranging
from 20 mM to 20 mM. Maximal induction (3.5 to 4-fold
induction) was observed for concentrations higher than 200 mM
Gene name
Ratio (+/2 SD)
suxR
5.87 (+/21.98)
suxC
11.14 (+/20.4)
suxA
20.92 (+/28.5)
suxB
44.97 (+/22.64)
a
a
From real-time quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction
perfomed in at least three independent experiments. Cells were cultivated in
minimal medium with or without sucrose. Calculation of relative expression
includes normalization against the 16S rRNA endogenous control gene. SD:
standard deviation.
doi:10.1371/journal.pone.0000224.t003
Table 4. Relative expression ratios of suxR, suxC, suxA and suxB
in the suxR insertion mutant (suxR::pVO) vs wild-type strain.
......................................................................
10
Gene name
Ratio (+/2SD)
a
Without sucrose
With sucrose
suxR
10.4 (+/22.3)
1.01 (+/20.64)
suxC
23.6 (+/24.8)
2.56 (+/20.8)
suxA
154 (+/283.2)
2.08 (+/21,8)
suxB
176.45 (+/277.7)
1.54 (+/20.8)
a
From real-time quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction
perfomed in at least three independent experiments. Cells were cultivated in
minimal medium with or without sucrose. Calculation of relative expression
includes normalization against the 16S rRNA endogenous control gene. SD:
standard deviation.
doi:10.1371/journal.pone.0000224.t004
February 2007 | Issue 2 | e224
TBDRs and Carbohydrate Uptake
suxA expression by sucrose requires the entry of this molecule into
the cell. The pattern and level of expression of suxA observed in the
suxA mutant were very similar to those observed in the wild-type
strain, except that this expression was significantly higher in the
mutant in the presence of 2 mM sucrose. This difference was
reproducibly observed and further investigations are needed to
understand this phenomenon.
Expression assays suggested that sucrose transport through
SuxA is not high enough to influence the expression of the suxAB
operon. Sucrose entry across the outer membrane by slow
diffusion seems to be sufficient to promote induction of sux genes
after 6 hours growth in the presence of sucrose.
suxA is required for its rapid induction as revealed
by using low sucrose concentrations
We performed time-course experiments comparing suxA expression in the wild-type strain and the suxA deletion mutant grown in
presence of different sucrose concentrations (0, 20 mM, 50 mM,
100 mM, 200 mM 500 mM, 1 mM, 2 mM, 5 mM and 20 mM).
For clarity, only results obtained with 100 mM and 20 mM are
shown in Figure 10B. In the presence of 20 mM sucrose (triangles
on Figure 10B), suxA expression was not significantly different after
6 hours growth in the wild-type and the suxA mutant backgrounds.
However, a slight difference was observed in the induction level of
suxA, from 60 to 120 minutes after sucrose addition. The
expression level of suxA was 1.5 to 1.6 fold higher in the wild
type strain than in the suxA mutant. Later, this difference tended to
decrease and the ratio reached a value of 1.1 after 6 hours. A
reproducible and clear difference in curve profiles was noticed in
the presence of 100 mM sucrose (squares on Figure 10B). A rapid
induction was observed in the wild-type context, from 30 to
120 minutes after sucrose addition, followed by a plateauing, in
which expression seems to remain constant. On the other hand, in
the suxA deletion mutant background, the induction was linear and
less rapid. Between 30 and 120 minutes after sucrose addition, the
expression level of suxA was 2 fold higher in the wild-type strain
background than in the suxA deletion mutant background,
although after 360 minutes, the expression levels were identical
in both strains. Similar results were obtained with sucrose
concentrations ranging from 20 to 200 mM (data not shown).
We propose that these results could reflect the existence of two
pathways controlling suxA expression, which can be clearly
differentiated with low sucrose concentrations. One of these
pathways is controlled by SuxA. These results can be related to the
transport analyses showing the existence of two types of sucrose
transport across the outer membrane, one being SuxA-dependent
and the other one, slower, being dependent on passive diffusion.
We thus postulate that the induction of suxA indirectly reflects
these two means of transport. Moreover, this induction is specific
to sucrose and is not due to its degradation products glucose and
fructose, as no induction was observed following addition of
100 mM of these molecules in the wild-type background
(Figure 10C). Therefore, these experiments suggest that SuxA
plays a role in sucrose transport which might be crucial at low
concentrations of this sugar.
Figure 10. Expression of the Xanthomonas campestris pv. campestris
suxA gene in the presence of sucrose, fructose or glucose. The pPr-suxA
plasmid carrying the promoterless LacZ reporter gene under the suxA
promoter region was used to monitor suxA expression in different
genetic backgrounds. Expression was measured in minimal medium
and cells were harvested at the indicated times. (A) Expression after
6 hours induction in the presence of different sucrose concentrations,
in the wild-type background, the suxR and suxC insertion mutant
backgrounds (suxR::pVO and suxC::pVO, respectively), and the suxA and
suxB deletion mutant backgrounds (DsuxA and DsuxB, respectively). (B)
Kinetics of LacZ expression in the wild-type background or in the suxA
deletion mutant background (DsuxA), in presence of 20 mM (triangles)
or 100 mM (squares) sucrose. (C) Kinetics of LacZ expression in the wildtype background in the presence of 100 mM sucrose, fructose or glucose.
doi:10.1371/journal.pone.0000224.g010
in the wild-type background (Figure 10A). As expected, the
expression of suxA was highly induced in the suxR mutant,
confirming the repressor activity of this gene. However, we
observed a significant diminution of the induction level at 2 and
20 mM sucrose in this mutant, suggesting the existence of a second
level of control. A high and constitutive induction of suxA
expression was also observed in the suxB deletion mutant,
suggesting that the amylosucrase gene plays a role in the repression
of the suxAB operon. At 2 mM sucrose concentration, a reduction
in suxA expression level was also observed in this mutant, but it was
smaller than that detected in the suxR mutant. The deregulation of
suxA expression in the suxB mutant is in agreement with transport
studies which showed a higher sucrose transport rate in this
mutant (Figure 8C). No induction of suxA expression was observed
in the suxC mutant, whatever sucrose concentration was used. This
lack of induction certainly reflects the absence of sucrose entry into
the cytoplasm of this mutant, thus preventing the alleviation of
SuxR repression. This result clearly shows that the induction of
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Identification of other Xcc TBDRs in loci probably
involved in plant carbohydrates utilization
The genome of Xcc was then explored to see whether other
TBDRs could belong to loci involved in the utilization of other
plant compounds. Xcc has an extensive repertoire of plant cell-wall
degrading enzymes, with cellulolytic, pectinolytic and hemicellulolytic activities [14]. The analysis of carbohydrate active enzymes
11
February 2007 | Issue 2 | e224
56
TBDRs and Carbohydrate Uptake
existence of several repression pathways. It is worth noting that
most Fur-regulated TBDR genes were submitted to catabolic
repression.
Three TBDR/Ps-TBDR genes were induced by PGA
(XCC0120, XCC1749 and XCC1750-1751), one by maltose
(XCC2469), seven by arabinose (XCC0050, XCC1749, XCC1750,
XCC1892, XCC2828, XCC4120 and XCC4222), three by xylan
(XCC2828, XCC4120 and XCC4237) and finally two by xylose
(XCC2828 and XCC4120) (Table S4). Interestingly, the 2 TBDRs
induced by xylose were also induced by xylan and arabinose, and
XCC1749 and XCC1750 were both induced by PGA and
arabinose. suxA is the only TBDR gene for which expression is
specifically induced by sucrose, and XCC2469, the orthologue of C.
crescentus malA TBDR gene [22], is the only one induced by
maltose. It is worth noting that the expression of the XCC0120,
XCC4120 and XCC2469 TBDR genes was specifically induced by
the postulated substrate of the associated CAZy referenced
enzymes (see Figure 11). Altogether, these data suggest that
several TBDRs are part of loci which seem to be involved in
carbohydrate utilization. We thus propose the existence of 6
putative loci named carbohydrate utilization containing TBDRs
(CUT) loci, which were defined by the presence of genes coding
for carbohydrate degradative enzymes, inner membrane transporters and sugar related regulators beside TBDR genes. We also
identified 15 putative partial CUT loci in the Xcc genome (see
Table S3).
identified in the predicted proteomes of 209 Gram negative
bacteria and referenced in the CAZy database (http://afmb.cnrsmrs.fr/CAZY/) showed that, after Bacteroides sp. and S. degradans,
which are well known specialists for polysaccharide degradation,
Xcc has one of the highest number of genes involved in
polysaccharide metabolism per megabase (29.9, total 152) (Table
S2). These genes encode 82 predicted glycosyl hydrolases, 45
glycosyl transferases, 5 polysaccharide lyases, 18 carbohydrate
esterases and 2 carbohydrate binding proteins. Interestingly, 46 of
these proteins are encoded in the vicinity of 24 TBDR/Ps-TBDR
genes, thus suggesting the existence of 19 new loci putatively
involved in carbohydrate utilization (Table S3). Among those loci,
7 also contain an inner membrane transporter coding gene and
a regulatory gene. For 3 loci identified in this analysis, the
substrate probably utilized and transported could be easily
deduced from the nature of the degradative enzymes: the
XCC0120 TBDR gene is localized upstream of genes coding for
a pectin methyl esterase and a pectate lyase and might belong to
a locus involved in pectin utilization (Figure 11A); the XCC4120
TBDR gene is found in a cluster of genes probably involved in
xylan metabolism (Figure 11B); and the XCC2469 TBDR gene
might be related to maltose/maltodextrin utilization, since it is
associated with genes coding for a cyclomaltodextrin glucanotransferase, two a-glucosidases, a sugar transporter and a maltose
transport gene repressor (Figure 11C).
To verify whether these TBDRs are really associated with
carbohydrate utilization, we studied their regulation by plant
compounds. For this purpose, we performed b-glucuronidase
expression assays using all Xcc TBDR pVO155 insertion mutants.
Cells were grown in rich medium or in minimal medium
supplemented or not with polygalacturonic acid (PGA), arabinose,
glucose, maltose, sucrose, xylose or xylan. Most TBDR (or PsTBDR) genes (44 out of 74) were repressed in rich medium,
compared to minimal medium (Table S4). We also observed that
in minimal medium, 48 Xcc TBDR genes are repressed in the
presence of sucrose, xylose, arabinose and/or glucose, suggesting
that these genes are submitted to catabolic repression (Table S4).
However, the repression patterns were variable, suggesting the
Conservation and distribution of TBDRs and CUT loci
in Xanthomonads
When compared with proteins in the databases using BlastP and
the ‘‘distance tree of results option’’ displayed on the BlastP result
page, the best homologous genes of Xcc TBDRs/Ps-TBDRs were
putative TBDRs of other Xanthomonas species and in some cases of
Xyllela strains. These conserved genes might be considered as
orthologs. We compared the distribution of Xcc TBDRs among
Xanthomonads strains for which genome sequences are available,
i.e. Xcc strain 8004, Xcv (strain 85–10), Xac (strain 306), Xoo (strains
KACC10331 and MAFF311018) and Xf (strains 9a5c and PD). A
Figure 11. Genetic organization of putative Xanthomonas campestris pv. campestris CUT loci and specific induction of the TonB-dependent receptor
gene by plant carbohydrates. Putative pectin (A), xylan (B) and maltodextrin (C) utilization CUT loci and specific induction of the corresponding TBDR
gene in the presence of PGA, xylose and maltose, respectively. b-glucuronidase assays were performed in at least two independent experiments with
TBDR insertion mutants cultivated in minimal medium supplemented with glutamate 20 mM (GT) or specific carbohydrates (PGA: polygalacturonic
acid 0.125%; XYL: xylose 20 mM; MAL: maltose 20 mM). TBDR: TonB-dependent receptor; PME: pectin methyl esterase; PL: pectate lyase; CGTase:
cyclomaltodextrin glucanotransferase.
doi:10.1371/journal.pone.0000224.g011
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57
12
February 2007 | Issue 2 | e224
TBDRs and Carbohydrate Uptake
search similar to that used for Xcc allowed us to identify 72
TBDR/Ps-TBDR in the proteome of Xcc strain 8004, 74 in that of
Xac, 61 in Xcv, 41 and 42 in Xoo strains KACC10331 and
MAFF311018 respectively, and finally 10 in each Xf strain. To
further study the relationship between these TBDRs and Xcc
TBDRs, we performed a comparative study using alignments
generated by ClustalW [64]. To carry out this comparative
analysis, we only used TBDRs which seemed to be complete and
Ps-TBDRs over 600 amino acids, in order to avoid bias in
alignments. Examination of the phylogenetic tree, coupled with
Blast results analysis, clearly confirmed that most Xcc TBDRs are
well conserved in other Xanthomonas strains (Figure S1 and Table
S3). All TBDR or Ps-TBDR genes detected in Xcc strain
ATCC33913 are present in strain 8004; 55 seem to have orthologs
in Xac; 49 are conserved in Xcv and 34 only are conserved in Xoo
strains which possess significantly less TBDRs. In most instances,
the grouping and distribution pattern of orthologous TBDRs
matched the phylogenetic classification of Xanthomonas species [65–
67]. This observation suggests that this protein family is ancient in
the Xanthomonas genus. It is worth noting that branch lengths were
variable, suggesting differential evolution rates. Moreover, we
noticed that some truncated Xcc Ps-TBDRs could be functional in
other strains: the Ps-TBDR XCC1750-1751 doublet corresponds
to unique and complete TBDR proteins in Xcv, Xac and Xcc strain
8004. Similarly, the 2 Ps-TBDRs XCC3215-3216 and XCC32703271, which are also truncated in Xcc strain 8004, correspond to
unique proteins in both Xac and Xcv. Interestingly, Xac, Xcv or Xoo
TBDR orthologs of Xcc Ps-TBDR having non-canonical Cterminal regions (b-sheet ended by an aromatic amino acid
followed by a short extension of 1 to 4 amino acids), also displayed
this feature (data not shown). In most cases, these non canonical Cterminal domains were identical in all strains. This conservation
might reflect a specific functional feature of Xanthomonas TBDRs.
The analysis of the phylogenetic tree also showed that
Xanthomonads TBDRs can be divided into three main groups,
with most TBDRs belonging to group 1. This group can be
divided into 8 subgroups (1A to 1H). We noticed that (i) Xcc OarTBDRs are clustered in subgroup 1D, (ii) most plant carbohydrate
induced TBDRs (8 out of 11) are grouped in subgroup 1C, and (iii)
most Xcc Fur-regulated TBDRs (6 out of 8) are grouped in
subgroup 1F. Among these Fur-regulated TBDR genes, XCC3518,
XCC3595 and XCC4162, which belong to subgroup 1F, seem
specific to Xcc strains.
The comparison of genes located adjacent to orthologous
TBDR genes in the different Xanthomonas strains showed that in
most cases, these regions are syntenic (Table S3). Thus, all putative
CUT loci identified in Xcc genome are well conserved in Xac and
Xcv but only 2 out of 6 were found in Xoo. Similarly, almost all
putative partial CUT loci are present in both Xcv and Xac, but only
9 out of 15 are conserved in Xoo strains. The putative
polygalacturonate utilization locus (XCC0120-XCC0122) seems
unique to Xcc. The genes bordering this locus are conserved and
contiguous in Xcv and Xac, thus suggesting insertion or deletion
events (Table S3).
Finally, among the 10 TBDRs identified in Xf strains, 6 are
conserved in Xcc, Xac, Xcv and Xoo, 1 is conserved in Xcc, Xac and
Xcv, whereas only 1 is present in Xcc. The 2 remaining Xf TBDRs
(XF0339/PD1711; XF0599/PD1552) seem more divergent and
thus specific to Xf strains. However, XF0599 displays weak
similarities with XCC2772, a Fur-regulated TBDR of Xcc. None of
the other Xf TBDRs are related to Xcc Fur-regulated TBDRs nor
to Xcc TBDRs belonging to putative CUT loci identified in this
study. Only 2 Xf TBDR genes (XF2713 and XF1036) correspond
to Xcc TBDRs present in partial CUT loci.
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Xcc TBDRs are conserved in aquatic bacteria and/or
phytopathogenic bacteria.
For each Xcc TBDR included in the phylogenetic study, we
analyzed the BlastP results obtained on the nr databank, to
characterize the next best homologous genes after Xanthomonads
orthologs. This analysis allowed us to cluster Xcc TBDRs on the
basis of the bacterial origin of the homologous TBDR. Thus, Xcc
TBDRs could be divided into 4 main groups (Table S5). The first
group corresponds to TBDRs showing their next best homologies
(after Xanthomonads orthologs) with other Xanthomonas TBDRs
rather than with TBDRs from other genera. This observation
mainly concerned TBDRs found in subgroups 1B, 1C and 1D of
the phylogenetic tree. Their positions in the tree suggested that
they could be generated by successive duplication events that
occurred before Xanthomonas speciation (Figure S1). The second
group corresponds to TBDRs which display high similarities with
TBDRs of b-Proteobacteria and/or Pseudomonas species. Interestingly most of these TBDRs are clustered in subgroup 3 of the
phylogenetic tree. Moreover, some of these TBDRs showed high
similarities with TBDRs of phytopathogenic bacteria such as
Acidovorax avenae subsp. citrulli, Pseudomonas syringae pathovars or
Ralstonia solanacearum. The third group contains two Xcc TBDRs
proposed to be involved in iron uptake and showing significant
similarities with putative TBDRs from Cyanobacteria. The fourth
group, which is the largest one (with 35 TBDRs out of 70),
corresponds to TBDRs which displayed very significant homologies with putative TBDRs of a wide range of aquatic bacteria
belonging to the a or c classes of Proteobacteria. It is worth noting
that in most cases, Xcc TBDRs were not affiliated to TBDRs of
a specific bacterial class, but there was rather a variety of origins.
Thus, for 16 Xcc TBDRs the best similarities (after Xanthomonads
similarities) were obtained with putative TBDRs of C. crescentus
CB15 and Caulobacter sp. K31 strains, which are aquatic
oligotrophs belonging to the Caulobacterales order of the aProteobacteria. Homologies were also observed with TBDRs of
other a-Proteobacteria living in aquatic habitats, such as
Oceanicaulis alexandrii, Maricaulis maris or Parvilarcula bermudensis
HTCC2503, or found in multiple environments like Sphingomonas
sp. SKA58, Sphingopyxis alaskensis or Novosphingobium aromacitovorans.
Significant similarities were also obtained with putative TBDRs of
aquatic c-Proteobacteria classified in the Alteromonadales, including
Alteromonas macleodii, Saccharophagus degradans 2–40, Pseudoalteromonas
and Shewanella species. One common trait of most of these bacteria
is that they show TBDRs overrepresentation with values of TBDR
number per megabase ranging from 7.4 to 15.7 (Table S2). This
raised the question of whether homologies between these TBDRs
were fortuitous and a consequence of their large number or
whether they reflect common biological functions.
Conservation of TBDR regions and CUT loci in Gramnegative bacteria
Some regions surrounding TBDR genes were found to be
conserved in closely related bacteria such as Vibrio parahaemolyticus
or P. aeruginosa. Thus, the XCC3050 Fur-regulated TBDR belongs
to a cluster of 6 genes showing similarities with the pvuA-pvsABCDE
gene cluster of V. parahaemolyticus, involved in the uptake and
biosynthesis of the siderophore vibrioferrin [68] (Table S3).
Similarly, a group of proteins encompassing XCC3067 TBDR
and putatively involved in cobalamin uptake and biosynthesis in
Xcc was conserved in Pseudomonas species (Table S3). Preliminary
experiments showed that the expression of this TBDR gene is
repressed by the presence of vitamin B12 in Xcc, thus suggesting
that this cluster is functional (data not shown).
13
February 2007 | Issue 2 | e224
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TBDRs and Carbohydrate Uptake
only TBDR genes having a Fur-box in their promoter region.
Recently, a proteomic approach carried out in P. aeruginausa
PAO1, which contains 34 putative TBDR genes, identified a very
similar number of TBDR genes regulated by iron-stavation. In
fact, in this bacterium, 7 TBDRs are produced under ironstarvation conditions and 4 others are specifically induced by the
presence of heterologous siderophores, under iron-restricted
conditions [72]. Therefore, although it is possible that some Xcc
TBDR genes need specific heterologous siderophores for their
expression, as observed in P. aeruginosa, the number of TBDR
genes involved in iron uptake seems very comparable in both
bacteria. This suggests that the other putative TBDRs/Ps-TBDRs
might be required for different biological functions.
Several CUT loci identified in Xcc were not conserved in
taxonomically related bacteria but rather in the group of aquatic
bacteria showing TBDR conservation and in particular in C.
crescentus. The sux locus, 3 of the putative CUT loci and 4 of the
putative partial CUT loci identified in this study were entirely or
partially conserved in this group of bacteria (Table S3). Thus, the
putative maltose CUT locus was partially conserved with the mal
locus recently identified in C. crescentus, which contains the MalA
TBDR proposed to be involved in the uptake of maltodextrins
[22] (Figure S2B). Interestingly, MalA shows significant similarities
with the XCC2469 TBDR whose expression is induced by maltose
and maps in the maltose CUT locus (Figure 11C).
Similarly, the putative xylose locus, containing the XCC2828
TBDR gene, is also very well conserved in C. crescentus (Figure
S2C). The corresponding CC0999 TBDR gene was shown to be
induced by xylose in this bacterium [69]. Moreover, CC2832,
which was also shown to be xylose-induced in C. crescentus, displays
significant homologies with the xylose-induced TBDR gene
XCC4120 belonging to a xylose CUT locus. Furthermore, the
20-bp palindromic motif conserved upstream of genes of the C.
crescentus xylose regulon, was also found upstream of genes
putatively involved in xylose metabolism in Xcc, as well as in the
promoter region of XCC2828 and XCC4120 TBDR genes [69].
The sux CUT locus seems less well conserved and showed some
degree of variation (Figure S2D). The amylosucrase gene
(XCC3359) is only well conserved in the corresponding C. crescentus
locus. In the loci conserved in other bacteria, the degradation of
sucrose seems to involve more classical pathways (for review see
[70]). Moreover, the MFS transporter of the Xcc locus is different
from that of the C. crescentus sucrose locus encoded by CC1133,
although it is well conserved in both Sphingomonas SK58 and
Erythrobacter litoralis. These differences show the existence of some
degree of plasticity in the evolution of the putative CUT loci.
Further investigations are needed to see whether all these partially
conserved loci are involved in the utilization of the same molecule.
However, this wide conservation of CUT loci is in favor of their
existence. These results also confirm that the similarities observed
between TBDRs are probably not fortuitous.
The identification of CUT loci/systems in Xcc
suggests a relationships between TBDRs and
carbohydrate utilization
Our data reveal that several Xcc TBDRs are related to plant
carbohydrate utilization. A large proportion of Xcc TBDR genes
are coupled with carbohydrate active enzymes. For 6 of them, an
inner membrane transporter gene and a regulatory gene are also
present in the same region, thus defining the existence of putative
CUT loci involved in the uptake and utilization of plant
carbohydrates. Moreover, 15 Xcc TBDR genes belong to partial
CUT loci, thus suggesting the existence of CUT systems composed
of different parts scattered in the genome. The existence of such
multipartite CUT systems was supported by the observation that
11 TBDR/Ps-TBDR genes are specifically induced by plant
carbohydrates such as sucrose or plant cell wall derived
compounds including arabinose, xylan/xylose, pectin/polygalacturonate or maltose. Moreover, in 5 cases, there is a correlation
between the inducing carbohydrate and the degradative enzyme(s)
present in the CUT locus. This allows us to propose the existence
of a sucrose CUT locus as well as loci involved in the utilization of
complex carbohydrates such as pectin, xylan or starch.
The sux CUT locus is functional
The existence of functional CUT loci was confirmed by the
detailed study of the sucrose CUT locus, which showed its
involvement in the entry and utilization of sucrose in Xcc. This
locus comprises four genes, suxA, suxB, suxC and suxR, coding for
a TBDR, an amylosucrase, a sugar inner membrane transporter
and a regulatory protein, respectively. [14C]sucrose uptake
experiments showed that SuxA and SuxC are both required for
sucrose entry into the cell. Concentration-dependent sucrose
transport experiments showed a biphasic kinetic, with a similar
pattern observed for vitamin B12 uptake into E. coli through the
BtuB TBDR [55], and more recently for maltose transport into C.
crescentus through the MalA TBDR [22]. In both of these systems, it
has been concluded that the first phase reflects the binding of the
transported molecule to the OM TBDR, and that the second
slower phase reflects the binding to a cytoplasmic membrane
transporter. Thus, we presume in our experiments that the low Kd
value (0.033 mM) mainly reflects binding to SuxA and that the
higher Kd value (0.59 mM) binding to SuxC. Sucrose transport was
significantly lower in the suxC mutant than in the suxA non polar
mutant. This difference might explain the differential phenotype of
these two mutants observed for growth on sucrose: the suxA non
polar mutant was not impaired in growth on media containing
sucrose, whereas the suxC mutant was unable to grow under these
conditions. These observations suggest the existence of an
alternative pathway that supports facilitated diffusion of sucrose
across the OM, whereas it seems that there is a unique route for
DISCUSSION
Overview
The outer membrane (OM) of Gram negative bacteria serves as
a selective permeation barrier, excluding hydrophilic solutes,
including most nutrients. However, OMs contain embedded
integral proteins, named outer membrane proteins (OMPs), which
allow sensing and entry of nutrients into the cell. A major class of
OMP with a certain substrate specificity, called porins, allows the
translocation of hydrophilic solutes through the OM. Another
class of OMPs, the TonB-dependent receptors (TBDRs), is mainly
known to be involved in iron or vitamin B12 uptake [71].
Recently, the MalA TBDR of C. crescentus was shown to be
involved in the ExbBD-dependent uptake of maltodextrins [22].
Here, we show that several Gram negative bacteria, belonging to
different lineages and having diverse habitats, display an overrepresentation of TBDRs, which might be related to the uptake of
plant-derived carbohydrates.
Xcc TBDRs belonging to the Fur regulon
Our global study of Xcc TBDRs showed that only a small fraction
of them seems to be involved in iron uptake. Among the 72
TBDR/Ps-TBDRs identified in the Xcc genome, only 9 are upregulated under iron-limiting conditions. We established that these
9 genes are repressed by the Fur repressor and that they are the
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TBDRs and Carbohydrate Uptake
crossing the inner membrane, depending on SuxC. The existence
of this alternative pathway was also revealed by expression
analyses of the sux locus. The regulation of sux genes seems to
follow a classical inducer/repressor control, mediated by the SuxR
repressor, sucrose being the inducer. The expression of sux genes is
induced by sucrose but not by fructose or glucose. This induction
was detected with sucrose concentrations ranging from 20 mM to
20 mM. These experiments showed that SuxA transport influenced sucrose induction of suxA at low sucrose concentrations (20
to 200 mM), whereas this effect is masked at higher concentrations,
probably by interference by passive diffusion.
Our data also indicated that sucrose transport through the sux
system is active and depends on the proton motive force. However,
we could not conclude whether it depends on the TonB-ExbBD
energy coupling system. In addition to TonB, the Xcc genome
harbours 7 TonB-like proteins, which might substitute one for
another. Another Xcc feature is the presence of a second exbD gene,
named exbD2, mapping downstream of the tonB-exbBD1 locus.
Interestingly, exbD2 is not required for iron uptake but is essential
for HR induction, whereas tonB, exbB and exbD1 genes are
necessary for both processes [73,74]. This differential behavior
might be related to the existence of at least two classes of TBDRs
in Xcc, one involved in iron uptake and the other one in transport
of plant compounds. Further work is needed to address this
hypothesis.
wild type strain on medium containing sucrose, was also affected
in pathogenicity. Thus, it appears that the ability to scavenge
sucrose with a very high affinity plays a key role during the
interaction with host plants.
In conclusion, data obtained on this sucrose CUT locus strongly
support the existence of the other CUT loci identified in Xcc,
which might have a similar mode of action (see model presented in
Figure 12). This suggests the presence of several systems which
seem to partially overlap and which are involved in the scavenging
of plant molecules. They might form a complex network required
for the exploitation of plant resources but which might also
participate in signaling.
TBDRs and CUT loci are ancient in the Xanthomonas
genus
The importance of TBDRs and CUT loci is not restricted to Xcc
since they are well conserved in Xac and Xcv. A phylogenetic study
of Xanthomonads TBDRs suggests that these proteins are an
ancient class of proteins in the genus. Moreover, the grouping
pattern observed in our phylogenetic study seems to correlate with
functional features of Xcc TBDRs, thus suggesting the existence of
structure/function relationships. However, it seems that there is
some degree of variation in the repertoire of TBDR genes and
CUT loci among Xanthomonads, as the number of genes and loci
was lower in Xoo strains and also in Xylella. This latter species is
considered as a minimal pathogen in the Xanthomonads with
a restricted habitat and a reduced genome [81]. Xylella possesses
a significantly lower number of TBDRs and only one partially
conserved CUT locus.
The sux locus represents a new sucrose utilization
system
The Xcc sux locus is clearly different from other sucrose utilization
loci already found in bacteria (for review see [70]). In particular, it
differs from the scr sucrose-utilization system from enteric bacteria,
which is also present in the plant pathogenic bacterium Erwinia
amylovora, where it plays a major role in plant colonization [75].
The differences concern regulation, sucrose utilization and
transport. The scr genes are regulated by a LacI/GalR family
repressor, but fructose is the inducer [76]. In this system, the
degradation of sucrose uses a sucrose-6-phosphate hydrolase/
fructokinase degradation pathway [70]. On the contrary, the Xcc
sux locus contains an amylosucrase orthologous to SUH, a unique
sucrose hydrolase previously characterized in Xag [54]. This
enzyme is responsible for intracellular sucrose hydrolysis. It is
active on sucrose but not on sucrose-6-phosphate. In the scr
system, sucrose metabolism and uptake are coupled by the
phosphoeneolpyruvate-dependent carbohydrate:phosphotransferase system (PTS), which controls crossing of the inner membrane
and sucrose phosphorylation. The transport across the outer
membrane is mediated via a porin, named ScrY [77,78]. Thus, the
transport of sucrose is very different in sux and scr systems.
Interestingly, the Kd value of sucrose binding to SuxA is 1500- to
3000-fold lower than that of the E. coli ScrY sucrose porin, which
varies from 13 mM [79] to 50 mM [80]. Similarly, C. crescentus
MalA TBDR transports maltodextrins with Kd values 1000-fold
lower than those of the LamB porin, which facilitates the passive
diffusion of maltodextrin [22]. It is worth noting that the Kd values
of sucrose binding to SuxA and maltodextrins binding to MalA are
comparable. Thus, SuxA and MalA represents a new class of outer
membrane carbohydrate transporters showing a much higher
affinity for their substrate than porins.
The importance of the sux locus in Xcc is highlighted by the fact
that it is required for full virulence on Arabidopsis thaliana. The
phenotype of suxB and suxC mutants on plants can be related to
their inability to grow on medium containing sucrose (20 mM).
However, the non polar suxA mutant, which grows as well as the
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Figure 12. Model of CUT loci functioning based on the Xanthomonas
campestris pv. campestris sux locus. This scheme shows sucrose outer
membrane transport via the SuxA TBDR or by passive diffusion through
a putative porin. After crossing the inner membrane through the SuxC
transporter, sucrose is proposed to interact with the SuxR repressor
(thus allowing sux gene induction) and also to serve as a substrate for
the SuxB amylosucrase. The large double headed arrow below the sux
locus represents the balance between metabolic adaptation and
virulence control putatively mediated by CUT loci.
doi:10.1371/journal.pone.0000224.g012
15
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60
TBDRs and Carbohydrate Uptake
organism [87]. Interestingly, several C. crescentus TBDR genes have
been shown or proposed to be associated with the uptake of plant
compounds. As described above, Neugebauer and colleagues
showed that C. crescentus can grow on maltodextrins and that the
transport of these molecules is mediated by the MalA TBDR [22].
Proteomic and transcriptomic studies have shown that TBDR
genes are expressed at higher levels in minimal medium than in
rich medium [69,88–90], as we observed in Xcc. Moreover, several
TBDR genes are specifically induced by the presence of xylose
[69]. Interestingly, 2 TBDRs induced by xylose are conserved
between C. crescentus and Xcc. Strikingly, putative regulatory ciselement motifs are conserved in the promoters of these
homologous genes in both species. Moreover, one of these 2 Xcc
TBDR genes (XCC2828) belongs to a putative partial CUT locus
which is conserved in C. crescentus (Figure S2C). This suggests
a possible lineage between these loci. Moreover, 3 other Xcc CUT
loci are entirely or partially conserved in the C. crescentus
oligotrophic bacterium, including the maltose and sucrose CUT
loci. TBDRs in oligotrophs like C. crescentus might play a very
important role by allowing the foraging of carbohydrates in
nutrient poor environments.
Conservation of Xcc TBDRs and CUT loci reveals
carbohydrate scavenging abilities in other bacteria
One of the main surprises of this work was the observation that the
large majority of Xcc TBDRs (35 out of 72) display significant
similarities with TBDRs of bacteria which are mostly found in
aquatic habitats and which are not closely related to Xanthomonads (see Table S5). Phylogenetic studies place Xanthomonads as
a deep branch in the c-Proteobacteria class, close to that of the bProteobacteria [66,82]. The bacteria possessing similar TBDRs
belong either to the a-Proteobacteria class or to the Alteromonadales order of the c-Proteobacteria. Most bacteria in this latter
order have been collected from diverse aquatic environments and
belong mainly to 6 different genera: Alteromonas, Colwellia,
Idiomarina, Pseudoalteromonas, Saccharophagus and Shewanella. The aProteobacteria mentioned in this study are also found mostly in
aquatic habitats and are members of several orders, including
Caulobacterales, Sphingomonadales, Rhodospirillales and Rhodobacterales. Similarities were not restricted to TBDRs genes, and
genome context analyses showed that at least 8 putative (partial)
CUT loci identified in Xanthomonas species were conserved among
members of these aquatic bacteria. Several of them are found in
association with abiotic or biotic surfaces, such as the surface of
alga or shellfish. Some are adapted to live in oligotrophic
environments, while others are abundant in nutrient-rich habitats
or in association with particulate of organic matter. Some others
are associated with decaying tissues of plant or algae. Although
Xanthomonas seems to be very different from these bacteria in terms
of habitat, lifestyle and taxonomy, we identified several common
traits. All these bacteria belong to the class showing a TBDR
overrepresentation (with TBDRs/Mbp ratios.7.4). Most of them
are able to degrade a wide variety of plant molecules or other
complex carbohydrates such as chitin, alginate, as well as various
aromatic compounds. This combination of characters and the
similarities with Xcc suggest the existence of a shared biology which
might be related to the ability to scavenge carbohydrates. If the
situation in these bacteria is similar to that observed in Xcc, we can
speculate that there is a significant proportion of TBDRs involved
in the uptake of molecules other than iron-siderophores complexes. Moreover, as previously noticed [33], we observed that
bacteria having a restricted habitat, such as obligate parasites or
symbionts, have no or only a very small number of TBDRs. Thus,
these proteins might be considered as good indicators of bacterial
lifestyle.
Common themes between Xanthomonas and
aquatic bacteria
It is clear that the life cycle of Xanthomonas spp. presents common
features with the different lifestyles of bacteria described above.
The leaf surfaces encountered by Xanthomonas during their
epiphytic development might correspond to an oligotrophic
environment. Plant leaves release secondary metabolites which
can be used by epiphytic microorganisms [83]. However, carbon
resources have been shown to be the most limiting resource on
plants [91]. Simple sugars, like glucose, fructose and sucrose, are
the most dominant carbon sources on plants that have been
examined [92]. Studies with bacterial biosensors in situ on plants
revealed a high heterogeneity of sucrose availability, with an
average accessibility of only about 20 mM on moist bean leaves
[93]. Interestingly, this sucrose concentration allowed the induction of suxA gene in our expression assays, thus suggesting that
the sux uptake system might function on plant surfaces. The
involvement of sux locus in epiphytic life is now being investigated.
Furthermore, TBDRs might facilitate the exploitation of plant
debris generated during disease development, thus resembling
bacteria living on dead tissues. This phenomenon might have an
impact on Xanthomonas life cycle by increasing Xanthomonas
population size and thus facilitating new infections.
Association between TBDRs and carbohydrate
utilization in other Proteobacteria
TBDRs and virulence on plants
A specific role for TBDRs has already been attributed to bacteria
displaying an overrepresentation of this protein family. Sphingomonads are widely distributed in nature and are mostly found in
soils and aquatic environments. Some strains are associated with
plants [83]. Strains like Sphingomonas sp. A1 are able to take up and
metabolize macromolecules such as alginate produced by brown
seaweed and certain bacteria. This uptake is mediated by large
structures, so called superchannels, which form a pit in the outer
membrane, and which function as a funnel or concentrator (for
review, see [84]). Four TBDRs seem to be part of this
superstructure and are thus proposed to participate in alginate
transport [85]. Recently, the manipulation of these superchannels
revealed the importance of these structures in bioremediation [86].
In C. crescentus, beside the prediction of 67 TBDRs, a genome
analysis revealed the presence of several genes for the breakdown
of plant polysaccharides as well as transport systems, suggesting
that plant polymers are a significant source of nutriment for this
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It appears that in Xanthomonas, some TBDRs such as SuxA play an
additional and specific role by controlling virulence. Therefore, it
is tempting to propose that a strategy shared with non-pathogenic
bacteria and based on the active uptake of plant-derived nutrients,
could have been diverted by Xanthomonas for the control of
pathogenicity. It is worth noting that several phytopathogenic
bacteria such as P. syringae or E. carotovora subsp. Atroseptica, as well
as Pseudomonas species associated with plants, have an intermediate
overrepresentation of TBDRs, suggesting that this feature could be
shared by other bacteria interacting with plants. In R. solanacearum,
the expression of hrp genes coding for a type III secretion system
(TTSS) which controls disease and HR development, is specifically
induced upon contact with plant cells [94]. This signaling is
mediated by PrhA, a TBDR belonging to the transducer subclass.
This receptor senses contact with plant cells and transduces this
signal into the cytoplasm via PrhI and PrhR, which are FecI/FecR
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TBDRs and Carbohydrate Uptake
the evolution of Xanthomonads and thus played a key role in their
adaptation to plants. Most bacteria showing a TBDR overrepresentation possess TBDRs or CUT loci conserved with Xcc.
However, there is a main exception with members of the
Bacteroidetes phylum, as none of the TBDRs characterized in
this phylum showed very significant similarities with those
identified in Xcc. Bacteroidetes can be encountered in two very
different niches, the marine environment and the human intestine
[99,100]. Marine Bacteroidetes such as Gramella forsetii are
associated with particulate of organic matter [99], whereas those
found in the intestine are assembled on partially digested food
particles [101]. In both cases, these bacteria are able to consume
biopolymers. Bacteroides thetaiotaomicron, which is a prominent
mutualist in the distal intestine of adult humans, has the largest
ensemble of TBDR genes and glycobiome yet reported (Table S2).
Studies have shown that this bacterium has a carbohydrate
foraging behavior [100–102]. It is well known to bind starch
through a protein complex of the outer membrane, which
comprises SusD and the SusC TBDR protein [103]. One hundred
and six paralogs of SusC and fifty three paralogs of SusD were
predicted in the B. thetaiotaomicron genome [104]. In our study, we
did not detect in Xanthomonas genomes any protein displaying
similarities with SusD. Moreover, none of the TBDRs identified in
Xcc showed strong similarities with SusC. A Blast analysis
suggested that the SusC TBDR and the SusD OMP are
specifically conserved in Bacteroidetes (data not shown). These
results suggest that TBDRs involved in carbohydrate uptake
evolved independently in Proteobacteria and Bacteroidetes. The
analysis of the function and evolution of TBDRs in these phyla will
certainly help us to better understand the adaptation of bacteria to
their environment. This knowledge, which concerns the utilization
of plant molecules that are widespread in the environment, will
have a major impact not only in plant pathology, but also in
human health as well as in the cycling of carbon and geobiology in
marine environments.
homologs [94–96]. Apparently, this regulatory system does not
require the transport of plant molecules [94]. Although Xac, Xcc,
Xoo or Xcv do not carry any TBDR showing a high homology with
PrhA, recently a TBDR controlling both HR and pathogenicity
was described in X. oryzae pv. oryzicola, the causal agent of bacterial
leaf streak of rice. This TBDR does not belong to the transducer
subclass and only shows a weak similarity with PrhA [97]. This
TBDR gene is highly conserved in Xoo strain MAFF 311018
(XOO0785), Xcv (XCV3654) and Xcc (XCC0674). Interestingly, in
Xoo it is located close to trh (XOO0783), a regulatory gene
controlling the expression of hrp genes [53]. The orthologue of this
regulatory gene is also conserved in Xcc (XCC0672), in the vicinity
of the XCC0674 TBDR gene. Thus, it is possible to speculate that
both genes might be involved in a common circuit controlling the
expression of hrp genes in Xanthomonas spp. In our study, a mutation
in XCC0674 did not affect the pathogenicity of Xcc. However, as
there are more TBDRs in Xcc than in Xoo strains, we can speculate
that functional redundancy might have masked the effect of the
mutation. Further work is needed to see whether these genes
regulate hrp genes in Xcc. Nevertheless, we established a link
between hrp genes and TBDRs in Xcc. Indeed, we observed that 2
Xcc TBDR genes are regulated by the hrpG and hrpX regulatory
genes. Therefore, it seems that there is an overlap between hrp
genes and at least 2 TBDR genes. What is the function of these
two TBDRs? Are they specifically required during the infection of
plants, through the action of the hrp regulon, to exploit specific
released plant molecules?
What other functions for Xcc TBDRs?
We have been able to define a putative role for 21 TBDRs out of
72 identified in Xcc. The nature of the molecules putatively
transported by the other TBDRs remains to be discovered. It is
probable that TBDRs are not restricted to the transport of
carbohydrates and that they can take up various other molecules
produced by plants. Azospirillum irakensis, a plant associated
bacterium, is able to metabolize salicin, a phenolic glycoside
produced by plants. Interestingly, the sal operon, which controls
the degradation of salicin, contains a TBDR gene which was
proposed to be involved in salicin uptake [98]. Thus, secondary
metabolites including phenolic compounds might be assimilated
through TBDRs. We are now trying to characterize which new
molecules may be transported by Xcc TBDRs, to better understand
the adaptation of this pathogen to host plants.
MATERIALS AND METHODS
Bacterial strains, plasmids and growth conditions
The Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) strains and plasmids
used in this study are listed in Table S6. Xcc cells were grown at
30uC in MOKA rich medium (Yeast Extract 4 g/l, Casamino
acids 8 g/l, K2HPO4 2 g/l, MgSO4.7H2O 0.3 g/l) or in MME
minimal medium [12]. E. coli cells were grown on LB medium
[105]. Antibiotics were used at the following concentrations for
Xcc: rifampicin, 50 mg/ml; kanamycin: 50 mg/ml; tetracycline:
5 mg/ml. Antibiotics were used at the following concentrations for
E. coli: ampicillin, 50 mg/ml; kanamycin: 50 mg/ml; tetracycline:
10 mg/ml.
Growth curves were generated using the Bioscreen C instrument (Labsystems, Helsinki, Finland) in three independent
experiments. Growth measurements were realized in 200-well
microtiter plates on 350 ml volumes of a minimal medium
containing 20 mM sucrose, inoculated at an OD600 = 0.15 from
a washed starter culture. Non-inoculated wells were used as asepsis
controls. Optical densities at 600 nm values were measured every
30 min over a period of 2 to 3 days at 28uC. The microplates were
shaken for 5 sec before each measurement.
TBDRs, CUT loci and evolution in Gram-negative
bacteria
This work has identified the existence of an ensemble of bacteria
that have an overrepresentation of TBDR genes, and that share
specific loci for the scavenging and utilization of carbohydrates.
They belong to very different lineages in Proteobacteria and this
raises the question of the origin of these TBDRs and CUT loci.
Did they arise by convergent evolution or were they transferred
from species to species by lateral gene transfer? Our data suggest
that this latter hypothesis is most likely. Recently, a genomic
comparative study established that Xcc and Xac have close to 40%
of their genes showing highest similarities to genes from non cProteobacteria, especially from a-Proteobacteria (20%). These
genes seem to belong to genomic islands, denominated ‘‘unusual
best-match islands’’ (UBIs) [82]. Interestingly, among 35 UBIs
thus identified in Xcc genome, 14 contain TBDRs and/or CUT
loci. However, there was no significant difference between the GC
content of each of these loci and the overall content of the genome.
It is therefore possible that these loci were acquired very early in
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Construction of Xanthomonas campestris pv.
campestris mutants.
Insertion mutants were constructed using the suicide plasmid
pVO155 [36]. Oligonucleotide primers used for PCR amplification will be provided upon request. Amplicons were 300 bp in
17
February 2007 | Issue 2 | e224
62
TBDRs and Carbohydrate Uptake
scored at days 5, 7 and 9 post-inoculation using a disease index
ranging from 0 (no symptom), to 4 (leaf death).
average. Location of insertions are indicated in Table S6. Deletion
mutants in XCC3358, XCC3359, XCC1990, XCC3209 and
XCC2927 were constructed using the cre-lox system adapted from
Marx and colleagues [37,38]. Deleted regions are indicated in
Table S6.
A fur mutant strain was obtained using the manganese
mutagenesis method [106] in LB medium containing 5 mM
MnCl2. After incubation for 48 h at 30uC, surviving colonies were
harvested for siderophores over-expression on CAS agar plates
[107] adapted for Xanthomonas (K2HPO4 1 g/l; MgSO4 1 mM;
Casamino acids 0.15 g/l; (NH4)2SO4 1 g/l; sucrose 20 mM; CAS
60.5 mg/l; HDTMA 72.9 mg/l; FeCl3 10 mM). A resistant strain
over-expressing siderophores was selected; the fur gene was
sequenced and contains a point mutation (T212A leading to
L71Q).
[14C]sucrose transport experiments
Overnight cultures in minimal medium (MME) without carbon
source (uninduced) or with 20 mM sucrose (induced) were
centrifuged. Pellets were resuspended in MME and the OD600
was adjusted to 1. [14C]sucrose (PerkinElmer, specific activity of
21.8 GBq/mmol) was added to a final concentration of 0.5 mM.
For competition experiments, sucrose, fructose or glucose was
added to [14C]sucrose at a final concentration ranging from 0.5 to
100 mM. After different times, from 20 sec to 2 hours, samples of
0.2 ml were collected on cellulose nitrate filters, washed with
10 ml water, dried, and finally, the radioactivity was determined in
a liquid scintillation counter.
The concentration-dependent initial sucrose transport was
determined using the rapid dilution method as described [22].
Cells were precultured in minimal medium without sugar. After
centrifugation and adjustment to an OD600 of 1, cells were
incubated for 15 sec in presence of 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.25,
0.5, 1, 2.5 and 5 mM [14C]sucrose and 0.2 ml samples were
diluted into 5 ml MME supplemented with 0.1 mM sucrose. Cells
were collected by filtration, washed with 10 ml MME supplemented with 10 mM sucrose, dried and the radioactivity was
determined.
For inhibition of the proton motive force (PMF) with carbonyl
cyanide 3-chlorophenyl-hydrazone (CCCP), cells were incubated
for 10 minutes at 30uC with 20 mM CCCP prior to the addition of
[14C]sucrose.
Plasmid constructions
The XCC3358, XCC3359 and XCC1470 genes (suxA, suxB and fur
respectively, see Figure 6 and Table S6) were amplified by PCR
using appropriately designed primers (Oligonucleotide primers
used for PCR amplification will be provided upon request). PCR
products corresponding to suxA and suxB genes were cloned into
pCZ525, a derivative of pSC154 [108], without cyaA’ coding
sequence. The obtained plasmids were cloned into pLAFR6 [109]
to give pL-XCC3358 and pL-XCC3359 respectively. The PCR
product corresponding to the fur gene with its promoter and
terminator sequences was cloned into pFAJ1700 [110] to give pLXCC1470.
The XCC3358, XCC1990 and XCC3209 promoter regions (see
Table S6) were PCR amplified with appropriately designed
primers. These promoter regions were cloned as HindIII-XbaI
fragments, into the pCZ750 plasmid, a pFAJ1700 [110] derivative
containing the KpnI-AscI lacZ gene from the pCZ367 plasmid
[108].
In silico analysis
Location of the signal sequence responsible for the outer
membrane localization was determined using the SignalP 3.0
server [115] (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) with default parameters for Gram-negative bacteria.
Comparison alignments used to identify the TonB-box were
realized using ClustalW [64] (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) or
Multalin [116] (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.
html) softwares.
b-sheets in the last 50 amino-acids of Xcc TBDRs were located
using the secondary structure prediction method [117] on the
PSIPRED Protein Structure Prediction Server [118,119] (http://
bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/).
The MotifSampler program [41,42] was used to identify a motif
corresponding to the Xcc Fux-box upstream of the 9 Fur-repressed
TBDR and Ps-TBDR genes. MotifScanner program [42] or the
PatScan pattern matcher software [47] were used with the
identified motif to locate all the Fur-boxes in the Xcc genome.
Pip boxes (TTCGCN15TTCGC) [120] and hrpII boxes
(TTCGN16TTCG) [121] were identified in the Xcc genome using
the PatScan software [47] http://www-unix.mcs.anl.gov/compbio/PatScan/HTML/patscan.html).
For phylogenetic analysis, amino acid sequences were aligned
and phylogenetic trees were reconstructed by the neighbor-joining
method as implemented in ClustalX [122].
Expression studies
b-galactosidase and b-glucuronidase assays: bacterial cultures in
the appropriate medium were harvested at different time points
and b-galactosidase and b-glucuronidase assays were performed as
previously described [111,112].
Quantitative RT-PCR (qRT-PCR): a 6 hour bacterial culture
in the appropriate medium was harvested at an OD600 = 0.4 to
0.6. RNA were extracted using the Rneasy Mini Kit (QIAGEN).
One mg of RNA was treated with RNase-free DNase I (GEHealthcare) for 15 min at 37uC. After DNase inactivation (10 min
at 75uC), RNA were reverse-transcribed by Superscript II
(Invitrogen) using random hexamers (Biolabs), for 2 min at 25uC
followed by 1 h at 42uC. Quantitative-PCR amplification was
performed on Light Cycler (Roche): 10 min 95uC, 1 cycle; 10 sec
95uC, 10 sec 65uC, 20 sec 72uC, 40 to 50 cycles). Experiments
were carried out in three independent biological experiments.
Oligonucleotide primers used for quantitative-PCR amplification
will be provided upon request. As a control for real-time PCR, we
used the 16S rRNA as described [113]. The 16S rRNA forward
primer (59-TGACGGTACCCAAAGAATAAGCA-39) and 16S
rRNA reverse primer (59-ACGCTTGCACCCTTCGTATTA-39)
amplicon was 72 bp in length.
SUPPORTING INFORMATION
Figure S1 Phylogenetic tree of the family of TonB-dependent
receptor proteins from Xanthomonas campestris pv. campestris
strains ATCC33913 and 8004, Xanthomonas axonopodis pv. citri
strain 306, Xanthomonas campestris pv. vesicatoria strain 85–10,
Xanthomonas oryzae pv. oryzae strains KACC10331 and
MAFF311018 and Xylella fastidiosa strains 9a5c and PD.
Pathogenicity tests
Pathogenicity tests were conducted on Arabidopsis thaliana Sf-2
ecotype as previously described [114]. Each strain was tested on
sets of 4 plants with 4 leaves per plant. Disease development was
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TBDRs and Carbohydrate Uptake
Found at: doi:10.1371/journal.pone.0000224.s001 (0.04 MB
PDF)
definition of putative CUT loci, conservation in Xanthomonads or
in other genera, and TBDR conservation in Pseudomonas
aeruginosa PAO1.
Found at: doi:10.1371/journal.pone.0000224.s005 (0.18 MB
XLS)
Genome context of genes associated with TonBdependent receptors present in putative (partial) CUT loci of
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) and conservation in
non related bacteria. Homologous genes are marked by matching
colors. White color indicates non conserved genes. For conserved
genes, percentages of identity and similarity to the corresponding
Xcc gene are indicated beneath.
Found at: doi:10.1371/journal.pone.0000224.s002 (0.24 MB
PDF)
Figure S2
Table S4 Differential expression ratios of Xanthomonas campestris pv. campestris TonB-dependent receptor (TBDR) pVO155
insertion mutants.
Found at: doi:10.1371/journal.pone.0000224.s006 (0.03 MB
XLS)
Table S5 Conservation of Xanthomonas campestris pv. cam-
Table S1 Regions and domains of Xanthomonas campestris pv.
pestris (Xcc) TonB-dependent receptors (TBDRs) beside Xanthomonads orthologies.
Found at: doi:10.1371/journal.pone.0000224.s007 (0.04 MB
XLS)
campestris putative TonB-dependent receptors (TBDRs).
Found at: doi:10.1371/journal.pone.0000224.s003 (0.04 MB
XLS)
Distribution of TonB-dependent receptors in 226
sequenced Gram negative bacterial genomes. The EMBL-EBI,
Integr8 web portal (http://www.ebi.ac.uk/integr8/EBI-Integr8HomePage.do) and the NCBI ENTREZ Genome Project
database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db =
genomeprj) were used to select sequenced bacterial genomes.
TonB-dependent receptors (TBDRs) were detected by screening
the Pfam database and the UniprotKB protein knowledge
database using the two Pfam domains (PF07715, Plug; PF00593,
TonB_dep_Rec). Only proteins displaying the two Pfam domains
were considered.
Found at: doi:10.1371/journal.pone.0000224.s004 (0.08 MB
XLS)
Table S2
List of plasmids and Xanthomonas campestris pv.
campestris strains used or generated in this study.
Found at: doi:10.1371/journal.pone.0000224.s008 (0.03 MB
XLS)
Table S6
ACKNOWLEDGMENTS
We would like to thank J. Cullimore for critical comments on the
manuscript, J. Gouzy and S. Carrere for help in sequence analysis.
Author Contributions
Conceived and designed the experiments: EL SB DM MA. Performed the
experiments: EL SB DM AB ML CG ND JV. Analyzed the data: EL SB
DM MA. Contributed reagents/materials/analysis tools: EL SB DM MA.
Wrote the paper: EL MA.
Genome context of Xanthomonas campestris pv.
campestris (Xcc) TonB-dependent receptor (TBDR) genes and
Table S3
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100
XC 4327 Q4UNL1
XCC4132 Q8P3D9
100
XC 4224 Q4UNW1
100
XOO0249 Q5H6B7
100
100
XOO0228 Q2P8Z4 M
XAC4274 Q8PER6
100
XCV4376 Q3BMA6
XF 1036 Q9PEJ2
100
PD 0318 Q87EI9
XCC4131 Q8P3E0
100
XC 4223 Q4UNW2
100
XAC4273 Q8PER7
100
XCV4374 Q3BMA8
100
XOO0250 Q5H6B6
100
XOO0229 Q2P8Z3 M
XCC2208 Q8P8N2
100
XC 1910 Q4UVF0
100
XAC2312 Q8PK64
100
XCV2510 Q3BSM2
97
XOO2036 Q2P3T6 M
68
XOO2166 Q5H0V1
XCC2497 Q8P7W1
100
XC 1619 Q4UW88
100
XAC2672 Q8PJ70
100
XCV2823 Q3BRQ9
100
XOO3204 Q5GXW3
100
XOO3037 Q2P0Y5 M
XAC0999 Q8PNQ5
90
XCV1027 Q3BWV5
100
XOO0978 Q5H489
100
XOO0893 Q2P729 M
XOO1959 Q5H1F8
100
XOO1850 Q2P4C2 M
XAC2185 Q8PKI8
XCC3714 Q8P4J3
100
XC 3785 Q4UQ48
XAC3756 Q8PG61
100
XCV3875 Q3BNQ7
100
XOO0626
Q5H590
100
XOO0576 Q2P7Z6 M
XCC4162 Q8P3B4
100
XC 4249 Q4UNT6
XCC1391 Q8PAT6
100
XC 2846 Q4USS8
100
XAC1435 Q8PMJ2
68
XOO1992 Q5H1C5
100
XOO1883 Q2P489 M
XCC2772 Q8P742
100
XC 1341 Q4UX13
100
XAC2941 Q8PIF7
100
XCV3085 Q3BQZ7
XF 0599 Q9PFQ8
100
PD 1552 Q87BA6
XCC0394 Q8PDE5
100
XC 0405 Q4UZN4
XAC4062 Q8PFC1
XOO2827 Q5GYZ0
100
XOO2683 Q2P1Y9 M
XAC3529 Q8PGT7
XCC0674 Q8PCQ0
100
XC 3559 Q4UQS1
100
XCV3654 Q3BPC8
100
XOO0861 Q5H4K6
100
XOO0785 Q2P7D7 M
XCC3595 Q8P4W1
100
XC 0558 Q4UZ84
XCC0158 Q8PE25
100
XC 0167 Q4V0B9
100
XAC0176 Q8PQZ3
100
XCV0159 Q3BZC3
XCC3518 Q8P529
100
XC 0642 Q4UZ01
XAC3498 Q8PGW4
XAC3370 Q8PH89
100
XCV3489 Q3BPU3
XAC3201 Q8PHP8
XCC1719 Q8P9X4
100
XC 2512 Q4UTR1
XCC1037 Q8PBT2
100
XC 3209 Q4URS0
100
XAC1143 Q8PND0
100
XCV1161 Q3BWH1
99
XOO0897 Q5H4H0
100
XOO0824 Q2P798 M
XCC1179 Q8PBE3
100
XC 3063 Q4US62
100
XAC1276 Q8PMZ9
100
XCV1326 Q3BW06
XCC3050 Q8P6C0
100
XC 1108 Q4UXP5
100
XAC3176 Q8PHS3
100
XCV3306 Q3BQC6
99
XOO1359 Q5H358
100
XOO1249 Q2P623 M
XCC3036 Q8P6D4
100
XC 1122 Q4UXN1
100
XAC3158 Q8PHU1
100
XCV3290 Q3BQE2
XCC0946 Q8PC09
100
XC 3289 Q4URJ0
79
XAC1023 Q8PNN1
100
100
XCV1053 Q3BWS9
XOO3683 Q5GWI4
100
XOO3478 Q2NZP3 M
XAC4368 Q8PEI1
100
XCC4235 Q8P343
100
XC 4325 Q4UNL3
XCC3279 Q8P5Q7
100
XC 0885 Q4UYB4
100
XAC3427 Q8PH33
99
XCV3542 Q3BPP0
XOO3861 Q5GW06
100
XOO3640 Q2NZ82 M
XCC0098 Q8PE83
100
XC 0101 Q4V0I1
100
XAC0126 Q8PR40
100
XCV0102 Q3BZI0
100
XOO0017 Q5H6Z9
100
XOO0018 Q2P9K4 M
XCC3474 Q8P569
100
XC
0687
Q4UYV7
100
XAC0653 Q8PPN2
100
XCV0714 Q3BXR8
XCC2046 Q8P920
100
XC 2137 Q4UUT0
XAC0690 Q8PPJ6
100
XCV0751 Q3BXN1
XCC3177 Q8P605
100
XC 0988 Q4UY11
100
XAC3334 Q8PHC5
100
XCV3451 Q3BPY1
100
XOO3403 Q5GXB4
100
XOO3203 Q2P0G9 M
XF 1496 Q9PD83
100
PD 0711 Q87DH4
100
100
100
100
100
99
100
100
90
73
100
53
100
36
100
99
95
99
85
99
48
100
100
100
100
96
100
100
98
100
100
52
100
100
100
100
100
76
77
25
33
86
100
100
100
52
100
64
99
100
100
100
44
71
100
100
98
70
76
54
84
96
100
100
100
100
100
100
100
100
TRICHOTOMY
26
100
90
97
100
79
100
78
100
99
100
49
76
43
100
100
79
65
100
11
39
100
99
100
94
28
100
100
60
98
100
100
100
1A
100
100
100
99
100
100
100
1B
1C
1
1D
1E
1F
1G
1H
2A
2B
2
3A
3B
3
0.1
XCC : Xanthomonas campestris pv. campestris, strain ATCC33913
XC : Xanthomonas campestris pv. campestris, strain 8004
XAC : Xanthomonas axonopodis pv. citri, strain 306
XCV : Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, strain 85-10
XOO : Xanthomonas oryzae pv. oryzae, strain KACC10331
XOO M : Xanthomonas oryzae pv. oryzae, strain MAFF311018
XF : Xylella fastidiosa, strain 9a5c
PD : Xylella fastidiosa, strain PD
TBDR gene induced by iron starvation
TBDR gene induced by plant carbohydrates
TBDR of the oar subclass
67
68
Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444 (Saro)
Sphingopyxis alaskensis RB2256 (Sala)
Saccharophagus degradans 2-40 (Sde)
Shewanella frigidimarina NCIMB 400 (Sfri)
Pseudoalteromonas atlantica T6c (Patl)
Saccharophagus degradans 2-40 (Sde)
Colwellia psychrerythraea 34H (CPS)
Sphingomonas sp. (SKA58)
Caulobacter crescentus CB15 (CC)
Xanthomonas campestris pv. campestris str. AT 33913 (XCC)
Xanthomonas campestris pv. campestris str. AT 33913 (XCC)
C
Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 (PSHAa)
Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444 (Saro)
Erythrobacter litoralis HTCC2594 (ELI)
Caulobacter crescentus CB15 (CC)
Sphingopyxis alaskensis RB2256 (Sala)
Maricaulis maris MCS10 (Mmar10)
Sphingomonas sp. (SKA58)
Xanthomonas campestris pv. campestris str. AT 33913 (XCC)
B
Sphingomonas sp. (SKA58)
Sphingopyxis alaskensis RB2256 (Sala)
Xanthomonas campestris pv. campestris str. AT 33913 (XCC)
A
1885
ROK
03145
-amylase, putative
2472
IDS1
transposase
1350
Hyp. Prot.
50/66
1886
2471
2734
59/71
2736
51/64
38/54
30/42
4285
Metal dependent
phosphohydrolase
1602
!-lactamase-like
1396
1314
0913
Hyp. Prot.
Regulatory protein, LacI
Periplasmic binding protein
2832
Hyp. Prot.
3738
Hyp. Prot.
00630
Catalase
0998
ABC transporter,
ATP-binding protein
2829
3962
34/51
03165
36/51
45/62
42/59
39/56
40/56
44/60
41/57
42/58
34/48
45/62
Saro_1603
35/49
Sala_0914
35/49
Sde_1397
37/52
Sfri_1313
33/50
Patl_4286
34/49
Sde_2831
35/51
CPS_3737
36/50
SKA58_00625
41/56
48/60
42/59
0915
1398
1312
1604
35/54
42/57
0916
43/59
1399
44/63
1311
50/66
33/51
50/60
1605
46/61
47/62
0917
46/63
1400
40/55
TonB-like protein
1003
55/71
47/62
1606
46/60
2827
1308
Hyp. Prot.
59/71
2283
26/38
2739
58/73
0918
56/73
1022
2465
0919
2282
03185
1608
1357
-amylase
1893
Glucose-6-phosphate
1-dehydrogenase
24/32
01350
2741
2463
01355
Hypothetical sugar
transferase protein
1025
ABC transporter
related
Threonyl-tRNA
synthetase
49/64
1024
Putative esterase
subunit
2464
Tryptophan halogenase, putative
0186
Oxidoreductase,
53/67
2740
Glucoamylase
Glucan endo-1,3- !-Dglucosidase
59/77
1356
51/67
1892
03180
-glucosidase
51/66
0185
01340
43/59
1023
Maltose transport gene
repressor / LacI family
Hyp. Prot.
Cyclomaltodextrin
glucanotransferase /
-amylase
66/80
1021
Dihydroxy-acid dehydratase
60/75
1607
51/67
1402
Histidyl-tRNA
synthetase, class IIa
48/66
58/75
1309
50/69
1401
48/66
4290
Hyp. Prot.
Arabinogalactan endo1,4- !-galactosidase
3732
Hyp. Cation symporter
Prot. family protein
00605
2824
Glyscosyl transferase,
group 1 family protein
3967
2466
Sugar
transporter
protein / MFS1
1020
Hyp. Prot.
2203
Hyp. Prot.
Hyp. Prot.
1355
Glycosidase
51/65
1891
47/60
03175
38/55
2284
50/63
0184
51/66
01335
1019
!-glucosidase
Glucan endo-1,3-!-Dglucosidase
47/68
1310
58/74
40/59
55/71
4289
50/68
2828
56/73
3734
59/73
48/68
50/66
56/71
1002
58/71
50/66
3966
2825
55/69
2738
2467
Tryptophan
halogenase
50/62
00610
23/39
1354
27/38
1890
03170
1018
Endonuclease/
phosphatase
2204
ABC
transporter
sugar
permease
Hyp. Prot. / Amylo- 1,6-glucosidase
2285
-amylase
25/38
0183
35/53
43/61
32/50
54/70
48/64
4288
47/66
2829
40/62
Tryptophan halogenase
43/64
4287
39/59
43/62
2830
39/55
39/56
3735
47/62
00615
50/65
1001
51/64
53/66
2826
53/64
01330
2737
Hyp. Prot. /
Pass1-related
protein
3965
42/59
41/53
43/60
3736
35/56
35/52
00620
45/61
1000
41/57
CC0999
3964
37/51
2827
Hyp. Prot. /
SapC-related
protein
1353
Tryptophan halogenase
1889
Tryptophan halogenase
XCC3963
XCC2828
TonB-dependent receptor
PSHAa1352
35/51
66/78
Saro_1888
1887
35/52
ELI_03160
2286
Tryptophan halogenase
37/54
0182
CC2287
37/55
2468
Tryptophan halogenase
Mmar10_2735
28/39
39/52
Sala_0181
14307
-glucosidase
01325
1351
Peptidase
14312
55/71
Hyp. Prot.
1017
2205
ABC
transporter
sugar
permease
!-galactosidase
2206
ABC transporter
sugar binding
protein
SKA58_01320
XCC2469
TonB-dependent receptor
59/70
Glutathione Stransferase
03155
2288
Tryptophan halogenase
0180
Hyp. Prot
33/51
SKA58_14317
1016
50/63
39/57
2207
Hyp. Prot.
Sala_1015
XCC2208
TonB-dependent receptor
Tryptophan halogenase
59/70
01315
49/68
01310
Putative inositol
monophosphatase
2470
IS1479
transposase
45/60
14322
03150
-glucosidase /
-amylase
14327
Periplasmic !-glucosidase
1014
2209
Transcriptional
regulator LacI
family
Glycoside hydrolase,
family 3-like protein
Hyp. Hyp.
Prot. Prot.
Figure S2
1018
Hyp. Prot.
Sphingomonas sp. (SKA58)
Pseudoalteromonas atlantica T6c (Patl)
Saccharophagus degradans 2-40 (Sde)
Caulobacter crescentus CB15 (CC)
Xanthomonas campestris pv. campestris str. AT 33913 (XCC)
G
Maricaulis maris MCS10 (Mmar10)
Caulobacter crescentus CB15 (CC)
Sphingomonas sp. (SKA58)
Sphingopyxis alaskensis RB2256 (Sala)
Xanthomonas campestris pv. campestris str. AT 33913 (XCC)
F
Shewanella denitrificans OS217 (Sden)
Colwellia psychrerythraea 34H (CPS)
Saccharophagus degradans 2-40 (Sde)
Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444 (Saro)
Caulobacter crescentus CB15 (CC)
Xanthomonas campestris pv. campestris str. AT 33913 (XCC)
E
Pseudoalteromonas tunicata D2 (PTD2)
Shewanella sp. MR-7 (Shewmr7)
Shewanella frigidimarina NCIMB 400 (Sfri)
Saccharophagus degradans 2-40 (Sde)
Erythrobacter litoralis HTCC2594 (ELI)
Sphingomonas sp. SKA58 (SKA58)
Caulobacter crescentus CB15 (CC)
Xanthomonas campestris pv. campestris str. AT 33913 (XCC)
D
0059
51/68
1019
NLP/P60
protein
3407
3034
ATP-dependent
RNA helicase
32/49
03850
ATPase
3713
54/65
03845
Patl3777
31/48
0172
37/53
66/75
03835
36/53
SKA58_03840
3775
37/54
51/65
Patl_3776
3610
37/55
59/69
Sde_3611
1518
39/54
3715
53/66
0443
2412
3037
36/58
59/72
03830
54/68
1519
3609
45/58
2705
36/55
42/62
3038
36/56
3774
3716
38/55
3608
59/72
03825
49/63
3773
52/66
1520
3717
ABC
transporter
ATP-binding
protein
Mmar10_0379
39/55
CC0171
39/56
SKA58_09651
40/56
Sala_0313
XCC3427
3412
3039
Hyp. Prot.
3413
2703
Hyp. Prot.
39/55
0378
03820
Hyp. Prot.
3772
Phytanoyl-CoA
dioxygenase
3607
Pilus retraction protein PilT
1521
Antibiotic acyltransferase
3718
Hyp. Prot.
38/54
0170
42/56
09656
46/58
0312
3428
41/60
3960
3959
38/58
2702
1026
0311
Transcriptional
regulator,
XRE family
3719
Transcriptional
regulator
0169
Hyp. Prot.
09661
TPR repeat
protein
Leu
tRNA
3429
Hyp. Prot.
53/68
0377
Ornithine decarboxylase
2701
51/69
48/64
3042
3041
SapC
41/58
2416
1027
3415
61/72
56/68
3040
2415
51/66
ATPase
3414
Transcriptional
regulator, GntR Type II secretion
family
system protein N
3986
1132
UDP-N-acetylglucosamine
diphosphorylase
Transporter
04225
Hyp. Prot.
14632
Transposase
Hyp. Prot.
2414
1133
Transporter
Glucose /
Galactose
transporter
Hyp. prot. /
putative lipoprotein
47/60
2704
1025
!-hexosaminidase
2413
Phosphoenolpyruvate-protein
phosphotransferase
0442
TonB-dependent receptor
TonB-dependent receptor
2706
ATPase
1024
Hyp. Prot.
Hyp. Prot. / "-1pyrroline-5carboxylate
reductase
1023
Tryptophan halogenase,
putative
0059
molybdenum
cofactor synthesis
3961
Transcriptional
regulator LacI
family
Multiple antibiotic resistance
(MarC)-related protein
3411
Glutaminefructose-6phosphate
transaminase
04230
Hyp. Prot.
22207
1134
Fructokinase
45/60
3360
NonF-related
protein
Fructokinase
14627
putative sirtuin
0065
3987
Fructokinase
41/53
3962
04235
14622
Levansucrase
43/55
1135
3359
Amylosucrase
22202
PTS system,
N-acetylglucosamine
3410
N-acetyl
glucosamine-6phosphate
deacetylase
! -N-acetylhexosaminidase
Hyp. Prot. / Putative
ABC transporter
30/40
0380
09646
Hyp. Prot.
35/46
0314
3426
xcsC
CC1517
XCC3714
TonB-dependent receptor
39/57
55/70
0381
0173
0174
09641
65/78
32/47
0382
Peptidase M24
Penicillin-binding protein, 1A family
1516
09636
57/72
Hyp. Prot.
48/64
45/63
58/71
2OG-Fe(II) oxygenase
0315
3425
xcsD
2707
Tryptophan halogenase
1022
Tryptophan halogenase,
putative
3036
Hyp. Prot.
2411
Twin-arginine translocation pathway signal
63/71
0444
SIS domain protein
3409
Nisin-resistance
protein
57/71
PTD2_22197
53/69
55/69
57/71
22192
0316
09631
Methionine biosynthesis MetW
xcsE
Type II secretion system locus / xcs
Sden_2708
34/50
CPS_1021
34/52
55/71
53/69
53/70
Shewmr7_0064
42/58
Sde_3035
40/59
Sfri_3988
42/59
0063
0445
39/55
47/64
Sde_3963
50/65
ELI_04240
54/69
SKA58_14617
53/68
59/74
40/55
Saro_2410
3424
3989
58/74
53/69
3964
CC0446
XCC3408
48/65
63/74
3612
22187
3965
TonB-dependent receptor
0062
3990
09626
NADH dehydrogenase
1020
54/73
Transporter
04245
ATP synthase
38/59
58/74
04250
14612
58/74
42/65
CC1136
1137
XCC3358
TonB-dependent receptor
49/66
3357
MFS sugar
transporter
14607
Sucrose phosphorylase
14602
Hyp. Prot.
CC1138
TonB-dependent receptor
3356
Transcriptional
regulator LacI
family
2709
2409
Methionine synthase, vitamin-B12
independent
0447
!-N-acetylhexosaminidase, putative
2710
22182
tRNA
nucleotidyltransferase
22177
Hyp. Prot.
0061
3991
Transcriptional
regulator, LacI family
Glucose-6-phosphate isomerase
0060
Major facilitator
superfamily MFS_1
3992
NLP/P60
protein
04255
Hyp. Prot.
3355
acetoacetylCoA reductase
40/59
1028
3043
Hyp. Prot.
1029
Hyp. Prot.
2417
!-N-acetylhexosaminidase
Figure S2 - continued
69
Table S1
Gene ID
a
XCC0050
XCC0098
XCC0119
XCC0120
XCC0158
XCC0304 (Ct)
XCC0305 (Nt)
XCC0394
XCC0397
XCC0531
XCC0674
XCC0759
XCC0768
XCC0946
XCC1037
XCC1041
XCC1179
XCC1258
XCC1340
XCC1391
XCC1719
XCC1749
XCC1750 (Nt)
XCC1751 (Ct)
XCC1892
XCC1990
XCC2046
XCC2208
XCC2385
XCC2395
XCC2400
XCC2469
XCC2497
XCC2572
XCC2573
XCC2658
XCC2665
XCC2772
XCC2828
XCC2867
XCC2887
XCC2944
XCC3036
XCC3043
XCC3045
XCC3046
XCC3050
XCC3067
XCC3079
XCC3161
XCC3177
XCC3209
XCC3215 (Ct)
XCC3216 (Nt)
XCC3270 (Ct)
XCC3271 (Nt)
XCC3279
XCC3316
XCC3358
XCC3405
XCC3408
XCC3427
XCC3474
XCC3518
XCC3595
XCC3635
XCC3714
XCC3963
XCC4052
XCC4120
XCC4131
XCC4132
XCC4162
XCC4222
XCC4235
XCC4237
Signal sequence
cleavage position
44-45
43-44
29-30
36-37
32-33
No
38-39
29-30
27-28
27-28
28-29
38-39/40-41
24-25
26-27
26-27
27-28
28-29/31-32
39-40
25-26
23-24
28-29
41-42
28-29
No
29-30
15-16
21-22
33-34
No
30-31/42-43
43-44
24-25
27-28
31-32
30-31
29-30
24-25
22-23
24-25
33-34
24-25
22-23
28-29
23-24
36-37
26-27
26-27
26-27
23-24
30-31
41-42
24-25
No
37-38
No
23-24
43-44
30-31
33-34
27-28
27-28
29-30
33-34
44-45
31-32/32-33
32-33
29-30
27-28
37-38
28-29
32-33
32-33
36-37
28-29
35-36
33-34
b
c
reannotation
No
No
No
No
No
No
No
No
No
23 aa removal
No
No
No
30 aa removal
No
131 aa extension
18 aa removal
No
No
No
41 aa removal
No
68 aa removal
No
17 aa extension
No
No
No
No
No
No
22 aa removal
No
No
No
No
No
No
No
No
No
No
No
No
No
49 aa extension
No
No
No
No
No
74 aa removal
No
No
No
No
No
No
No
No
16 aa extension
No
No
No
No
39 aa removal
No
No
No
20 aa extension
No
No
No
No
No
No
Protein size Cleaved protein
(aa)
size (aa)
887
727
922
1066
746
294
548
711
873
961
722
933
743
774
738
1034
771
894
1038
713
846
970
662
200
1030
872
682
992
839
966
945
920
1085
996
1015
688
792
772
1047
928
913
878
802
793
806
799
709
626
811
978
689
904
506
227
495
605
763
963
824
959
873
884
794
754
824
884
712
999
900
980
1011
1010
699
976
783
1014
843
684
893
1030
714
nd
510
682
846
934
694
895/893
719
748
712
1007
743/740
855
1013
690
818
929
634
nd
1001
857
661
959
nd
936/924
902
896
1058
965
985
659
768
750
1023
895
889
856
774
770
770
773
683
600
788
948
648
880
nd
190
nd
582
720
933
791
932
846
855
761
710
793/792
852
683
972
863
952
979
978
663
948
748
981
Plug domain
(PF07715)
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
No
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
No
Yes
Yes
Yes
No
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
No
Yes
No
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
No
No
Yes
Yes
Yes
Yes
β -barrel domain
(PF00593)
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
No
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
No
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
No
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
No
Yes
No
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
TonB-box
d
sequence
11-TLDAVQV
9-ALPAVQV
13-DLDTVTV
14-DLDRVQV
16-TLDAVSV
12 Ct aa
e
APTVMVGVNVKL
TYTVGLQWDFGS
GRQYLLGLRYKF
GRQYYVGARYKF
PRFVSVSLRWRY
ERNTRLVVTYHF
18-SLDRMIV
8-TLDTVRV
14-EFEVITV
13-TLDAVSV
10-QLDAVNV
15/17-TLDKVTV
15-DFDRLQV
24-QLDAINV
11-RLDAVKV
107-TLDAMQV
14/17-ALDTVTV
22-TLDNITV
30-RLDSVMV
11-ELDGVNV
13/15-TLAALTV
14-DLDTVEV
17-QLDTVQV
DRRVEFTVDHRF
GRALFMRAGLTF
GREVAAEYVFTF
PRTARLTVQVDF
GMTSLVTAKYVF
GRTASVSLAVSW
PRQTFLSLDVKF
PRIVGAQFRANF
TYWVGLRFTPSL
RIVGVSVNVNWQ
GRRYALEATYKF
GRRYMFTLNHRF
PRRIYAQLAYSF
PRTFGMTLRLRY
DRRYSLVLRMNW
19-DLDAVTV
21-TLDAVQV
8-TMGSVDV
96-TLDAVQV
17-DLERLEV
12/24-TLDSVVV
16-TLEQVNV
21-ELDKVQV
93-TLGAVQA
12-DLDKVTV
91-TLGAITV
31-DLDKVVV
14-TLDAVIV
13-DLDAIRV
19-TLDTVNV
7-NLDKIEV
21-ELDTITV
10-ELDAVQV
24-TLDQVQV
10-TLDTVIV
9-TLDTLIV
8-TLDTLIV
16-ALDAVQV
7-DLDQVVV
9-TLDTVIV
11-ELDKVMV
6-TLGKVQV
9-TMDAVTV
DRRYGLTLRASL
GRLAYLGLTYKF
ERTYSLGLRFRL
GRTAFLSFNVKL
MRTFRLAFGLNW
GRTYALGLKVAL
GRFYWARATVKF
GRYFWSRLRVEF
GRTFVLGVNYKF
RWALQLGFRYQF
GRFFYLGTTVKF
PRFVRLSASYDF
GRNASFGVRLFF
GRQYQMSVAYRW
GRSAVLNATFSF
QPRYTLGVRYAF
GRYMYMQYRQRF
GRGYQAQLNFKF
GRRYMATLHLKF
PRTLGLTLTLDL
GAYVYGRINYRW
GALVYANVNYKW
GRYWYGRVTYRF
GRTVTAGLEYTF
AYLLTLRYHPAQ
GAYWYGRVRYSF
ERRYYAGLRLRF
GRALSLSWDWSF
GRAYMLTVGYTY
SRNGMLTFNYTF
15-TLDGVNV
PRSGRVTLSYDF
87-TLDSVTV
5-TLDAVSV
10-TLDRIEI
20-NLDSVFV
11-TLDSVQV
29-TLDEVKV
23-QLDQVVV
8-WLDRIEV
11-TLDQVLV
98/99-LLPTVKV
12-ELDRVQV
7-SLDAVQV
22-TLDTVQV
16-QLDAVQV
27-QLDTVTV
91-TLDAVQV
88-TLDTVTV
5-LLDAIVV
7-QLDAVTV
20-QLDAVSV
77-TLDRVEV
PRQVFASLSYKF
DRFLFVQYNQRF
GRTTSLSLRYDF
GRSWYVRADLKF
GRAFMLSLNFKL
GITYDISVTARF
PRQYLIGVRWAL
PRRLLFNLRANF
PRNVMVTLRGAL
GRTYSLGLRANF
PRTWTVGARLRF
PRYMLGVRYKFW
GRAYYLGVDYAF
GRTVMLGIRGTF
PRTLFMSARIIW
PRSVVLEVGAKF
PRTLSATLSMEF
GREIAAEYVFDF
PRQVFLTLDAKF
PRSFRLTARYDF
TBDR class/subclass f
Ps-TBDR
Ps-TBDR
TBDR
TBDR
TBDR
Ps-TBDR
Ps-TBDR
TBDR
Ps-TBDR
Ps-TBDR
TBDR
TBDR
TBDR
TBDR
TBDR
Ps-TBDR/ non conventional N terminal extension
Ps-TBDR
TBDR
TBDR
TBDR
TBDR
TBDR
Ps-TBDR
Ps-TBDR
TBDR
Ps-TBDR
Ps-TBDR
Ps-TBDR/ Oar-like
Ps-TBDR
TBDR
TBDR
TBDR
Ps-TBDR/ Oar-like
TBDR
TBDR/ Oar-like
TBDR
TBDR
TBDR
TBDR
TBDR
TBDR
TBDR
Ps-TBDR
TBDR
TBDR
TBDR
TBDR
Ps-TBDR
TBDR
TBDR
TBDR
TBDR
Ps-TBDR
Ps-TBDR
Ps-TBDR/ Oar-like
Ps-TBDR/ Oar-like
Ps-TBDR
TBDR
TBDR
TBDR
Ps-TBDR
TBDR
Ps-TBDR
TBDR
Ps-TBDR/ transducer
TBDR
TBDR
TBDR
TBDR
TBDR
Ps-TBDR/ Oar-like
Ps-TBDR/ Oar-like
TBDR
Ps-TBDR
TBDR
TBDR/ Oar-like
a
Gene identification (ID) from Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc ) strain ATCC33913 [14]. Putative TonB-dependent receptors were identified by automatic search in the EBI databank (http://www.ebi.ac.uk/) of
Xcc proteins harboring PF07715 or PF00593 HMMs corresponding to plug and β-barrel domains respectively. TBDRs having all canonical domains are boldfaced; TBDRs with a N-terminal extension are in italics; truncated
TBDRs are underlined. Nt and Ct indicate that the protein corresponds to the N-terminal or C-terminal part of TonB-dependent receptors, respectively.
b
As previously determined [14] or by using the signalP software (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/).
c
Manual reannotation of the start codon downstream (removal) or upstream (extension) from the start codon previously determined [14].
d
Matches to the Xcc TonB-box consensus sequence tLDxVxV determined in this study appear in boldface. Numbers on the left indicated the location of the TonB-box from the cleavage site.
e
Amino acids predicted to form a β-sheet by the PSIPRED secondary structure prediction method (see Materials and Methods for details) are boldfaced.
f
Proteins having a signal sequence, a plug and a β-barrel domain, a TonB-box and a β-sheet in the last 12 C terminal amino-acids ending with an aromatic residue, are named TBDRs. If one domain or sequence is missing, the
protein was named Pseudo-TBDR (Ps-TBDR). For proteins having a N-terminal extension, the subclass is specified.
70
71
Bacteroides thetaiotaomicron
(Caulobacter sp. K31)
Bacteroides fragilis (strain NCTC 9343)
Bacteroides fragilis (strain YCH46)
Pseudoalteromonas atlantica T6c
Xanthomonas axonopodis pv citri (strain 306)
Xanthomonas campestris pv campestris (strain 8004)
Xanthomonas campestris pv campestris (strain ATCC 33913)
Caulobacter crescentus (strain CB15)
(Pseudoalteromonas tunicata D2)
Novosphingobium aromaticivorans (strain DSM 12444)
Xanthomonas campestris pv vesicatoria (strain 85-10)
Saccharophagus degradans (strain 2-40)
(Alteromonas macleodii ' Deep ecotype')
(Sphingomonas sp. SKA58)
Colwellia psychrerythraea (strain 34H)
Pseudomonas fluorescens (strain Pf-5)
Pseudoalteromonas haloplanktis (strain TAC 125)
Sphingopyxis alaskensis RB2256
Shewanella sp. MR-4
Shewanella sp. MR-7
Xanthomonas oryzae pv oryzae (strain KACC10331)
Xanthomonas oryzae pv oryzae (strain MAFF 311018)
Pseudomonas aeruginosa (strain PAO1)
Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14
Gloeobacter violaceus (strain PCC 7421)
(Oceanicaulis alexandrii HTCC2633)
Hyphomonas neptunium ATCC 15444
Idiomarina loihiensis (strain L2-TR)
Pseudomonas entomophila L48
Shewanella frigidimarina NCIMB 400
Nitrosomonas europaea (strain ATCC 19718)
(Pseudomonas aeruginosa PA7)
(Pseudomonas putida F1)
Pseudomonas putida (strain KT2440)
Salinibacter ruber (strain DSM 13855)
Acinetobacter sp. (strainADP1)
Burkholderia sp. (strain 383)
Pseudomonas fluorescens (strain PfO-1)
Gluconobacter oxydans (strain 621H)
Maricaulis maris MCS10
Pseudomonas syringae pv tomato (strain DC3000)
Rhodopseudomonas palustris (strain CGA009)
Shewanella oneidensis (strain MR-1)
Shewanella denitrificans OS217
Methylobacillus flagellatus (strain KT / ATCC 51484 / DSM 6875)
Anabaena sp. (strain PCC 7120)
Pseudomonas syringae pv phaseolicola (strain 1448A / Race 6)
Zymomonas mobilis subsp. mobilis ZM4
Erwinia carotovora subsp. atroseptica (strain SCRI 1043)
Erythrobacter litoralis HTCC2594
Pseudomonas syringae pv syringae B728A
Zymomonas mobilis
Bordetella bronchiseptica (strain RB50 )
Escherichia coli (strain EDL933 / O157:H7)
Escherichia coli O6 (strain CFT073)
Rhodopseudomonas palustris (strain HaA2)
Ralstonia metallidurans (CH34)
Dechloromonas aromatica (strain RCB)
Nitrobacter winogradskyi (strain Nb-255)
Burkholderia cepacia AMMD
Ralstonia solanacearum (GMI1000)
Rhodospirillum rubrum (strain ATCC 11170)
(Acidovorax avenae subsp. citrulli AAC00-1)
Bordetella pertussis (strain Tohama I )
Ralstonia eutropha H16
Bordetella parapertussis (strain 12822)
Escherichia coli (strain Sakai / O157:H7 )
Nitrobacter hamburgensis X14
Yersinia pestis (biovar Mediaevalis , strain 91001)
Yersinia pestis (biovar Mediaevalis , strain KIM5)
Yersinia pestis (biovar Orientalis , strain CO-92)
Chromobacterium violaceum (strain ATCC 12472)
Hahella chejuensis (strain KCTC 2396)
Leptospira interrogans (serovar lai , strain 56601)
Pasteurella multocida (strain Pm70)
Photorhabdus luminescens laumondii (strain TT01)
Yersinia pseudotuberculosis (serovar I, strain IP32953)
Bradyrhizobium japonicum (strain USDA 110)
Porphyromonas gingivalis (strain W83)
Ralstonia eutropha (strain JMP134)
Rhodopseudomonas palustris (strain BisB18)
Vibrio parahaemolyticus (strain RIMD 2210633)
Wolinella succinogenes (strain DSMZ 1740)
Anabaena variabilis (strain ATCC 29413)
Bordetella avium (strain 197N)
Burkholderia pseudomallei (strain 1710b)
Burkholderia pseudomallei (strain K96243)
Burkholderia thailandensis (strain E264)
Leptospira interrogans copenhageni (strain Fiocruz L1-130)
Shigella sonnei (strain Ss046)
Chromohalobacter salexigens DSM 3043
Escherichia coli (strain K12)
Escherichia coli W3110*
Haemophilus influenzae (strain KW20 / Rd)
Neisseria meningitidis A (strain Z2491)
ORGANISM a
120
97
92
92
72
68
65
64
63
58
52
52
51
50
49
43
43
40
38
36
36
36
36
35
35
33
33
32
31
31
31
30
30
30
30
29
27
27
26
25
25
25
24
24
23
22
21
21
21
20
20
19
19
18
18
18
18
17
16
16
15
15
15
14
14
14
13
13
13
13
13
13
12
12
12
12
12
12
11
11
11
11
11
11
10
10
10
10
10
10
10
9
9
9
9
9
TBDR b
CAZy/
CAZy
GENOME
TBDR/ genome TBDR
CAZy d genome size
CDS c
size (Mbp)
SIZE (Mbp)
x103/CDS
x103/CDS
(Mbp)
6.293669
4814
19.1
24.9
370
58.78
76.85
5.876911
5404
16.5
17.9
na
5.2417
4235
17.6
21.7
229
43.68
54.07
5.31099
4612
17.3
19.9
236
44.43
51.17
5.187007
4287
13.9
16.8
123
23.71
28.69
5.274174
4424
12.9
15.4
154
29.19
34.81
5.148708
4273
12.6
15.2
148
28.74
34.63
5.076188
4178
12.6
15.3
152
29.94
36.38
4.016947
3742
15.7
16.8
97
24.14
25.92
4.982425
4504
11.6
12.9
na
3.561584
3324
14.6
15.6
72
20.21
21.66
5.420152
4726
9.6
11
149
27.49
31.52
5.057531
4008
10.1
12.7
339
67.02
84.58
4.413342
4163
11.3
12.0
na
3.948
3914
12.4
12.5
na
5.37318
4900
8
8.8
85
15.81
17.34
7.074893
6137
6.1
7
99
13.99
16.13
3.850272
3486
10.4
11.5
41
10.64
11.76
3.373713
3195
11.3
11.9
45
13.33
14.08
4.706287
3924
7.6
9.2
61
12.96
15.55
4.799109
4014
7.5
9.0
65
13.54
16.19
4.940217
4372
7.3
8.2
119
24.08
27.21
4.941439
4628
7.3
7.8
123
24.89
26.57
6.264403
5569
5.6
6.3
80
12.77
14.36
6.537648
5892
5.4
5.9
80
12.24
13.58
4.659019
4427
7.1
7.5
104
22.32
23.49
3.168201
3029
10.4
10.9
na
3.705021
3505
8.6
9.1
53
14.30
15.12
2.839318
2627
10.9
11.8
28
9.86
10.65
5.88878
5134
5.3
6.0
76
12.91
14.80
4.845257
4029
6.4
7.7
63
13.00
15.64
2.812094
2460
10.7
12.2
49
17.42
19.91
6.663529
5815
4.5
5.2
na
5.925059
5251
5.1
5.7
na
6.181863
5349
4.9
5.6
68
11.00
12.71
3.587328
2833
8.1
10.2
55
15.33
19.41
3.598621
3323
7.5
8.1
43
11.94
12.94
8.676277
7717
3.1
3.5
123
14.17
15.93
6.438405
5736
4
4.5
92
14.28
16.03
2.922384
2660
8.6
9.4
68
23.26
25.56
3.36878
3063
7.4
8.2
61
18.11
19.92
6.53826
5606
3.8
4.5
104
15.90
18.55
5.46764
4815
4.4
5
71
12.98
14.74
5.131416
4777
4.7
5
50
9.74
10.46
4.54591
3754
5.1
6.1
49
10.77
13.05
2.971517
2753
7.4
8.0
54
18.17
19.61
7.211289
6130
2.9
3.4
145
20.10
23.65
6.112448
5121
3.4
4.1
103
16.85
20.11
2.056416
1998
10.2
10.5
31
15.07
15.52
5.064019
4471
3.9
4.5
109
21.52
24.37
3.052398
3011
6.6
6.6
43
14.08
14.28
6.093697
5089
3.1
3.7
98
16.08
19.25
2.097407
2041
9
9.3
31
14.78
15.18
5.339179
4994
3.4
3.6
60
11.23
12.01
5.620522
5438
3.2
3.3
100
17.79
18.38
5.231427
5381
3.4
3.3
97
18.54
18.02
5.331656
4683
3.4
3.8
76
14.25
16.22
3.928089
3601
4.3
4.7
71
18.07
19.71
4.501104
4171
3.6
3.8
67
14.88
16.06
3.402093
3122
4.7
5.1
54
15.87
17.29
7.528567
6617
2.0
2.3
142
18.86
21.46
5.810922
5119
2.6
2.9
83
14.28
16.21
4.406557
3841
3.4
3.9
87
19.74
22.65
5.312942
4568
2.6
3.1
na
4.086189
3449
3.4
4.1
49
11.99
14.20
4.052032
3651
3.5
3.8
81
19.99
22.19
4.773551
4186
2.7
3.1
55
11.52
13.13
5.591171
5449
2.3
2.4
95
16.99
17.43
4.406967
3804
2.9
3.4
80
18.15
21.03
4.803217
4150
2.7
3.1
65
13.53
15.66
4.600754
4086
2.8
3.2
71
15.43
17.37
4.829855
4092
2.7
3.2
72
14.90
17.59
4.75108
4407
2.5
2.7
78
16.41
17.69
7.215267
6778
1.7
1.8
151
20.92
22.27
4.691184
4724
2.6
2.5
56
11.93
11.85
2.257487
2015
5.3
6
49
21.70
24.31
5.688987
4680
2.1
2. 6
77
13.53
16.45
4.840899
4035
2.5
3
81
16.73
20.07
9.105828
8314
1.2
1.3
108
11.86
12.99
2.343476
1908
4.7
5.8
51
21.76
26.72
7.25529
6445
1.5
1.7
83
11.43
12.87
5.513843
4886
2
2.3
85
15.41
17.39
5.16577
4832
2.1
2.3
83
16.06
17.17
2.110355
2045
5.2
5.4
28
13.26
13.69
7.105752
5708
1.4
1.8
145
20.40
25.40
3.732255
3382
2.7
3
50
13.39
14.78
7.308054
6347
1.4
1.6
122
16.69
19.22
7.247547
5729
1.4
1.7
124
17.10
21.64
6.723972
5634
1.5
1.8
116
17.25
20.58
4.627366
3659
2.2
2.7
57
12.31
15.57
5.039661
4461
2
2.2
76
15.08
17.03
3.696649
3298
2.4
2.7
51
13.79
15.46
4.738834
4383
1.9
2.1
96
20.25
21.90
4.646332
4227
1.9
2.1
70
15.07
16.56
1.830138
1718
4.9
5.2
37
20.21
21.53
2.184406
2064
4.1
4.4
27
12.36
13.08
HABITAT
Host-associated
Aquatic
Host-associated
Host-associated
Aquatic
Host-associated
Host-associated
Host-associated
Aquatic
Aquatic
Multiple
Host-associated
Aquatic
Aquatic
Aquatic
Specialized: psychrophilic
Multiple/ Plant-associated
Aquatic/ psychrophilic
Aquatic
Multiple
Aquatic
Host-associated
Host-associated
Multiple
Multiple
Terrestrial
Multiple
Aquatic
Specialized: hydrothermal vent
Multiple
Multiple
Multiple
Multiple
Multiple
Multiple
Specialized: Extreme halophilic
Multiple
Multiple
Multiple
Multiple (including plants)
Aquatic
Multiple
Multiple
Multiple
Aquatic
Specialized
Multiple
Multiple
Multiple
Multiple
Aquatic
Multiple
Multiple (including plants)
Host-associated
Host-associated
Host-associated
Multiple
Specialized
Multiple
Multiple/terrestrial
Multiple
Multiple
Multiple
Multiple
Host-associated
Specialized
Host-associated
Host-associated
Multiple/terrestrial
Multiple
Multiple
Multiple
Multiple
Aquatic
Host-associated
Host-associated
Host-associated
Multiple
Plant symbiont
Host-associated
Multiple
Multiple
Aquatic
Host-associated
Multiple
Host-associated
Terestrial
Terestrial
Terrestrial
Host-associated
Host-associated
Specialized: Moderate halophilic
Host-associated
Host-associated
Host-associated
Host-associated
PATHOGENIC IN
Human
Human
Animal
Human
Animal
Animal
Animal
Human
Human
Animal
Human, animal
Insect
Human, animal
Human, rodent
Human, rodent
Human, rodent
Human
Human, sheep
Human
Plant
Human
Plant
Animal
Human
Human
Plant
Plant
Plant
Plant
Nosocomial infection
Human
Human/ opportunistic
Insects
Plant
Plant
Human/ opportunistic
Human/ opportunistic
Plant
Human
Human
Shellfish
Plant
Plant
Plant
Mammals/ opportunistic
Plant: soybean
SYMBIOTIC IN
LINEAGE
Bacteroidetes; Bacteroidetes; Bacteroidales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Caulobacterales
Bacteroidetes; Bacteroidetes (class); Bacteroidales
Bacteroidetes; Bacteroidetes (class); Bacteroidales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Alteromonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales
Proteobacteria, Alphaproteobacteria; Caulobacterales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Alteromonadales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Alteromonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Alteromonadales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Alteromonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Alteromonadales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Alteromonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Alteromonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales
Cyanobacteria; Gloeobacteria; Gloeobacterales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Alteromonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Alteromonadales
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Nitrosomonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales
Bacteroidetes; Sphingobacteria; Sphingobacteriales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Alteromonadales
Proteobacteria ; Gammaproteobacteria ; Alteromonadales
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Methylophilales
Cyanobacteria; Nostocales; Nostocaceae
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Oceanospirillales
Spirochaetes; Spirochaetales; Leptospiraceae
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pasteurellales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales
Bacteroidetes; Bacteroidetes; Bacteroidales
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Vibrionales
Proteobacteria; Epsilonproteobacteria; Campylobacterales
Cyanobacteria; Nostocales; Nostocaceae
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales
Spirochaetes; Spirochaetales; Leptospiraceae
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Oceanospirillales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pasteurellales
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales
Table S2
Neisseria meningitidis B (strain MC58)
Nitrosospira multiformis (strain ATCC 25196)
Shigella dysenteriae (strain Sd197)
Xylella fastidiosa (strain 9a5c)
Xylella fastidiosa (strain Temecula1)
Agrobacterium tumefaciens (strain C58 sub strain Cereon)
Agrobacterium tumefaciens (strain C58 sub strain Dupont)
Burkholderia mallei (strain ATCC 23344)
Nitrosococcus oceani (strain ATCC 19707)
Pelobacter carbinolicus (strain DSM 2380)
Salmonella choleraesuis (strain SC-B67)
Salmonella typhimurium (strain LT2)
Shigella boydii serotype 4 (strain Sb227)
Sinorhizobium meliloti (strain 1021)
Thiobacillus denitrificans (strain ATCC 25259)
Thiomicrospira denitrificans (strain ATCC 33889)
Vibrio Fischeri (strain ES114)
Vibrio vulnificus (strain CMCP6)
Azoarcus sp. (strain EbN1)
Neisseria gonorrhoeae (strain FA 1090)
Photobacterium profundum (strain SS9)
Vibrio vulnificus (strain YJ016)
Escherichia coli O6:K15:H31 (strain 536)
Helicobacter pylori (strain J99)
Methylococcus capsulatus (strain Bath)
Salmonella paratyphi-a (ATCC 9150)
Salmonella typhi (strain CT18)
Salmonella typhi (strain Ty2)
Shigella flexneri (serovar 2a, strain 301)
Vibrio cholerae (serovar O1, strain ElTor N16961)
Chlorobium tepidum (strain TLS )
Fusobacterium nucleatum nucleatum (strain ATCC 25586)
Helicobacter pylori (strain 26695)
Rhodoferax ferrireducens (strain T118)
Shigella flexneri (strain 2457T)
Thiomicrospira crunogena (strain XCL-2)
Bdellovibrio bacteriovorus (strain HD100)
Helicobacter hepaticus (strain ATCC 51449)
Mannheimia succiniciproducens (Strain MBEL55E)
Rhodobacter sphaeroides (strain 2.4.1)
Synechocystis sp. (strain 6803)
Anaeromyxobacter dehalogenans (strain 2CP-C)
Brucella abortus (biovar 1, strain 9-941)
Brucella abortus (strain 2308)
Brucella melitensis (strain 16M)
Brucella suis (strain 1330)
Campylobacter jejuni (serovar O:2, strain NCTC 11168)
Campylobacter jejuni (strain RM1221)
Haemophilus ducreyi (strain 35000HP)
Pelodictyon luteolum (strain DSM 273)
Desulfovibrio desulfuricans (strain G20).
Desulfovibrio vulgaris (strain Hildenborough)
Geobacter metallireducens (strain GS-15)
Geobacter sulfurreducens (strain PCA)
Haemophilus influenzae (strain 86-028NP)
Magnetospirillum magneticum (strain AMB-1)
Rhizobium etli (strain CFN 42)
Syntrophus aciditrophicus (strain SB)
Aquifex aeolicus
Bartonella henselae (strain Houston 1)
Bartonella quintana (strain Toulouse)
Blochmannia floridanus
Blochmannia pennsylvanicus (strain BPEN)
Chlorobium chlorochromatii (strain CaD3)
Desulfotalea psychrophila (strain LSv54 / DSM 12343)
Jannaschia sp. (strain CCS1)
Mesorhizobium loti (strain MAFF30309)
Psychrobacter arcticum (strain 273-4)
Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841
Anaplasma marginale (strain St. Maries)
Anaplasma phagocytophilum (strain HZ)
Baumannia cicadellinicola (strain HC)
Borrelia burgdorferi (strain B31)
Borrelia garinii (strain PBi)
Buchnera aphidicola (subsp. APS)
Buchnera aphidicola graminum (subsp. Schizaphis)
Buchnera aphidicola pistaciae (subsp. Baizongia)
Chlamydia muridarum (strain Nigg)
Chlamydia pneumoniae (strain CWL029)
Chlamydia trachomatis (strain A/HAR-13 )
Chlamydia trachomatis (strain D/UW-3/Cx)
Chlamydophila abortus (strain S26/3)
Chlamydophila caviae (strain GPIC)
Chlamydophila felis (strain Fe/C-56)
Coxiella burnetii (strain Nine Mile phase I / RSA 493)
Dehalococcoides ethenogenes (strain 195)
Dehalococcoides sp. (strain CBDB1)
Ehrlichia canis (strain Jake)
Ehrlichia chaffeensis (strain Arkansas)
Ehrlichia ruminantium (strain Gardel)
Ehrlichia ruminantium (strain Welgevonden, sub_strain ARC-OVI)
Ehrlichia ruminantium (strain Welgevonden, sub_strain CIRAD)
Francisella tularensis (subsp. holarctica , strain LVS)
Francisella tularensis tularensis (strain SCHUS4)
Lawsonia intracellularis PHE/MN1-00
Legionella pneumophila (strain Lens)
Legionella pneumophila (strain Paris)
Legionella pneumophila (subsp. Pneumophila strain Philadelphia 1)
Neorickettsia sennetsu (strain Miyayama)
9
9
9
9
9
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
7
7
7
7
6
6
6
6
6
6
6
6
5
5
5
5
5
5
4
4
4
4
4
3
3
3
3
3
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
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0
0
0
0
0
0
0
2.27236
3.234309
4.551958
2.73175
2.521148
5.673465
5.674064
5.835527
3.481691
3.665893
4.944
4.951371
4.64652
6.691694
2.909809
2.201561
4.28405
5.126797
4.727255
2.153922
6.40328
5.260086
4.93892
1.643831
3.304561
4.585229
5.133713
4.791961
4.828821
4.033464
2.154946
2.1745
1.667867
4.969784
4.599353
2.427734
3.78295
1.799146
2.314078
4.451915
3.947019
5.013479
3.286445
3.278307
3.294931
3.315175
1.6411481
1.777831
1.698955
2.364842
3.730232
3.773159
4.011182
3.814139
1.913428
4.967148
6.530228
3.1793
1.590791
1.931047
1.581384
0.705557
0.791654
2.572079
3.659634
4.404049
7.596297
2.650701
5.057142
1.197687
1.471282
0.686194
1.519856
0.986914
0.655725
0.654174
0.618379
1.080451
1.230229
1.051969
1.042519
1.144377
1.181356
1.173991
2.032674
1.46972
1.395502
1.31503
1.176248
1.49992
1.516355
1.512977
1.895994
1.892819
1.457619
3.345687
3.50361
3.397754
0.859006
2061
2805
4498
2827
2036
5302
5405
5024
2974
3119
4663
4540
4286
6201
2827
2097
3800
4526
4594
2002
5478
5028
4629
1491
2959
4091
4768
4327
4459
3831
2254
2064
1567
4418
4089
2192
3583
1875
2383
4126
3565
4346
3085
3034
3193
3273
1634
1838
1713
2083
3775
3531
3532
3446
1791
4559
5963
3168
1556
1487
1142
583
610
2002
3233
4283
7276
2120
4699
949
1264
595
1637
928
573
563
507
916
1053
919
895
932
1005
1013
2050
1580
1458
925
1105
949
887
957
1706
1561
1185
2877
3026
2941
932
4
2.8
2
3.3
3.6
1.4
1.4
1.4
2.3
2.2
1.6
1.6
1.7
1.2
2.7
3.6
1.9
1. 6
1.5
3.2
1.1
1.3
1.2
3.7
1.8
1.3
1.2
1.3
1.2
1.5
2.3
2.3
3
1
1.1
2.1
1.1
2.2
1.7
0.9
1
0.6
0.9
0.9
0.9
0.9
1.8
1.7
1.8
1.3
0.5
0.5
0.5
0.5
1
0.4
0.3
0.6
0.6
0.5
0.6
1.4
1.3
0.4
0.3
0.2
0.1
0.4
0.2
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3.2
2
3.2
4.4
1.5
1.5
1.6
2.7
2. 6
1.7
1.8
1.9
1.3
2.8
3.8
2.1
1.8
1.5
3.5
1.3
1.4
1.3
4
2
1.5
1.3
1.4
1.3
1.6
2.2
2.4
3.2
1.1
1.2
2.3
1.1
2.1
1.7
1
1.1
0.7
1
1
0.9
0.9
1.8
1.6
1.8
1.4
0.5
0.6
0.6
0.6
1.1
0.4
0.3
0.6
0.6
0.7
0.9
1.7
1.6
0.5
0.3
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0.1
0.5
0.2
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0
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68
60
64
56
104
na
98
68
54
85
100
63
121
62
32
88
88
84
26
100
104
95
27
82
94
96
91
70
65
42
31
25
66
70
33
40
28
51
73
84
101
39
43
46
42
29
24
30
64
92
74
84
74
38
82
136
77
30
17
11
na
na
52
41
71
104
27
148
3
0
2
10
10
3
2
3
12
9
10
10
9
10
10
25
14
8
0
0
na
0
na
41
1
43
36
41
35
0
12.76
21.02
13.18
23.42
22.21
18.33
16.79
19.53
14.73
17.19
20.19
13.55
18.08
21.30
14.53
20.54
17.16
17.76
12.07
15.61
19.77
19.23
16.42
24.81
20.50
18.69
18.99
14.49
16.11
19.49
14.25
14.98
13.28
15.21
13.59
10.57
15.56
22.03
16.39
21.28
20.14
11.86
13.11
13.96
12.66
17.67
13.49
17.65
27.06
24.66
19.61
20.94
19.40
19.85
16.50
20.82
24.21
18.85
8.80
6.95
20.21
11.20
16.12
13.69
10.18
29.26
2.504
0.00
2.91
6.57
10.13
4.57
3.05
4.85
11.11
7.31
9.50
9.59
7.86
8.46
8.51
12.29
9.52
5.73
0.00
0.00
0.00
21.62
0.52
29.50
10.76
11.70
10.30
0.00
14.07
24.24
13.33
22.63
27.50
19.61
19.50
22.86
17.31
18.22
22.02
14.69
19.51
21.93
15.25
23.15
19.44
18.28
12.98
18.25
20.68
20.52
18.10
27.71
22.97
20.13
21.03
15.69
16.96
18.63
15.01
15.95
14.93
17.11
15.05
11.16
14.93
21.40
17.69
23.56
23.23
12.64
14.17
14.40
12.83
17.74
13.05
17.51
30.72
24.37
20.95
23.78
21.47
21.21
17.98
22.80
24.30
19.28
11.43
9.63
25.97
12.68
16.57
14.29
12.73
31.49
3.16
0.00
3.361
6.10
10.77
5.23
3.55
5.91
13.10
8.54
10.88
11.17
9.65
9.95
9.87
12.19
8.86
5.48
0.00
0.00
0.00
24.03
0.64
36.28
12.51
13.54
11.90
0.00
Host-associated
Terrestrial
Host-associated
Host-associated
Host-associated
Multiple
Multiple
Host-associated
Aquatic
Aquatic
Host-associated
Host-associated
Host-associated
Multiple
Multiple
Aquatic
Multiple
Aquatic
Terrestrial
Host-associated
Multiple
Aquatic
Host-associated
Host-associated
Multiple thermophilic
Host-associated
Host-associated
Host-associated
Host-associated
Multiple
specialized, thermophilic
Host-associated
Host-associated
Multiple
Host-associated
Aquatic
Multiple
Host-associated
Host -associated: bovine rumen
Multiple
Aquatic
Terrestrial
Host-associated
Host-associated
Host-associated
Host-associated
Multiple
Multiple
Host-associated
Multiple
Multiple
Multiple
Aquatic
Multiple
Host-associated
Aquatic
Host-associated
Multiple
Specialized, hyperthermophylic
Host-associated, opportunistic
Host-associated, opportunistic
Host associated: Obligate endosymbiont
Host associated: Obligate endosymbiont
Phototrophic consortium
Specialized: psychrophilic
Aquatic
Multiple
Specialized: psychrophilic
Host-associated
Host-associated
Host-associated
Host associated: obligate endosymbiont
Host-associated
Host-associated
Host associated: obligate endosymbiont
Host associated: obligate endosymbiont
Host associated: obligate endosymbiont
Host associated : obligate intracellular parasite
Host associated: obligate intracellular parasite
Host associated: obligate intracellular parasite
Host associated: obligate intracellular parasites
Host associated: obligate intracellular parasites
Host associated: obligate intracellular parasite
Host associated: obligate intracellular parasite
Multiple
Multiple
Multiple
Host associated
Host associated: obligate intracellular pathogen
Host associated: obligate intracellular parasite
Host associated: obligate intracellular parasite
Host associated: obligate intracellular parasite
Host-associated
Aquatic
Host associated: obligate intracellular pathogen
Host-associated
Host-associated
Host-associated
Multiple/ intracellular pathogen
Dog
Human, animal
Ruminant
Ruminant
Ruminant
Human, animal
Human, animal
Animal
Animal
Animal
Animal
Human
Human, animal
Human
Human
Human
Human, animal
Human, animal
Human, animal
Animal
Human
Human
Cattle
Human, animal
Human, animal
Human
Human
Human, cattle
Human
Human, animal
Human, animal
Human
Human
Human
Animal
Human
Human, animal
Human
Human
Human
Human
Human
Human, primate
Human
Human
Human
Human
Human
Human, animal
Human
Human
Human
Plant
Plant
Plant
Plant
Human, animal
Human
Insect: Pea aphid
Insect: aphid Schizaphis graminum
Insect: aphid Baizongia pistaciae
Insect: leafhopper
Plant: Viciae tribe
Plant: lotus
Insect: Carpenter ant
Insect: ants
epibiont
Plant: Common bean
Squid: Euprymna scolopes
Plant: Medicago sativa
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Nitrosomonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales.
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Chromatiales
Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfuromonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Hydrogenophilales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Thiotrichales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Vibrionales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Vibrionales
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Vibrionales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Vibrionales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Epsilonproteobacteria; Campylobacterales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Methylococcaless
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Vibrionales
Chlorobi; Chlorobia; Chlorobiales; Chlorobiaceae
Fusobacteria; Fusobacterales; Fusobacteriaceae
Proteobacteria; Epsilonproteobacteria; Campylobacterales
Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Thiotrichales
Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Bdellovibrionales
Proteobacteria; Epsilonproteobacteria; Campylobacterales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pasteurellales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales
Cyanobacteria; Chroococcales; Synechocystis
Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Myxococcales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales
Proteobacteria; Epsilonproteobacteria; Campylobacterales
Proteobacteria; Epsilonproteobacteria; Campylobacterales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pasteurellales
Chlorobi; Chlorobia; Chlorobiales
Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfovibrionales
Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfovibrionales
Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfuromonadales
Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfuromonadales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pasteurellales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales
Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Syntrophobacterales
Aquificae; Aquificales; Aquificaceae
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales.
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales.
Chlorobi; Chlorobia; Chlorobiales
Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfobacterales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Baumannia
Spirochaetes; Spirochaetales; Spirochaetaceae
Spirochaetes; Spirochaetales; Spirochaetaceae
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Chlamydiae; Chlamydiales; Chlamydiaceae
Chlamydiae; Chlamydiales; Chlamydiaceae
Chlamydiae; Chlamydiales; Chlamydiaceae
Chlamydiae; Chlamydiales; Chlamydiaceae
Chlamydiae; Chlamydiales; Chlamydiaceae
Chlamydiae; Chlamydiales; Chlamydiaceae
Chlamydiae; Chlamydiales; Chlamydiaceae
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Legionellales
Chloroflexi; Dehalococcoidetes; Dehalococcoides
Chloroflexi; Dehalococcoidetes; Dehalococcoides
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Thiotrichales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Thiotrichales
Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfovibrionales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Legionellales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Legionellales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Legionellales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales
Table S2 - continued
72
Parachlamydia sp. (subsp. Acanthamoeba sp., strain UWE25)
0
2.414465
2030
0
0
29
12.01
14.28
Host-associated
Animal
Pelagibacter ubique (strain HTCC1062)
0
1.308759
1354
0
0
na
Aquatic
Prochlorococcus marinus (strain CCMP 1375)
0
1.75108
1882
0
0
33
18.84
17.53
Aquatic
Prochlorococcus marinus (strain MIT 9312)
0
1.709204
1809
0
0
30
17.55
16.58
Aquatic
Prochlorococcus marinus (strain MIT 9313)
0
2.410873
2262
0
0
41
17.00
18.12
Aquatic
Prochlorococcus marinus (strain NATL2A)
0
1.842899
1890
0
0
31
16.82
16.40
Aquatic
Prochlorococcus marinus (subsp. pastoris , strain CCMP 1378 / MED4)
0
1.65799
1712
0
0
33
19.90
19.27
Aquatic
Rhodopirellula baltica (strain 1)
0
7.145576
7325
0
0
124
17.35
16.92
Aquatic
Rickettsia bellii (strain RML369-C)
0
1.522076
1429
0
0
20
13.13
13.99
Host associated: obligate intracellular pathogen
Animal
Rickettsia conorii (strain Malish 7)
0
1.268755
1372
0
0
16
12.61
11.66
Host associated: obligate intracellular pathogen
Human
Rickettsia felis (strain URRWXCal2)
0
1.58724
1512
0
0
20
12.60
13.22
Host associated: obligate intracellular pathogen
Human
Rickettsia prowazekii (strain Madrid E)
0
1.111523
834
0
0
15
13.49
17.98
Host associated: obligate intracellular pathogen
Human
Rickettsia typhi (strain Wilmington)
0
1.111496
838
0
0
16
14.39
19.09
Obligate intracellular pathogens
Human, rodent
Silicibacter pomeroyi (DSS-3)
0
4.601053
4251
0
0
50
10.86
11.76
Aquatic
Sodalis glossinidius (strain morsitans)
0
4.292502
2516
0
0
69
16.07
27.42
Host-associated: endosymbiont
Insect: tsetse fly
Synechococcus elongatus (strain BP-1)
0
2.593857
2474
0
0
na
Specialized: thermophilic
Synechococcus sp. (strain CC 9605)
0
2.510659
2638
0
0
54
21.50
20.47
Aquatic
Synechococcus sp. (strain CC 9902)
0
2.234828
2304
0
0
59
26.40
25.60
Aquatic
Synechococcus sp. (strain JA-2-3B'a(2-13))
0
3.046682
2863
0
0
na
Specialized: thermophilic
Synechococcus sp. (strain JA-3-3Ab)
0
2.932766
2760
0
0
na
Specialized: thermophilic
Synechococcus sp. (strain PCC 6301)
0
2.696255
2525
0
0
47
17.43
18.61
Aquatic
Synechococcus sp. (strain PCC 7942)
0
2.742269
2662
0
0
56
20.42
21.03
Aquatic
Synechococcus sp. (strain WH8102)
0
2.434427
2514
0
0
62
25.46
24.66
Aquatic
Thermotoga maritima (strain MSB8)
0
1.860725
1853
0
0
79
42.45
42.63
Specialized: hyperthermophilic
Thermus thermophilus (strain HB27)
0
2.127482
2210
0
0
35
16.45
15.83
Specialized: thermophilic
Thermus thermophilus (strain HB8)
0
2.116056
2239
0
0
39
18.43
17.41
Specialized: thermophilic
Treponema denticola (strain ATCC 35405)
0
2.843201
2767
0
0
37
13.01
13.37
Host-associated
Human
Treponema pallidum (strain Nichols)
0
1.138011
1029
0
0
6
5.27
5.83
Host-associated
Human
Wigglesworthia glossinidia brevipalpis
0
0.703004
612
0
0
9
12.80
14.70
Host associated: obligate endosymbiont
Insect: tsetse fly
Wolbachia pipientis wMel
0
Insect: Drosophila melanogasrer
1.267782
1195
0
0
4
3.15
3.34
Host associated: obligate endosymbiont
Invertebrate
Wolbachia sp. (subsp. Brugia malayi, strain TRS)
0
1.080084
805
0
0
2
1.85
2.48
Host associated: obligate endosymbiont
Nematode: Brugia malayi
a
Bacterial names into brackets correspond to unfinished sequenced genomes available in the NCBI ENTREZ Genome Project database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=genomeprj).
b
Number of TonB-dependent receptor (TBDR) proteins having both pfam PF07715 and PF00593 HMMs.
c
Number of protein coding genes as reported in the EMBL-EBI, Integr8 web portal (http://www.ebi.ac.uk/integr8/EBI-Integr8-HomePage.do) or the NCBI ENTREZ Genome Project database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=genomeprj).
d
Number of Carbohydrate active enzymes (CAZy) or functional domains of enzymes that degrade, modify, or create glycosidic bonds. CAZy database (http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/). na: not available in CAZy database.
Chlamydiae; Chlamydiales; Parachlamydiaceae
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales
Cyanobacteria; Prochlorales; Prochlorococcaceae
Cyanobacteria; Prochlorales; Prochlorococcaceae
Cyanobacteria; Prochlorales; Prochlorococcaceae
Cyanobacteria; Prochlorales; Prochlorococcaceae
Cyanobacteria; Prochlorales; Prochlorococcaceae
Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Cyanobacteria; Chroococcales; Synechococcus
Cyanobacteria; Chroococcales; Synechococcus
Cyanobacteria; Chroococcales; Synechococcus
Cyanobacteria; Chroococcales; Synechococcus
Cyanobacteria; Chroococcales; Synechococcus
Cyanobacteria; Chroococcales; Synechococcus
Cyanobacteria; Chroococcales; Synechococcus
Cyanobacteria; Chroococcales; Synechococcus
Thermotogae; Thermotogales; Thermotogacea
Deinococcus-Thermus; Deinococci; Thermales
Deinococcus-Thermus; Deinococci; Thermales
Spirochaetes; Spirochaetales; Spirochaetaceae
Spirochaetes; Spirochaetales; Spirochaetaceae
Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales
Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales
Table S2 - continued
73
74
60kDa chaperonin
helicase
ATP-dependent DNA helicase
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
Ps-TBDR
hypothetical protein
ISxcd1 transposase
ISxcd1 transposase
IS1478 transposase
hypothetical protein
hypothetical protein
Putative CUT locus (unknown substrate)
hypothetical protein
transcriptional regulator
Nicotinamide mononucleotide transporter
TBDR
hypothetical protein
glycosyl transferase
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
nicotinate phosphoribosyltransferase
XCC0523
XCC0524
XCC0525
XCC0526
XCC0527
XCC0528
XCC0529
XCC0530
XCC0531
XCC0532
XCC0533
XCC0534
XCC0535
XCC0536
XCC0537
XCC0755 transcriptional regulator tetR/acrR family
XCC0756 hypothetical protein
XCC0671
XCC0672
XCC0673
XCC0674
XCC0675
XCC0676
XCC0677
XCC0678
XCC0679
XCC0680
XCC0681
tRNA
phage-related integrase
IS1481 transposase
TBDR
superoxidase dismutase
hypothetical protein
Ps-TBDR
isopenicillin N epimerase
IS1404 transposase
IS1404 transposase
Ps-TBDR
XCC0391
XCC0392
XCC0393
XCC0394
XCC0395
XCC0396
XCC0397
XCC0398
XCC0399
XCC0400
TldD protein
fructose-1,6-bisphosphatase
aromatic-amino-acid aminotransferase
Ps-TBDR
hypothetical protein
hypothetical protein
chloroacetaldehyde dehydrogenase
putative partial CUT locus, CAZy associated TBDR, polygalacturonate induced TBDR
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
2-keto-3-deoxygluconate kinase
TBDR
TBDR
pectin methyl esterase
pectate lyase
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
deoxycytidylate deaminase
IS1479 transposase
Fur regulated TBDR
rhamnogalacturonan acetylesterase
hypothetical protein
phenylalanine hydroxylase
transcriptional regulator asnC family
TBDR
hypothetical protein
hypothetical protein
ABC transporter ATP-binding protein
fatty acid desaturase
putative partial CUT locus
transcriptional regulator lysR family
MFS transporter
hypothetical protein
SIR2-like regulatory protein
FMN oxidoreductase
dehydrogenase
a
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
pncB
gtrB
pnuC
groEL
bfeA
nifS
fhuA
sodM
frp
fhuA
ynfM
ylma
fpvA
pah
kdgK
iroN
iroN
aldA
tldD
cbbFC
tyrB
yncD
cirA
xylR
avrBs2
mecI
GT2
GT2
CE12
CE8
PL10
Orientation Gene name CAZy family
a
Xanthomonas campestris pv. campestris strain ATCC33913
putative partial CUT locus, arabinose induced TBDR
transcriptional regulator
transcriptional regulator
methicillin resistance protein
ankyrin-like protein
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
Ps-TBDR
xylose repressor-like protein
avirulence protein
hypothetical protein
Function
a
XCC0301
XCC0302
XCC0303
XCC0304
XCC0305
XCC0306
XCC0307
XCC0308
XCC0154
XCC0155
XCC0156
XCC0157
XCC0158
XCC0159
XCC0160
XCC0161
XCC0162
XCC0115
XCC0116
XCC0117
XCC0118
XCC0119
XCC0120
XCC0121
XCC0122
XCC0123
XCC0124
XCC0125
XCC0126
XCC0127
XCC0095
XCC0096
XCC0097
XCC0098
XCC0099
XCC0100
XCC0101
XCC0043
XCC0044
XCC0045
XCC0046
XCC0047
XCC0048
XCC0049
XCC0050
XCC0051
XCC0052
XCC0053
Gene ID
a
b
Fur-regulated
PGA induced
Arabinose induced
Characteristics
XC_3478
XC_3477
XC_3562
XC_3561
XC_3560
XC_3559
XC_3558
XC_3557
XC_3556
XC_3555
XC_3554
XC_3553
XC_3552
XC_0535
XC_0536
XC_0537
XC_0538
XC_0539
XC_0540
XC_0541
XC_0542
XC_0543
XC_0544
XC_0545
XC_0546
abs
XC_3697
XC_3696
XC_0001_tRNA
XC_0403
abs
XC_0405
XC_0407
XC_0408
XC_0409
XC_0411
XC_0412
XC_0413
XC_0312
XC_0313
XC_0314
XC_0315
XC_0316
XC_0318
XC_0319
XC_0320
XC_0163
XC_0164
XC_0165
XC_0166
XC_0167
XC_0168
XC_0169
XC_0170
XC_0171
XC_0119
XC_0120
XC_0121
XC_0122
XC_0123
XC_0124
XC_0125
XC_0126
XC_0127
XC_0128
XC_0130
XC_0132
XC_0133
XC_0097
XC_0098
XC_0100
XC_0101
XC_0102
XC_0103
XC_0104
XC_0043
XC_0044
XC_0045
XC_0046
XC_0047
XC_0048
XC_0049
XC_0050
XC_0051
XC_0052
XC_0053
XAC0316
XAC0317
abs
abs
abs
XAC0320
XAC0321
XAC0322
XAC0171
XAC0173
XAC0174
XAC0175
XAC0176
XAC0177
XAC0178
XAC0179
XAC0180
XAC0141
XAC0142
abs
XAC0143
XAC0144
abs
abs
abs
XAC0145
abs
abs
abs
abs
XAC0122
XAC0124
XAC0125
XAC0126
XAC0127
abs
XAC0129
abs
abs
XAC0069
XAC0070
XAC0071
XAC0072
XAC0073
XAC0074
XAC0075
XAC0076
XAC0077
Orthologs c in:
X. axonopodis
pv. citri strain
306
XOO4350
XOO4349
abs
abs
abs
XOO4347
XOO4346
XOO4345
XOO0265
XOO0266
XOO0267
XOO0268
XOO0271-70-69
XOO4518
XOO4517
XOO4515
XOO4514
XOO0027
abs
abs
XOO0028
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XOO0015
XOO0016
XOO0017
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XOO0173
XOO0172
XOO0171-70
XOO0169
XOO0168
XOO0167
X. oryzae pv.
oryzae strain
KACC10331
XCV0859
XCV0860
XCV3657
XCV3656
XCV3655
XCV3654
XCV3653
XCV3652
XCV3651
XCV3650
XCV3649
XCV3648
XCV3647
XCV0571
abs
abs
abs
abs
abs
XCV0572
XCV0572
XCV0573
abs
abs
abs
XCV2716
abs
XCV3784
XAC0807
XAC0808
XAC3533
XAC3532
XAC3531
XAC3529
XAC3528
XAC3526
XAC3525
XAC3524
XAC3523
XAC3522
XAC3521
XAC0542
abs
abs
abs
abs
abs
XAC0543
XAC0543
XAC0544
abs
abs
abs
XAC2423
abs
abs
XOO3795
abs
XOO0858
XOO0859
XOO0860
XOO0861
XOO0862
XOO0863
abs
abs
abs
abs
abs
XOO4288
abs
abs
abs
abs
abs
XOO4287
XOO4287
XOO4285
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XCV0001_tRNA XAC0391_tRNA XOO4657_tRNA
abs
abs
abs
abs
XAC4328
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XOO2828
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XCV0022 D
XAC3936
abs
XCV0325
XCV0326
abs
abs
abs
XCV0329
XCV0330
XCV0331
XCV0155
XCV0156
XCV0157
XCV0158
XCV0159
XCV0160
XCV0162
XCV0163
XCV0164
XCV0120
XCV0121
abs
XCV0122
XCV0123
abs
abs
abs
XCV0124
abs
abs
abs
XCV0129
XCV0093
XCV0098
XCV0101
XCV0102
XCV0103
XCV0104
XCV0105
abs
abs
XCV0045
XCV0046
XCV0047
XCV0048
XCV0049
XCV0050
XCV0051
XCV0052
XCV0054
X. campestris
Xcc strain 8004 pv. vesicatoria
strain 85-10
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XF1637
abs
abs
abs
abs
XF1097
XF0615
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XFt02_tRNA
abs
abs
abs
XF1921
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XF0066
abs
abs
abs
XF1835
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XF0036
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
Xylella
fastidiosa
strain 9a5c
Psyr_3769, Pseudomonas syringae pv. syringae B728a
PA2057, Pseudomonas aeruginosa PAO1
Patl_3441, Pseudoalteromonas atlantica T6c
Bcep18194_B2705, Burkholderia sp. 383
Sala_0305, Sphingopyxis alaskensis RB2256
CPS_3961, Colwellia psychrerythraea 34H
PSEEN2482, Pseudomonas entomophila L48
Mmar10_0224, Maricaulis maris MCS10
CC0442, Caulobacter crescentus CB15
BB0832, Bordetella bronchiseptica RB50
CC1790
CC1791, Caulobacter crescentus CB15
CC1792
Representative homologs in non Xanthomonads bacteria d
PA1910 (26/43)
PA2057 (33/48)
PA2590 (31/46); PA2089 (31/46)
PA2911 (41/57)
PA2398; FpvA (36/52)
PA2289 (39/54)
(Identity/Similarity%) e
Conservation in Pseudomonas
aeruginosa PAO1
Table S3
tRNA delta(2)-isopentenylpyrophosphate transferase
host factor-I protein
GTP-binding protein
hypothetical protein
TBDR
ubiquinone biosynthesis protein
LexA repressor
RecA protein
RecX protein
XCC1715
XCC1716
XCC1717
XCC1718
XCC1719
XCC1720
XCC1721
XCC1722
XCC1723
XCC1389
XCC1388
XCC1390
XCC1391
XCC1392
XCC1393
XCC1394
hypothetical protein
ferredoxin II
phosphotransferase
methionyl-tRNA synthetase
TBDR
hypothetical protein
glyoxylase I family protein
S-methylmethionine permease
homocysteine S-methyltransferase
Fur regulated TBDR
hypothetical protein
asparagine synthase B
hypothetical protein
TBDR
penicillin acylase II
bacterioferritin
thiopurine methyltransferase
ABC transporter sulfate permease
sulfate ABC transporter ATP-binding protein
hypothetical protein
threonine 3-dehydrogenase
TBDR
non-hemolytic phospholipase C
phosphoglycerate mutase
hypothetical protein
folylpolyglutamate synthase/dihydrofolate synthase
CAZy associated TBDR
aconitate hydratase 1
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
TBDR
inosine-uridine preferring nucleoside hydrolase
hypothetical protein
hypothetical protein
Ps-TBDR
glycerophosphodiester phosphodiesterase
hypothetical protein
bifunctional penicillin-binding protein 1C
bacterioferritin
peroxiredoxin
low molecular weight heat shock protein
Putative partial CUT locus, CAZy associated TBDR
two-component system regulatory protein
two-component system sensor protein
histidine kinase/response regulator hybrid protein
IS1480 transposase
xylosidase/arabinosidase
Ps-TBDR
thioredoxin
hypothetical protein
two-component system regulatory protein
protein-glutamate methylesterase
chemotaxis protein
two-component system sensor protein
two-component system sensor protein
two-component system regulatory protein
Putative partial CUT locus
Beta-glucosidase
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
IS1478 transposase
beta-galactosidase
arabinogalactan endo-1,4-beta-galactosidase
TBDR
transcriptional regulator
methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase
acyl-CoA dehydrogenase
hypothetical protein
hypothetical protein
TBDR
phosphoanhydride phosphohydrolase
methionine adenosyltransferase
hypothetical protein
Fur regulated TBDR
nucleoside transporter
voltage-gated potassium channel beta subunit
hypothetical protein
TBDR
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
permease
ABC transporter ATP-binding component
ABC transporter substrate binding protein
XCC1336
XCC1337
XCC1338
XCC1339
XCC1340
XCC1341
XCC1342
XCC1343
XCC1344
XCC1250
XCC1251
XCC1252
XCC1253
XCC1254
XCC1255
XCC1256
XCC1257
XCC1258
XCC1259
XCC1260
XCC1261
XCC1174
XCC1175
XCC1176
XCC1177
XCC1178
XCC1179
XCC1180
XCC1181
XCC1182
XCC1183
XCC1184
XCC1185
XCC1186
XCC1187
XCC1033
XCC1034
XCC1035
XCC1036
XCC1037
XCC1038
XCC1039
XCC1040
XCC1041
XCC1042
XCC1043
XCC1044
XCC1045
XCC1046
XCC1047
XCC0942
XCC0943
XCC0944
XCC0945
XCC0946
XCC0947
XCC0948
XCC0949
XCC0950
XCC0765
XCC0766
XCC0767
XCC0768
XCC0769
XCC0770
XCC0771
XCC0772
XCC0773
XCC0774
XCC0757
XCC0758
XCC0759
XCC0760
XCC0761
XCC0762
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
GH2
GH53
bga
galA
btuB
aarF
lexA
recA
recX
miaA
hfq
hflX
fhuA
acyII
brf
tpmT
asnB
ykfD
mmuM
ydgM
cicA
metS
btuB
mmsA
fadE9
GH3
GH29; CBM32
GH43
GT51
bglX
cheB
cheR
xylB
fyuA
trx
cvgSY
hspA
pbpC
fecA
glpQ
fyuA
acnA
folC
pgmA
tdh
fecA
cysW
cysA
nrtB
nrtCD
phuR
yeiM
cirA
appA
metK
HrpX regulated
Fur-regulated
HrpX regulated
Fur-regulated
XC_2516
XC_2515
XC_2514
XC_2513
XC_2512
XC_2511
XC_2510
XC_2509
XC_2508
XC_2850
XC_2848
XC_2847
XC_2846
XC_2845
XC_2844
XC_2843
XC_2903
XC_2902
XC_2901
XC_2900
XC_2899
XC_2898
XC_2897
XC_2895
XC_2894
XC_2991
XC_2990
XC_2989
XC_2988
XC_2987
XC_2986
XC_2985
XC_2984
XC_2983
XC_2982
XC_2981
XC_2980
XC_3069
XC_3068
XC_3067
abs
XC_3064
XC_3063
XC_3062
XC_3061
XC_3060
XC_3059
XC_3058
XC_3057
XC_3056
XC_3055
XC_3213
XC_3212
XC_3211
XC_3210
XC_3209
XC_3208
XC_3207
XC_3206
XC_3205
XC_3204
XC_3203
XC_3202
XC_3201
XC_3200
XC_3199
XC_3293
XC_3292
XC_3291
XC_3290
XC_3289
XC_3288
XC_3287
XC_3286
XC_3285
XC_3467
XC_3466
XC_3464
XC_3463
XC_3462
XC_3461
abs
XC_3459
abs
XC_3457
XC_3476
XC_3475
XC_3474
XC_3473
XC_3471
XC_3470
XAC1734
XAC1735
XAC1736
XAC1737
abs
XAC1738
XAC1739
XAC1740
XAC1741
abs
XAC1433
XAC1434
XAC1435
XAC1437
XAC1438
XAC1439
abs
XCV1490
XCV1491
XCV1493
XCV1494
XCV1495
XCV1496
XCV1767
XCV1768
XCV1769
XCV1770
abs
XCV1771
XCV1772
XCV1773
XCV1774
XAC1382
XAC1384
XAC1385
XAC1386
abs
XAC1387
XAC1390
XAC1391
XAC1392
XAC3869
XAC1306
XAC1307
abs
abs
XAC2423
XAC1308
XAC1309
XAC1310
XAC1311
XAC1312
XAC1313
XAC1272
XAC1273
XAC1274
abs
XAC1275
XAC1276
XAC1277
XAC1278
XAC1279
XAC1280
XAC1281
XAC1283
XAC1282
XAC1284
XAC1139
XAC1140
XAC1141
XAC1142
XAC1143
XAC1144
XAC1145
abs
XAC1146
XAC1147
abs
XAC1148
XAC1149
XAC1150
XAC1151
XAC1019
XAC1020
XAC1021
XAC1022
XAC1023
XAC1024
XAC1028
abs
XAC1029
XAC0819
XAC0821
XAC0822
XAC0823
XAC0824
XAC0825 D
XAC0826
XAC0827
XAC0828
XAC0829
XAC0809
abs
XAC0811
XAC0812
XAC0813
XAC0814
XCV1438
XCV1439
XCV1440
XCV1441
abs
XCV1442
XCV1445
XCV1448
XCV1449
XCV3988
XCV1357
XCV1358
abs
abs
XCV2716
XCV1359
XCV1360
XCV1361
XCV1362
XCV1363
XCV1364
XCV1322
XCV1323
XCV1324
abs
XCV1325
XCV1326
XCV1327
XCV1328
XCV1329
XCV1330
XCV1331
XCV1332
XCV1333
XCV1334
XCV1158
abs
abs
XCV1160
XCV1161
XCV1162
XCV1164
XCV1177
XCV1165
XCV1166
abs
XCV1168
XCV1169
XCV1170
XCV1172
XCV1049
XCV1050
XCV1051
XCV1052
XCV1053
XCV1054
XCV1057
abs
XCV1058
XCV0871
XCV0873
XCV0874
XCV0875
XCV0876
XCV0878
XCV0879
XCV0880
XCV0881
XCV0882
XCV0861
XCV0862
XCV0863
XCV0864
XCV0865
XCV0866
XF0090
XF0089
XF0088
XF0086
abs
abs
XF0122
XF0123
abs
abs
XF0118
XF0119
abs
abs
abs
abs
abs
XOO1990
XOO1991
XOO1992
XOO1993
XOO1994
XOO1995 D
XOO2947
XOO2946
XOO2945
XOO2944
abs
XOO2943
XOO2942
XOO2941
XOO2940
abs
XF0547
abs
XF0549
XF0550
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XF1243
abs
abs
XF1252
abs
abs
abs
abs
XF2235
abs
abs
XF2234
XF1346
XF1347
abs
abs
abs
abs
XF1886
abs
XF1946
abs
XF0367
abs
abs
abs
abs
XF0449
abs
XF0412
abs
abs
abs
abs
abs
XF0392
abs
XOO1921
XOO1922
XOO1923
XOO1924
abs
XOO1925
XOO1927
XOO1929
XOO1930
XOO4123
XOO1835
XOO1836
abs
abs
XOO1863
XOO1837-8 D
XOO1838 D
XOO1839
XOO1841
XOO1842
XOO1843
abs
abs
abs
XOO4178
XOO4422
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XOO0894
abs
XOO0895
XOO0896
XOO0897
XOO0898
abs
abs
XOO0901
XOO0902
abs
abs
XOO0907
XOO0908
XOO0909
XOO3688
XOO3686
XOO3685
XOO3684
XOO3683
XOO3682
XOO3680
abs
XOO3679
XOO3783
XOO3782
XOO3781
abs
XOO3775
abs
XOO3774
XOO3772
XOO3770 D
XOO3768
abs
abs
XOO3793
XOO3792
XOO3791
XOO3789
CC3336, Caulobacter crescentus CB15
PSHAb0284
PSHAb0279, Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125
GOX0945, Gluconobacter oxydans 621H
Sde_3880, Saccharophagus degradans 2-40
CC1970, Caulobacter crescentus CB15
CC1113, Caulobacter crescentus CB15
Sala_0027, Sphingopyxis alaskensis RB2256
Psyr_4483, Pseudomonas syringae pv. syringae B728a
alr2153, Nostoc sp. PCC 7120
GOX1188, Gluconobacter oxydans 621H
GOX1190
PA2335 (29/43); PA0192 (28/41)
PA2466 (27/43)
PA2070 (24/37)
PA2335 (27/40)
PA2335 (27/43)
PA4710; PhuR (33/49)
Table S3 - continued
75
76
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
Ps-TBDR
chemotaxis protein
hypothetical protein
hypothetical protein
Putative partial CUT locus, conserved locus
hypothetical protein
ABC transporter sugar permease
ABC transporter sugar permease
ABC transporter sugar binding protein
hypothetical protein
Ps-TBDR/oar
transcriptional regulator lacI family
hypothetical protein
hypothetical protein
Putative partial CUT locus, CAZy associated TBDR
transcriptional regulator asnC/lrp family
L-lysine 6-aminotransferase
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
Ps-TBDR
putative UMP pyrophosphorylase
cellulase
gamma-glutamyltranspeptidase
ferredoxin
hypothetical protein
CAZy associated TBDR
lipopolysaccharide synthesis enzyme
hypothetical protein
heat shock protein G
hypothetical protein
TBDR
avirulence protein
peptidase
xylosidase/arabinosidase
hypothetical protein
TBDR
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
Putative CUT locus (starch/maltodextrin?)
maltose transport gene repressor
cyclomaltodextrin glucanotransferase (CGTase)
transport protein
hypothetical protein
alpha-glucosidase
TBDR, MalA
IS1479 transposase
alpha-glucosidase
ISD1 transposase
ISD1 transposase
VirB4 protein
pre-pilin leader sequence
pre-pilin like leader sequence
hypothetical protein
Ps-TBDR/oar
XCC2043
XCC2044
XCC2045
XCC2046
XCC2047
XCC2048
XCC2049
XCC2494
XCC2495
XCC2496
XCC2497
XCC2464
XCC2465
XCC2466
XCC2467
XCC2468
XCC2469
XCC2470
XCC2471
XCC2472
XCC2473
XCC2474
XCC2391
XCC2392
XCC2393
XCC2394
XCC2395
XCC2396
XCC2397
XCC2398
XCC2399
XCC2400
XCC2401
XCC2402
XCC2403
XCC2380
XCC2381
XCC2382
XCC2383
XCC2384
XCC2385
XCC2386
XCC2387
XCC2388
XCC2389
XCC2390
XCC2203
XCC2204
XCC2205
XCC2206
XCC2207
XCC2208
XCC2209
XCC2210
XCC2211
+
+
+
+
+
+
GTP-binding protein
molybdopterin biosynthesis
molybdopterin biosynthesis protein
Ps-TBDR
hypothetical protein
glucose 1-dehydrogenase homolog
fatty acid alpha hydroxylase
hypothetical protein
XCC1987
XCC1988
XCC1989
XCC1990
XCC1991
XCC1992
XCC1993
XCC1994
-
+
+
+
+
+
-
+
+
-
+
+
-
-
+
+
-
+
+
+
-
dgoK
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
GH13
algA
oar
pilV
fimT
virB4
GH97
GH13
GH43
GH9
GH35
GH31
GH95
GH74
algA
btuB
suc1
btuB
xsa
btuB
avrXccA2
htpG
kdtB
cirA
upp
egl2
ggt
lacG
lacF
malE
fecA
tsr
yxnA
cypC
engA
moeA
moeB
cirA
parA
motB
motA
cirA
xylA
xylE
xylS
dgoA
dgoA
gbpR
alaS
csrA
+
+
+
XCC1724 alanyl-tRNA synthetase
XCC1725 carbon storage regulator
XCC1726 tRNA
Putative CUT locus (pectin/polygalacturonate?)
XCC1744 2-oxo-3-deoxygalactonate kinase
XCC1745 regucalcin
XCC1746 4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase/2-deydro-3-deoxyphosphogluconate aldolase
XCC1747 4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase/2-deydro-3-deoxyphosphogluconate aldolase
XCC1748 galactose-binding protein regulator
XCC1749 TBDR
XCC1750
Ps-TBDR
XCC1751
XCC1752 cellulase
XCC1753 sialic acid-specific 9-O-acetylesterase
XCC1754 hypothetical protein
XCC1755 alpha-xylosidase
XCC1756 hypothetical protein
XCC1757 D-xylulokinase
XCC1758 xylose isomerase
XCC1759 MFS transporter
XCC1760 sensor kinase
Arabinose induced TBDR
XCC1889 chromosome partioning protein
XCC1890 MotB protein
XCC1891 MotA protein
XCC1892 TBDR
XCC1893 hypothetical protein
XCC1894 hypothetical protein
XCC1895 hypothetical protein
Maltose induced
Arabinose induced
PGA/Arabinose induced
PGA/Arabinose induced
PGA induced
XC_1622
XC_1621
XC_1620
XC_1619
XC_1649
XC_1648
XC_1647
XC_1646
XC_1645
XC_1644
XC_1643
XC_1642
abs
XC_1640
XC_1639
XC_1723
XC_1722
XC_1721
XC_1718
XC_1717
XC_1716
XC_1715
XC_1714
XC_1713
XC_1712
XC_1711
XC_1710
XC_1709
XC_1734
XC_1733
XC_1732
XC_1731
XC_1730
XC_1729
XC_1728
XC_1727
XC_1726
XC_1725
XC_1724
XC_1915
XC_1914
XC_1913
XC_1912
XC_1911
XC_1910
XC_1909
XC_1908
XC_1907
XC_2140
XC_2139
XC_2138
XC_2137
XC_2136
XC_2135
XC_2134
XC_2197
XC_2196
XC_2195
XC_2194
XC_2193
XC_2192
XC_2191
XC_2190
XC_2299
XC_2298
XC_2297
XC_2296
abs
abs
abs
XC_2490
XC_2489
XC_2488
XC_2487
XC_2486
XC_2485
XC_2484
XC_2484
XC_2483
XC_2482
XC_2481
XC_2480
XC_2479
XC_2478
XC_2477
XC_2476
XC_2475
XC_2507
XC_2506
XC_4359_tRNA
XCV2820
XCV2821
XCV2822
XCV2823
XCV2796
XCV2797
XCV2798
XCV2799
XCV2800
XCV2801
abs
XCV2803
abs
abs
abs
XCV2709
XCV2710
XCV2711
XCV2724
XCV2725
abs
XCV2726
XCV2728
XCV2729
XCV2730
XCV2732
abs
XCV2735
XCV2697
XCV2698
XCV2699
XCV2700
XCV2701
XCV2702
XCV2703
XCV2704
XCV2706
XCV2707
XCV2708
XCV2505
XCV2506
XCV2507
XCV2508
XCV2509
XCV2510
XCV2511
XCV2513
XCV2514
abs
abs
abs
XCV0751
XCV1702
abs
abs
XCV2072
XCV2073
XCV2074
XCV2075
XCV2076
abs
abs
XCV2077
XCV1960
XCV1961
XCV1962
XCV1963
abs
abs
abs
XCV1794
XCV1795
XCV1796
XCV1797
XCV1798
XCV1799 D
XCV1801
XCV1801
XCV1802
XCV1803
XCV1804
XCV1805
XCV1806
XCV1807
XCV1808
XCV1809
XCV1810
abs
abs
XAC2671
XAC2672
XAC2595
XAC2596
XAC2597
XAC2598
XAC2599
XAC2600
abs
XAC2602
abs
abs
XAC2614
XAC2526
XAC2527
XAC2528
XAC2530
XAC2531
abs
XAC2532
XAC2533
XAC2534
XAC2535
XAC2536
XAC2538 D
XAC2539
XAC2515
XAC2516
XAC2517
XAC2518
XAC2519
XAC2520
XAC2521
XAC2522
XAC2523
XAC2524
XAC2525
XAC2307
XAC2308
XAC2309
XAC2310
XAC2311
XAC2312
XAC2313
XAC2314
XAC2315
abs
abs
XAC2134
XAC0690
XAC1666
abs
abs
XAC2021
XAC2022
XAC2023
XAC2024
XAC2025
abs
abs
XAC2026
XAC1907
XAC1908
XAC1909
XAC1910
abs
abs
abs
XAC1763
XAC1764
XAC1765
XAC1766
XAC1767
XAC1768
XAC1769
XAC1769
XAC1770
XAC1771
XAC1772
XAC1773
XAC1774
XAC1775
XAC1776
XAC1777
XAC1778
XOO3201
XOO3202
XOO3203
XOO3204
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XOO2508
XOO2509
XOO2510
XOO3112
abs
abs
XOO3120
XOO3121
XOO3122
XOO3123
XOO3124
abs
XOO3126
XOO2486
XOO2487
XOO2488
XOO2497
XOO2499
XOO2500
XOO2501
abs
XOO2505
XOO2506
XOO2507
XOO2173
XOO2172
XOO2171
XOO2170
XOO2169
XOO2166
XOO2165
abs
XOO2164
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XOO3309
XOO2529
XOO2528
XOO2514
abs
abs
abs
abs
abs
XOO2832
XOO2831
XOO2830
XOO2826
abs
abs
abs
XOO2920
XOO2918
XOO2919
XOO2917
XOO2916
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XOO2914
XOO2913
XOO2911
XOO2910
XOO2909
abs
XCV1775
XAC1742
XOO2939
XCV1776
XAC1743
XOO2938
XCV0024_tRNA XAC1744_tRNA XOO4650_tRNA
no XF0474
no XF0473
XF0472
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XF0980
XF0979
XF0978
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XF0984
XF0983
XF0981
XF2445
XF2446
XF2447
XF2448
XF2449
abs
abs
XF2450
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XF0465
abs
XF0466
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XF0124
XF0125
XFt05_tRNA
PSHAb0340, Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125
CC2285
CC2287, Caulobacter crescentus CB15
CC2284
CC2286
CC2283
CC1623, Caulobacter crescentus CB15
Sden_2427, Shewanella denitrificans OS217
PSHAa0437, Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125
Sala_1021
Sala_1022
Sala_1023
Sala_1016
Sala_1015, Sphingopyxis alaskensis RB2256
Sala_1024
PP_3340, Pseudomonas putida KT2440
Rfer_3396, Rhodoferax ferrireducens T118
PSHAb0165, Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125
Sde_2504
Sde_2492
Sde_2501
Sde_2500
Sde_2503
Sde_2502, Saccharophagus degradans 2-40
CC2804, Caulobacter crescentus CB15
PA2070 (27/43)
PA2070 (27/44)
PA2289 (22/39)
Table S3 - continued
XCC3033
XCC3034
XCC3035
XCC3036
XCC3037
XCC2941
XCC2942
XCC2943
XCC2944
XCC2945
XCC2946
XCC2947
XCC2883
XCC2884
XCC2885
XCC2886
XCC2887
XCC2888
XCC2889
XCC2890
XCC2891
XCC2892
XCC2893
XCC2894
XCC2895
XCC2896
XCC2897
XCC2863
XCC2864
XCC2865
XCC2866
XCC2867
XCC2868
XCC2869
XCC2870
XCC2824
XCC2825
XCC2826
XCC2827
XCC2828
XCC2829
XCC2830
XCC2831
XCC2832
hypothetical protein
hypothetical protein
glucose kinase
TBDR
ATP dependent RNA helicase
DNA-binding related protein
DNA helicase
Putative CUT locus (unknown substrate)
hypothetical protein
transmembrane transport protein
alpha,alpha-trehalose-phosphate synthase
Ps-TBDR
phospholipase C
chloride channel
hypothetical protein
hypothetical protein
TBDR
transcriptional regulator
transmembrane transport protein
cytochrome D oxidase subunit B
cytochrome D oxidase subunit A
hypothetical protein
formate dehydrogenase related protein
TBDR
extracellular serine protease
extracellular serine protease
hypothetical protein
extracellular serine protease
oxidoreductase
oxidoreductase
MFS transporter
transcriptional regulator lysR family
Fur regulated TBDR
ABC transporter permease
ABC transporter ATP-binding protein
ABC transporter permease
cysteine desulfurase
acetyltransferase
benzene 1,2-dioxygenase, ferredoxin protein
TBDR
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
Putative partial CUT locus, conserved locus
hypothetical protein
tryptophan halogenase
hypothetical protein
hypothetical protein
TBDR
peptidase
hypothetical protein
transcriptional regulator soxR family
MFS transporter
CAZy associated TBDR
glucosyl transferase
monofunctional biosynthetic peptidoglycan transglycosylase
heat shock protein
hypothetical protein
TBDR
transcriptional regulator
hypothetical protein
acyl-CoA dehydrogenase
Putative partial CUT locus, CAZy associated TBDR, conserved locus
ADP compounds hydrolase
adenosylmethionine-8-amino-7-oxononanoate aminotransferase
hypothetical protein
glucose kinase
TBDR
alpha-L-fucosidase
hypothetical protein
beta-hexosaminidase
beta-hexosaminidase
glucan 1,4-beta-glucosidase
hypothetical protein
hypothetical protein
beta-galactosidase
virulence protein
ISxac3 transposase
XCC2655
XCC2656
XCC2657
XCC2658
XCC2659
XCC2660
XCC2661
XCC2662
XCC2663
XCC2664
XCC2665
XCC2666
XCC2667
XCC2668
XCC2669
XCC2670
XCC2671
XCC2672
XCC2673
XCC2766
XCC2767
XCC2768
XCC2769
XCC2770
XCC2771
XCC2772
XCC2773
XCC2774
XCC2775
+
+
+
+
+
+
+
hypothetical protein
deoxycytidine triphosphate deaminase
hypothetical protein
TBDR
Ps-TBDR/oar
metallopeptidase
metallopeptidase
metallopeptidase
integral membrane protein
methylated-DNA-protein-cysteine S-methyltransferase related protein
reductase
D-amino acid dehydrogenase subunit
transport protein
peptidyl-prolyl cis-trans isomerase
lipoprotein
XCC2569
XCC2570
XCC2571
XCC2572
XCC2573
XCC2574
XCC2575
XCC2576
XCC2577
XCC2578
XCC2579
XCC2580
XCC2581
XCC2582
XCC2583
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
XCC2498 hypothetical protein
XCC2499 short chain dehydrogenase
XCC2500 hypothetical protein
fhuA
plcN
recQ
glk
fepA
hrpA
bga
psvA
nahA
glk
iroN
fucA1
nudE
bioA
btuB
gtrB
mtgA
soxR
fecA
prnA
bedB
fhuA
ynhE
ynhD
ynhC
nifS
mocA
mocA
fhuA
qxtB
qxtA
phuR
yadQ
dadA
yxaH
slyD
btuB
oar
dcd
GT20
GH92
GH35
GH20
GH2
GH3
GH29
GT2
GT51
Arabinose/xylan/xylose induced
Fur-regulated
XC_1125
XC_1124
XC_1123
XC_1122
XC_1121
XC_1168
XC_1167
XC_1166
XC_1165
XC_1164
XC_1163
XC_1162
XC_1226
XC_1225
XC_1224
XC_1223
XC_1222
XC_1221
XC_1220
XC_1219
XC_1218
XC_1217
XC_1216
XC_1215
XC_1214
XC_1213
XC_1212
XC_1245
XC_1244
XC_1243
XC_1242
XC_1241
XC_1240
XC_1239
XC_1238
XC_1288
XC_1287
XC_1286
XC_1285
XC_1284
XC_1282
XC_1281
XC_1280
XC_1279
XC_1347
XC_1346
XC_1345
XC_1344
XC_1343
XC_1342
XC_1341
XC_1340
XC_1339
XC_1338
XC_1462
XC_1461 D
XC_1460
XC_1459
XC_1457
XC_1456
XC_1455
XC_1454
XC_1453
XC_1452
XC_1451
XC_1450
XC_1449
XC_1448
XC_1447
XC_1446
XC_1445
XC_1444
XC_1443
XC_1549
XC_1548
XC_1547
XC_1546
XC_1545
XC_1544
XC_1543
XC_1542
XC_1541
XC_1540
XC_1539
XC_1538
XC_1537
XC_1536
XC_1535
XC_1618
XC_1617
XC_1616
XCV3288
XCV3289
abs
XCV3290
XCV3291
XCV3249
XCV3250
XCV3251
XCV3252
XCV3253
XCV3254
XCV3255
XCV3201
XCV3202
XCV3203
XCV3204
XCV3206
XCV3207
XCV3208
XCV3209
XCV3210
XCV3211
XCV3212
XCV3213
XCV3214
XCV0437
XCV0024 D
XCV3183
XCV3184
XCV3185
XCV3186
XCV3187
XCV3188
XCV3189
XCV3190
XAC3156
XAC3157
abs
XAC3158
XAC3160
XAC3118
XAC3119
XAC3120
XAC3121
XAC3122
XAC3123
XAC3124
XAC3067
XAC3068
XAC3069
XAC3070
XAC3071
XAC3072
XAC3073
XAC3074
XAC3075
XAC3076
XAC3082
XAC3083
XAC3084
abs
abs
XAC3046
XAC3047
XAC3048
XAC3049
XAC3050
XAC3052
XAC3053
XAC3054
XAC2993
XAC2995
XAC2996
XAC2997
XAC2998
XAC2999
XAC2999
XAC3000
XAC3001
XAC2935
XAC2936
XAC2937
XAC2938
XAC2939
XAC2940
XAC2941
XAC2942
XAC2943
XAC2944
XCV3079
XCV3080
XCV3081
XCV3082
XCV3083
XCV3084
XCV3085
XCV3086
XCV3087
XCV3088
XCV3142
XCV3144
XCV3145
XCV3146
XCV3147
XCV3148
XCV3148 D
XCV3149
XCV3150
XAC2825
XAC2827
XAC2828
XAC2829
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XAC2830
XAC2831
XAC2831
XAC2832
XAC2831
abs
XAC2835
XAC2837
XAC2838
XAC2739
XAC2740
XAC2741
XAC2742
XAC2743
XAC2745
XAC2746
XAC2747
XAC2748
XAC2749
XAC2750
XAC2751
XAC2752
XAC2754
XAC2753
XAC2674
XAC2675
XAC2676
XCV2986
XCV2987 D
XCV2988
XCV2989
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XCV2991
XCV2993
XCV2993 D
XCV2994
XCV2993 D
abs
XCV2995 D
XCV2996
XCV2997
XCV2891
XCV2892
XCV2893
XCV2894
XCV2896
XCV2898
XCV2899
XCV2900
XCV2901
XCV2902
XCV2903
XCV2904
XCV2905
XCV2906
XCV2907
XCV2824
XCV2825
XCV2826
XOO1654
XOO1653
abs
abs
XOO1651
XOO1732
XOO1731
XOO1785
XOO1727
XOO1725
XOO1724
XOO1723
XOO1789
XOO1787
XOO1786
XOO1785
XOO1784
XOO1783
XOO1782
XOO1781
XOO1780
XOO1779
XOO1771
XOO1770
XOO1769
abs
XOO2820
abs
XOO1808
XOO1807
XOO1806
XOO1805
XOO1804
XOO1803
XOO1802
XOO1265
XOO1263
XOO1262
XOO1261
XOO1260
XOO1259-8
XOO1258
XOO1257
XOO1255-4-3
XOO1405
XOO1404
XOO1403
XOO1402
XOO1401
XOO1400
abs
abs
abs
abs
XOO1536
XOO1534
XOO1533
XOO1531
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XOO1530
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XOO3277
XOO3278
XOO3279
abs
XOO3320
abs
abs
XOO3281
XOO3282
XOO3283
XOO3286-87
XOO3288
XOO3289
XOO3290
XOO3291
XOO3205
XOO3206
XOO3207
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XF1384
abs
abs
XF1383
XF1382
XF1381
XF0188
XF0189
XF0190
abs
XF2713
XF2714
XF0848
XF0847
XF0846
XF0845
XF0843
XF0842
XF0840
abs
abs
XF0176
XF1715
XF1714-13
XF1712
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XF1476
XF1475
XF1474
XF1473
abs
XF1472
XF0599
abs
abs
XF0597
abs
XF0382
XF0383
XF0384
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XF0762
XF2301
abs
abs
XF0576
abs
abs
XF0649
abs
abs
abs
XF0651
XF0652
XF0653
XF2666
abs
XF2669
IL2594, Idiomarina loihiensis L2TR
CC0446, Caulobacter crescentus CB15
Saro_2417
Saro_2418
Saro_2419
Saro_2420
Saro_2421
Saro_2410, Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444
Saro_2423
SO1822, Shewanella oneidensis MR-1
Patl_4270
Patl_3277
Patl_4288
Patl_4287
Patl_3278 / Patl_4286, Pseudoalteromonas atlantica T6c
PA1322, Pseudomonas aeruginosa PAO1
Sala_0305, Sphingopyxis alaskensis RB2256
Mfla_0134, Methylobacillus flagellatus KT
Shewmr4_0124, Shewanella sp. MR-4
Patl_1148, Pseudoalteromonas atlantica T6c
PA2070 (29/45)
PA4514; PiuA (35/50)
PA0781 (36/52)
PA2070 (27/42)
Table S3 - continued
77
78
TonB-like protein
transcriptional regulator blaI family
hypothetical protein
hypothetical protein
TBDR
hypothetical protein
hypothetical protein
reductase
Fur regulated TBDRs
hypothetical protein
reductase
transcriptional regulator
IS1478 transposase
XCC3171
XCC3172
XCC3173
XCC3174
XCC3175
XCC3176
XCC3177
XCC3178
XCC3179
XCC3180
XCC3181
XCC3182
XCC3205
XCC3206
XCC3207
XCC3208
XCC3209
XCC3210
XCC3211
XCC3212
IS1404 transposase
IS1404 transposase
proline imino-peptidase
transketolase 1
XCC3267 conserved hypothetical protein
XCC3268 rubredoxin
XCC3211
XCC3212
XCC3213
XCC3214
XCC3215
XCC3216
XCC3217
XCC3218
XCC3219
XCC3220
Ps-TBDR
ATP sulfurylase/adenylylsulfate kinase
ATP sulfurylase small subunit
NADPH-sulfite reductase flavoprotein subunit
NADPH-sulfite reductase iron-sulfur protein
3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate reductase
hypothetical protein
TBDR
sensor histidine kinase
hypothetical protein
transcriptional regulator lysR family
siroheme synthase
cysteine synthase
XCC3157
XCC3158
XCC3159
XCC3160
XCC3161
XCC3162
XCC3163
XCC3164
XCC3076
XCC3077
XCC3078
XCC3079
XCC3080
XCC3081
XCC3082
XCC3083
XCC3084
XCC3057
XCC3058
XCC3059
XCC3060
XCC3061
XCC3062
XCC3063
XCC3064
XCC3065
XCC3066
XCC3067
XCC3068
XCC3069
XCC3070
XCC3071
XCC3072
XCC3073
XCC3074
XCC3047
XCC3048
XCC3049
XCC3050
XCC3051
XCC3052
XCC3053
XCC3054
XCC3055
XCC3056
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
XCC3040
XCC3041
XCC3042
XCC3043
XCC3044
XCC3045
XCC3046
XCC3047
XCC3048
XCC3049
transcriptional activator ampR family
hypothetical protein
ABC transporter ATP-binding protein
TBDR
hypothetical protein
TBDR
TBDR
cytochrome P450 hydroxylase
cation:proton antiporter
4-hydroxy-2-oxovalerate aldolase
Fur regulated TBDR, conserved locus
cytochrome P450 hydroxylase
cation:proton antiporter
4-hydroxy-2-oxovalerate aldolase
TBDR
hypothetical protein
hypothetical protein
transport protein
iron transporter
diaminopimelate decarboxylase
transcriptional regulator araC family
Putative Cobalamin locus
cobalamin synthase
conserved hypothetical protein
nicotinate-nucleotide-dimethylbenzimidazole phosphoribosyltransferase
adenosyl cobinamide kinase/adenosyl cobinamide phosphate guanylyltransferase
cobyric acid synthase
cobalamin biosynthesis protein
cobyrinic acid a,c-diamide synthase
cob(I)alamin adenolsyltransferase
conserved hypothetical protein
hypothetical protein
Ps-TBDR
homocysteine synthase PA5025
hypothetical protein
ATP-dependent Clp protease subunit
ABC transporter ATP-binding subunit
hypothetical protein
glutathione transferase
hypothetical protein
CAZy associated TBDR
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
TBDR
trehalose-6-phosphate phosphatase
hypothetical protein
trehalose-6-phosphate synthase
glucose dehydrogenase
chemotaxis protein
Putative partial CUT locus, CAZy associated TBDR
aminopeptidase
aminopeptidase
transcriptional regulator lacI family
1,4-beta-cellobiosidase
TBDR
glycosyl hydrolase
alpha-glucosidase
carboxylesterase
+
XCC3038 xylanase
XCC3039 beta lactamase
XCC3040 transcriptional activator ampR family
rubA
tktA
fhuE
cirA
blaI
cysB
cysG
cysK
fecA
nodQ
cysD
cysJ
cysI
cysH
susB
iroN
salR
mcp1
ostA
bfeA
ostB
clpB
btuB
metB
cobD
cobB
btuR
cobT
cobU
cobS
yceE
iucA
lysA
bioI
ybaL
mphE
fecA
bfeA
bfeA
bioI
ybaL
mphE
yheS
bfeA
ampR
xynB
bla
ampR
GH2
GH97
GH6
GH15
GT20
CE10
Fur-regulated
Fur-regulated
Fur-regulated
XC_0897
XC_0896
XC_0921
XC_0922
XC_0923
abs
XC_0924
XC_0925
XC_0926
XC_0927
XC_0928
XC_0929
XC_0915
XC_0916
XC_0917
XC_0918
XC_0919
XC_0920
XC_0921
XC_0922
XC_0994
XC_0993
XC_0992
XC_0991
XC_0990
XC_0989
XC_0988
XC_0987
XC_0985
XC_0984
XC_0983
XC_0982
XC_1008
XC_1007
XC_1006
XC_1005
XC_1004
XC_1003
XC_1002
XC_1001
XC_1082
XC_1081
XC_1080
XC_1079
XC_1078
XC_1077
XC_1076
XC_1075
XC_1074
XC_1101
XC_1100
XC_1099
XC_1098
XC_1097
XC_1096
XC_1095
XC_1094
XC_1093
XC_1092
XC_1091
XC_1090
XC_1089
XC_1088
XC_1087
XC_1086
XC_1085
XC_1084
XC_1111
XC_1110
XC_1109
XC_1108
XC_1107
XC_1106
XC_1105
XC_1104
XC_1103
XC_1102
XC_1118
XC_1117
XC_1116
XC_1115
XC_1114
XC_1113
XC_1112
XC_1111
XC_1110
XC_1109
XC_1120
XC_1119
XC_1118
XAC3413
XAC3414
XAC3368
abs
abs
XAC2423
XAC3370
XAC3370
abs
XAC3936
XAC3371
XAC3372
XCV3487
abs
XCV3880
XCV2716
XCV3489
XCV3489
abs
XCV0022 D
abs
XCV3490
XCV3530
XCV3531
XAC3362
XAC3363
XAC3364
XAC3365
XAC3366
XAC3367
XAC3368
abs
XAC3328
XAC3329
XAC3330
XAC3331
XAC3332
XAC3333 D
XAC3334
XAC3335
XAC3338
XAC3339
XAC3340
XAC3341
XAC3309
XAC3309
XAC3310
abs
XAC3311
XAC3312
XAC3313
XAC3315
XAC3206
XAC3208
abs
XAC3207
XAC3209
XAC3210
XAC3211
XAC3212
XAC3213
XCV3479 D
XCV3481
XCV3482
XCV3483
XCV3485
XCV3486
XCV3487
abs
XCV3445
XCV3446
XCV3447
XCV3448
XCV3449
XCV3450
XCV3451
XCV3453
XCV3456
XCV3457
XCV3458
XCV3459
XCV3425
XCV3425 D
XCV3427
abs
XCV3428
XCV3430
XCV3431
XCV3433
XCV3330
XCV3331
XCV3332
XCV3333
XCV3334
XCV3335
XCV3336
XCV3337
XCV3338
XAC3184
XAC3185
XAC3186
XAC3187
XAC3188
XAC3190
abs
XAC3191
XAC3192
XAC3193
XAC3194
abs
abs
XAC3195
XAC3196
XAC3202
XAC3203
XAC3204
XAC3170
XAC3171
XAC3175
XAC3176
XAC3177
XAC3178
XAC3179
XAC3180
XAC3181
abs
XCV3302
XCV3304
XCV3305
XCV3306
XCV3307
XCV3308
XCV3309
XCV3310
XCV3311
XCV3312
XCV3313
XCV3314
XCV3315
XCV3316
XCV3317
XCV3319
abs
XCV3320
XCV3321
XCV3322
XCV3323
abs
abs
XCV3324
XCV3325 D
XCV3326
XCV3327
XCV3328
XAC3163
XAC3164
XAC3165
XAC3166
XAC3167
XAC3168
XAC3169
XAC3170
XAC3171
XAC3175
abs
XAC3162
XAC3163
XCV3294
XCV3295
XCV3296
XCV3297
XCV3298
XCV3299
XCV3301
XCV3302
XCV3304
XCV3305
XCV3292
XCV3293
XCV3294
XOO1125
XOO1124
XOO1178
abs
abs
XOO1863
abs
abs
abs
abs
abs
XOO1176
XOO1191
XOO1190
XOO1182
XOO1181
XOO1180
XOO1179
XOO1178
abs
XOO3396
XOO3397
XOO3398
XOO3400
XOO3401
XOO3402 D
XOO3403
XOO3405
XOO3406
XOO3407
XOO3408
XOO3409
abs
abs
abs
XOO4035
abs
abs
abs
XOO3386
XOO1607
abs
XOO1605
XOO1604
XOO1603
XOO1602
XOO1601
abs
abs
XOO1353
XOO1352
XOO1351
XOO1350
XOO1350 D
XOO1350 D
abs
XOO1349
XOO1348
XOO1347
XOO1345
abs
XOO1338
XOO1337
abs
XOO1336
XOO1335 D
abs
abs
XOO1362
XOO1360
XOO1359
XOO1358
XOO1357
XOO1356
XOO1355
XOO1354
abs
XOO1369
XOO1368
XOO1367
XOO1366
XOO1365
XOO1364
XOO1363
abs
XOO1362
XOO1360
XOO1371
XOO1370
XOO1369
XF1494
XF0379
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XF1936
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XF1501
XF1500
XF1499
XF1498
XF1497
abs
XF1496
abs
abs
XF0833
XF0832
XF0831
abs
abs
abs
XF1267
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XF0381
abs
abs
abs
abs
abs
XF2140
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XF2133
XF2134
abs
XF2137
abs
abs
XF2140
abs
abs
abs
abs
Csal_3182, Chromohalobacter salexigens DSM 3043
STM1204, Salmonella typhimurium LT2
CC0563, Caulobacter crescentus CB15
PP_3340, Pseudomonas putida KT2440
Sde_4006, Saccharophagus degradans 2-40
Pfl_2344
Pfl_2342, Pseudomonas fluorescens PfO-1
PaerPA_01001749, strain PACS2 / PaerP_01003957, strain PA7
PaerPA_01001759 / PaerP_01003967
PaerPA_01001758 / PaerP_01003966
PaerPA_01001757 / PaerP_01003965
PaerPA_01001756 / PaerP_01003964
PaerPA_01001755 / PaerP_01003963
PaerPA_01001753 / PaerP_01003961
PaerPA_01001751 / PaerP_01003959
- / PaerP_01003958
PA2398; FpvA (43/65)
PA2398; FpvA (43/65)
PA2590 (35/48); PA2089 (35/47)
PA1271 (51/65)
PA3901 (31/48)
PA2590 (35/51); PA2089 (35/50)
PA2590 (35/52); PA2089 (35/50)
Psyr_2290, Pseudomonas syringae pv. syringae B728a
Shewmr7_0415, Shewanella sp. MR-7
VPA1656 (PvuA), Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633
VPA1658 (PvsA)
VPA1659 (PvsB)
VPA1660 (PvsC)
VPA1661 (PvsD)
VPA1662 (PvsE)
PA2590 (39/54); PA2089 (38/54)
Psyr_2290, Pseudomonas syringae pv. syringae B728a
Table S3 - continued
TdcF protein
cytochrome C6
flavin monoamine oxidase-related protein
Ps-TBDR
hypothetical protein
hypothetical protein
acetylornithine aminotransferase
hypothetical protein
inorganic pyrophosphatase
response regulator
TBDR
transcriptional regulator
hypothetical protein
thiamine biosynthesis protein
Sucrose utilization locus (sux locus)
transcriptional regulator, SuxR
sugar transporter, SuxC
TBDR, SuxA
amylosucrase or alpha amylase, SuxB
CAZy associated TBDR
high-affinity choline transport
betaine aldehyde dehydrogenase
choline dehydrogenase
TBDR
soluble lytic murein transglycosylase
tRNA nucleotidyltransferase
Putative CUT locus (unknown substrate)
tRNA nucleotidyltransferase
Ps-TBDR
nisin-resistance protein
N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase
glucosamine-fructose-6-phosphate aminotransferase
transcriptional regulator lacI family
glucose/galactose transporter
transcriptional regulator gntR family
type II secretion system protein N
Conserved locus
type II secretion system protein N
type II secretion system protein M
type II secretion system protein L
type II secretion system protein K
type II secretion system protein J
type II secretion system protein I
type II secretion system protein H
type II secretion system protein G
type II secretion system protein F
type II secretion system protein E
type II secretion system protein D
type II secretion system protein C
TBDR
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
Putative partial CUT locus
sugar kinase
transcriptional regulator
IS1480 transposase
Ps-TBDR
alcohol dehydrogenase class III
surface antigen gene
hypothetical protein
Fur regulated TBDR
periplasmic glucan biosynthesis protein
sulfur deprivation response regulator
aminopeptidase
TBDR
GGDEF family protein
sulfate permease
cellulase
Fur regulated TBDR
hypothetical protein
RNA polymerase sigma factor
transmembrane sensor
Ps-TBDR/transducer
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
TBDR
oxidoreductase
hydrolase
ribosomal small subunit pseudouridylate synthase
Conserved locus
hypothetical protein
chemotaxis protein
hypothetical protein
TBDR
hypothetical protein
XCC3276
XCC3277
XCC3278
XCC3279
XCC3280
XCC3281
XCC3282
XCC3313
XCC3314
XCC3315
XCC3316
XCC3317
XCC3318
XCC3319
XCC3632
XCC3633
XCC3634
XCC3635
XCC3636
XCC3637
XCC3638
XCC3711
XCC3712
XCC3713
XCC3714
XCC3715
XCC3592
XCC3593
XCC3594
XCC3595
XCC3596
XCC3597
XCC3598
XCC3515
XCC3516
XCC3517
XCC3518
XCC3519
XCC3520
XCC3521
XCC3471
XCC3472
XCC3473
XCC3474
XCC3475
XCC3476
XCC3477
XCC3415
XCC3416
XCC3417
XCC3418
XCC3419
XCC3420
XCC3421
XCC3422
XCC3423
XCC3424
XCC3425
XCC3426
XCC3427
XCC3428
XCC3429
XCC3430
XCC3407
XCC3408
XCC3409
XCC3410
XCC3411
XCC3412
XCC3413
XCC3414
XCC3415
XCC3402
XCC3403
XCC3404
XCC3405
XCC3406
XCC3407
XCC3356
XCC3357
XCC3358
XCC3359
glutamate-1-semialdehyde 2,1-aminomutase
transcriptional regulator
electron transfer protein azurin I
Ps-TBDR/oar
thiamin-phosphate pyrophosphorylase
XCC3269
XCC3270
XCC3271
XCC3272
XCC3273
XCC3274
+
+
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
-
fecI
fecR
pbuA
ybaR
engXCA
fpvA
hrpM
sac1
fepA
adhC
acoR
xcsN
xcsM
xcsL
xcsK
xcsJ
xcsI
xcsH
xcsG
xcsF
xcsE
xcsD
xcsC
fecA
xcsN
gluP
nagA
glmS
cca
fyuA
betT
betB
betA
btuB
slt
cca
cebR
suc1
fyuA
thiC
btuB
ppa
argD
fhuA
tdcF
hemL
acoK
az1
thiE
GH5; CBM2
GT2
CE9
GH23
GH13
Fur-regulated
Fur-regulated
Sucrose induced
Sucrose induced
Sucrose induced
Sucrose induced
XC_3782
XC_3783
XC_3784
XC_3785
XC_3786
XC_3703
XC_3704
XC_3705
XC_3706
XC_3707
XC_3708
XC_3709
XC_0555
XC_0556
XC_0557
XC_0558
XC_0559
XC_0560
XC_0561
XC_0645
XC_0644
XC_0643
XC_0642
XC_0641
XC_0640
XC_0639
XC_0690
XC_0689
XC_0688
XC_0687
XC_0686
XC_0685
XC_0684
XC_0749
XC_0748
XC_0747
XC_0746
XC_0745
XC_0744
XC_0743
XC_0742
XC_0741
XC_0740
XC_0739
XC_0738
XC_0737
XC_0736
XC_0735
XC_0734
XC_0757
XC_0756
XC_0755
XC_0754
XC_0753
XC_0752
XC_0751
XC_0750
XC_0749
XC_0762
XC_0761
XC_0760
XC_0759
XC_0758
XC_0757
XC_0808
XC_0807
XC_0806
XC_0805
XC_0852
XC_0851
XC_0850
XC_0849
XC_0848
XC_0847
XC_0846
XC_0888
XC_0887
XC_0886
XC_0885
XC_0884
XC_0883
XC_0882
XC_0895
XC_0894
XC_0893
XC_0892
XC_0891
XC_0890
XCV3872
XCV3873
XCV3874
XCV3875
XCV3876
XAC3753
abs
XAC3755
XAC3756
XAC3757
XAC3671
XAC3675
abs
XAC4131
XAC3676
XAC3677
XAC3678
XAC0549
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XCV0578
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XCV3791
XCV3795
abs
XCV4224
XCV3797
XCV3798
XCV3799
XAC0618
abs
XAC0615
abs
XAC0614
XAC0613
XAC0612
XAC0655
XAC0654
abs
XAC0653
XAC0652
XAC0651
XAC0650
XAC0705
XAC0704
XAC0703
XAC0702
XAC0701
XAC0700
XAC0699
XAC0698
XAC0697
XAC0696
XAC0695
XAC0694
XAC0693
XAC0692
XAC0691
XOO0689
XAC0717
XAC0716
abs
XAC0715
XAC0714
XAC0713
XAC0712
XAC0711
XAC0705
XAC0720
XAC0719
XAC0718
XAC3560
XAC3561
XAC0717
XAC3487
XAC3488
XAC3489
XAC3490
XAC3441
XAC3442
XAC3443
XAC3444
XAC3445
XAC3446
XAC3447
XAC3424
XAC3425
XAC3426
XAC3427
XAC3428
XAC3428
XAC3429
XAC3415
XAC3418
XAC3418
XAC3420
XAC3421
XAC3422
XCV0675
abs
XCV0673
abs
XCV0672
XCV0671
XCV0670
XCV0716
XCV0715
abs
XCV0714
XCV0713
XCV0712
XCV0711
XCV0766
XCV0765
XCV0764
XCV0763
XCV0762
XCV0761
XCV0760
XCV0759
XCV0758
XCV0757
XCV0756
XCV0755
XCV0754
XCV0753
XCV0752
XCV0750
XCV0773
XCV0772
abs
XCV0771
XCV0770
XCV0769
XCV0768
XCV0767
XCV0766
XCV0776
XCV0775
XCV0774
XCV3685
XCV3686
XCV0773
XCV3615
XCV3616
XCV3617
XCV3618
XCV3569
XCV3570
XCV3571
XCV3572
XCV3573
XCV3574
XCV3575
XCV3539
XCV3540
XCV3541
XCV3542
XCV3543
XCV3543
XCV3544
XCV3532
XCV3534
XCV3534
XCV3535
XCV3536
XCV3537
XOO0629
XOO0628
XOO0627
XOO0626
XOO0625
XOO0711
XOO0707
abs
abs
XOO0705
XOO0704
XOO0703
XOO4275
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XOO4011
abs
XOO4015
abs
XOO4016-7
XOO4018
XOO4019
XOO3971
abs
XOO3975
abs
XOO3867
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XOO0849
XOO0848
XOO0847
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XOO3900
XOO1784
abs
XOO3915
XOO3917
XOO3918
XOO3919
XOO3920
abs
XOO3886 D
abs
abs
abs
XOO0820
XOO3900
XOO1101
XOO1100
XOO1099
XOO1098
XOO0953
XOO0952
XOO0951
XOO0950
XOO0949
XOO0948
XOO0947
XOO1226
XOO1225
XOO1223
XOO1222-1
XOO1220
XOO1220
XOO1219
XOO1123
XOO1233
XOO1233
XOO1232
XOO1230
XOO1229
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XF1204
abs
abs
abs
XF1201
XF1200
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XF1623
abs
XF0820
abs
abs
abs
XF0818
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XF1519
XF1518
XF1517
abs
abs
abs
abs
abs
XF1459
XF1362
abs
abs
XF1465
XF1464
XF1463
XF1462
XF1461 D
abs
abs
abs
abs
abs
XF1363
XF1362
abs
abs
abs
abs
abs
XF2171
abs
abs
abs
abs
XF1888
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XF1427
XF0378
abs
abs
XF2302
abs
XF0557
CC1517, Caulobacter crescentus CB15
CC1520
CC1131, Caulobacter crescentus CB15
PFL_2293, Pseudomonas fluorescens Pf-5
PFL_2291
Pfl_2583, Pseudomonas fluorescens PfO-1
H16_B1039, Ralstonia eutropha H16
Sala_0314
Sala_0313, Sphingopyxis alaskensis RB2256
Sala_0312
Sala_0323
Sala_0322
Sala_0321
Sala_0320
Sala_0319
Sala_0318
Sala_0317
Sala_0316
Sala_0325
CC0445
CC0443
CC0444
CC0446, Caulobacter crescentus CB15
SO1822, Shewanella oneidensis MR-1
CC1136, Caulobacter crescentus CB15
CC1135
CC1137
SO1822, Shewanella oneidensis MR-1
CC3436, Caulobacter crescentus CB15
Patl_1148, Pseudoalteromonas atlantica T6c
Patl_1148, Pseudoalteromonas atlantica T6c
PA4837 (36/53)
PA4168; FpvB (35/51)
PA2398; FpvA (38/55)
PA2289 (22/39)
PA2070 (27/42)
PA2070 (27/43)
Table S3 - continued
79
80
ankyrin-like protein
ankyrin-like protein
hypothetical protein
TBDR
transcriptional regulator
hypothetical protein
peptidyl-prolyl cis-trans isomerase
Putative partial CUT locus (xylan/xylose)
gluconolactonase precursor
hypothetical protein
endo-1,4-beta-xylanase A
beta-galactosidase
hexuronic acid isomerase
xylanase
putative hexuronate transporter
TBDR
transport protein
xylosidase/arabinosidase
outer membrane lipoprotein
hypothetical protein
hypothetical protein
Putative partial CUT locus
glycerol-3-phosphate acyltransferase
hypothetical protein
transcriptional regulator lacI family
Ps-TBDR/oar
Ps-TBDR/oar
tryptophan halogenase
orotidine 5'-phosphate decarboxylase
acid phosphatase
Fur regulated TBDR
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
TBDR
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
Putative partial CUT locus, CAZy associated TBDR, arabinose induced TBDR
hypothetical protein
amino acid transporter
hypothetical protein
Ps-TBDR
hypothetical protein
hypothetical protein
sugar diacide regulator
Putative partial CUT locus, CAZy associated TBDR, xylan induced TBDR
export protein
hypothetical protein
glycerophosphoryl diester phosphodiesterase
TBDR
phosphatase precursor
Ps-TBDR/oar
thiophene and furan oxidation protein
polysaccharide deacetylase
60kDa inner-membrane protein
hypothetical protein
ABC transporter ATP-binding protein
hypothetical protein
transcriptional regulator
Conserved locus
hypothetical protein
hypothetical protein
hypothetical protein
dipeptidyl peptidase IV
glutathione S-transferase
TBDR
SapC related protein
Pass1-related protein
tryptophan halogenase
TonB-like protein
+
+
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
glpQ
fecA
phoC
oar
thdF
ygjT
yhdG
prnA
pyrF
lppC
plsB
hrmL
xynB
exuT
cirA
xylP
xsa
blc
xynA
gnl
fecA
prnA
gst
iroN
drrA
CE4
GH92
GH43
GH10
GH10
GH2
Xylan induced
Arabinose induced
Fur-regulated
Arabinose/xylan/xylose induced
XC_4321
XC_4322
XC_4324
XC_4325
XC_4326
XC_4327
XC_4328
XC_4329
XC_4330
XC_4308
XC_4309
XC_4310
XC_4311
XC_4312
XC_4313
XC_4314
XC_4246
XC_4247
XC_4248
XC_4249
XC_4250
XC_4251
XC_4252
XC_4220
XC_4221
XC_4222
XC_4223
XC_4224
XC_4225
XC_4226
XC_4227
XC_4205
XC_4206
XC_4207
XC_4208
XC_4209
XC_4210
XC_4211
XC_4212
XC_4213
XC_4214
XC_4215
XC_4216
XC_4217
XC_4138
XC_4139
XC_4140
XC_4141
XC_4142
XC_4143
XC_4144
XC_4047
XC_4049
XC_4050
XC_4051
XC_4052
XC_4053
XC_4054
XC_4055
XC_4056
XC_4057
XC_3787
XC_3788
XC_3789
XC_3790
XCV4477
XCV4478
XCV4479
XCV4480
XCV4482
abs
XCV4483
XCV4484
XCV4485
XAC4365
XAC4366
XAC4367
XAC4368
XAC4369
abs
XAC4370
XAC4371
XAC4372
XAC4353
XAC4354
XAC4355
XAC0544
XAC4357
XAC4358
XAC4359
XOO4626
XOO4627
XOO4628
XOO6430
XOO4633
abs
XOO4634
XOO4635
XOO4636
abs
XOO4572
abs
abs
abs
abs
XOO4619 D
XOO0286
abs
abs
abs
XOO4595
XOO4596
XOO4597
XAC4297
abs
XAC4298
abs
XAC4299
XAC4300
XAC4301
XCV4397
XCV0647 D
XCV4398
abs
XCV4399
XCV4400
XCV4401
XCV4465
XCV4466
XCV4467
XCV4468
XCV4369
XCV4470
XCV4471
XOO0254
XOO0253
XOO0252
XOO0250
XOO0249
XOO0248
XOO0247
XOO0246
abs
abs
abs
abs
XOO4427
XOO4429
XOO4430
XOO4431
XOO4432
XOO4433
XOO0274
abs
XOO0259 D
abs
abs
abs
abs
XOO4549
abs
abs
XOO0400
XOO0399
abs
XOO0398
XOO0397
XOO0394
XOO0393
XOO0392
XOO0391
XOO0390
XOO0624
XOO0623
abs
abs
XAC4270
XAC4271
XAC4272
XAC4273
XAC4274
XAC4275
XAC4276
XAC4277
XAC4248
abs
XAC4249
XAC4250
XAC4251
XAC4254
XAC4255
XAC4256
XAC4257
XAC4258
XAC4259
XAC4260
XAC4267
abs
abs
abs
abs
XAC4172
XAC4173
XAC4174
XAC4042
XAC4044
abs
XAC4046
XAC4047
XAC4048
XAC4049
XAC4050
XAC4051
XAC4052
XAC3758
XAC3759
XAC3760
XAC3761
XCV4371
XCV4372
XCV4373
XCV4374
XCV4375-6
XCV4377
XCV4378
XCV4379
XCV4353
abs
XCV4355
XCV4356
XCV4357
XCV4360
XCV4361
XCV4362
XCV4363
XCV4364
XCV4365
XCV4366
XCV4368
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XCV4133
XCV4134
XCV4135
XCV4136
XCV4137
XCV4138
XCV4139
XCV4140
XCV4141
XCV4142
XCV3877
XCV3878
XCV3879
XCV3880
XF0406
abs
abs
abs
abs
abs
XF2778
XF2779
XF2780
abs
XF0408
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
XF1031
abs
abs
abs
XF1036
abs
XF0034
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
abs
Patl_1148, Pseudoalteromonas atlantica T6c
Psyr_4483, Pseudomonas syringae pv. syringae B728a
Pfl_3124, Pseudomonas fluorescens PfO-1
slr1490, Synechocystis sp. PCC 6803
Sala_1015, Sphingopyxis alaskensis RB2256
Sala_1015, Sphingopyxis alaskensis RB2256
CC2832, Caulobacter crescentus CB15
CC1791, Caulobacter crescentus CB15
CC1792
Saro_1603, Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444
Saro_1605
Saro_1606
Saro_1607
CC1519
CC1518
PA2057 (31/46)
PA4837 (35/51)
c
b
Gene identification (ID), gene name, function and orientation are from Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc ) strain ATCC33913 [14].
Family number of proteins having functional domains of enzymes that degrade, modify, or create glycosidic bonds and referenced in the CAZy database (http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/). GH: Glycoside Hydrolase; GT: Glycosyl Transferase; PL: Polysaccharide Lyase; CE: Carbohydrate Esterase; CBM: Carbohydrate-Binding Module.
Orthologs (i.e, a minimum of 40% identity and a ratio of 0.8 of the length of the smallest protein) were identified by Blastp searches in the corresponding genomes. Genes belonging to the same syntheny group are bright yellow shadowed and genes present elswere in the genome are dark yellow shadowed. D: deleted protein; Abs: no blast or blast with an identity lower
d
Homologs were obtained by using the BlastP program without filter on the nr database with Xcc TBDRs as query sequences. A representative non Xanthomonads strain completely sequenced was considered. Synthenic regions (blue shadowed) were identified by reiterating the blast search using contiguous genes. Only proteins showing bidirectional identity above
30% and a ratio of 0.8 of the length of the smallest protein were considered.
e
Best homologs obtained in Pseudomonas aeruginosa PAO1 proteome by using BlastP program with Xcc TBDRs as query sequences. PAO1 TBDRs induced under iron restricted conditions [72] are orange shadowed.
a
XCC4232
XCC4233
XCC4234
XCC4235
XCC4236
XCC4237
XCC4238
XCC4239
XCC4240
XCC4219
XCC4220
XCC4221
XCC4222
XCC4223
XCC4224
XCC4225
XCC4159
XCC4160
XCC4161
XCC4162
XCC4163
XCC4164
XCC4165
XCC4128
XCC4130
XCC4129
XCC4131
XCC4132
XCC4133
XCC4134
XCC4135
XCC4113
XCC4114
XCC4115
XCC4116
XCC4117
XCC4118
XCC4119
XCC4120
XCC4121
XCC4122
XCC4123
XCC4124
XCC4126
XCC4049
XCC4050
XCC4051
XCC4052
XCC4053
XCC4054
XCC4055
XCC3958
XCC3959
XCC3960
XCC3961
XCC3962
XCC3963
XCC3964
XCC3965
XCC3966
XCC3967
XCC3716
XCC3717
XCC3718
XCC3719
Table S3 - continued
Table S4
Gene ID a
XCC0050
XCC0098
XCC0119
XCC0120
XCC0158
XCC0304
XCC0305
XCC0394
XCC0397
XCC0531
XCC0674
XCC0759
XCC0768
XCC0946
XCC1037
XCC1041
XCC1179
XCC1258
XCC1340
XCC1391
XCC1719
XCC1749
XCC1750
XCC1751
XCC1892
XCC1990
XCC2046
XCC2208
XCC2385
XCC2395
XCC2400
XCC2469
XCC2497
XCC2572
XCC2573
XCC2658
XCC2665
XCC2772
XCC2828
XCC2867
XCC2887
XCC2944
XCC3036
XCC3043
XCC3045
XCC3046
XCC3050
XCC3067
XCC3079
XCC3161
XCC3177
XCC3209
XCC3215
XCC3216
XCC3270
XCC3271
XCC3279
XCC3316
XCC3358
XCC3405
XCC3408
XCC3427
XCC3474
XCC3518
XCC3595
XCC3635
XCC3714
XCC3963
XCC4052
XCC4120
XCC4131
XCC4132
XCC4162
XCC4222
XCC4235
XCC4237
MM+PGA vs
MM (+/- SD) b
0.96 (+/- 0.04)
0.99 (+/- 0.06)
19.13 (+/- 1.45)
0.89 (+/- 0.09)
1.41 (+/- 0.53)
1.10 (+/- 0.02)
1.03 (+/- 0.01)
0.93 (+/- 0.03)
1.08 (+/- 0.03)
0.79 (+/- 0.21)
1.06 (+/- 0.00)
1.02 (+/- 0.12)
0.64 (+/- 0.16)
1.04 (+/- 0.01)
2.06 (+/- 0.05)
13.45 (+/- 0.66)
1.99 (+/- 0.05)
1.01 (+/- 0.00)
nt
0.97 (+/- 0.05)
1.06 (+/- 0.02)
1.06 (+/- 0.06)
1.02 (+/- 0.02)
1.05 (+/- 0.02)
0.91 (+/- 0.07)
0.98 (+/- 0.02)
1.03 (+/- 0.04)
0.91 (+/- 0.09)
0.94 (+/- 0.11)
1.02 (+/- 0.03)
1.04 (+/- 0.10)
1.04 (+/- 0.07)
1.00 (+/- 0.01)
1.02 (+/- 0.05)
0.63 (+/- 0.09)
1.02 (+/- 0.02)
1.09 (+/- 0.06)
1.04 (+/- 0.03)
0.96 (+/- 0.06)
nt
1.00 (+/- 0.00)
1.00 (+/- 0.01)
1.08 (+/- 0.07)
1.06 (+/- 0.02)
1.13 (+/- 0.14)
0.97 (+/- 0.05)
1.07 (+/- 0.03)
1.06 (+/- 0.08)
0.96 (+/- 0.02)
1.16 (+/- 0.05)
1.03 (+/- 0.08)
1.05 (+/- 0.06)
1.01 (+/- 0.01)
0.98 (+/- 0.03)
1.01 (+/- 0.00)
1.05 (+/- 0.04)
MM+MAL vs
MM (+/- SD) b
0.94 (+/- 0.00)
0.89 (+/- 0.00)
0.86 (+/- 0.12)
1.08 (+/- 0.02)
1.12 (+/- 0.02)
0.94 (+/- 0.02)
1.13 (+/- 0.03)
0.88 (+/- 0.02)
0.89 (+/- 0.00)
0.86 (+/- 0.01)
0.87 (+/- 0.02)
0.99 (+/- 0.01)
0.98 (+/- 0.08)
0.80 (+/- 0.10)
0.85 (+/- 0.23)
0.88 (+/- 0.03)
0.98 (+/- 0.06)
0.90 (+/- 0.06)
nt
1.16 (+/- 0.06)
1.03 (+/- 0.02)
16.45 (+/- 2.71)
0.81 (+/- 0.01)
0.86 (+/- 0.04)
1.13 (+/- 0.00)
0.95 (+/- 0.01)
0.92 (+/- 0.02)
0.78 (+/- 0.08)
0.82 (+/- 0.03)
0.86 (+/- 0.01)
0.84 (+/- 0.09)
0.84 (+/- 0.05)
0.79 (+/- 0.12)
0.91 (+/- 0.06)
1.14 (+/- 0.02)
1.03 (+/- 0.11)
1.05 (+/- 0.00)
0.80 (+/- 0.12)
0.82 (+/- 0.02)
nt
0.97 (+/- 0.00)
1.05 (+/- 0.03)
1.08 (+/- 0.26)
1.10 (+/- 0.09)
0.82 (+/- 0.03)
0.85 (+/- 0.03)
0.79 (+/- 0.06)
1.33 (+/- 0.36)
0.95 (+/- 0.01)
0.95 (+/- 0.06)
0.92 (+/- 0.07)
0.80 (+/- 0.02)
0.90 (+/- 0.13)
1.06 (+/- 0.03)
0.91 (+/- 0.02)
0.72 (+/- 0.08)
MM+ARA vs
MM+XYLAN vs
MM (+/- SD) b
MM (+/- SD) b
6.57 (+/- 0.64)
0.58 (+/- 0.02)
0.96 (+/- 0.02)
0.48 (+/- 0.02)
1.26 (+/- 0.02)
0.45 (+/- 0.29)
0.75 (+/- 0.04)
0.12 (+/- 0.02)
0.12 (+/- 0.00)
0.31 (+/- 0.03)
0.79 (+/- 0.03)
0.05 (+/- 0.07)
1.17 (+/- 0.22)
1.24 (+/- 0.00)
1.83 (+/- 0.57)
1.29 (+/- 0.32)
1.18 (+/- 0.93)
0.21 (+/- 0.09)
0.14 (+/- 0.12)
1.05 (+/- 0.32)
1.15 (+/- 0.21)
1.27 (+/- 0.59)
1.77 (+/- 0.81)
0.92 (+/- 0.07)
1.40 (+/- 0.38)
0.53 (+/- 0.04)
1.56 (+/- 0.49)
0.68 (+/- 0.03)
0.67 (+/- 0.02)
0.48 (+/- 0.02)
1.29 (+/- 0.05)
2.33 (+/- 0.03)
1.31 (+/- 0.01)
9.95 (+/- 1.20)
1.50 (+/- 0.30)
1.03 (+/- 0.00)
1.13 (+/- 0.09)
2.58 (+/- 0.07)
1.35 (+/- 0.04)
nt
nt
0.85 (+/- 0.28)
0.92 (+/- 0.74)
1.01 (+/- 0.00)
0.92 (+/- 0.35)
1.00 (+/- 0.19)
1.30 (+/- 0.34)
1.13 (+/- 0.08)
1.59 (+/- 0.15)
0.54 (+/- 0.06)
1.11 (+/- 0.05)
0.46 (+/- 0.02)
0.48 (+/- 0.02)
0.71 (+/- 0.01)
1.06 (+/- 0.01)
0.75 (+/- 0.01)
0.74 (+/- 0.02)
16.50 (+/- 1.52) 63.32 (+/- 0.30)
1.03 (+/- 0.04)
1.72 (+/- 0.07)
0.71 (+/- 0.01)
1.10 (+/- 0.02)
0.76 (+/- 0.11)
1.53 (+/- 0.14)
0.67 (+/- 0.02)
1.07 (+/- 0.01)
0.73 (+/- 0.13)
1.66 (+/- 0.29)
0.92 (+/- 0.06)
1.83 (+/- 0.11)
0.43 (+/- 0.07)
0.18 (+/- 0.01)
1.41 (+/- 0.19)
1.06 (+/- 0.31)
1.30 (+/- 0.23)
1.39 (+/- 0.13)
0.76 (+/- 0.03)
1.45 (+/- 0.01)
1.24 (+/- 0.04)
1.37 (+/- 0.04)
nt
nt
1.05 (+/- 0.20)
0.46 (+/- 0.05)
1.19 (+/- 0.06)
0.41 (+/- 0.05)
1.08 (+/- 0.10)
0.92 (+/- 0.03)
0.52 (+/- 0.03)
0.98 (+/- 0.06)
0.82 (+/- 0.04)
1.73 (+/- 0.13)
1.35 (+/- 1.39)
1.71 (+/- 1.18)
1.25 (+/- 0.56)
1.84 (+/- 0.85)
1.38 (+/- 0.90)
0.68 (+/- 0.42)
0.77 (+/- 0.30)
1.16 (+/- 0.09)
1.20 (+/- 0.13)
1.47 (+/- 0.11)
2.19 (+/- 0.16) 82.39 (+/- 22.11)
0.68 (+/- 0.34)
1.46 (+/- 0.42)
0.97 (+/- 0.05)
1.73 (+/- 0.29)
0.77 (+/- 0.04)
0.75 (+/- 0.26)
3.54 (+/- 0.68)
1.89 (+/- 0.36)
1.03 (+/- 0.01)
2.83 (+/- 0.02)
MM+XYL vs
MM (+/- SD) b
0.33 (+/- 0.01)
0.40 (+/- 0.02)
0.55 (+/- 0.05)
0.48 (+/- 0.05)
0.27 (+/- 0.05)
0.72 (+/- 0.05)
1.13 (+/- 0.11)
0.44 (+/- 0.09)
0.74 (+/- 0.01)
0.17 (+/- 0.02)
0.49 (+/- 0.02)
0.32 (+/- 0.05)
0.49 (+/- 0.01)
0.18 (+/- 0.01)
0.33 (+/- 0.02)
0.34 (+/- 0.04)
0.15 (+/- 0.01)
0.22 (+/- 0.00)
nt
0.56 (+/- 0.03)
0.60 (+/- 0.04)
0.27 (+/- 0.01)
0.63 (+/- 0.02)
0.23 (+/- 0.01)
0.37 (+/- 0.04)
0.26 (+/- 0.01)
0.71 (+/- 0.02)
5.50 (+/- 0.97)
0.38 (+/- 0.02)
0.44 (+/- 0.01)
0.31 (+/- 0.01)
1.17 (+/- 0.18)
0.26 (+/- 0.00)
0.23 (+/- 0.02)
0.46 (+/- 0.06)
0.72 (+/- 0.01)
1.23 (+/- 0.07)
0.30 (+/- 0.01)
0.30 (+/- 0.01)
nt
0.45 (+/- 0.00)
0.47 (+/- 0.02)
0.37 (+/- 0.08)
0.38 (+/- 0.00)
0.22 (+/- 0.03)
0.37 (+/- 0.00)
0.34 (+/- 0.02)
0.39 (+/- 0.01)
0.30 (+/- 0.01)
0.43 (+/- 0.01)
7.43 (+/- 1.06)
0.33 (+/- 0.02)
0.37 (+/- 0.01)
0.37 (+/- 0.02)
0.28 (+/- 0.00)
0.20 (+/- 0.00)
MM+SUC vs
MM (+/- SD) b
0.27 (+/- 0.00)
0.29 (+/- 0.00)
0.35 (+/- 0.11)
0.62 (+/- 0.06)
0.22 (+/- 0.08)
0.43 (+/- 0.00)
1.01 (+/- 0.12)
0.43 (+/- 0.04)
0.88 (+/- 0.02)
0.13 (+/- 0.03)
0.29 (+/- 0.00)
0.37 (+/- 0.05)
0.49 (+/- 0.07)
0.20 (+/- 0.01)
0.31 (+/- 0.00)
0.30 (+/- 0.05)
0.09 (+/- 0.00)
0.22 (+/- 0.00)
nt
0.40 (+/- 0.06)
0.58 (+/- 0.01)
0.21 (+/- 0.00)
0.50 (+/- 0.01)
0.17 (+/- 0.01)
0.32 (+/- 0.03)
0.18 (+/- 0.01)
0.42 (+/- 0.01)
0.24 (+/- 0.01)
0.32 (+/- 0.02)
0.37 (+/- 0.02)
0.30 (+/- 0.00)
1.10 (+/- 0.06)
0.18 (+/- 0.00)
0.18 (+/- 0.02)
0.70 (+/- 0.07)
0.72 (+/- 0.05)
1.72 (+/- 0.15)
0.23 (+/- 0.03)
0.27 (+/- 0.00)
nt
0.46 (+/- 0.05)
0.57 (+/- 0.01)
0.34 (+/- 0.05)
5.51 (+/- 0.05)
0.18 (+/- 0.03)
0.28 (+/- 0.02)
0.23 (+/- 0.10)
0.45 (+/- 0.01)
0.18 (+/- 0.03)
0.30 (+/- 0.05)
0.23 (+/- 0.02)
0.24 (+/- 0.02)
0.31 (+/- 0.01)
0.42 (+/- 0.01)
0.28 (+/- 0.01)
0.16 (+/- 0.01)
MM+GLC vs
MM (+/- SD) b
0.31 (+/- 0.01)
0.42 (+/- 0.01)
0.48 (+/- 0.11)
0.46 (+/- 0.00)
0.28 (+/- 0.01)
0.34 (+/- 0.05)
1.21 (+/- 0.04)
0.38 (+/- 0.01)
0.91 (+/- 0.06)
0.23 (+/- 0.01)
0.21 (+/- 0.01)
0.39 (+/- 0.09)
0.40 (+/- 0.01)
0.17 (+/- 0.02)
0.33 (+/- 0.08)
0.28 (+/- 0.01)
0.22 (+/- 0.04)
0.18 (+/- 0.03)
nt
0.44 (+/- 0.00)
0.74 (+/- 0.04)
0.27 (+/- 0.00)
0.50 (+/- 0.02)
0.25 (+/- 0.04)
0.42 (+/- 0.00)
0.20 (+/- 0.02)
0.43 (+/- 0.00)
0.19 (+/- 0.03)
0.31 (+/- 0.01)
0.41 (+/- 0.00)
0.25 (+/- 0.01)
1.21 (+/- 0.02)
0.20 (+/- 0.01)
0.22 (+/- 0.00)
0.59 (+/- 0.04)
0.89 (+/- 0.05)
1.44 (+/- 0.04)
0.24 (+/- 0.01)
0.29 (+/- 0.00)
nt
0.54 (+/- 0.13)
0.66 (+/- 0.04)
0.77 (+/- 0.30)
0.36 (+/- 0.08)
0.18 (+/- 0.01)
0.37 (+/- 0.04)
0.28 (+/- 0.02)
1.01 (+/- 0.11)
0.40 (+/- 0.15)
0.36 (+/- 0.00)
0.38 (+/- 0.04)
0.32 (+/- 0.01)
0.24 (+/- 0.03)
0.40 (+/- 0.16)
0.17 (+/- 0.02)
0.19 (+/- 0.02)
RM vs MM (+/SD) b
0.16 (+/- 0.00)
0.20 (+/- 0.06)
0.53 (+/- 0.05)
0.27 (+/- 0.07)
0.16 (+/- 0.01)
0.63 (+/- 0.02)
0.38 (+/- 0.00)
0.38 (+/- 0.01)
0.26 (+/- 0.06)
0.16 (+/- 0.04)
0.14 (+/- 0.01)
0.17 (+/- 0.01)
0.34 (+/- 0.04)
0.11 (+/- 0.02)
0.23 (+/- 0.00)
1.11 (+/- 0.02)
0.15 (+/- 0.02)
0.15 (+/- 0.00)
nt
0.33 (+/- 0.06)
0.62 (+/- 0.02)
0.14 (+/- 0.00)
0.71 (+/- 0.04)
0.20 (+/- 0.01)
0.09 (+/- 0.01)
0.10 (+/- 0.01)
1.12 (+/- 0.04)
0.26 (+/- 0.01)
0.36 (+/- 0.00)
0.45 (+/- 0.03)
0.31 (+/- 0.01)
0.89 (+/- 0.05)
0.10 (+/- 0.00)
0.11 (+/- 0.00)
0.18 (+/- 0.02)
0.49 (+/- 0.02)
0.93 (+/- 0.07)
0.23 (+/- 0.02)
0.19 (+/- 0.00)
nt
0.87 (+/- 0.03)
0.81 (+/- 0.01)
0.62 (+/- 0.02)
0.46 (+/- 0.15)
0.12 (+/- 0.02)
0.21 (+/- 0.02)
0.41 (+/- 0.05)
0.40 (+/- 0.00)
0.20 (+/- 0.02)
0.24 (+/- 0.04)
0.24 (+/- 0.02)
0.23 (+/- 0.04)
0.27 (+/- 0.00)
0.22 (+/- 0.03)
0.22 (+/- 0.04)
0.22 (+/- 0.02)
a
Gene identification (ID) from Xanthomonas campestris pv. campestris strain ATCC33913 [14]. Genes coding for proteins possessing all canonical TBDR
domains are boldfaced, for TBDRs with an N-terminal extension are in italics and for truncated TBDRs are underlined.
b
Average ratios of β-glucuronidase expression assays on TBDR insertion mutants. Standard deviations (SD) were calculated from at least two
independent biological experiments. Genes induced or repressed (by at least a two-fold factor) are dark and bright gray-shadowed respectively. nt: not
tested; -: non significant expression (less than 1 Miller unit in both tested media). MM: minimal medium; PGA: polygalacturonic acid 0.125%; MAL: maltose
20 mM; ARA: arabinose 20 mM; Xylan 0.125%; XYL: xylose 20 mM; SUC: sucrose 20 mM; GLC: glucose 20 mM; RM: rich medium.
81
XCC2572
XCC2658
XCC2867
XCC2828
XCC1892
XCC3161
XCC4237
XCC1391
XCC1037
XCC3036
XCC2385
XCC2665
XCC3358
XCC0397
XCC1340
XCC3427
XCC3963
XCC0119
XCC0759
XCC0050
XCC3635
XCC1041
XCC4052
XCC3209
XCC2944
XCC0120
XCC4120
XCC1749
XCC2469
XCC1258
XCC2497
XCC2772
XCC1179
XCC1719
XCC3279
XCC0768
XCC4162
XCC3714
XCC0394
XCC3474
XCC0098
XCC2046
XCC3177
XCC3079
XCC3067
XCC0674
XCC3518
XCC3595
XCC3050
XCC4235
1B
1B
1B
1C
1C
1C
1D
1F
1H
2B
1C
1B
1B
1B
1B
1C
1C
1C
1C
1C
1C
1C
1C
1C
1C
1C
1C
1C
1C
1C
1D
1F
1H
1H
2B
1B
1F
1F
1F
3A
3A
3B
3B
1B
1B
1F
1F
1F
2A
2B
1B
1B
1B
1B
1B
1B
1B
1B
1B
1C
1C
1C
1C
1D
1D
1D
1D
1D
1F
2B
Subgroup
b
hrp
oar
iron
plant
plant
plant
plant
hrp
plant
plant
oar/plant
iron
plant
plant
iron
iron
iron
iron
iron
oar
oar
oar
oar
oar
iron
plant
plant
plant
Specificity
c
Shewanella sp. MR-4; Shewmr4_0124; 39/57
(Idiomarina baltica OS145); OS145_12066; 37/51
(Alteromonas macleodii 'Deep ecotype'); MADE_16410; 41/57
Pseudoalteromonas atlantica T6c; Patl_3278; 42/58
Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125; PSHAb0165; 37/54
Saccharophagus degradans 2-40; Sde_4006; 37/54
(Pseudoalteromonas tunicata D2); PTD2_04266; 43/59
Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125; PSHAb0279; 47/67
(Pseudoalteromonas tunicata D2); PTD2_15087; 44/62
Idiomarina loihiensis L2TR; IL2594; 44/61
(Desulfuromonas acetoxidans DSM 684); Dace_2425; 34/51
Sphingopyxis alaskensis RB2256; Sala_0305; 40/60
Caulobacter crescentus CB15; CC1136; 58/74
(Oceanicaulis alexandrii HTCC2633); OA2633_12910; 35/50
(Caulobacter sp. K31); CaulDRAFT_0125; 40/55
Sphingopyxis alaskensis RB2256; Sala_0313; 41/57
Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444; Saro_1603; 45/62
Maricaulis maris MCS10; Mmar10_0224; 43/58
Gluconobacter oxydans 621H; GOX1188; 35/50
Caulobacter crescentus CB15; CC1791; 35/51
Caulobacter crescentus CB15; CC1131; 48/62
Caulobacter crescentus CB15; CC1113; 31/45
Caulobacter crescentus CB15; CC1113; 30/47
Caulobacter crescentus CB15; CC0563; 30/49
Caulobacter crescentus CB15; CC0446; 37/54
Caulobacter crescentus CB15; CC0442; 38/51
(Caulobacter sp. K31); CaulDRAFT_3665; 51/65
(Caulobacter sp. K31); CaulDRAFT_2405; 43/59
(Caulobacter sp. K31); CaulDRAFT_1654; 38/55
(Caulobacter sp. K31); CaulDRAFT_1139; 46/60
(Parvularcula bermudensis HTCC2503); PB2503_02212; 34/50
(Sphingomonas sp. SKA58); SKA58_12165; 47/61
(Caulobacter sp. K31); CaulDRAFT_3818; 73/83
(Caulobacter sp. K31); CaulDRAFT_0763; 50/65
Caulobacter crescentus CB15; CC3436; 31/47
Anabaena sp. PCC 7120; alr2153; 37/54
Synechocystis sp. PCC 6803; slr1490; 35/53
Ralstonia solanacearum GMI1000; RSp0100; 41/57
Burkholderia sp. 383; Bcep18194_B2705; 50/69
Ralstonia eutropha H16; H16_B1039; 51/68
Bordetella bronchiseptica RB50; BB0832; 47/60
(Acidovorax avenae subsp. citrulli AAC00-1); AaveDRAFT_1098; 63/76
(Acidovorax avenae subsp. citrulli AAC00-1); AaveDRAFT_0325; 58/72
Pseudomonas fluorescens PfO-1; Pfl_2342; 54/67
Pseudomonas aeruginosa PAO1; PA1271; 50/64
Pseudomonas syringae pv. syringae B728a; Psyr_3769; 56/71
Pseudomonas fluorescens PfO-1; Pfl_2583; 40/55
Pseudomonas fluorescens Pf-5; PFL_2293; 40/58
(Pseudomonas aeruginosa PA7); PaerP_01004786; 56/68
Pseudomonas syringae pv. syringae B728a; Psyr_4483; 42/57
st
1
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC4222; 55/69
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC3045; 56/70
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC3045; 47/61
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC3043; 56/70
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC2867; 41/57
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC2867; 37/52
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC2400; 40/57
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC2395; 39/56
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC0531; 55/69
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC3408; 45/60
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC2887; 45/60
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC1749; 38/54
X. campestris pv. campestris 8004; XC_2484 (XCC1750); 33/49 (31/46)
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC4237; 34/51
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC4237; 35/49
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC4132; 49/64
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC4132; 42/59
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC4131; 48/64
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC3518; 38/52
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC4235; 41/57
(Pseudoalteromonas tunicata D2); PTD2_18885; 40/57
Methylobacillus flagellatus KT; Mfla_0134; 36/55
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC3405; 37/52
Colwellia psychrerythraea 34H; CPS_3698; 41/56
(Pseudoalteromonas tunicata D2); PTD2_22047; 37/54
(Caulobacter sp. K31); CaulDRAFT_1586; 36/52
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC2573; 34/51
Shewanella sp. MR-4; Shewmr4_2386; 44/59
Sphingopyxis alaskensis RB2256; Sala_0027; 45/60
(gamma proteobacterium KT 71); KT71_02412; 42/58
(Alteromonas macleodii 'Deep ecotype'); MADE_18984; 34/51
Shewanella frigidimarina NCIMB 400; Sfri_3503; 36/54
(Shewanella baltica OS195); Sbal195DRAFT_3485; 43/69
Pseudoalteromonas atlantica T6c; Patl_3441; 34/50
Gluconobacter oxydans 621H; GOX0945; 28/45
(Sphingomonas sp. SKA58); SKA58_09651; 39/56
(Sphingomonas sp. SKA58); SKA58_00625; 45/61
Caulobacter crescentus CB15; CC0442; 40/56
Caulobacter crescentus CB15; CC0562; 35/51
Caulobacter crescentus CB15; CC1113; 29/45
(Caulobacter sp. K31); CaulDRAFT_3050; 37/55
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC4052; 28/45
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC1041; 28/45
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC0759; 27/43
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC3408; 37/52
Maricaulis maris MCS10; Mmar10_0224; 36/50
(Sphingomonas sp. SKA58); SKA58_04811; 44/61
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC1750; 38/54
Caulobacter crescentus CB15; CC1754; 36/54
Saccharophagus degradans 2-40; Sde_3880; 36/55
(Oceanicaulis alexandrii HTCC2633); OA2633_12585; 32/48
(Pseudomonas aeruginosa PA7); PaerP_01004007; 40/56
Caulobacter crescentus CB15; CC1970; 50/63
Caulobacter crescentus CB15; CC3336; 49/63
(Parvularcula bermudensis HTCC2503); PB2503_08669; 30/49
Caulobacter crescentus CB15; CC2194; 36/52
Anabaena sp. PCC 7120; alr2588; 35/52
(Caulobacter sp. K31); CaulDRAFT_2832; 33/46
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC0119; 28/42
Shewanella frigidimarina NCIMB 400; Sfri_1787; 37/55
Saccharophagus degradans 2-40; Sde_0682; 30/48
Maricaulis maris MCS10; Mmar10_0368; 34/48
Pseudomonas aeruginosa PAO1; PA1322; 39/55
(Alteromonas macleodii 'Deep ecotype'); MADE_03081; 45/59
Maricaulis maris MCS10; Mmar10_1115; 41/57
(Caulobacter sp. K31); CaulDRAFT_4856; 32/46
Maricaulis maris MCS10; Mmar10_2735; 38/54
(Alteromonas macleodii 'Deep ecotype'); MADE_11505; 33/52
Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125; PSHAb0340; 32/48
(Pseudomonas aeruginosa 2192); Paer2_01000319; 39/55
(Caulobacter sp. K31); CaulDRAFT_0617; 48/63
(Caulobacter sp. K31); CaulDRAFT_5326; 48/62
Hyphomonas neptunium ATCC 15444; HNE_2355; 30/47
(marine gamma proteobacterium HTCC2207); GB2207_01907; 32/48
(Shewanella sp. ANA-3); Shewana3DRAFT_4183; 44/60
Caulobacter crescentus CB15; CC1970; 44/61
Pseudoalteromonas atlantica T6c; Patl_2585; 39/58
(Sphingomonas sp. SKA58); SKA58_03800; 33/51
(Pseudoalteromonas tunicata D2); PTD2_20302; 34/51
Shewanella sp. MR-7; Shewmr7_0064; 53/69
Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125; PSHAa2973; 33/50
Zymomonas mobilis subsp. mobilis ZM4; ZMO1040; 28/45
Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444; Saro_2438; 39/56
(Shewanella baltica OS195); Sbal195DRAFT_0485; 43/60
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC0120; 39/52
(marine gamma proteobacterium HTCC2207); GB2207_09881; 39/55
Pseudoalteromonas atlantica T6c; Patl_0122; 35/51
(Caulobacter sp. K31); CaulDRAFT_1582; 34/51
(Alteromonas macleodii 'Deep ecotype'); MADE_02756; 39/55
Ralstonia eutropha H16; H16_A0191; 35/50
(Sphingomonas sp. SKA58); SKA58_03670; 34/51
Caulobacter crescentus CB15; CC2832; 44/58
Shewanella sp. MR-7; Shewmr7_2458; 43/59
Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125; PSHAa2180; 44/62
Pseudoalteromonas atlantica T6c; Patl_3410; 41/58
(Pseudoalteromonas tunicata D2); PTD2_04446; 33/53
Colwellia psychrerythraea 34H; CPS_0977; 34/53
(Shewanella baltica OS155); SbalDRAFT_3744; 53/69
Caulobacter crescentus CB15; CC1666; 34/50
(Oceanicaulis alexandrii HTCC2633); OA2633_07829; 29/46
Caulobacter crescentus CB15; CC0171; 40/55
Shewanella frigidimarina NCIMB 400; Sfri_1313; 44/60
Saccharophagus degradans 2-40; Sde_0952; 40/56
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC3209; 27/43
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC4052; 28/44
(Caulobacter sp. K31); CaulDRAFT_3053; 37/54
Caulobacter crescentus CB15; CC0999; 41/56
(Shewanella amazonensis SB2B); SamaDRAFT_2978; 37/53
Saccharophagus degradans 2-40; Sde_2542; 33/47
Shewanella frigidimarina NCIMB 400; Sfri_2471; 38/57
(Pseudomonas putida F1); PputDRAFT_2116; 36/53
Synechococcus sp. JA-3-3Ab; CYA_2031; 35/51
Anabaena sp. PCC 7120; alr2626; 34/51
(Pseudomonas aeruginosa C3719): PaerC_01000244; 50/64
Pseudomonas fluorescens Pf-5; PFL_3835; 52/71
(Pseudomonas aeruginosa 2192); Paer2_01001533; 38/55
Pseudomonas fluorescens PfO-1; Pfl_1848; 38/56
(Vibrio alginolyticus); vfgA; 44/60
(Pseudomonas aeruginosa PA7); PaerP_01003957; 50/64
Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448A; PSPPH_1484; 55/71
Pseudomonas fluorescens Pf-5; PFL_3315; 38/56
Pseudomonas sp.; pbuA; 40/57
(Vibrio splendidus 12B01); V12B01_16041; 45/59
Chromobacterium violaceum ATCC 12472; CV3896; 36/52
Anabaena sp. PCC 7120; all2610; 36/54
(Ralstonia solanacearum UW551); RRSL_00729; 42/56
Pseudomonas fluorescens Pf-5; PFL_0646; 42/59
(Polaromonas naphthalenivorans CJ2); PnapDRAFT_2142; 35/50
Nitrosospira multiformis ATCC 25196; Nmul_A1426; 41/57
Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000; PSPTO_1855; 42/59
Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000; PSPTO_1855; 49/63
th
4
Ralstonia solanacearum GMI1000; RSc2729; 42/55
Rhodopseudomonas palustris HaA2; RPB_0102; 42/61
(Rubrivivax gelatinosus PM1); Rgel02002002; 44/59
(Rubrivivax gelatinosus PM1); Rgel02003219; 43/57
(Pseudomonas putida F1); PputDRAFT_4622; 43/59
(Pseudomonas putida F1); PputDRAFT_4622; 50/63
Ranking of Blast results beside Xanthomonads othologs (Bacterial name; locus_tag; %Identity/%Similarity) d
rd
3
(Ralstonia solanacearum UW551); RRSL_03417; 41/57
(Burkholderia cenocepacia HI2424); Bcen2424DRAFT_6742; 48/68
Ralstonia eutropha JMP134; Reut_A1787; 49/66
Azoarcus sp. EbN1; ebA6096; 44/58
Pseudomonas putida KT2440; PP_3340; 44/60
Pseudomonas putida KT2440; PP_3340; 50/64
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC3043; 41/56
Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14; PA14_47800; 50/64
Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000; PSPTO_1610; 56/72
Pseudomonas entomophila L48; PSEEN2482; 38/56
(Pseudomonas putida F1); PputDRAFT_3079; 39/57
(Azotobacter vinelandii AvOP); AvinDRAFT_7778; 49/64
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC0946; 43/59
nd
2
c
b
Gene identification (ID) from Xanthomonas campestris pv. campestris strain ATCC33913 [14].
From the phylogenetic tree presented on Figure S1.
Iron: TBDR probably involved in iron uptake; plant: TBDR probably involved in plant carbohydrate uptake; Oar: TBDR of the Oar-like subclass; hrp: TBDR gene regulated by hrp regulators.
d
Blast hit results with similarities lower than those obtained with non orthologous Xcc TBDRs were not included. Only the five first results were shown. Colors correspond to bacterial classification: α- (blue), β- (orange), δ-proteobacteria (pink), γ- (green) proteobacteria, Xanthomonas (yellow) or cyanobacteria (violet).
a
a
XCC0531
XCC3043
XCC3046
XCC3045
XCC3316
XCC3405
XCC2395
XCC2400
XCC4222
XCC2887
XCC3408
XCC1750
XCC1990
XCC2573
XCC3271
XCC4131
XCC2208
XCC4132
XCC0158
XCC0946
Gene ID
Caulobacter crescentus CB15; CC2287; 36/54
(Caulobacter sp. K31); CaulDRAFT_1147; 29/46
(Alteromonas macleodii 'Deep ecotype'); MADE_07746; 32/47
(Pseudomonas aeruginosa PACS2); PaerPA_01001801; 39/55
(Oceanicaulis alexandrii HTCC2633); OA2633_01564; 43/59
(Oceanicaulis alexandrii HTCC2633); OA2633_00415; 41/56
Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000; PSPTO_0671; 29/45
Sphingopyxis alaskensis RB2256; Sala_3041; 33/47
Colwellia psychrerythraea 34H; CPS_2359; 29/49
Pseudoalteromonas atlantica T6c; Patl_1142; 41/58
Colwellia psychrerythraea 34H; CPS_1977; 43/60
(Alteromonas macleodii 'Deep ecotype'); MADE_16255; 39/56
(Azotobacter vinelandii AvOP); AvinDRAFT_2260; 35/52
Pseudoalteromonas atlantica T6c; Patl_1822; 33/52
Shewanella frigidimarina NCIMB 400; Sfri_3988; 53/70
Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125; PSHAa1271; 33/50
(Pseudoalteromonas tunicata D2); PTD2_06374; 30/46
(Oceanicaulis alexandrii HTCC2633); OA2633_11970; 36/54
Colwellia psychrerythraea 34H; CPS_3737; 42/59
(Caulobacter sp. K31); CaulDRAFT_3041; 40/57
(Caulobacter sp. K31); CaulDRAFT_2836; 28/43
X. campestris pv. campestris ATCC33913; XCC1749; 28/43
(Idiomarina baltica OS145); OS145_10882; 39/56
Pseudomonas entomophila L48; PSEEN1173; 35/51
(Caulobacter sp. K31); CaulDRAFT_0034; 35/50
Gloeobacter violaceus PCC 7421; glr0349; 34/50
Nitrosomonas europaea ATCC 19718; NE0636; 45/63
Burkholderia sp. 383; Bcep18194_B2436; 46/63
(Shewanella sp. W3-18-1); Sputw3181DRAFT_3279; 36/55
(Pseudomonas putida F1); PputDRAFT_3127; 39/57
(Vibrio alginolyticus 12G01); V12G01_04486; 44/60
Burkholderia cepacia AMMD; Bamb_4928; 40/57
Pseudomonas fluorescens PfO-1; Pfl_0594; 42/60
Methylobacillus flagellatus KT; Mfla_1253; 35/49
Escherichia coli W3110; yncD; 41/59
(Acidovorax avenae subsp. citrulli AAC00-1); AaveDRAFT_0325; 42/58
Caulobacter crescentus CB15; CC1781; 45/60
th
5
Table S5
82
Table S6
Plasmids
pVO155
pLAFR6
pFAJ1700
pSC154
pCZ367
pCZ750
pCZ525
pL-XCC3358 ; pL-suxA
pL-XCC3359 ; pL-suxB
pL-XCC1470 ; pL-fur
pPr-XCC3358 ; pPr-suxA
pPr-XCC1990
pPr-XCC3209
Strains
Xcc 568
XP001
XP002
XP003
XP004
XP005
XP006
XP007
XP008
XP009
XP010
XP011
XP012
XP013
XP014
XP015
XP016
XP017
XP018
XP019
XP020
XP021
XP022
XP023
XP024
XP025
XP026
XP027
XP028
XP029
XP030
XP031
XP032
XP033
XP034
XP035
XP036
XP037
XP038
XP039
XP040
XP041
XP042
XP043
XP044
XP045
XP046
XP047
XP048
XP049
XP050
XP051
XP052
XP053
XP054
XP055
XP056
XP057
83
Features
Xcc sequence cloned
relative to the
putative start codon
pUC119 derivative, containing the promoterless gus (uidA ) reporter gene encoding ȕglucuronidase, used for insertion mutagenesis; KmR AmpR
pLAFR1 with trp terminators; TetR
pTR102-derived expression vector, containing a multiple cloning site and transcriptional
terminators in both orientations; TetR AmpR
pET-26b(+) derived vector with the cyaA' gene from pMS107 used for translational fusion
constructs. The T7 promoter has been replaced by Ptac promoter sequence; KmR
pUC18-derived vector used for insertional mutagenesis; AmpR GmR
pFAJ1700 containing the Kpn I-Asc I lacZ gene from the pCZ367 plasmid; TetR AmpR
pSC154 ∆cyaA' ; KmR
[36]
[108]
[109]
[107]
pCZ525-XCC3358- pLAFR6; TetR KmR
pCZ525-XCC3359- pLAFR6; TetR KmR
pFAJ1700-XCC1470 ; TetR AmpR
pFAJ1700-lacZ -prXCC3358 ; TetR AmpR
pFAJ1700-lacZ -prXCC1990 ; TetR AmpR
pFAJ1700-lacZ -prXCC3209 ; TetR AmpR
from - 247 to + 2474
from - 15 to + 1913
from - 95 to + 545
from - 580 to + 459
from - 500 to + 1
from - 500 to + 1
Genotype and/or phenotype
Location of insertion
or deletion relative to
the putative start
codon
Wild-type strain; Rifampycin resistant strain derivative of Xanthomonas campestris pv.
campestris LMG568/ATCC33913
XCC0050 ::pVO155; RifR KmR
XCC0098 ::pVO155; RifR KmR
XCC0119 ::pVO155; RifR KmR
XCC0120 ::pVO155; RifR KmR
XCC0158 ::pVO155; RifR KmR
XCC0304 ::pVO155; RifR KmR
XCC0305 ::pVO155; RifR KmR
XCC0394 ::pVO155; RifR KmR
XCC0397 ::pVO155; RifR KmR
XCC0531 ::pVO155; RifR KmR
XCC0674 ::pVO155; RifR KmR
XCC0759 ::pVO155; RifR KmR
XCC0768 ::pVO155; RifR KmR
XCC0946 ::pVO155; RifR KmR
XCC1037 ::pVO155; RifR KmR
XCC1041 ::pVO155; RifR KmR
XCC1179 ::pVO155; RifR KmR
XCC1258 ::pVO155; RifR KmR
XCC1340 ::pVO155; RifR KmR
XCC1391 ::pVO155; RifR KmR
XCC1719 ::pVO155; RifR KmR
XCC1749 ::pVO155; RifR KmR
XCC1750 ::pVO155; RifR KmR
XCC1751 ::pVO155; RifR KmR
XCC1892 ::pVO155; RifR KmR
XCC2046 ::pVO155; RifR KmR
XCC2208 ::pVO155; RifR KmR
XCC2385 ::pVO155; RifR KmR
XCC2395 ::pVO155; RifR KmR
XCC2400 ::pVO155; RifR KmR
XCC2469 ::pVO155; RifR KmR
XCC2497 ::pVO155; RifR KmR
XCC2572 ::pVO155; RifR KmR
XCC2573 ::pVO155; RifR KmR
XCC2658 ::pVO155; RifR KmR
XCC2665 ::pVO155; RifR KmR
XCC2772 ::pVO155; RifR KmR
XCC2828 ::pVO155; RifR KmR
XCC2867 ::pVO155; RifR KmR
XCC2887 ::pVO155; RifR KmR
XCC2944 ::pVO155; RifR KmR
XCC3036 ::pVO155; RifR KmR
XCC3043 ::pVO155; RifR KmR
XCC3045 ::pVO155; RifR KmR
XCC3046 ::pVO155; RifR KmR
XCC3050 ::pVO155; RifR KmR
XCC3067 ::pVO155; RifR KmR
XCC3079 ::pVO155; RifR KmR
XCC3161 ::pVO155; RifR KmR
XCC3177 ::pVO155; RifR KmR
XCC3215 ::pVO155; RifR KmR
XCC3216 ::pVO155; RifR KmR
XCC3270 ::pVO155; RifR KmR
XCC3271 ::pVO155; RifR KmR
XCC3279 ::pVO155; RifR KmR
XCC3316 ::pVO155; RifR KmR
suxA: :pVO; XCC3358 ::pVO155; RifR KmR
Reference
[107]
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Reference
[113]
+ 2473
+ 784
+ 1084
+ 3119
+ 691
+ 765
+ 1007
+ 2082
+ 406
+ 736
+ 1958
+ 418
+ 387
+ 2091
+ 502
+ 1249
+ 1632
+ 2524
+ 1205
+ 878
+ 244
+ 966
+ 1657
+ 304
+ 1274
+ 200
+ 2036
+ 1285
+ 1258
+ 2355
+ 201
+ 1880
+ 830
+ 866
+ 1556
+ 780
+ 833
+ 2871
+ 293
+ 1558
+ 334
+ 451
+ 428
+ 1572
+ 702
+ 295
+ 929
+ 1195
+ 835
+ 723
+ 365
+ 397
+ 747
+ 961
+ 1481
+ 2262
+ 817
This
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This
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Table S6 - continued
XP058
XP059
XP060
XP061
XP062
XP063
XP064
XP065
XP066
XP067
XP068
XP069
XP070
XP071
XP072
XP073
XP074
XP075
XCC3405 ::pVO155; RifR KmR
XCC3408 ::pVO155; RifR KmR
XCC3427 ::pVO155; RifR KmR
XCC3474 ::pVO155; RifR KmR
XCC3518 ::pVO155; RifR KmR
XCC3595 ::pVO155; RifR KmR
XCC3635 ::pVO155; RifR KmR
XCC3714 ::pVO155; RifR KmR
XCC3963 ::pVO155; RifR KmR
XCC4052 ::pVO155; RifR KmR
XCC4120 ::pVO155; RifR KmR
XCC4131 ::pVO155; RifR KmR
XCC4132 ::pVO155; RifR KmR
XCC4162 ::pVO155; RifR KmR
XCC4222 ::pVO155; RifR KmR
XCC4235 ::pVO155; RifR KmR
XCC4237 ::pVO155; RifR KmR
XCC1990 ∆1; RifR
XP076
XP077
XP078
XP079
XP080
XP081
XP082
XP083
XP084
XP085
XP086
XP087
∆suxB ; XCC3359 ∆1; RifR
from + 1 to +1914
XP088
XP089
XP090
XP091
XP092
XP093
XP094
XP095
XP096
XP097
XP098
XP099
XP100
XP101
XP102
XP103
XP104
XP105
XP106
XP107
+ 1813
+ 1897
+ 2236
+ 1443
+ 452
+ 2148
+ 367
+ 922
+ 1243
+ 1673
+ 1217
+ 952
+ 2804
+ 952
+ 2401
+ 1405
+ 225
from + 1 to + 2619
This
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XCC3209 ∆1; RifR
from + 1 to + 2715
fur 1; XCC1470 T212A leading to L71Q; RifR
Xcc 568 (pL-fur ); Xcc 568 (pL-XCC1470 ); RifR TetR AmpR
fur 1 (pL-fur ); XCC1470 T212A (pL-XCC1470 ); RifR TetR AmpR
Xcc 568 (pPr-XCC1990 ); RifR TetR AmpR
Xcc 568 (pPr-XCC3209 ); RifR TetR AmpR
hrpG ::pVO; XCC1166 ::pVO155; RifR KmR
hrpX ::pVO; XCC1167 ::pVO155; RifR KmR
suxR ::pVO; XCC3356 ::pVO155; RifR KmR
suxC ::pVO; XCC3357 ::pVO155; RifR KmR
suxB ::pVO; XCC3359 ::pVO155; RifR KmR
∆suxA ; XCC3358 ∆1; RifR
T212A leading to L71Q
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[113]
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+ 487
+ 1013
+ 350
+ 896
+ 757
from + 474 to + 2475
Xcc 568 (pL-suxA ); Xcc 568 (pL-XCC3358 ); RifR TetR
suxA ::pVO (pL-suxA ); XCC3358 ::pVO155 (pL-XCC3358 ); RifR KmR TetR
∆suxA (pL-suxA ); XCC3358 ∆1 (pL-XCC3358 ); RifR TetR
Xcc 568 (pL-suxB ); Xcc568 (pL-XCC3359 ); RifR TetR
suxA ::pVO (pL-suxB ); XCC3358 ::pVO (pL-XCC3359 ); RifR KmR TetR
∆suxB (pL-suxB ); XCC3359 ∆1 (pL-XCC3359 ); RifR TetR
Xcc 568 (pPr-suxA ); Xcc568 (pPr-XCC3358 ); RifR TetR AmpR
suxR ::pVO (pPr-suxA ); XCC3356 ::pVO155 (pPr-XCC3358 ); RifR KmR TetR AmpR
suxC ::pVO (pPr-suxA ); XCC3357 ::pVO155 (pPr-XCC3358 ); RifR KmR TetR AmpR
∆suxA (pPr-suxA ); XCC3358 ∆1 (pPr-XCC3358 ); RifR TetR AmpR
∆suxB (pPr-suxA ); XCC3359 ∆1 (pPr-XCC3358 ); RifR TetR AmpR
XCC0008 ::pVO155; RifR KmR
XCC1592 ::pVO155; RifR KmR
XCC1593 ::pVO155; RifR KmR
XCC2081 ::pVO155; RifR KmR
XCC2612 ::pVO155; RifR KmR
XCC2927 ∆1; RifR
+ 425
+ 293
+ 243
+ 143
+ 124
from +3 to + 876
XCC3205 ::pVO155; RifR KmR
XCC3967 ::pVO155; RifR KmR
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84
CHAPITRE II : ETUDE DE LOCI
IMPLIQUES DANS LE
METABOLISME DE
POLYSACCHARIDES DE LA PAROI
VEGETALE CHEZ XCC
Membrane plasmique
Paroi secondaire
Plasmodesme
Paroi primaire
Lamelle moyenne
Figure II-1 : Représentation schématique et simplifiée de la structure pariétale d’une
cellule végétale et des sous-couches qui la constituent. La lamelle moyenne, la paroi
primaire et la paroi secondaire se forment successivement au cours de l’élongation et de
la différenciation cellulaire. Les plasmodesmes traversent les parois et permettent la
communication intercellulaire, le passage d'eau, d’ions et de différentes molécules. La
membrane plasmique, formée d’une bicouche de phospholipides, délimite le cytoplasme
de la cellule végétale.
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
CHAPITRE II : ETUDE DE LOCI IMPLIQUES DANS LE METABOLISME DE
POLYSACCHARIDES DE LA PAROI VEGETALE CHEZ XANTHOMONAS
CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS
INTRODUCTION : L’utilisation de la paroi végétale par les bactéries
I. Structure de la paroi végétale
La paroi constitue l’un des éléments essentiels de la cellule végétale. Elle donne à la cellule
sa forme et ses caractéristiques structurales, assure son maintien et sa croissance. Elle est le lieu
des échanges intercellulaires, participe à la régulation des relations avec l'extérieur, et, de manière
passive, au transport, à l'absorption et à la sécrétion de multiples substances.
I.1. Description générale
L'étude de la formation de la paroi cellulaire et l'analyse de sa structure ont conduit à
distinguer dans cette paroi 3 sous-couches se formant successivement (Figure II-1).
C’est la lamelle moyenne qui se forme la première et constitue donc la partie la plus externe
de la paroi. Elle est commune à deux cellules contiguës et est constituée principalement de
matières pectiques. La paroi primaire, qui se forme ensuite, mesure 1 à 3 µm d'épaisseur et est
extensible, permettant la croissance cellulaire en longueur et en épaisseur. Cette paroi n'existe
seule (sans paroi secondaire) que dans les cellules juvéniles indifférenciées. Elle est constituée de
cellulose et d'hémicellulose, les microfibrilles de cellulose étant disposées de façon régulière, en
strates successives, décrivant des hélices très redressées par rapport à l’axe principal de la cellule ;
sa structure est détaillée dans le paragraphe I.2.
La paroi secondaire apparaît contre la paroi primaire lors de la différenciation de la cellule.
Cette différenciation s'observe pour les cellules conductrices de sève (vaisseaux du xylème), ainsi
que pour différents tissus de soutien (sclérenchyme) ou de protection (liège). La paroi secondaire
est rigide, peut atteindre une épaisseur considérable dans certains tissus de soutien, et ne permet
plus la croissance cellulaire. En plus des constituants de la paroi primaire, la paroi secondaire est
enrichie en composés phénoliques : la lignine, qui rigidifie la paroi, ainsi que la cutine et la
subérine, qui l’imperméabilisent.
Enfin, pour permettre les communications entre cellules de cytoplasme à cytoplasme, les
parois sont finement ponctuées de plasmodesmes.
85
Paroi
primaire
Pectine
Membrane
plasmique
Microfibrille de
cellulose
Hemicellulose
Figure II-2 : Vue d’ensemble de la structure de la paroi végétale primaire et de ses
principaux constituants : la matrice pectique, les microfibrilles de cellulose et le réseau
d’hémicelluloses. (Schéma issu du site web http://www.buta-connection.net/phpBB2/imagesexposes/japon-papier/Paroi-primaire.gif).
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
I.2. Architecture moléculaire de la paroi primaire
La paroi primaire est constituée d’une matrice de 3 groupes glucidiques : la cellulose, les
hemicelluloses et les pectines (Figure II-2). De plus, les parois renferment des protéines de
structure dites « pariétales ». Enfin, la paroi contient un fort pourcentage d’eau et beaucoup d’ions
(notamment du calcium).
I.2.A. La cellulose
La molécule de cellulose
La cellulose est le constituant principal de la paroi des cellules végétales. Il s’agit d’un β1,4-glucane composé d'environ 2 000 à 25 000 résidus glucose dans la paroi primaire. Plus
précisément, la molécule de cellulose est un polymère linéaire monotone, constitué uniquement de
cellobiose, dimère de glucoses liés en β-1,4 (Figure II-3A). Par suite de la liaison β-1,4, les
fonctions homologues des monomères se trouvent alternativement au dessus et en dessous du
plan. Le degré de liberté au niveau de chaque liaison explique la flexibilité de la molécule de
cellulose, toutefois limitée par la formation régulière de liaisons hydrogène intra-caténaires.
Les microfibrilles (Figure II-3A)
Des liaisons hydrogène inter-caténaires relient plusieurs molécules de cellulose et
permettent la formation d'une structure aux propriétés de résistance remarquables : la
microfibrille, véritable charpente de la paroi végétale primaire. Cette structure cristalline
cylindrique de 20 à 30 nm de diamètre contient environ 2 000 molécules de cellulose, maintenues
parallèles par les liaisons hydrogène.
Les microfibrilles sont réunies entre elles par une matrice constituée d'hémicelluloses et de
pectines (Figure II-2).
I.2.B. Les hémicelluloses
Les hémicelluloses sont des polymères très variés, formés d’une chaîne linéaire ramifiée par
de courtes chaînes latérales qui empêchent la molécule de former des microfibrilles. Les blocs de
bases des hémicelluloses sont des sucres monomériques divers (glucose, xylose, arabinose,
galactose, fucose et mannose) liés en β-1,4.
La classe la mieux étudiée correspond au xyloglucane, polymère de glucose ramifié par de
courtes chaînes de xylose, galactose et fucose (Figure II-3B). Un autre type d’hémicellulose très
abondant dans la nature est le glucuronoarabinoxylane (GAX), plus couramment appelé xylane
86
A
dimère de
cellobiose
portion de
microfibrille
B
C
D
Figure II-3 : Structure moléculaire des constituants de la paroi primaire des cellules
végétales. (A) Cellobiose, cellulose et portion de microfibrille. (B) Xyloglucane, ici avec
des substituants xylose, galactose, arabinose (Ara) et fucose (Fuc). (C) Xylane. α-4-OMe-GlcUA, α-4-O-méthylglucuronic acid ; α-araf, α-arabinose furanoside ; pcou./fer.,
acide p-coumarique/férulique. (D) Oligomère d’acides galacturoniques, constituant des
pectines de type homogalacturonan (HGA) ou rhamnogalacturonane II (RGII).
Figure II-4 : Structure de la pectine, de ses chaînes linéaires et de ses ramifications
(D’après Ochiai et al., 2007)
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
(Figure II-3C). La structure de ce polymère est détaillée dans l’introduction de l’article
préliminaire
(cf.
Résultats).
Enfin,
le
mannane
(glucomannane,
galactomannane
galactoglucomannane), l’arabinane, le galactane (arabinogalactane) et le galacturonane sont
d’autres types d’hémicelluloses moins répandus.
Les hémicelluloses forment des liaisons hydrogène avec les microfibrilles de cellulose,
jouant ainsi un rôle fondamental dans le maintien de l’architecture pariétale.
I.2.C. Les pectines
Les pectines sont constituées d’une chaîne polysaccharidique linéaire, ramifiée de chaînes
latérales non monotones et non linéaires. La variété d’oses formant ces chaînes et de liaisons
reliant ces oses font de la pectine un réseau complexe de macromolécules.
Il existe 3 types de polymères pectiques (Figure II-4) : l’homogalacturonane (HGA), le
rhamnogalacturonane I (RGI) et le rhamnogalacturonane II (RGII) (Ochiai et al., 2007 ; Ridley et
al., 2001).
Le HGA est un polymère monotone d’acides galacturoniques (GA) liés en α-1,4, appelé
acide polygalacturonique (PGA) (Figure II-3D et Figure II-4).
Le RGI est un hétéropolymère formé d’une chaîne principale et de ramifications. La chaîne
pricipale est formée d’une alternance de résidus GA liés en α-1,4 et rhamnoses liés en α-1,2.
Environ la moitié des résidus rhamnoses du RGI sont substitués par de longues chaînes
polysaccharidiques neutres d’arabinane, de galactane ou d’arabinogalactane (Delangle et al.,
2007 ; McNeil et al., 1980) (Figure II-4). Les chaînes latérales de galactane peuvent être de 2
types, selon que les résidus D-galactopyranoses sont liés en β-1,4 (Type I) ou en β-1,3 (Type II)
(Delangle et al., 2007).
Le RGII est un polysaccharide complexe formé d’un squelette de HGA et de chaînes
latérales diverses et variées, formées de résidus rhamnose, arabinose, galactose, etc. (O'Neill et al.,
1996 ; Pérez et al., 2003) (Figure II-4).
Certains résidus GA peuvent être méthylés au niveau de leur groupement carboxyl ; d’autres
peuvent être acétylés au niveau des atomes d’oxygène O2 et/ou O3. Dans la plupart des pectines,
40 à 65% des résidus GA sont méthylés, cette proportion fixant le caractère plus ou moins acide
de la pectine. En présence de calcium, deux portions de chaînes constituées de résidus non
méthylés peuvent se lier et former un réseau, ou gel. Ces liaisons inter-caténaires sont toutefois
87
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
faibles et peuvent facilement se rompre, ce qui résulte en une interruption de la gélification et en
une fluidification de la pectine. Ceci peut être réalisé chimiquement par extraction à l'EDTA
(puissant chélateur de calcium), ou physiquement en abaissant le pH : la concentration forte en
protons provoque alors le remplacement du calcium.
I.2.D. Autres constituants
La paroi végétale comporte une quantité significative de glycoprotéines, formées d’un
squelette peptidique substitué de chaînes glucidiques. On distingue 3 classes principales de
glycoprotéines pariétales : les protéines riches en glycine (GRP, Glycin-rich proteins), les
protéines riches en proline (PRP, Prolin-rich proteins) et les protéines riches en hydroxyproline.
Cette dernière classe, appelée à tort "extensine" lors de sa découverte, est maintenant appelée
HRGP (Hydroxyprolin-rich Glycoproteins). En fin de croissance, le réseau d'HRGP bloque les
propriétés de plasticité du réseau polysaccharidique, solidifiant ainsi la structure pariétale [pour
revue, voir (Keller, 1993)].
Il existe quelques différences structurales entre la paroi des monocotylédones et celle des
dicotylédones. Tout d’abord, seules les dicotylédones possèdent du xyloglucane ; elles présentent
par ailleurs une teneur réduite en cellulose mais une forte teneur en polymères pectiques gélifiés
[30 à 50% de la composition totale, (Delangle et al., 2007)]. Des protoplastes de dicotylédones
peuvent être préparés par simple traitement par un chélateur de calcium et une
endopolygalacturonase purifiée.
Les monocotylédones présentent une teneur élevée en polysaccharides non cellulotiques
(xylane notamment), mais une teneur réduite en cellulose, en matériel pectique et en protéines
HRGP. Ce sont donc les réseaux d’hemicelluloses, renfermant des composés phénoliques, qui
confèrent la solidité de la paroi végétale des monocotylédones (Bacic et al., 1988 ; Shedletzky et
al., 1992). La paroi de certaines monocotylédones (graminées et céréales) renferme par ailleurs un
glucane particulier, présentant quelques liaisons β-1,3 parmi les liaisons β-1,4. Ce glucane est
absent de la paroi des dicotylédones (Burton et al., 2006).
II. L’utilisation des parois végétales par les bactéries
La paroi végétale constitue un véritable réservoir de nutriments pour la plupart des
microorganismes présents dans l’environnement des plantes (insectes, champignons, bactéries…).
De nombreux microorganismes saprophytes sont capables de dégrader les polymères pariétaux
complexes et d’utiliser les produits de cette dégradation comme sources de carbone et d’énergie
88
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
grâce à des voies métaboliques spécifiques. Chez les bactéries et les champignons
phytopathogènes, la dégradation de la paroi végétale n’est pas seulement une source de nutriments
pour la croissance, mais elle facilite leur progression et constitue ainsi une étape clé dans leur
cycle infectieux.
La dégradation de la paroi végétale conduit à la production de molécules, appelées
« oligosaccharines », capables de jouer un rôle « éliciteur » des réponses de défense des plantes
(Côté & Hahn, 1994 ; Côté et al., 1998) : la dégradation de la paroi végétale peut donc s’avérer
néfaste pour les microorganismes. Dès leur formation, les oligosaccharines activent les étapes
précoces des voies de défense végétales. Ils stimulent la biosynthèse d’enzymes anti-microbiennes
(chitinases, glucanases), stimulent la production d’éthylène et de phytoalexines, augmentent le
taux de calcium intracellulaire et créent un « burst oxydatif » : il y production d’espèces réactives
de l’oxygène telles que du péroxyde d’hydrogène ou des radicaux super-oxydes, très toxiques
pour les microorganismes.
La dégradation de la pectine par les champignons phytopathogènes et son rôle dans
l’activation des réponses de défense de la plante sont particulièrement bien connus (Federici et al.,
2006) : les champignons sécrètent des polygalacturonases (PG), qui sont reconnues et inhibées par
des protéines végétales extracellulaires possédant des LRR (Leucine-Rich Repeats), appelées
Polygalacturonase-Inhibiting Proteins (PGIP) ; l’interaction PG-PGIP limite l’agressivité des PG
fongiques et favorise l’accumulation d’oligogalacturonides, qui constituent d’excellents éliciteurs
des défenses végétales (Bellincampi et al., 2000 ; Bergmann et al., 1994 ; Cervone et al., 1987 ;
Cervone et al., 1989).
Au cours de ce travail de thèse, nous avons identifié des gènes codant pour des TBDR de
Xanthomonas campestris pv. campestris spécifiquement induits par la pectine, et présents dans
des loci potentiellement impliqués dans la dégradation de ce polysaccharide pariétal complexe. Le
paradigme de la pectinolyse et de sa régulation repose sur les résultats des recherches menées chez
la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi, dont je me propose de présenter une vue
d’ensemble dans le paragraphe suivant. Je complèterai cette introduction par quelques
informations supplémentaires concernant la bactérie Ralstonia solanacearum. Parallèlement,
l’étude de loci de Xcc potentiellement impliqués dans l’utilisation du xylane a été entreprise. Cette
partie du travail est décrite à travers un article préliminaire figurant dans la partie Résultats de ce
chapitre ; ainsi, le mécanisme et les enzymes de dégradation du xylane chez les bactéries seront
exposés en introduction de cet article.
89
A
B
C
D
E
Figure II-5 : Symptômes causés par la bactérie Erwinia chrysanthemi. (A) et (B)
Pourriture de feuilles de chrysanthème (Institut national de production végétale et de la
protection des plantes, Mayence, Allemagne). (C) Symptômes sur aloe (National
Research Centre for Medicinal and Aromatic Plants, Gujarat, Inde). (D) Symptômes
sur la tige d’un plant de pomme de terre. (E) Macération d’un tubercule de pomme de
terre (Photo extraite de la thèse de Fréderic Login, Université de Lyon 1, Département
«Microbiologie, Adaptation et Pathogénie», France).
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
III. La pectinolyse et sa régulation chez les bactéries du genre
Erwinia
Erwinia chrysanthemi et Erwinia carotovora sont des entérobactéries phytopathogènes
responsables de la « pourriture molle » (soft rot), également appelée « jambe noire » (black leg).
Le séquençage récent du génome d’E. chrysanthemi a conduit à quelques révisions taxonomiques
et la bactérie se nomme aujourd’hui Dickeya dadantii (Samson et al., 2005). Nous conserverons
toutefois le nom d’E. chrysanthemi dans ce chapitre.
Ces bactéries présentent un très large spectre d’hôtes : elles infectent des plantes d’intérêt
agronomique (carottes, pommes de terre, betterave, chou, chicorée, endive…), ainsi que des
plantes ornementales (chrysanthème, saintpaulia…). Les principaux symptômes, illustrés sur la
Figure II-5, incluent une pourriture brune-noire à la base puis à l’intérieur des tiges, un
ramollissement des tissus, un flétrissement du feuillage ainsi qu'un jaunissement et un
enroulement des feuilles. L’apparition des symptômes, puis le développement de la maladie,
dépendent largement de facteurs climatiques et environnementaux. E. chrysanthemi provoque la
maladie dans des zones tropicales et sub-tropicales, tandis qu’E. carotovora est restreinte aux
zones tempérées. E. carotovora est également responsable de la pourriture molle des tubercules
après récolte (Harrison & Nielsen, 1981).
La principale caractéristique des bactéries du genre Erwinia est la production de très
nombreuses enzymes de dégradation de la paroi végétale, principalement des pectinases et des
cellulases, mais également des protéases et une phospholipase. Le catabolisme de la pectine, ou
pectinolyse, joue un rôle majeur dans la pathogénie de ces bactéries et dans le processus de
macération des tissus végétaux (Collmer & Keen, 1986 ; Herron et al., 2000 ; Hugouvieux-CottePattat et al., 1996).
Les enzymes impliquées dans la pectinolyse sont les pectinases et les pectine estérases. Les
pectinases, qui clivent les liaisons β-1,4 entre les résidus GA, sont classées en différents groupes
suivant leur préférence pour un substrat donné et suivant leur mécanisme d’action. Les
polygalacturonases (PG) clivent leur substrat par un mécanisme d’hydrolyse à pH acide à neutre,
tandis que les lyases (PL) procèdent par un mécanisme de β-élimination calcium-dépendant à pH
légèrement basique. Au sein de la famille des lyases, on trouve des pectine lyases, qui ont une
préférence pour le PGA méthylé, des pectate lyases, qui préfèrent le PGA non méthylé, et des
oligogalacturonate lyases, qui reconnaissent des petits oligomères (2 à 4 résidus). Enfin, on
appelle endo-pectinases les enzymes qui clivent au hasard les liaisons de la chaîne, produisant un
mélange d’oligomères de tailles variées, et exo-pectinases celles qui attaquent l’extrémité
réductrice ou l’extrémité non-réductrice du polymère, produisant uniquement des dimères. Les
90
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
pectine méthyl estérases (PME) sont impliquées dans l’hydrolyse des groupements méthoxyl
(méthyl ester -CH3OH) au niveau des résidus GA méthylés, relarguant ainsi du PGA non méthylé
et du méthanol. Les pectine acétyl estérases (PAE) sont quant à elles impliquées dans l’hydrolyse
des groupements acétyl (CH3COOH) de la pectine.
III.1. Les enzymes de dégradation de la pectine d’Erwinia chrysanthemi
La souche 3937 d’E. chrysanthemi, isolée du Saintpaulia (Saintpaulia ionanthia),
possède au moins 20 enzymes de dégradation de la pectine (Figure II-6). Ces enzymes ont été
identifiées au cours des 20 dernières années ; leurs propriétés biochimiques, leur régulation et leur
implication dans le pouvoir pathogène de la bactérie ont été finement étudiées. Nous nous
concentrerons dans ce paragraphe sur les enzymes actives sur les chaînes principales de la pectine,
mais il est important de noter que la bactérie possède également des enzymes spécifiques des
chaînes latérales : par exemple, les gènes impliqués dans le catabolisme du β-1,4 galactane ont été
récemment caractérisés chez E. chrysanthemi (Delangle et al., 2007).
Les enzymes pectinolytiques « générales » d’E. chrysanthemi se répartissent comme suit :
• 8 endo-pectate lyases : PelA (Bourson et al., 1993 ; Favey et al., 1992), PelB, PelC
(Hugouvieux-Cotte-Pattat & Robert-Baudouy, 1992), PelD, PelE (Peng et al., 2006 ; Reverchon
& Robert-Baudouy, 1987 ; Reverchon et al., 1989 ; Rouanet et al., 1999 ; Roy et al., 1999 ; Tardy
et al., 1997), PelI (Shevchik et al., 1997), PelL (Lojkowska et al., 1995), et PelZ (Pissavin et al.,
1996 ; Pissavin et al., 1998). Les gènes codant pour ces endo-pectate lyases sont organisés en 2
clusters principaux (pelB-pelC-pelZ et pelA-pelE-pelD) au sein desquels chacun est transcrit
indépendamment. Le gène pelI est proche du cluster pelA-pelE-pelD ; le gène pelL est adjacent à
un gène codant pour une cellulase (celZ).
• 2 exo-pectate lyases : PelX (Shevchik et al., 1999) et PelW (Shevchik et al., 1999).
Au sein de la base de données CAZy (Carbohydrate Active Enzymes), les polysaccharide lyases
sont classées en 18 familles, dont 5 renferment des pectate lyases. Une classification des pectate
lyases en 5 familles (distinctes de la classification CAZy) sur la base d’homologies de séquences a
également été proposée (Kim & Beer, 1998 ; Shevchik et al., 1997). Chez E. chrysanthemi, selon
cette seconde classification PelA à PelE appartiennent à la famille 1, PelW à la famille 2, PelI à la
famille 3, PelL et PelX à la famille 4, et PelZ à la famille 5.
91
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
• 1 pectine lyase : PnlA. En réalité le gène pnlA a été cloné et étudié chez Erwinia carotovora
subsp. carotovora (McEvoy et al., 1990). Il est présent chez E. chrysanthemi mais n’a pas été
caractérisé à l’heure actuelle.
• 1 oligogalacturonate lyase : Ogl (Reverchon et al., 1989 ; Shevchik et al., 1999).
• 4 polygalacturonases : PehN (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 2002), PehV, PehW, PehX
(Nasser et al., 1999), dont au moins 3 sont des exo-enzymes (PehV, PehW et PehX). Les gènes
pehV, W et X sont adjacents dans le génome.
• 2 pectine méthyl estérases : PemA (Boccara & Chatain, 1989 ; Laurent et al., 1993) et PemB
(Shevchik et al., 1996).
• 2 pectine acétyl estérases : PaeX (Shevchik & Hugouvieux-Cotte-Pattat, 2003) et PaeY
(Shevchik & Hugouvieux-Cotte-Pattat, 1997).
Localisation cellulaire des enzymes pectinolytiques :
La localisation cellulaire des enzymes de dégradation de la pectine d’E. chrysanthemi est la
suivante : PemB est une protéine de la membrane externe de la bactérie, PelX, PehV, PehW et
PaeX sont périplasmiques, et Ogl et PelW sont cytoplasmiques (Figures II-6) ; les autres enzymes
pectinolytiques d’E. chrysanthemi sont toutes sécrétées dans le milieu extracellulaire. Pour cela,
elle sont synthétisées avec un peptide signal, qui est clivé lors de l’export à travers la membrane
interne par la machinerie Sec, puis le transport vers l’extérieur de la bactérie est assuré par un
système de sécrétion de type II, appelé Out. Le système Out est organisé en 5 unités
transcriptionnelles (outS, outB, outT, outCDEFGGIJKLM et outO) (Salmond, 1994).
PemB présente 100 fois plus d’activité sur des oligomères de pectine que sur de la pectine
naturelle. Il est donc supposé que les pectinases extracellulaires libèrent des oligogalacturonides
partiellement méthylés et acétylés, qui sont déméthylés par l’action de PemB, puis entrent dans le
périplasme où PaeX hydrolyse les derniers groupements acétyl et où les 4 polygalacturonases
poursuivent la dégradation en petits oligogalacturonides (2 à 4 résidus) ; enfin, dans le
cytoplasme, ils sont convertis en monomères grâce à l’exo-pectate lyase PelW puis à
l’endogalacturonate lyase Ogl (Shevchik et al., 1999) (Figures II-6).
Rôle de ces enzymes dans le pouvoir pathogène :
La contribution de chacune des enzymes pectinolytiques dans la virulence de la bactérie
varie considérablement d’une plante hôte à une autre. D’une manière générale, ces enzymes
agissent de façon synergique et leurs effets sont additifs. La redondance des enzymes, surtout dans
92
Tableau II-1 : Contribution au pouvoir pathogène de différentes protéines (enzymes, transporteurs, régulateurs) impliquées dans la pectinolyse chez Erwinia chrysanthemi . PdT,
pomme de terre. no, pas d'effet de la mutation ; -, très légèrement à légèrement affecté dans le pouvoir pathogène ; - -, significativement affecté dans le pouvoir pathogène ; - - , très fortement affecté dans le pouvoir pathogène ; avirulent, non pathogène. Les cases jaunes indiquent les phénotypes les plus marqués. Les cases grises indiquent que
l'information n'est pas connue, du moins à ma connaissance. Ce tableau a été établi à partir des articles suivants : Ried & Collmer, 1988 ; Boccara et al. , 1988 ; Lojkowska et
al. , 1995 ; Beaulieu et al. , 1993, ainsi qu'à partir des travaux dont les références sont mentionnées dans le texte.
Effet de la mutation sur la capacité de macération des plantes indiquées
Feuilles
Mutant
PdT
Pectate lyases
Pois
-
--
-
no
no
--
pelB
no
no
pelC
no
no
Poivron
Chou
no
-
no
--
-
no
-
pelE
no
---
no
no
no
no
no
avirulent
-
Quadruple mutant B à E
pelL
no
Sextuple mutant A à E + L
no
--
-
--
-no
no
---
pelI
no
--
no
pelZ
no
--
no
pelX
no
--
no
pehN
no
no
no
Triple mutant pehV-pehW-pehX
no
--
-
no
paeY
--
Double mutant paeX-paeY
---
Pectin méthyl
estérase
pemA
Régulateurs
---
no
hns
---
---
crp
---
---
pir
Transporteurs
Carotte
no
paeX
Pectin acétyl
estérases
Celeri
pelD
Quintuple mutant A à E
Polygalacturonases
Endive
pelA
pelB-pelC
Tubercules de PdT
Saintpaulia
--
-
--
kdgM
--
togM
--
togT
--
Double mutant togM-togT
---
---
--
---
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
le cas des pectate lyases, explique que chaque enzyme ne contribue pas de façon individuelle au
pouvoir pathogène de la bactérie. Cependant, dans certains cas, la mutation d’une seule enzyme
suffit à affecter significativement la capacité de macération de la bactérie. Le Tableau II-1 résume
les phénotypes de souches mutantes d’E. chrysanthemi 3937 observés sur différentes plantes. Ce
tableau a été établi à partir des travaux publiés sur chaque enzyme (cf. références mentionnées
dans la liste des enzymes ci-dessus) et d’un ensemble de travaux supplémentaires [(Beaulieu et
al., 1993; Boccara et al., 1988 ; Lojkowska et al., 1995 ; Ried & Collmer, 1988)].
III.2. Le transport des produits de dégradation de la pectine
Les oligogalacturonides sont transportés à travers la membrane externe par les porines
spécifiques KdgM et KdgN (cf. Introduction du Chapitre I et Figure II-6) (Condemine & Ghazi,
2007). En présence de PGA, les simples mutants dans les gènes kdgM ou kdgN sont fortement
affectés dans l’activité pectate lyase globale de la bactérie : l’entrée des molécules nécessaires à
l’induction des gènes codant pour ces enzymes est réduite dans ces mutants (Condemine & Ghazi,
2007). Le fait que l’inactivation d’un seul des 2 gènes suffise à affecter l’expression des pectate
lyases peut s’expliquer en partie par l’hypothèse selon laquelle les 2 porines auraient une
spécificité pour des oligogalacturonides de tailles ou de structures différentes. Il est par ailleurs
proposé que les 2 gènes pourraient intervenir dans des étapes distinctes du cycle de vie de la
bactérie : kdgM s’exprimerait de façon concomitante avec les gènes codant pour les enzymes
pectinolytiques au début du cycle infectieux, tandis que kdgN pourrait s’exprimer lors de la survie
saprophyte de la bactérie dans le sol, pour l’exploitation de la pectine des débris végétaux
(Condemine & Ghazi, 2007).
Le transport des oligogalacturonides à travers la membrane interne des bactéries est pris en
charge par les systèmes TogMNAB et TogT. Le transporteur ABC TogMNAB n’est que
partiellement impliqué dans le transport d’oligogalacturonides : son action est complétée par celle
du symporteur TogT, de la famille des transporteurs glycoside-pentoside-hexuronide (GPH) (TC
2.A.2.5.1) (Figure II-6). L’inactivation des 2 systèmes simultanément résulte en une perte totale
de la croissance bactérienne sur pectine, ainsi qu’en une forte diminution du pouvoir pathogène de
la bactérie sur feuilles d’endive (Hugouvieux-Cotte-Pattat & Reverchon, 2001).
La perméase ExuT peut par ailleurs transporter du galacturonate dans le cytoplasme ; une
autre perméase, KdgT, transporte du DKI (5-keto-4-deoxyuronate), du DKII (2,5-diketo-3deoxygluconate), ou du KDG (2-keto-3-deoxygluconate) (Figure II-6). Des mutants dans l’un ou
93
Figure II-6 : Etapes extracellulaires, périplasmiques et cytoplasmiques de la pectinolyse chez
Erwinia chrysanthemi. La pectine est tout d’abord partiellement déméthylée et déacétylée par
des enzymes extracellulaires, respectivement la pectine méthyl estérase PemA et la pectine
acétyl estérase PaeY. Les pectate lyases Pel A, B, C, D, E, I, L et Z et la polygalacturonase
PehN clivent alors les liaisons β-1,4 entre les résidus d’acide galacturonique (GA), libérant
des oligogalacturonides insaturés encore partiellement méthylés et acétylés. Une protéine
ancrée dans la membrane externe de la bactérie, PemB, achève la déméthylation. Ce sont
donc des oligogalacturonides insaturés, non méthylés et partiellement acétylés qui entrent
dans le périplasme par les deux porines spécifiques KdgN et KdgM. Ces composés sont
intégralement déacétylés par la protéine PaeX, libérant des oligogalacturonides insaturés
(uGAn) qui peuvent directement entrer dans le cytoplasme. Dans ce cas, ils seront dégradés
en dimères insaturés (uGA2) dans le cytoplasme par la protéine PelW. Mais certains
oligogalacturonides sont dégradés en dimères avant le passage de la membrane interne, par
la pectate lyase PelK et les polygalacturonases Peh V, W et X. Tout comme les pectate
lyases, les polygalacturonases clivent les liaisons β-1,4 entre les résidus GA, mais procèdent
par un mécanisme d’hydrolyse, libérant préférentiellement des dimères saturés (GA2). Le
passage de la membrane interne est assuré par le transporteur de type ABC TogMNAB et la
perméase TogT.
Dans le cytoplasme, les di-galacturonides uGA2 et GA2 sont pris en charge parallèlement par
la protéine Ogl (Oligogalacturonate lyase) ; cette hydrolyse conduit à la formation de 2
monomères différents, le DKI (5-keto-4-deoxyuronate) et le D-galacturonate, respectivement,
qui sont ensuite convertis en un même composé, le KDG (2-keto-3-deoxygluconate), puis en
des intermédiaires métaboliques classiques tels que le pyruvate et le 3phosphoglycéraldéhyde.
Sur ce schéma figurent également 2 perméases de la membrane interne : ExuT et KdgT, qui
transportent respectivement du galacturonate (ExuT) et du DKI, du DKII ou du KDG (KdgT),.
Enfin, le système Out, qui permet la sécrétion des enzymes extracellulaires, est également
représenté. ME, Membrane Externe ; MI, Membrane Interne. (D’après Pissavin et al., 1996 ;
Hugouvieux Cotte-Pattat et al., 1996 ; Hugouvieux Cotte-Pattat et al., 2001 ; Blot et al., 2002).
Me
Me
Me
Ac
pectine
Ac
PaeY
PemA
CH3COOH
CH3OH
pectine partiellement méthylée /
acétylée
Me
Ac
PelA, B, C, D, E, I, L, Z, PehN
Me
oligogalacturonides insaturés
partiellement méthylés / acétylés
Ac
KdgN KdgM
CH3OH
PemB
ME
Périplasme
Ac
PaeX
CH3COOH
oligogalacturonides insaturés (uGAn)
PelX
PehV, W, X
di-galacturonides insaturés (uGA2)
ou saturés (GA2)
B
Tog
TogT
M N
MI
Cytoplasme
A A
uGAn
uGA2
GA2
PelW
Ogl
Dgalacturonate
UxaC
DKI
KduI
UxaB
UxaA
DKII
KduD
ExuT
galacturonate
KdgT
DKI, DKII, KDG
KDG
KdgK
KdgA
Pyruvate
+
3-phosphoglycéraldéhyde
PemA, PaeY,
PelA, PelB, PelC,
PelD, PelE, PelI,
PelL, PelZ
Out
Tableau II-2 : Expression et régulation des gènes codant pour les enzymes pectinolytiques d'Erwinia chrysanthemi . Ce tableau regroupe des données d'expression "globale" (quatre
premières lignes) puis liste les composés végétaux, les facteurs environnementaux et les protéines régulatrices impliqués dans le contrôle de l'expression de ces gènes. Ogl,
Oligogalacturonate lyase ; PdT, pommes de terre ; PGA, acide polygalacturonique ; GA, acide galacturonique ; GA2, acide di-galacturonique ; DKI, 5-keto-4-deoxyuronate ; DKII, 2,5-diketo-3deoxygluconate ; KDG, 2-keto-3-deoxygluconate ; KdgR, keto-deoxygluconate Regulator ; CRP, cAMP Receptor Protein ; Pir, Plant inducible regulator ; moy, expression moyenne,
intermédiaire ; +/-, induction/répression de l'expression du gène ; +/- (N ou Fe), induction/répression de l'expression du gène en réponse à une carence en azote ou en fer ; act/rep,
activation/répression de la transcription du gène par la protéine régulatrice considérée ; no, pas d'effet sur l'expression du gène. Les cases jaunes indiquent les informations remarquables.
Les cases grises indiquent que l'information n'est pas disponible, du moins à ma connaissance.
Ce tableau a été établi à partir de l'article Hugouvieux Cotte-Pattat et al. , 1992, de la revue Hugouvieux Cotte-Pattat et al. , 1996 ainsi que des nombreux travaux dont les références sont
mentionnées dans le texte.
Pectate lyases
pelA
pelB
pelC
pelD
pelE
Niveau d'expression basale en milieu synthétique a,b
faible
moy
moy
faible
forte
Niveau d'expression en milieu synthétique inducteur a,b,c
faible
moy
moy
forte
forte
Niveau d'expression in planta (tubercules de PdT) a
moy
moy
moy
forte
forte
Niveau d'expression in planta (Saintpaulia) a
faible
moy
moy
forte
moy
Pectine
+
+
+
+
+
+
PGA
+
+
+
+
+
+
+
+
GA, GA2
+
+
+
+
+
+
+
+
Réponse à des composés
DKI
végétaux
+
+
+
+
+
DKII
+
+
+
+
+
KDG
+
+
+
+
Extraits végétaux
+
+
+
+
no
no
no
-
+
-
no
--
-
-
--
--
-
+
Forte osmolarité
Réponse à des facteurs
environnementaux
Effet des protéines
régulatrices
T > T optimale
Anaérobiose
d
pelL
pelZ
pelX
pelW
ogl
pehN
pehV
pehW
pehX
forte
paeX
paeY
faible
faible
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
no
no
+
+
-
- (N)
+ (Fe)
- (N)
+ (Fe)
- (N)
+ (Fe)
- (N)
+ (Fe)
- (N)
+ (Fe)
- (N)
KdgR
rep
rep
rep
rep
rep
no
CRP
rep
act
act
act
act
PecS
rep
rep
rep
rep
rep
PecT
no
act
rep
rep
rep
rep
+
no
Pectin methyl
esterases
pemA
pemB
moy
induction in
planta
Carences
Pir
pelI
Pectin acetyl
esterases
Polygalacturonases
Ogl
+
+
+
no
-
no
no
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
no
no
no
--
no
+
légère +
+
+
+
+
no
- (N)
- (N)
+ (N)
- (N)
- (N)
- (N)
- (N)
- (N)
rep
rep
rep
rep
rep
rep
rep
rep
rep
rep
act
act
act
act
act
act
act
act
rep
rep
no
no
act
act
act
rep
no
no
no
rep
rep
no
no
no
no
no
rep
rep
légère act
act
act
rep
très forte
act
a
D'après Hugouvieux Cotte-Pattat et al ., 1992 et Hugouvieux Cotte-Pattat et al. , 1996. Ces résultats ont été obtenus grâce à des fusions transcriptionnelles entre le promoteur du gène et le gène rapporteur GUS.
Chaque ligne étant indépendante, les informations ne peuvent être comparées d'une ligne à une autre.
b
Le milieu utilisé est le milieu M63 additionné de glycérol comme unique source de cabone.
c
Les inducteurs utilisés sont l'acide galacturonique ou polygalacturonique.
d
Effet d'une élévation de la température au-dessus de la température optimale de croissance (thermorégulation). - - indique une forte thermorégulation et - une thermorégulation modérée.
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
l’autre des gènes exuT ou kdgT sont incapables d’utiliser leur(s) substrat(s) respectif(s) comme
source de carbone, suggérant que ce sont les seuls transporteurs impliqués dans l’acquisition de
ces substrats (Condemine & Robert-Baudouy, 1987 ; Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1983 ; San
Francisco & Keenan, 1993).
III.3. Le catabolisme intracellulaire de la pectine
Pour sa croissance, E. chrysanthemi est capable d’utiliser la pectine et ses produits de
dégradation comme sources de carbone. La dégradation de ces composés conduit à 2 monomères
différents : le D-galacturonate et le DKI. Les enzymes du catabolisme du DKI (KduI et KduD)
sont indispensables à la croissance de la bactérie sur pectine et PGA, tandis que ceux de la voie du
galacturonate (UxaA, B et C) ne le sont pas. Les 2 voies métaboliques se rejoignent ensuite au
niveau d’un intermédiaire commun, le KDG, produisant in fine, via les enzymes KdgK et KdgA,
des intermédiaires généraux du métabolisme tels que le pyruvate [Figure II-6 et pour revue, voir
(Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1996)].
III.4. La régulation de la pectinolyse
III.4.A. Paramètres influençant l’expression des enzymes pectinolytiques
L’expression des différentes enzymes pectinolytiques d’E. chrysanthemi est influencée par
de nombreux paramètres (Tableau II-2). Des conditions de croissance bactérienne favorables
permettent le développement de la maladie. En revanche, la production de pectinases est
globalement stimulée par des conditions de stress environnementaux. Par exemple, cette
production augmente lorsque la température descend en dessous de la température optimale de
croissance de la bactérie (30°C), et diminue fortement lorsque la température monte au-delà de
30°C. Les gènes codant pour les enzymes pectinolytiques sont par ailleurs globalement induits en
phase stationnaire de croissance, ainsi que dans des conditions anaérobies, défavorables pour la
croissance bactérienne. L’osmolarité et la disponibilité en azote ou en fer ont également un effet
sur l’expression des enzymes (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1992 ; Hugouvieux-Cotte-Pattat et
al., 1996).
La production des enzymes pectinolytiques, ainsi que d’autres protéines intervenant dans la
pectinolyse (porines spécifiques, transporteurs…) est également soumise à la répression
catabolique en présence de sources de carbone facilement métabolisables par la bactérie (glucose,
produits de dégradation de la pectine…), via la protéine activatrice CRP (cAMP receptor protein).
94
Extraits de
plantes
Pir
Fer
Source de
carbone,
AMPc
Pectate
(KDG, DKI, DKII)
KdgR
pH, osmolarité,
température,
anaérobiose
?
?
PecS
Fur
PecT
CRP
?
pel
ExpR
QS / OHHL
Activation
Répression
HNS
Auto-régulation
?
Figure II-7 : Schéma simplifié de la régulation de la pectinolyse chez la bactérie Erwinia
chrysanthemi. L’expression des enzymes pectinolytiques, et notamment des gènes
codant pour les nombreuses pectates lyases de la bactérie (gènes pel) est soumise à
une régulation complexe : de nombreux signaux environnementaux, tels que la
disponibilité en fer, en sources de carbone ou en oxygène, la température ou
l’osmolarité, ainsi que le quorum sensing, sont impliqués dans le contrôle de
l’expression de ces gènes. Le traitement de cet ensemble de signaux nécessite
l’intervention d’un grand nombre de protéines régulatrices spécifiques. La protéine KdgR
est le répresseur central, qui orchestre ce réseau de régulation et contrôle l’expression
d’un large ensemble de gènes codant pour des protéines impliquées dans la pectinolyse
(enzymes, mais aussi porines, transporteurs, régulateurs…). Les protéines PecS et
PecT sont également des répresseurs contrôlant directement l’expression des gènes
pel, mais les signaux reconnus par ces protéines n’ont pas été identifiés à l’heure
actuelle. CRP (régulateur de l’utilisation des sources de carbone), Pir et ExpR sont en
revanche des protéines activatrices de l’expression des gènes pel. Enfin, la protéine
HNS, homologue à une histone, joue un rôle indirect sur l’expression des gènes codant
pour les enzymes pectinolytiques, en exerçant un contrôle positif ou négatif sur la
transcription de plusieurs gènes régulateurs. AMPc, Adénosine MonoPhosphate
cyclique ; KDG, 2-keto-3-deoxygluconate ; DKI, 5-keto-4-deoxyuronate ; DKII, 2,5-diketo3-deoxygluconate ; QS, Quorum Sensing ; OHHL, N-3-oxohexanoyl-homoserine lactone.
(D’après Brencic et Winans, 2005).
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
CRP est la principale protéine activatrice des gènes codant pour les enzymes pectinolytiques. Un
mutant crp est incapable de pousser sur PGA ou GA et est affecté dans la production de pectate
lyases (Reverchon et al., 1997).
En plus de ces facteurs environnementaux, les gènes s’expriment différentiellement selon la
plante hôte infectée. Le Tableau II-2 montre bien à quel point la régulation des gènes codant pour
ces enzymes est complexe, chaque gène ayant son propre profil de régulation ou presque ! En
dépit de leur organisation en clusters, les gènes codant pour les pectate lyases d’E. chrysanthemi
sont transcrits et régulés indépendamment, ce qui permet pour chacun une grande flexibilité
d’expression. Les inducteurs véritables des gènes codant pour les enzymes pectinolytiques ne sont
pas la pectine et le PGA eux-mêmes, mais leurs produits de dégradation intracellulaires : le DKI,
le DKII et le KDG. Ainsi, les polymères ou oligomères sont incapables d’induire l’expression de
ces gènes si les enzymes impliquées dans leur conversion en monomères (Ogl ou UxaA par
exemple) sont inactivées (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1996).
Le traitement de cet ensemble complexe de signaux, ainsi que la modulation de l’expression
génique qui s’en suit, sont pris en charge par plusieurs protéines régulatrices spécifiques (Figure
II-7).
III.4.B. Les protéines spécifiques de la régulation de la pectinolyse
III.4.B.a. KdgR
KdgR est le régulateur central de la pectinolyse chez E. chrysanthemi (Figure II-7),
contrôlant la quasi-totalité des étapes précédemment décrites (Nasser et al., 1992 ; Nasser et al.,
1994 ; Reverchon et al., 1991 ; Rodionov et al., 2004). C’est une protéine dimérique de 306 acides
aminés présentant un domaine de fixation à l’ADN de type « hélice-tour-hélice » dans sa région
N-terminale. Elle appartient à la famille IclR de régulateurs transcriptionnels, qui contient des
répresseurs et des activateurs. KdgR est un répresseur ; seuls de très rares cas d’activation ont été
rapportés pour KdgR (Rodionov et al., 2004).
Le régulon de KdgR inclut les gènes codant pour les enzymes pectinolytiques
précédemment listées (à l’exception du gène pelL), les gènes codant pour les transporteurs
(porines spécifiques kdgM et kdgN, transporteurs de la membrane interne), une partie des gènes
codant pour le système de sécrétion Out (outT, outCDE), certains gènes impliqués dans la
95
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
régulation de la pectinolyse tels que le gène pecT (cf. III.4.B.c), ainsi que des gènes de fonction
inconnue, certains étant inductibles par le PGA (gènes pgi, pour PGA-inducible) sans pour autant
jouer un rôle apparent dans le métabolisme de la pectine. Plusieurs observations suggèrent qu’en
réalité, l’activité de KdgR n’est probablement pas restreinte à la régulation de la pectinolyse et
pourrait être étendue à la régulation d’autres facteurs de virulence.
Les gènes réprimés par KdgR peuvent être séparés en 2 catégories distinctes selon leur
réponse à une mutation dans kdgR : ceux dont l’expression devient constitutive (non-inductible
par le PGA), tels que pemB, ogl, kduI, kduD, kdgT, kdgA ou outT, et ceux dont l’expression est déréprimée mais reste inductible par le PGA, tels que pemA, pelA, pelB, pelC, pelD, pelE, ou outC
(Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1996).
La fixation directe de KdgR sur ses régions opératrices a été montrée par des expériences de
gels retard au niveau des sites opérateurs de nombreux gènes : pelA, pelB, pelC, pelE, pelI, pelW,
ogl, pheN, kduI, kdgT, kdgK, et outT. Cette fixation se fait au niveau d’un motif précis, appelé
KdgR-box, de séquence consensus palindromique AATRAAAYRNYRTTTYATT, où R
représente un A ou un G, Y un C ou un T, et N n’importe quel nucléotide. La KdgR-box est très
proche ou chevauche même les boîtes -10 et -35 des promoteurs, et entre donc en compétition
avec l’ARN polymérase pour sa fixation. Par des expériences de « footprint », il a été montré que
la fixation de KdgR protège la KdgR-box de l’action de la DNaseI. Par une recherche des KdgRbox dans le génome d’E. chrysanthemi, Rodionov et ses collaborateurs définissent un régulon
putatif de KdgR, formé d’environ 45 loci (Rodionov et al., 2004). Certains gènes, tels que kduD,
pemA, kdgA et outC, ont été montrés comme étant réprimés par KdgR mais présentent dans leur
région promotrice une KdgR-box dégénérée sur laquelle KdgR est incapable de se fixer ; cela
suggère que des mécanismes plus complexes gouvernent l’expression de ces gènes (HugouvieuxCotte-Pattat et al., 1996).
Les molécules inductrices interagissant avec KdgR sont le DKI, le DKII et le KDG, seule
l’interaction avec le KDG ayant été vérifiée in vitro (Nasser et al., 1992 ; Nasser et al., 1994). Il
semble en réalité que toutes les molécules présentant le motif COOH-CO-CH2-CHOH-C-C sous
la forme d’un cycle pyranique pourraient interagir avec KdgR (Nasser et al., 1991).
III.4.B.b. Le couple PecS - PecM
PecS et PecM sont des protéines exprimées à partir de 2 gènes adjacents transcrits de façon
divergente. PecM est une protéine transmembranaire nécessaire à l’activité de PecS in vivo
(Praillet et al., 1997). PecS appartient à la famille de régulateurs transcriptionnels de type MarR.
96
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
Ce régulateur ne présente pas de motif connu de fixation à l’ADN, mais renferme au milieu de sa
séquence protéique le motif GX9DRRX5LT, conservé chez d’autres protéines régulatrices, qui
pourrait donc correspondre à un motif de fixation à l’ADN putatif (Praillet et al., 1996). PecS
réprime les gènes codant pour les enzymes de la biosynthèse d’indigoïdine, un pigment bleu
extracellulaire impliqué dans la résistance aux produits du burst oxydatif lors de la réaction
hypersensible. Si la nature du signal perçu par PecM/PecS est mal connue, il a été suggéré que ces
protéines pourraient être impliquées dans la réponse aux formes réactives de l’oxygène (ROS) et
aux composés phénoliques produits lors des réponses de défense de la plante (Reverchon et al.,
2002).
Le couple PecS/PecM réprime de nombreux autres gènes, incluant des gènes codant pour
des pectinases (pelA, B, C, D, E, L, Z), des protéines des systèmes de sécrétion (outC), des
cellulases (celZ), mais ne présente pas d’activité sur les étapes intracellulaires de la pectinolyse
(Reverchon et al., 1994). En se fixant sur la région intergénique, PecS autorégule l’expression des
2 gènes pecS et pecM (Praillet et al., 1997). Enfin, de façon très intéressante, PecS réprime
également la transcription du gène hrpN codant pour la protéine harpine d’E. chrysanthemi,
facteur majeur de la virulence de la bactérie, sécrétée par son système de sécrétion de type III
(Nasser et al., 2005).
Si PecS a une fonction principale de répresseur, quelques cas isolés d’activation par ce
régulateur ont été rapportés : l’expression des gènes codant pour les polygalacturonases Peh est
notamment activée par PecS. En réalité, il a été montré que PecS a dans ce cas une fonction
d’anti-répresseur, empêchant la protéine régulatrice KdgR de se fixer à son site opérateur, donc de
réprimer l’expression des gènes peh (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 2002 ; Nasser et al., 1999).
PecS régule également l’expression des gènes codant pour les porines spécifiques des
oligogalacturonides, de façon négative pour le gène kdgM et positive pour kdgN. Contrairement
aux gènes codant pour les polygalacturonases, il s’agirait dans le cas de kdgN d’une activation
directe (Condemine et al., 2005).
D’une façon générale, la répression exercée par PecS est beaucoup plus forte que celle
exercée par PecM : dans un mutant pecS, les taux de dé-répression sont globalement très élevés,
tandis qu’ils sont relativement faibles dans un mutant pecM. Ceci s’explique par le modèle selon
lequel la protéine PecM, ancrée dans la membrane interne, serait impliquée dans la modification
de PecS, augmentant l’affinité de cette dernière pour l’ADN (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al.,
1992 ; Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1996). Cette hypothèse est plus vraisemblable que celle
selon laquelle PecM jouerait un rôle purement signalétique (Reverchon et al., 1994), d’autant
97
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
moins probable que PecM ne présente pas d’homologie avec les protéines senseurs des systèmes
de régulation à 2 composants.
Récemment, il a été montré que le régulateur PecS se fixe à l’ADN au niveau d’une
séquence opératrice de 23 paires de bases, de séquence consensus palindromique
CGANWTCGTATATTACGANNNCG, dans laquelle W correspond à un A ou un T et N à
n’importe quel nucléotide (Rouanet et al., 2004).
III.4.B.c. PecT
PecT est un régulateur de la famille LysR, dont les membres possèdent un motif hélice-tourhélice de fixation à l’ADN dans leur séquence N-terminale. PecT réprime l’expression des gènes
pelC, pelD, pelE, pelL et kdgC en l’absence de molécules inductrices (Castillo et al., 1998 ;
Surgey et al., 1996). De même que pour le couple PecS-PecM, PecT régule hrpN et ne régule pas
les étapes intracellulaires de la pectinolyse. Un mutant dans le gène pecT forme des colonies très
muqueuses sur milieu solide et il a été montré que PecT régule un cluster de gènes impliqués dans
la synthèse d’exopolysaccharides (EPS) chez E. chrysanthemi (Condemine et al., 1999). Enfin,
PecT s’autorégule par un mécanisme encore mal connu, l’autorégulation ayant été trouvée
positive (Surgey et al., 1996) ou négative (Castillo & Reverchon, 1997).
III.4.B.d. ExpR
ExpR est une protéine régulatrice répondant à la N-acyl homosérine lactone. Le couple
ExpI-ExpR régule le quorum sensing chez Erwinia. De plus, il exerce un contrôle positif sur la
production des enzymes extracellulaires, et notamment des pectate lyases : en présence de
molécules d’OHHL (N-3-oxohéxanoyl-homosérine lactone) générées par la synthase ExpI, le
régulateur ExpR active directement l’expression des gènes pel, ainsi que la transcription du gène
pecS. Le gène expR est lui-même activé par la protéine CRP (Nasser et al., 1998 ; Reverchon et
al., 1998).
III.4.B.e. HNS
Plus récemment, il a été montré que le gène pecT est réprimé par la protéine régulatrice
HNS (Histone like protein). Par conséquent, HNS active de façon indirecte la synthèse des pectate
lyases. Mais paradoxalement, HNS exerce également un contrôle négatif indirect sur les gènes pel,
via la formation d’un complexe avec la protéine CRP et l’ARN polymérase. Enfin, HNS réprime
l’expression des gènes expR, expI (Nasser & Reverchon, 2002) et kdgN (Condemine et al., 2005).
98
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
Il a été suggéré que HNS pourrait être une protéine régulatrice répondant à différents changements
environnementaux tels que le stress nutritionnel ou les changements de température (Nasser &
Reverchon, 2002).
III.4.B.f. Pir
Tout comme KdgR, Pir appartient à la famille IclR de régulateurs transcriptionnels. En
revanche, Pir n’est pas un répresseur mais un activateur : en présence d’extraits de pommes de
terre, la protéine Pir active fortement la production de pectate lyases, et notamment de PelE. Dans
le promoteur de pelE, Pir se fixe au niveau d’un motif chevauchant la KdgR-box, ce qui suggère
l’existence d’une compétition in vivo entre le répresseur KdgR et l’activateur Pir (Nomura et al.,
1998). Un mutant dans le gène pir est significativement affecté dans son pouvoir pathogène sur
pommes de terre, céleri et chou chinois (Nomura et al., 1998), démontrant ainsi que la régulation
positive de la biosynthèse des pectate lyases joue un rôle crucial dans le pouvoir pathogène d’E.
chrysanthemi. De plus, Pir régule sa propre expression et le gène pir n’est régulé ni par KdgR, ni
par PecS, ni par CRP (Nomura et al., 1999).
III.4.B.g. ExuR
Les gènes impliqués dans le catabolisme du galacturonate (exuT, uxaC, uxaB et uxaA) sont
sous le contrôle négatif spécifique de ExuR. Ce régulateur ne régule pas les autres gènes
impliqués dans la pectinolyse (Hugouvieux-Cotte-Pattat & Robert-Baudouy, 1987 ; Valmeekam et
al., 2001).
Sepulchre et ses collaborateurs ont récemment modélisé la transition entre la phase latente et
la phase d’infection de la bactérie E. chrysanthemi. A partir de données de dynamique quantitative
et de données expérimentales, cette étude intégrative établit un modèle mathématique du réseau de
régulation contrôlant l’expression des gènes pel (Sepulchre et al., 2007). Le recours à des outils
théoriques pointus pour modéliser les mécanismes de la pectinolyse chez E. chrysanthemi illustre
bien la complexité de ces voies de signalisation/régulation chez cette bactérie. La pectinolyse a
également été étudiée chez la bactérie Ralstonia solanacearum, chez qui elle contribue également
de façon importante au métabolisme et à la virulence de la bactérie. Je me propose à présent
d’exposer succinctement l’état des connaissances chez cette bactérie.
99
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
IV. La dégradation du PGA chez Ralstonia solanacearum
Ralstonia solanacearum est une bactérie capable d’utiliser le PGA comme unique source de
carbone (Tans-Kersten et al., 1998). Pour cela, elle produit une pectine méthyl estérase et 3
polygalacturonases (PG), ces dernières présentant différentes activités sur le PGA. La protéine
PehA, également connue sous le nom de PglA, est une endo-PG qui relargue des oligomères de
différentes tailles (trimères principalement) (Huang & Schell, 1990). PehB et PehC sont deux exoPG relarguant respectivement des dimères et des monomères. PehA et PehB contribuent
significativement et de façon additive à la virulence de la bactérie et à sa croissance dans les tissus
d’aubergine ou de tomate (González & Allen, 2003 ; Huang & Allen, 1997 ; Schell et al., 1988).
En revanche, PehC n’est pas importante pour le pouvoir pathogène de la bactérie. Toutefois, il a
été montré que le triple mutant pehA-B-C est plus virulent que le double mutant pehA-B. Les
auteurs formulent l’hypothèse que PehC pourrait jouer un rôle dans la dégradation des éliciteurs
oligogalacturoniques, protégeant ainsi la bactérie vis-à-vis des réponses antimicrobiennes de la
plante et, indirectement, augmentant sa virulence (González & Allen, 2003).
Un mutant dans le gène codant pour la pectine méthyl estérase Pme de R. solanacearum
n’est pas affecté dans son pouvoir pathogène sur tomate, aubergine ou tabac, suggérant soit que la
pectine de la paroi de ces plantes n’est pas ou peu méthylée, soit que la déméthylation de la
pectine n’est pas une étape critique pour le développement de la maladie causée par R.
solanacearum (Tans-Kersten et al., 1998).
L’expression des polygalacturonases est régulée de façon positive par le système à deux
composants PehSR, appartenant à la famille NtrBC. Des mutants dans les gènes pehSR présentent
une activité endo-PG quasi-nulle, une activité exo-PH réduite de moitié, et une forte réduction du
pouvoir pathogène. Le gène pme n’est en revanche pas régulé par ce système à deux composants
(Allen et al., 1997).
Le gène codant pour l’exo-PG PehC est co-transcrit avec le gène exuT codant pour un
transporteur d’oligogalacturonides (tout comme chez E. chrysanthemi) (González & Allen, 2003).
Un mutant exuT ne pousse plus sur PGA ni sur GA, mais n’est pas affecté dans sa croissance in
planta ni dans son pouvoir pathogène sur tomate, suggérant que le métabolisme des
oligogalacturonides n’est pas très important pour le développement de la maladie chez R.
solanacearum. De façon différente, un mutant exuT d’E. chrysanthemi est toujours capable de
pousser sur PGA mais est affecté dans son pouvoir pathogène, suggérant que cette hypovirulence
est due à une réduction de l’expression de différentes enzymes pectinolytiques plutôt qu’à une
limitation nutritionnelle (González & Allen, 2003).
100
Tableau II-3 : Les enzymes pectinolytiques de Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc ). (D'après da Silva et al. , 2002).
Substrat général
Fonction
Identification des gènes
Homologies avec E. chrysanthemi
a
Homologies avec R. solanacearum
a
XCC0122
XCC0644
Pectate lyases
XCC0645
Chaînes linéaires de la
pectine
Pectin Methyl Esterases
Rhamnogalacturonane
acetylesterase
Ramifications de la
pectine
44% id. 63% sim.
PelE
41% id. 62% sim.
PelA
40% id. 60% sim.
PelC
41% id. 61% sim.
PelD
44% id. 62% sim.
PelA
40% id. 62% sim.
PelE
40% id. 59% sim.
PelC
42% id. 57% sim.
PelA
40% id. 56% sim.
XCC2266
PehN
29% id. 42% sim.
PglA
53% id. 66% sim.
XCC3459
PehN
31% id. 47% sim.
PglA
32% id. 45% sim.
Pme
60% id. 73% sim.
XCC2815
Polygalacturonases
PelC
XCC0121
PemA (chaîne B) 34% id. 46% sim.
XCC2265
PemA (chaîne B) 31% id. 46% sim.
XCC0154
PaeY
29% id. 43% sim.
XCC3377 (ORF tronquée)
Rhamnogalacturonases
XCC3378 (ORF tronquée)
XCC3379 (ORF tronquée)
a
Les pourcentages d'identité (id.) et de similarité (sim.) entre protéines orthologues ont été obtenus à partir du site du génome de Xcc au NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=genome&cmd=Retrieve&dopt=Overview&list_uids=240), grâce à la fonction "Blink".
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
V. Et chez Xanthomonas campestris pv. campestris ?
Xcc possède un répertoire conséquent d’enzymes de dégradation de la pectine (Tableau II3), bien que nettement plus restreint qu’E. chrysanthemi. Pour la dépolymérisation et la
déméthylation du PGA, la bactérie dispose de 4 pectate lyases, de 2 polygalacturonases et de 2
pectine méthyl estérases. Ces enzymes n’ont pas été caractérisées à l’heure actuelle. Une activité
polygalacturonase (ou pectate lyase) a toutefois été rapportée chez Xcc : l’enzyme purifiée libère
des dimères et des trimères insaturés d’acide galacturonique, ainsi que des monomères, dimères et
trimères saturés (Nasuno & Starr, 1967). Comme le montre le Tableau II-3, les enzymes
pectinolytiques de Xcc présentent peu d’homologies avec des enzymes caractérisées d’E.
chrysanthemi ou R. solanacearum. Par ailleurs, Xcc possède dans son génome les gènes codant
pour les enzymes du catabolisme intracellulaires du DKI (KduI, XCC0151 ; KduD, XCC0152 ;
KdgK, XCC0118) mais pas du D-galacturonate (UxaC, B et A). Enfin, Xcc ne possède pas
l’enzyme finale de la voie de dégradation, la KDGP aldolase KdgA.
Xcc présente deux régulateurs transcriptionnels de la famille IclR (famille de KdgR d’E.
chrysanthemi). Cependant, ces protéines présentent peu d’homologies avec la protéine KdgR d’E.
chrysanthemi : XCC0373 (annotée PcaR) ne présente que 28% d’identité et 50% de similarité
avec KdgR, et XCC4072 (annotée KdgR) seulement 28% d’identité et 46% de similarité. Les
autres régulateurs de la pectinolyse d’E. chrysanthemi sont a priori absents du protéome de Xcc.
Ces observations suggèrent que l’utilisation des produits de dégradation de la pectine et sa
régulation chez Xcc diffèrent, au moins en partie, de ce qui est décrit chez E. chrysanthemi.
RESULTATS : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la
paroi végétale chez Xanthomonas campestris pv. campestris
Au cours des travaux présentés dans l’article du Chapitre I, nous avons identifié plusieurs
gènes TBDR dont l’expression est régulée positivement par des molécules de la paroi végétale.
Mon travail de thèse s’est ensuite focalisé sur l’étude de ces gènes TBDR et des « CUT loci »
putatifs auxquels ils sont associés. Le premier axe de cette partie Résultats concerne l’étude des
gènes codant pour les TBDR XCC0120, XCC1749 et XCC1750-1751, dont l’expression est
induite par le PGA (Blanvillain et al., 2007). Le deuxième axe, rédigé sous la forme d’un article
préliminaire, rassemble l’étude menée sur les gènes codant pour les TBDR XCC2828 et
XCC4120, dont l’expression est induite par la présence de xylose (Blanvillain et al., 2007), un
constituant essentiel des hémicelluloses de la paroi végétale.
101
Tableau II-4 : Couples d'amorces utilisés dans cette étude pour le clonage des promoteurs, la mutagénèse et la RT-PCR sur les régions intergéniques. Les
sites de restriction sont en rouge et les codons stop en vert. Les mutants d'insertion pVO155 sont décrits dans l'article Blanvillain et al . (2007).
Clonage de promoteurs
Nom du fragment
Taille du fragment amplifié (pb)
Pr1-XCC0119
Amorce L
Amorce R
500
TACGAAGCTTGCAACTCGCCCAGCACCG
TACGTCTAGAGTCCTCCCCTCCCAAGGG
Pr2-XCC0119
1114
TACGAAGCTTGCCGGTAGTTGCCGTCAAA
TACGTCTAGACGGCCTTCGCCGGCTTCA
Pr1-XCC0120
500
TACGAAGCTTGTGGAATGCCACGCTGTT
TACGTCTAGAGATGCGGCTCTCTCCAGG
Pr2-XCC0120
1000
TACGAAGCTTTGCAGCTCAACTACACCTGG
TACGTCTAGACCAGGCCGTTGATGCGCAC
Pr-XCC1749
1100
TACGAAGCTTACGAGCCGCATTCGGTGATC
TACGTCTAGAGGCCGCGAATCATCACGCC
Pr-XCC1750
500
TACGAAGCTTCGTGACCAAGGTGCTGAT
TACGTCTAGAAGCCCGGCCTGCCGGAAT
Mutagénèse par délétion
Produit Amont
Amorce L
Produit Amont
Amorce R
Amorce L
Amorce R
XCC0120
TACGGAATTCAGCATTCCGCTCAATACC
TACGCCATGGCTACGATGCGGCTCTCTCCAG
TACGTACGTATAGGTAGCAGGAGAACCGCCATGC
TACGGAGCTCATTGCGAAACACGAAGCC
XCC1748
TACGGAATTCGGGGTGACGATGAAACGC
TACGCCATGGGGTGCCGTCGCGGACG
TACGTACGTAGCAGGCTCTTCCATTTCC
TACGGAGCTCCACGTCTTCAAAGCTCAG
XCC1749-50-51
TACGGAATTCACGAGCCGCATTCGGTGA
TACGCCATGGCCGAATCCCTCCCAGGAC
TACGTACGTAAACGCGCCGTAGGAAGTG
TACGGAGCTCCGCCGCGATCGTCGCTAC
RT-PCR sur les régions intergéniques
Taille du fragment amplifié (pb)
XCC0119-XCC0120
610
Amorce L
GTGCGGAAGCCGGCTTCAA
Amorce R
TTGCTGCAGGCTTTCGCGAT
XCC0119::pVO
XCC0120::pVO
0117
0118
XCC0119
XCC0120
0121
0122
SGNH
hydrolase
KdgK
TBDR
TBDR
PME
PL
Pr1-XCC0119
Pr1-XCC0120
Pr2-XCC0119
Pr2-XCC0120
Figure II-8 : Représentation schématique du locus XCC0117-XCC0122 de
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). Les sites d’insertion sont symbolisés
par une tête de flèche noire, et les 4 constructions promotrices utilisées dans cette
étude (cf. Figure II-11) par un trait noir épais. Le couple d’oligonucléotides utilisé pour
la RT-PCR (cf. Figure II-12) est schématisé par des flèches horizontales. KdgK, Ketodeoxygluconate Kinase ; PME, Pectin Méthyl Estérase ; PL, Pectate Lyase. Les
hydrolases de la famille SGNH présentent dans leur site catalytique les 4 résidus
conservés S, G, N et H. La présence dans ce locus de 2 TBDR et de 3 enzymes de
dégradation de la pectine suggère qu’il pourrait former un CUT locus impliqué dans
l’utilisation de la pectine chez Xcc.
B
Supplément
10
Xylose
0
Saccharose
Xylose
Saccharose
PGA
Methanol
Glutamine
Cellobiose
0
20
PGA
2
30
Methanol
3
40
Glutamine
5
50
Cellobiose
6
XCC0120::pVO
Sans
supplément
Activité Beta-glucuronidase
XCC0119::pVO
Sans
supplément
Activité Beta-glucuronidase
A
Supplément
Figure II-9 : Dosage de l’activité β-glucuronidase des mutants d’insertion portant le
plasmide suicide pVO155 dans les gènes TBDR XCC0119 (A) et XCC0120 (B). Les
différentes souches bactériennes ont été cultivées pendant 6 heures en milieu minimum
sans supplément, ou additionné de différentes molécules végétales. La cellobiose, la
glutamine, le saccharose et le xylose ont été utilisés à une concentration finale de 20
mM, le méthanol à 120 mM et l’acide polygalacturonique (PGA) à 0,125%. Les barres
d’erreurs représentent les écarts-types obtenus pour 2 répétitions biologiques
indépendantes.
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
I. Etude de loci potentiellement impliqués dans l’utilisation de la
pectine chez Xanthomonas campestris pv. campestris
I.1. Le locus XCC0117-XCC0122
I.1.a. Le locus XCC0117-XCC0122 : un CUT locus potentiellement impliqué dans
l’utilisation de la pectine
La structure du locus est présentée sur la Figure II-8. XCC0117 code pour une hydrolase de
la famille SGNH. XCC0118 code pour une 2-keto-3-deoxygluconate kinase, enzyme impliquée
dans le catabolisme intracellulaire de la pectine : chez E. chrysanthemi, elle catalyse la
phosphorylation du KDG (2-keto-3-deoxygluconate) en 6-phospho-KDG, et est indispensable à la
croissance de la bactérie sur acide galacturonique (GA) ou polygalacturonique (PGA)
(Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1994). XCC0119 et XCC0120 codent pour 2 TBDR qui, avec
39% d’identité et 53% de similarité, sont les 2 TBDR les plus proches l’un de l’autre chez Xcc
[voir arbre phylogénétique, (Blanvillain et al., 2007)]. XCC0121 code pour une pectine méthyl
estérase (PME), et XCC0122 pour une Pectate Lyase (PL).
La présence dans ce locus de gènes codant pour 2 TBDR et 3 enzymes de dégradation de la
pectine suggère que ces gènes pourraient former un CUT locus (Carbohydrate Utilization
containing TBDR locus) impliqué dans l’utilisation de la pectine chez Xcc (Blanvillain et al.,
2007).
I.1.b. XCC0120 est spécifiquement induit par le PGA
Des mutants d’insertion dans les gènes XCC0119 et XCC0120 (Blanvillain et al., 2007) ont
été utilisés pour étudier l’expression de ces gènes en présence de différentes molécules d’origine
végétale : la cellobiose (disaccharide constituant la cellulose), la glutamine (acide aminé présent
dans les gouttes de guttation qui permettent l’entrée de Xcc dans les feuilles), le méthanol (produit
à la surface des feuilles par dégradation de la pectine), l’acide polygalacturonique (PGA, squelette
de la pectine), le saccharose (principal disaccharide présent chez les végétaux supérieurs), et le
xylose (monomère du xylane, constituant majeur de l’hémicellulose). L’insertion du plasmide
suicide pVO155 conduit à une fusion transcriptionnelle entre le promoteur du gène et le gène
rapporteur uidA (GUS), codant pour la β-glucuronidase. Il est important de noter à ce stade
qu’avec de telles constructions, (i) l’expression du gène d’intérêt est suivie dans un contexte
mutant pour ce gène, et (ii) en cas d’opérons polycistroniques, la mutation est potentiellement
polaire sur le ou les gènes en aval.
102
Niveau d’expression (unités arbitraires)
5
ARNm XCC0119
4
Sans supplément
3
GA 0,125%
PGA 0,125%
2
1
0
1200
1000
800
pPr1-XCC0119
600
pPr2-XCC0119
400
200
PGA
GA
0
Sans
supplément
Activité Beta-galactosidase
(Unités Miller)
(Unités Miller)
Figure II-10 : Niveau d’expression du gène XCC0119 de Xanthomonas campestris pv.
campestris (Xcc), mesuré par RT-PCR quantitative (qRT-PCR). La souche sauvage de
Xcc a été cultivée pendant 6 heures en milieu minimum sans supplément, ou additionné
d’acide galacturonique (GA) ou polygalacturonique (PGA), puis les ARN ont été extraits
et rétrotranscrits. L’amplification a été réalisée à partir d’amorces spécifiques du gène.
Les barres d’erreurs représentent les écarts-types obtenus pour 3 répétitions biologiques
indépendantes.
Supplément
Suppément dans le
milieu minimum
Figure II-11 : Dosage de l’activité β-galactosidase dans 2 souches différentes de
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). Les fragments d’ADN en amont du gène
XCC0119, représentés Figure II-8, ont été clonés dans le plasmide pCZ750, en amont
du gène rapporteur LacZ, conduisant aux plasmides pPr1-XCC0119 et pPr2-XCC0119.
Ces constructions ont été introduites dans la souche sauvage de Xcc et les souches
obtenues ont été cultivées pendant 6 heures en milieu minimum sans supplément, ou
additionné d’acide galacturonique (GA) ou polygalacturonique (PGA) a une
concentration de 0,125%. Les barres d’erreurs représentent les écarts-types obtenus
pour 2 répétitions biologiques indépendantes.
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
L’activité de la β-glucuronidase a été dosée après 6 heures de culture en milieu minimum
additionné ou non d’une molécule végétale, et les résultats sont présentés sur la Figure II-9. Dans
le contexte mutant, l’expression du gène XCC0119 dans la fusion XCC0119::pVO n’est induite
par aucune des molécules végétales testées. En revanche, dans les mêmes conditions, l’expression
du gène XCC0120 est induite par le PGA, et cette induction semble spécifique dans la mesure où
les autres molécules végétales testées ne sont pas inductrices de l’expression de ce gène. De façon
intéressante, le gène XCC0120 a également été trouvé comme étant régulé par la pectine (résultat
non montré). Par ailleurs, les 2 gènes sont soumis à la répression catabolique par le saccharose et
le xylose, deux sources de carbone très bien métabolisées par Xcc.
Les différences de profils d’expression entre les gènes codant pour les 2 TBDR consécutifs
de ce locus suggèrent que les insertions du pVO155 introduisent peut-être un biais, et il est
possible que la mutation dans le gène XCC0119 soit polaire sur le gène XCC0120. Cette
hypothèse nous a conduit à approfondir l’étude de l’expression et de la transcription de ces gènes.
I.1.c. La transcription de XCC0119 est induite en présence de PGA
L’expression des gènes XCC0119 et XCC0120 a été mesurée au niveau transcriptionnel, par
RT-PCR quantitative (qRT-PCR). Comme le montre la Figure II-10, dans le contexte sauvage
l’expression du gène XCC0119 est spécifiquement induite par le PGA, d’un facteur 5. De façon
très intéressante, le monomère de GA n’influence pas l’expression de ce gène. Un profil similaire
a été obtenu pour le gène XCC0120 (résultat non montré). Le fait que l’induction de XCC0119 par
le PGA n’ait pas été détectée dans le contexte mutant pour ce gène (fusion XCC0119::pVO)
suggère fortement que le récepteur TonB-dépendant XCC0119 pourrait être impliqué dans le
transport de molécules dérivées du PGA inductrices de sa propre expression. En revanche, le
transport d’oligogalacturonides par le TBDR XCC0120 ne peut être exclu, mais contrairement à
XCC0119, la présence de XCC0120 n’est pas indispensable au transport (Figure II-9).
I.1.d. Recherche des promoteurs putatifs des gènes codant pour les TBDR de ce locus
Afin d’identifier le(s) promoteur(s) contrôlant la transcription des gènes XCC0119 et
XCC0120, les fragments d’ADN en amont de ces gènes, Pr1-XCC0119, Pr2-XCC0119, Pr1XCC0120 et Pr2-XCC0120 (Figure II-8), ont été amplifiés grâce aux couples d’amorces indiqués
dans le Tableau II-4, puis clonés en amont du gène rapporteur LacZ dans le plasmide d’expression
pCZ750 (Blanvillain et al., 2007).
Comme le montre la Figure II-11, le gène rapporteur LacZ est inductible par le PGA d’un
facteur 4 s’il est placé en aval du fragment d’ADN Pr2-XCC0119. En revanche, le plus petit
103
1 2 3 4 5
6 7
1 ADNc WT
2 ARN WT
3 ADNc XCC0119::pVO
4 ARN XCC0119::pVO
5 ADNc XCC0120::pVO
6 ARN XCC0120::pVO
7 ADN génomique
Figure II-12 : RT-PCR sur la région intergénique entre les gènes XCC0119 et XCC0120.
Les différentes souches bactériennes ont été cultivées pendant 6 heures en milieu
minimum additionné d’acide galacturonique (GA), d’acide polygalacturonique (PGA) ou
de pectine, à une concentration de 0,125%. Les ARN ont ensuite été extraits à partir d’un
mélange de ces 3 cultures indépendantes.
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
fragment d’ADN, Pr1-XCC0119, ne permet pas cette induction par le PGA, ce qui suggère
l’existence d’une séquence de régulation par le PGA dans Pr2-XCC0119, absente de Pr1XCC0119. En accord avec les résultats de qRT-PCR obtenus pour ce gène, les résultats présentés
sur la Figure II-11 montrent donc que l’expression du gène XCC0119 est induite par le PGA mais
pas par le monomère de GA.
Les dosages de l’activité β-galactosidase des souches exprimant le gène LacZ sous le
contrôle des fragments d’ADN Pr1-XCC0120 et Pr2-XCC0120 ont conduit à des résultats
préliminaires complexes qui doivent être répétés et complétés par d’autres expériences ; il semble
en effet que ces fragments d’ADN ne permettent pas l’induction du gène LacZ par le PGA mais
renferment tout de même des motifs régulateurs (résultats non montrés).
Nos résultats suggèrent que le gène XCC0119 possède son propre promoteur. Le promoteur
contrôle-t-il également l’expression du gène XCC0120 ?
I.1.e. XCC0119 et XCC0120 sont co-transcrits
Pour répondre à cette question, des expériences de RT-PCR ont été effectuées sur la région
intergénique entre les gènes XCC0119 et XCC0120. La souche sauvage ainsi que les 2 mutants
d’insertion XCC0119::pVO et XCC0120::pVO ont été cultivés pendant 6 heures en milieu
minimum additionné de GA, PGA ou pectine. Les ARN ont ensuite été extraits à partir d’un
mélange de ces 3 cultures indépendantes, puis rétro-transcrits. L’amplification PCR a ensuite été
réalisée avec le couple d’amorces indiqué dans le Tableau II-4. Le résultat de ces RT-PCR est
présenté sur la Figure II-12. Le fragment comprenant la région intergénique entre XCC0119 et
XCC0120 a pu être amplifiée à partir des ADN complémentaires de la souche sauvage (puits 1),
suggérant que cette région intergénique est bien transcrite. Par ailleurs, dans les mêmes
conditions, cette région intergénique peut être amplifiée à partir des ADNc du mutant
XCC0120::pVO (puits 5), mais pas à partir des ADNc du mutant XCC0119::pVO (puits 3). Ces
résultats démontrent que les gènes XCC0119 et XCC0120 forment un opéron ; la mutation
XCC0119::pVO est donc polaire sur XCC0120.
I.1.f. Le PGA n’est pas la molécule induisant directement l’expression de l’opéron XCC01190120
L’étude systématique des régulateurs de la famille LacI de Xcc, menée dans l’équipe par
Alice Boulanger, a permis l’identification et la caractérisation de XCC0150 comme régulateur
négatif des gènes XCC0119 à XCC0122 (résultats de qRT-PCR non montrés). La construction
104
Activité Beta-galactosidase (Unités Miller)
20000
18000
16000
14000
12000
Sans supplément
10000
8000
GA 0,125%
6000
PGA 0,125%
4000
2000
0
Fond génétique :
WT
XCC0150::pVO
+ pPr2-XCC0119
Figure II-13 : Dosage de l’activité β-galactosidase dans différentes souches de
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). Le plasmide portant le fragment Pr2XCC0119, représenté sur la Figure II-8, a été introduit dans la souche sauvage de Xcc et
dans le mutant XCC0150::pVO. Les souches ont été cultivées pendant 6 heures en
milieu minimum sans supplément, ou additionné d’acide galacturonique (GA) ou
polygalacturonique (PGA). Les barres d’erreurs représentent les écarts-types obtenus
pour 2 répétitions biologiques indépendantes.
Activité Beta-galactosidase (Unités Miller)
4000
3500
3000
WT
hrpG
hrpX
clp
kdgR
2500
2000
1500
+ pPr2-XCC0119
1000
500
0
Sans supplément
PGA 0,125%
Figure II-14 : Dosage de l’activité β-galactosidase dans différentes souches de
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). Le plasmide portant le fragment pPr2XCC0119, représenté sur la Figure II-8, a été introduit dans la souche sauvage de Xcc et
dans des mutants d’insertion du plasmide pVO155 dans différents régulateurs généraux
de Xcc. Les souches ont été cultivées pendant 6 heures en milieu minimum sans
supplément, ou additionné d’acide polygalacturonique (PGA). Les barres d’erreurs
représentent les écarts-types obtenus pour 2 répétitions biologiques indépendantes.
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
portant le fragment Pr2-XCC0119 a donc été introduite dans le mutant XCC0150::pVO, et
l’expression de l’opéron XCC0119-0120 a été suivie dans la souche sauvage et dans ce mutant, en
présence de GA ou de PGA. La Figure II-13 montre que, en présence de PGA, le niveau de
dérépression observé dans la souche sauvage est 14 fois inférieur à celui observé dans le mutant
XCC0150::pVO. Ce résultat suggère que l’induction de l’opéron n’est pas optimale dans notre
test, et que la molécule effectrice du répresseur XCC0150 n’est pas présente. Il est possible que,
tout comme chez E. chrysanthemi, le véritable inducteur de notre système soit un produit du
catabolisme intracellulaire tel que le KDG, mais que cette molécule ne soit pas encore produite
après 6 heures de culture de Xcc en présence de PGA. Dans la mesure où Xcc ne peut utiliser le
PGA/la pectine comme uniques sources de carbone, on peut penser que le catabolisme de la
pectine est plus lent et moins efficace chez Xcc que chez E. chrysanthemi. Alternativement, la
molécule effectrice de ce régulateur est peut-être un substituant des chaînes de PGA (arabinane,
galactane, arabinogalactane…), ou n’est peut-être pas de nature pectique ; il serait donc
intéressant d’effectuer ces mêmes expériences en présence d’autres molécules végétales.
I.1.g. L’opéron XCC0119-0120 est réprimé par HrpG et HrpX, et faiblement réprimé par
Clp
Afin de décrypter le réseau de régulation contrôlant l’expression de ce locus, la construction
pPr2-XCC0119, portant le fragment d’ADN inductible par le PGA, a été introduite dans la souche
sauvage de Xcc et dans des mutants d’insertion pVO155 dans différents régulateurs centraux de
Xcc : hrpG (XCC1166), hrpX (XCC1167) et clp (XCC0472). Comme mentionné en introduction,
Xcc présente 2 membres de la famille de régulateurs transcriptionnels IclR mais ni l’un ni l’autre
n’est homologue au régulateur KdgR d’E. chrysanthemi. Un mutant dans l’un des deux gènes
correspondant (XCC4072, annoté KdgR) a tout de même été construit et utilisé pour cette étude.
L’expression de l’opéron XCC0119-0120 à partir du promoteur Pr2-XCC0119 a été comparée dans
la souche sauvage et dans ces mutants, en l’absence ou en la présence de PGA. La Figure II-14
montre que, en l’absence de PGA dans le milieu, XCC0119-0120 sont surexprimés dans les
mutants hrpG::pVO ou hrpX::pVO, d’un facteur 2,4 et 2,7 respectivement, suggérant que ces 2
régulateurs majeurs du système de sécrétion de type III répriment cet opéron. En présence de
PGA, les facteurs de répression sont sensiblement les mêmes, suggérant que cette régulation est
indépendante de celle exercée par le PGA. Par ailleurs, le même profil est obtenu en comparant
l’expression de l’opéron dans la souche sauvage et dans un mutant clp::pVO, le facteur de
répression étant tout de fois plus faible (1,9) dans ce cas. Enfin, l’expression de l’opéron n’est pas
105
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
affectée en réponse à une mutation dans le gène XCC4072, annoté « KdgR » par da Silva et al.
(2002).
I.1.h. Discussion des résultats obtenus sur ce locus
Ce locus est centré sur les gènes codant pour les deux TBDR XCC0119 et XCC0120, que
nous avons montrés comme étant co-transcrits. Lorsque le gène XCC0119 est muté, son
expression n’est pas induite par le PGA. Pourtant, nos expériences de qRT-PCR (Figure II-10) et
de dosages de l’activité β-galactosidase (Figure II-11) dans la souche sauvage de Xcc, montrent
que l’expression de ce gène est inductible par le PGA. La présence de la protéine XCC0119
semble donc indispensable à l’induction de l’opéron par le PGA. Nous proposons donc que le
récepteur TonB-dépendant XCC0119 est impliqué dans le transport d’oligogalacturonides. Ainsi,
dans un mutant pour ce gène, ces molécules ne sont plus transportées et ne sont donc plus
capables d’induire l’expression de l’opéron. Il est à présent nécessaire de complémenter ce
phénotype, en regardant si l’induction par le PGA est restaurée dans une souche XCC0119::pVO
exprimant le gène XCC0119 en trans sur un plasmide. Par ailleurs, XCC0120 est peut-être
également capable de transporter des oligogalacturonides ; l’étude d’un mutant non polaire dans le
gène XCC0119 devrait permettre d’évaluer la contribution de XCC0120 dans le transport
d’oligogalacturonides à travers la membrane externe de la bactérie.
L’expression de l’opéron est sous le contrôle partiel de différents régulateurs. Outre le
répresseur XCC0150 qui, d’après les études préliminaires menées par Alice Boulanger, semble
spécifique de ce locus, les 2 TBDR sont sous le contrôle de régulateurs plus généraux. Il reste à
déterminer si la répression par HrpG, HrpX et Clp (plus largement connus comme activateurs de
transcription) est directe ou indirecte. Dans le cas d’une régulation directe par HrpX, il serait
intéressant de déterminer la boîte de fixation de ce régulateur : les TBDR de notre locus ne
présentent pas de Pip-box (ou de HrpII-box) dans leur promoteur, mais possèdent peut-être un
motif spécifique de la répression par HrpX.
Il est à présent important de poursuivre l’étude de l’expression de ce locus : les gènes codant
pour les enzymes pectinolytiques situés en aval des deux TBDR font-t-ils partie de l’opéron ? A
partir de quel(s) promoteur(s) s’expriment-ils ? Leur expression est-elle inductible par les produits
de dégradation de la pectine ? Des résultats préliminaires menés par qRT-PCR indiquent que, tout
comme XCC0119 et XCC0120, les gènes XCC0121 et XCC0122 codant respectivement pour une
pectine méthyl hydrolase et une pectate lyase sont activés par le PGA mais pas par le GA
(résultats non montrés).
106
A
∆XCC1748
XCC1750::pVO
XCC1749::pVO XCC1751::pVO
1748
GbpR
1749
1750
51 1752
1755
1753 1754
1756 1757 1758 1759
cellulase ESAS Hyp. α-glucosidase Hyp. D-XK XI MFS-T
Ps-TBDR
Prot.
Prot.
Pr-XCC1750
TBDR
Pr-XCC1749
B
XC_2485::pVO
2486
GbpR
XC_2484::pVO
2485
TBDR
2483
2484
TBDR
2480
2482 2481
2479 2478 2477 2476
cellulase ESAS Hyp. α-glucosidase Hyp. D-XK XI MFS-T
Prot.
Prot.
Figure II-15 : Représentation schématique du locus XCC1748 - XCC1759 de la souche
ATCC33913 de Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) (A), et du locus
XC_2486 - XC_2476 de la souche Xcc 8004 (B). Les sites d’insertion sont symbolisés
par une tête de flèche noire, et les 2 constructions promotrices utilisées dans cette
étude sont symbolisées par un trait noir épais. La délétion du gène XCC1748 est
signalée par un trait épais pointillé. GbpR, Galactose-binding protein Regulator ; PsTBDR, Pseudo-TBDR ; ESAS, Esterase Sialic Acid Specific ; D-XK, D-XyluloKinase ;
XI, Xylose Isomerase ; MFS-T, Major Facilitator Superfamily Transporter.
B
Supplément
Activité Beta-glucuronidase
60
40
20
24
16
8
Supplément
Xylose
Saccharose
PGA
Methanol
Xylose
Glutamine
0
0
Saccharose
Xylose
Saccharose
PGA
Methanol
Glutamine
Cellobiose
0
80
PGA
2
100
Methanol
3
120
Glutamine
5
140
Cellobiose
6
XCC1751::pVO
32
Sans supplément
Activité Beta-glucuronidase
8
Sans supplément
Activité Beta-glucuronidase
C
XCC1750::pVO
160
Cellobiose
XCC1749::pVO
9
Sans supplément
A
Supplément
Figure II-16 : Dosage de l’activité β-glucuronidase des mutants d’insertion du plasmide
pVO155 dans les gènes TBDR XCC1749 (A) et dans le pseudogène TBDR XCC17501751 (B et C). Les différentes souches bactériennes ont été cultivées pendant 6 heures
en milieu minimum sans supplément, ou additionné de différentes molécules végétales
aux concentrations indiquées dans la légende de la Figure II-9. Les barres d’erreurs
représentent les écarts-types obtenus pour 2 répétitions biologiques indépendantes.
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
I.2. Le locus XCC1748-XCC1759
I.2.a. Le locus XCC1748-XCC1759 : un autre CUT locus impliqué dans la dégradation de la
paroi végétale ?
La structure du locus est présentée sur la Figure II-15A. Il est constitué successivement des
gènes codant pour un régulateur de la famille GbpR (Galactose binding protein Regulator), un
TBDR, un pseudo-TBDR, une cellulase, une estérase acide sialique-spécifique, une protéine de
fonction inconnue, une α-glucosidase, une autre protéine de fonction inconnue, une Dxylulokinase, une xylose isomerase et un transporteur de la membrane interne de la famille MFS.
Les régulateurs de la famille GbpR appartiennent à une plus grande famille, celle des
régulateurs LysR. Les membres de cette famille possèdent dans leur séquence N-terminale un
motif hélice-tour-hélice de fixation à l’ADN (Henikoff et al., 1988). Ce motif (pfam00126) est
présent dans la séquence protéique de XCC1748, entre les acides aminés 27 et 75. Les ORF
(Open Reading Frames) XCC1750 et XCC1751 forment un pseudogène, dont la séquence est
interrompue par une mutation entraînant un changement de phase. La protéine XCC1755, annotée
α-xylosidase par da Silva et ses collaborateurs (2002), appartient à la famille des Glycoside
Hydrolases 31 (GH31), selon la classification proposée par la base de données CAZy. Toutefois,
au sein des GH31, XCC1755 serait une α-glucosidase (EC3.2.1.20) et non pas une α-xylosidase
(EC3.2.1-).
La figure II-15B présente la structure de ce locus chez la souche 8004 de Xcc, et montre que
la structure du locus est parfaitement conservée, à la différence notable que le pseudo-TBDR
XCC1750-51 de la souche ATCC33913 est remplacé par un gène unique (XC_2484) dans la
souche 8004 ; le décalage de phase de lecture étant absent chez cette souche, le TBDR XC_2484
est vraisemblablement fonctionnel.
I.2.b. L’expression du gène TBDR XCC1749 et du pseudogène TBDR XCC1750-51 est
spécifiquement induite par le PGA et le GA
L’expression de XCC1749 et de XCC1750-51 a été suivie dans différentes conditions grâce
aux souches XCC1749::pVO, XCC1750::pVO et XCC1751::pVO portant une fusion avec le gène
rapporteur GUS. Parmi les 6 molécules d’origine végétale testées, seul le PGA s’est révélé
inducteur du gène XCC1749 et du pseudogène XCC1750-51, par ailleurs soumis à la répression
catabolique par le saccharose et le xylose (Figures II-16 A, B et C). De façon surprenante, le gène
XCC1750 (codant pour la partie N-terminale du pseudo-TBDR) semble plus fortement régulé par
107
A
B
C
D
150
9,0
24
16
8
0
7,5
6,0
4,5
3,0
1,5
125
100
75
50
25
XCC1749::pVO
i1749
28,0
21,0
14,0
7,0
0,0
0
0,0
i1748
XCC1748::pVO
Activité
Beta-glucuronidase
Activité
Beta-glucuronidase
32
ActivitéBeta-glucuronidase
Beta-glucuronidase
Activité
Activité
ActivitéBeta-glucuronidase
Beta-glucuronidase
Activité
Beta-glucuronidase
Activité
Beta-glucuronidase
40
XCC1750::pVO
i1750
i1751
XCC1751::pVO
Pseudo-TBDR
F960
E 16
Activité
Beta-glucuronidase
Activité
Beta-glucuronidase
Activité
Beta-glucuronidase
Activité
Beta-glucuronidase
14
12
10
8
6
4
2
0
800
640
Sans supplément
480
GA 0,125%
320
PGA 0,125%
160
0
XC_2485::pVO
i2485
XC_2484::pVO
i2484
Figure II-17 : Dosage de l’activité β-glucuronidase des mutants d’insertion du plasmide
pVO155 dans différents gènes de la souche ATCC33913 de Xanthomonas campestris
pv. campestris (Xcc) : régulateur XCC1748 (A), TBDR XCC1749 (B), parties N-terminale
et C-terminale du Ps-TBDR XCC1750-1751 (C et D, respectivement). Dosage de
l’activité β-glucuronidase des mutants pVO155 dans les gènes orthologues des TBDR
XCC1749 et XCC1750-1751 chez la souche 8004 de Xcc : respectivement XC_2485 (E)
et XC_2484 (F). Les différentes souches bactériennes ont été cultivées pendant 6
heures en milieu minimum sans supplément, ou additionné d’acide galacturonique (GA)
ou polygalacturonique (PGA). Les barres d’erreurs représentent les écarts-types obtenus
pour 2 répétitions biologiques indépendantes.
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
le PGA que le gène XCC1751 (codant pour la partie C-terminale du pseudo-TBDR) et que le gène
XCC1749.
La Figure II-17 présente les résultats des dosages de l’activité β-glucuronidase effectués en
présence ou en absence de GA ou de PGA, sur les souches XCC1748::pVO, XCC1749::pVO,
XCC1750::pVO, XCC1751::pVO, et sur les souches issues de Xcc 8004 mutées dans les gènes
orthologues aux TBDR : XC_2584::pVO et XC_2585::pVO. Le gène XCC1749 et le pseudogène
XCC1750-51sont induits par le PGA et par le monomère (GA), le polymère étant un inducteur
légèrement meilleur que le monomère (Figures II-17 B, C et D). Il est intéressant de noter que, de
la même façon qu’avec le PGA, c’est XCC1750 qui est le plus soumis à la régulation par le GA.
Le gène XC_2485 présente le même profil d’expression que son orthologue XCC1749 (Figures II17 B et E), et l’expression du gène XC_2484 suit le même profil que XCC1750, à savoir une forte
induction par le GA et le PGA (Figures II-17 C et F).
Les différences de taux d’induction mentionnées sont à prendre avec prudence dans la
mesure où leur interprétation est impossible à ce stade de notre étude ; il est possible que
l’insertion du plasmide conduise dans certains cas à des dé-régulations via des modifications de la
structure des ARN messagers, ou encore que des petits ARN régulateurs interviennent dans la
régulation de ces gènes. Toutefois, nos résultats sont nettement insuffisants pour formuler de telles
hypothèses. De plus, la présence d’un frameshift dans le deuxième gène TBDR complique encore
la compréhension des finesses de cette régulation.
Dans le contexte mutant XCC1748::pVO, le gène XCC1748 n’est pas régulé par le GA ni le
PGA (Figure II-17A), suggérant soit que ce gène régulateur n’est effectivement pas régulé par ces
composés, soit que la mutation est polaire sur un ou plusieurs transporteurs nécessaires à l’entrée
de ces composés dans Xcc, donc à l’induction par ces composés. Toutefois, si la mutation dans
XCC1748 était polaire sur les TBDR du locus, on obtiendrait le même profil d’expression pour
XCC1749::pVO que pour XCC1748::pVO, ce qui n’est pas le cas.
I.2.c. XCC1748 régule l’expression des TBDR du locus
Afin de déterminer si le régulateur XCC1748 joue un rôle dans la régulation de ce locus, un
mutant non polaire a été construit dans ce gène, en utilisant le système cre-lox (Angot et al.,
2006 ; Marx & Lidstrom, 2002). Les fragments d’ADN amont et aval ont été amplifiés à partir des
couples d’amorces indiqués dans le Tableau II-4. La régulation par XCC1748 a ensuite été étudiée
de 2 façons différentes : la première a consisté à insérer le plasmide pVO155 dans les gènes dont
on souhaitait suivre l’expression, et ce dans le contexte délété pour XCC1748. Ce type de
construction donne donc lieu à des doubles mutants et permet d’étudier l’expression du gène
108
A
B
135
Activité Beta-Glucuronidase
Activité Beta-Glucuronidase
9
150
8
6
5
3
2
120
105
90
Sans supplément
75
GA 0,125%
60
45
PGA 0,125%
30
15
0
0
DELTA 1748
WT
XCC1749::pVO
16
XCC1749
D
8
Niveau d'expression (unités arbitraires)
Niveau d'expression (unités arbitraires)
C
12
8
4
0
WT
∆1748
WTWT
XCC1750::pVO
XCC1750
DELTA 1748
∆1748
XCC1750::pVO
E
10
Niveau d'expression (unités arbitraires)
∆1748
XCC1749::pVO
WT
6
4
2
0
WT
∆1748
XCC1751
7,5
5
2,5
0
WT
∆1748
Figure II-18 : Etude de la régulation par le régulateur XCC1748 des gènes codant pour le
TBDR XCC1749 et le pseudo-TBDR XCC1750-51. (A) et (B) Dosage de l’activité βglucuronidase des mutants d’insertion du plasmide pVO155 dans les gènes TBDR
XCC1749 (A) et Ps-TBDR XCC1750 (B), dans le contexte sauvage ou délété du gène
XCC1748. Les barres d’erreurs représentent les écarts-types obtenus pour 2 répétitions
biologiques indépendantes. (C), (D) et (E) Niveau d’expression, déterminé par qRT-PCR,
des gènes TBDR XCC1749 (C), et Ps-TBDR XCC1750-1751 (D et E), dans le contexte
sauvage ou délété du gène XCC1748. Les oligonucléotides utilisés pour l’amplification
ont été choisis au début de la séquence codante de chaque gène. Les différentes
souches bactériennes ont été cultivées pendant 6 heures en milieu minimum sans
supplément, ou additionné d’acide galacturonique (GA) ou polygalacturonique (PGA).
Les barres d’erreurs représentent les écarts-types obtenus pour 3 répétitions biologiques
indépendantes.
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
interrompu par le plasmide portant le gène rapporteur GUS. Ainsi, les souches ∆1748XCC1749::pVO et ∆1748-XCC1750::pVO ont été obtenues et les résultats des tests d’expression
pour chacun des 2 gènes sont présentés sur les Figures II-18 A et B. Ces histogrammes montrent
que XCC1748 a une légère activité de répression sur le gène XCC1749, et ce uniquement en
l’absence de GA ou de PGA dans le milieu. Le profil obtenu pour XCC1750 est différent : si
XCC1748, de la même façon que pour XCC1749, réprime légèrement XCC1750 en l’absence de
GA ou de PGA, en revanche ce régulateur active fortement l’expression de ce gène en présence
des molécules inductrices GA et PGA. En effet, en présence de ces molécules et en l’absence du
régulateur, l’expression de XCC1750 est beaucoup plus faible que lorsque le régulateur est
présent, cet effet étant plus important dans le cas du PGA que dans le cas du GA. Ces résultats
sont toutefois à considérer avec prudence pour les raisons évoquées précédemment, mais aussi car
les constructions pVO155 introduites dans des TBDR, qui sont de potentiels transporteurs des
molécules étudiées dans ces tests, introduisent un biais pouvant masquer une éventuelle induction
qui aurait lieu dans la souche sauvage, et enfin car ces mutations par insertion sont potentiellement
polaires sur les gènes situés en aval.
La deuxième technique utilisée pour étudier la régulation par XCC1748 a été de comparer,
par qRT-PCR, l’expression d’un gène donné dans le contexte sauvage et dans le contexte délété
pour XCC1748. Cette méthode ne passe donc pas par une mutation dans un transporteur
quelconque, levant ainsi le biais introduit par la précédente méthode. Les résultats obtenus sont
présentés sur les Figures II-18 C, D et E. Le régulateur XCC1748 réprime faiblement le gène
XCC1749 en l’absence ou en la présence des molécules GA ou PGA (Figure II-18 C). En
revanche, XCC1748 active l’expression du pseudogène XCC1750-51, et ce uniquement en
présence des molécules GA ou PGA dans le milieu, sans lesquelles le régulateur n’a aucun effet
sur l’expression du pseudogène. Il est intéressant de constater que, en l’absence de mutations
pVO155, XCC1750 et XCC1751 suivent rigoureusement le même profil d’expression et présentent
des taux d’induction comparables (Figures II-18 D et E). Cela irait donc dans le sens de
l’hypothèse selon laquelle les mutations par insertion du pVO155 pourraient conduire à des
dérégulations importantes.
I.2.d. Tentative d’identification des promoteurs des TBDR
Afin de mieux comprendre la régulation de ce locus, il nous a semblé intéressant de localiser
les promoteurs des gènes. Ceci a été entrepris pour les gènes codant pour les TBDR. Les
fragments d’ADN localisés sur la Figure II-15A ont été clonés dans le plasmide d’expression
109
A
WT + pPr-XCC1749
B
WT + pPr-XCC1750
Activité Beta-galactosidase
(Unités Miller)
Activité Beta-galactosidase
(Unités Miller)
150
125
100
75
50
25
375
300
225
150
75
0
0
Sans
supplément
GA
Supplément
PGA
Sans
supplément
GA
PGA
Supplément
Figure II-19 : Dosage de l’activité β-galactosidase dans différentes souches de
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) ATCC33913. Les fragments d’ADN en
amont du gène XCC1749 ou du gène XCC1750, représentés Figure II-15, ont été clonés
en amont du gène rapporteur LacZ, donnant lieu respectivement aux constructions pPrXCC1749 (A) et pPr-XCC1750 (B). Ces constructions ont été introduites dans la souche
sauvage de Xcc, et les différentes souches obtenues ont été cultivées pendant 6 heures
en milieu minimum sans supplément, ou additionné d’acide galacturonique (GA) ou
polygalacturonique (PGA) à une concentration de 0,125%. Les barres d’erreurs
représentent les écarts-types obtenus pour 2 répétitions biologiques indépendantes.
A
B
Activité Beta-galactosidase (Unités Miller)
Activité Beta-galactosidase (Unités Miller)
1500
200
160
120
80
40
1200
900
600
300
0
0
Sans supplément
WT
hrpG
hrpX
clp
kdgR
PGA 0,125%
+ pPr-XCC1749
Sans supplément
WT
hrpG
hrpX
clp
kdgR
PGA 0,125%
+ pPr-XCC1750
Figure II-20 : Dosage de l’activité β-galactosidase dans différentes souches de
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). Les constructions portant le fragment
Pr-XCC1749 (A) ou le fragment Pr-XCC1750 (B) ont été introduites dans la souche
sauvage de Xcc et dans des mutants d’insertion du plasmide pVO155 dans différents
régulateurs généraux de Xcc. Les souches ont été cultivées pendant 6 heures en milieu
minimum sans supplément, ou additionné d’acide polygalacturonique (PGA). Les barres
d’erreurs représentent les écarts-types obtenus pour 2 répétitions biologiques
indépendantes.
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
pCZ750 (Blanvillain et al., 2007) en amont du gène rapporteur LacZ, à partir des couples
d’amorces indiqués dans le Tableau II-4. Les résultats des dosages de l’activité β-Galactosidase de
ces souches sont représentés sur la Figure II-19. Le gène rapporteur LacZ sous le contrôle du
fragment d’ADN Pr-XCC1749 est très faiblement induit par le GA et par le PGA. En revanche, le
gène rapporteur LacZ sous le contrôle du fragment d’ADN Pr-XCC1750, situé en amont du
pseudogène, est significativement induit par le GA et par le PGA (facteurs 2,4 et 2,8,
respectivement). Nos résultats sont insuffisants pour pouvoir affirmer que les fragments d’ADN
clonés renferment
les promoteurs du gène TBDR et du pseudogène ; toutefois, les profils
d’expression présentés sur la Figure II-19 sont proches de ceux obtenus par qRT-PCR (Figures II18 C, D et E), suggérant que le gène XCC1749 et le pseudogène XCC1750-51 ont chacun leur
propre promoteur.
I.2.f. Les TBDR du locus sont réprimés par Clp
Les constructions Pr-XCC1749 et Pr-XCC1750 ont été utilisées pour évaluer la régulation de
ces TBDR par les régulateurs généraux de Xcc HrpG, HrpX, Clp et KdgR. Les résultats obtenus,
présentés sur la Figure II-20, montrent que le gène TBDR XCC1749 est faiblement réprimé par
Clp, et que le pseudogène XCC1750-51 est fortement réprimé par ce régulateur. Cette répression
est indépendante des molécules inductrices GA ou PGA, suggérant que la voie de signalisation en
réponse à ces molécules est distincte de la voie impliquant le régulateur Clp. L’expression des
gènes TBDR n’est par ailleurs pas affectée par une mutation dans les gènes codant pour les
régulateurs HrpG, HrpX ou KdgR.
I.2.g. Discussion des résultats obtenus sur ce locus
Les expériences menées sur les TBDR de ce locus n’ont pas permis de déterminer si le
pseudo-TBDR XCC1750-51 est fonctionnel ou non. Il serait intéressant de séquencer la région
intergénique XCC1750-XCC1751 dans de nombreuses souches de Xcc afin de voir si le frameshift
a tendance ou non à être « sélectionné » par cette bactérie au cours de l’évolution. Par ailleurs, il
semble plus raisonnable de poursuivre l’étude de ce locus chez la souche 8004 de Xcc, dont le
génome est lui-aussi disponible et ne présente pas de frameshift dans la séquence nucléotidique du
deuxième TBDR du locus.
Les résultats d’expression obtenus semblent indiquer que le régulateur XCC1748 réprime
peu ou pas l’expression du pseudogène XCC1750-51 en l’absence de GA et PGA, et active
fortement son expression en présence de ces molécules inductrices. Ce profil original a déjà été
110
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
décrit pour le régulateur GbpR d’Agrobacterium tumefaciens, qui régule l’expression du gène
chvE (chromosomal virulence gene), codant pour une protéine périplasmique impliquée dans le
transport de sucres chez la bactérie et jouant un rôle majeur dans sa virulence. GbpR réprime
faiblement chvE en l’absence d’un sucre inducteur (tel que l’arabinose), et active l’expression de
ce gène lorsque le sucre inducteur est présent (Doty et al., 1993). La plupart des membres de la
famille LysR sont transcrits de façon divergente aux gènes qu’ils régulent (Schell, 1993). De
façon originale, le gène XCC1748, tout comme le gène pecT codant pour un régulateur de la
synthèse des pectinases chez Erwinia chrysanthemi, est transcrit dans le même sens que le(s)
gène(s) qu’il régule (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1996). Chez A. tumefaciens, GbpR réprime
sa propre expression (Doty et al., 1993), et c’est le cas de nombreux régulateurs de la famille
LysR. Il serait intéressant de voir si XCC1748 présente cette même activité d’aurorégulation.
Enfin, pour préciser l’activité de XCC1748, il faudra déterminer si ce régulateur régule les autres
gènes du locus. Des résultats préliminaires obtenus par qRT-PCR montrent une activation par
XCC1748 des gènes XCC1753, XCC1758 et XCC1759 en présence de PGA (résultats non
montrés). Ces résultats restent toutefois à reproduire et à affiner.
De nombreuses expériences complémentaires sont nécessaires à la compréhension des
finesses de la régulation de ce locus. Des expériences de RT-PCR sur les régions intergéniques
semblent montrer que ce locus est transcrit en de nombreux opérons polycistroniques et que
chaque gène pourrait être exprimé à partir de plusieurs promoteurs différents (résultats non
montrés). Il est possible que chaque gène ait un promoteur principal, mais qu’un ou plusieurs
promoteurs cryptiques prennent le relais dans certaines conditions, encore assez mal définies par
notre étude.
Nous avons tenté de déterminer le nombre et la taille des différents transcrits par des
hybridations de type Northern Blot. Des sondes spécifiques des gènes XCC1748, XCC1749, et
XCC1750 ont été successivement testées pour l’hybridation, mais aucun signal d’hybridation n’a
jamais été détecté quelle que soit la sonde. Ce type d’expérience a été réalisé à partir des ARN
totaux des souches Xcc ATCC33913 et 8004, aucune des 2 souches ne donnant de résultats
satisfaisants. Le niveau d’expression des gènes de ce locus est probablement trop faible,
n’atteignant pas le seuil de sensibilité de la technique de Northern Blot.
Notre étude établit un lien entre ce locus et les produits dérivés de la pectine. Pourtant, les
enzymes présents dans ce « CUT-locus » putatif sont potentiellement impliquées dans la
dégradation de la cellulose (la cellulase XCC1752), de polymères de glucose (l’α-glucosidase
111
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
XCC1755), ou encore dans le métabolisme du xylose, bloc de base constituant le xylane (la Dxylulokinase XCC1757 et la xylose isomérase XCC1758). Ce locus répond principalement à la
présence de pectine et de ses produits de dégradation, qui ne sont peut-être que des molécules
signalant la présence de la plante à la bactérie. Le locus pourrait par la suite être impliqué dans la
dégradation, le transport et le métabolisme de molécules végétales d’origines variées (pectine,
cellulose, hemicellulose…). Ainsi, l’étude de la régulation de l’expression des gènes de ce locus
par des extraits bruts de parois végétales, mais aussi des composés végétaux pas encore testés, tels
que le galactane ou l’arabinane, devrait fournir de précieuses informations. Nous avons déjà pu
observer que l’expression du pseudogène XCC1750-51 est induite en présence d’arabinose après
une culture d’environ 15 heures (Blanvillain et al., 2007). De plus, une induction par le xylane a
pu être observée suite à une longue culture (20 heures environ), le xylose n’étant pas inducteur
dans les mêmes conditions. Ces résultats pourraient suggérer que certains produits de dégradation
du xylane autres que le xylose (on pense donc à des substituants du xylane tels que l’α-arabinose
furanoside), pourraient être impliqués dans la régulation de ce locus. Cette étude traduit donc bien
la mise en œuvre, au cours de l’interaction avec la plante, de réseaux de régulation multiples et
complexes. Il serait intéressant de déterminer si ce locus est impliqué au cours d’une phase
spécifique du cycle de vie de Xcc.
Aucun des mutants construits au cours de cette étude (∆XCC1748, XCC1748::pVO,
∆XCC1749-1750-1751, XCC1749::pVO, XCC1750::pVO, XCC1751::pVO) n’est clairement
affecté dans son pouvoir pathogène sur Arabidopsis thaliana lorsque l’on introduit les bactéries
directement dans le xylème. En revanche, des résultats préliminaires obtenus dans l’équipe de
Marie-Agnès Jacques et Armelle Darras (UMR Pavé, Angers) semblent indiquer qu’un mutant
dans le gène XCC1750 (XCC1750::pVO) est affecté dans le passage de la vie épiphyte à la vie
endophyte (résultat non montré). Des expériences sont actuellement en cours à Angers afin de
reproduire et confirmer ce phénotype, surprenant dans le cas d’une mutation dans un pseudogène.
I.3. Discussion des résultats obtenus sur ces 2 loci
La régulation de ces 2 loci est visiblement indépendante. Alors que l’expression des gènes
codant pour les TBDR XCC1749 et XCC1750-51 est inductible par le monomère d’acide
galacturonique, les gènes TBDR XCC0119 et XCC0120 ne répondent pas du tout à la présence de
ce composé. Par ailleurs, le régulateur du locus XCC0119-XCC0122 (XCC0150) ne régule pas les
gènes du locus XCC1749 (résultats non montrés, obtenus par qRT-PCR), et inversement, le
112
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
régulateur de certains gènes du locus XCC1749-XCC1759 (XCC1748) ne régule pas l’expression
du gène XCC0120 (Résultat non montré, obtenu par comparaison de l’activité GUS dans les
souches XCC0120::pVO et ∆XCC1748-XCC0120::pVO). Il semble donc que les 2 loci étudiés
soient impliqués dans des réseaux de signalisation/régulation bien distincts, éventuellement
associés à des étapes différentes du cycle de vie de Xcc. Cette hypothèse a également été formulée
dans les cas des porines KdgM et KdgN d’E. chrysanthemi, toutes deux impliquées dans le
transport d’oligogalacturonides mais codées par des gènes régulés de façon très différente
(Condemine & Ghazi, 2007).
Si l’effort de recherche sur ces loci s’est jusqu’à présent focalisé sur les gènes codant pour
les TBDR, il est à présent nécessaire d’étudier la fonction et la régulation des autres gènes de ces
loci. Quelle(s) activité(s) catalytiques présentent les nombreux enzymes de ces loci ? Dans quelles
conditions s’expriment les gènes qui les codent et sont-t-ils régulés par les même protéines que les
gènes TBDR ? Quelle est leur contribution au pouvoir pathogène de Xcc ? Autant de questions
auxquelles il sera intéressant de répondre dans la suite de ce travail.
Le pouvoir pathogène de nos mutants devra également être étudié plus finement, et ce d’une
part en collaboration avec Angers pour l’étude de la vie épiphyte, et d’autre part en réalisant des
expériences de compétition dans la plante, afin de déterminer si certains gènes (TBDR
notamment) procurent un avantage sélectif à la bactérie lors de son interaction avec la plante.
Quelles sont les molécules transportées par ces systèmes ? Comme cela a été fait pour le
xylane (cf. Article Préliminaire), il est maintenant nécessaire d’étudier l’effet des oligomères
d’acides galacturonique (oligogalacturonides) sur l’expression de nos loci. Cela n’a pas encore été
entrepris en raison des prix prohibitifs du dimère et du trimère dans le commerce. Enfin, ces
molécules pourraient être marquées par fluorescence et être utilisées dans des expériences de
transport chez la souche sauvage de Xcc et chez nos différents mutants ; de telles expériences
devraient permettre de déterminer si les TBDR présentent une spécificité de reconnaissance et/ou
de transport de molécules de différentes tailles. L’étude du transport dans les double mutants
∆XCC0119-20 et ∆XCC1749-1750-51, ainsi que dans le quadruple mutant ∆XCC0119-20
∆XCC1749-1750-51, devrait notamment fournir des informations importantes pour l’étude
fonctionnelle de ces loci. Le mutant ∆XCC1749-1750-51 est disponible et le mutant ∆XCC011920 est à construire.
113
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
II. Etude de loci potentiellement impliqués dans l’utilisation du
xylane chez Xanthomonas campestris pv. campestris
Cette partie de ma thèse est rédigée sous la forme d’un article préliminaire présenté ci-après.
114
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
XCC4101, a repressor controlling the expression of the major xylanase and the utilization of
small-sized xylo-oligosaccharides in Xanthomonas campestris pv. campestris
Servane Blanvillain,1 Guillaume Déjean,1 Alice Boulanger,1 Martine Lautier,1,2 Emmanuelle
Lauber,#1* and Matthieu Arlat#1,2*
1
Laboratoire des Interactions Plantes-Microorganismes, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)/Institut
National de la Recherche Agronomique (INRA) UMR2594/441, Castanet-Tolosan, France
2
Université Paul Sabatier, Toulouse III, Toulouse, France
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Contributed equally.
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be
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E-mail:
[email protected]
(EL);
E-mail:
[email protected] (MA)
INTRODUCTION
Plant cell wall plays a dual role in plant-pathogen interactions: although it represents a
physical barrier to the pathogens, its components serve as carbohydrates storage for them.
Degrading the plant cell wall is one of the first difficulties that phytopathogenic microorganisms
have to meet when they invade plants with the aim to multiply and start an infectious cycle. To
that purpose, they secrete a number of hydrolytic enzymes capable of degrading cell-wall
polymers, which enable them to invade the plant tissue and feed on the released nutrients (Walton,
1994). In addition to this metabolic function, fragments of the wall, called oligosaccharins (Darvill
et al., 1992 ; Darvill et al., 1994), which result from normal plant metabolism or pathogen attack,
have a variety of signalling functions: they act as “elicitors”, which means that they stimulate
plant defense responses by inducing ethylen synthesis, phytoalexin production and secretion of
specific enzymes against the pathogen [for review, see (Garcia-Brugger et al., 2006)]. The
fragments of the pathogen can also act as oligosaccharins for the plant to further induce its defense
mechanisms. Cytoplasmic calcium levels increase, thus causing an oxidative burst which produces
active oxygen species that attack the pathogen directly, or cause increased cross-links in the cell
wall, making it harder to penetrate (Grant & Loake, 2000). On the other side, the pathogen secrete
enzymes able to degrade the oligosaccharin signals, which would reduce plant responses against
the pathogen and thus indirectly increase the virulence of the pathogen. In Ralstonia
solanacearum, the extracellular polygalacturonase PehC may degrade galacturonide elicitors of
115
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
host defense, thereby protecting the bacteria from plant antimicrobial responses (González &
Allen, 2003).
Xylan is the predominant hemicellulose in the cell wall of plants and the second most
abundant polysaccharide on earth. It is a complex, highly branched heteropolysaccharide, which
varies in structure between different plant species. Several cooperatively acting enzymes are
involved in its breakdown. Endo-β-1,4-xylanases (EC 3.2.1.8) play a key role in the degradation
of this polysaccharide: they catalyze the initial breakdown of xylan by hydrolyzing internal β-1,4
bonds in the polymer backbone, yielding short xylo-oligomers (mainly xylobiose, the building
block of xylan). Most known xylanases belong to Glycoside Hydrolase families 10 and 11 (GH10
and GH11), but a few xylanases are also classified into families 5, 7, 8 and 43 (Beliën et al., 2006;
Collins et al., 2005). The xylanases of these families differ not only in the protein fold, but also in
substrate specificity and reaction mechanism (Collins et al., 2005). The major difference between
GH10 and GH11 resides in the fact that GH11 endoxylanases are usually more selective and
release larger oligosaccharides than GH10 xylanases, since substituents represent a more serious
hindrance to their activity (Biely et al., 1997). Endoxylanases are known to be important
components of the offensive arsenal of plant pathogens: the virulence of at least one Xanthomonas
strain, Xanthomonas oryzae pv. oryzae, which causes rice blast disease, is dependent on the ability
to secrete xylanase (Ray et al., 2000). These enzymes are also strong elicitors of plant defense
responses [for review, see (Beliën et al., 2006)]. The xylobiose and other short oligomers released
during xylan degradation are further hydrolyzed by exo-β-1,4-D-xylosidases (β-xylosidases, EC
3.2.1.37) into single xylose units, a primary carbon source for plant cell metabolism as well as
pathogen metabolism.
The xylan backbone chain of 1,4-linked β-D-xylopyranosyl units is modified with various
side chains, including 4-O-methyl-D-glucuronic acid, acetic acid and L-arabinofuranose residues
that may be esterified with phenolic substitutions of p-coumaric acid or ferulic acid. The
abundance and linkage types of these substitutions vary between xylans from different sources.
For example, a comparatively large amount of arabinose is contained in oat spelt xylan but little
glucuronic acid, and vice versa in birch wood xylan (Miyazaki et al., 2005). These side chains are
cleaved by α-D-glucuronidases (EC 3.2.1.139), acetyl-xylan-esterases (EC 3.1.1.72), and α-Larabinofuranosidases (EC 3.2.1.55), respectively. p-coumaric acid and ferulic acid substitutions
are hydrolyzed by p-coumaric acid esterases (EC 3.1.1.-) and ferulic acid esterases (EC 3.1.1.73),
respectively [for review, see (Shallom & Shoham, 2003) and (Collins et al., 2005)].
116
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
For bacterial pathogens, hydrolytic enzymes are not the only key components for a
successful infection. To enter the metabolic pathway and/or the signalisation cascades of
virulence, the released nutrients have to be transported across bacterial membranes and further
degraded in the cytoplasm. At the genetic scale, these different steps are very thinly regulated
during the infection process; the genes involved in nutrient transport and degradation are under the
control of regulators which allow or prevent their transcription according to the nutrient status in
the environment (Cases et al., 2003).
Xanthomonas campestris pv. campestris, the bacterial agent of black rot of crucifers, has
evolved powerful strategies to adapt itself to the host plant and take advantage of the nutrients. In
the genome, the over-representation of the TonB-Dependent receptor (TBDR) family and the
presence of numerous CUT loci (Carbohydrate Utilization containing TBDR loci), confers the
ability to scavenge plant carbohydrates (Blanvillain et al., 2007). These loci are composed of
TonB-dependent
receptors,
inner
membrane
transporters,
degrading
enzymes
and/or
transcriptional regulators. The Xcc sux CUT locus has been studied in details; this cluster, made of
four genes (a TBDR for the transport across the outer membrane, an inner membrane transporter,
an amylosucrase and a LacI family repressor), enables Xcc to transport and metabolize sucrose
(the main sugar present in higher plants) at very low concentrations, with a very high efficiency.
The importance of such a system is highlighted by the fact that this locus is required for full
virulence of the bacteria on Arabidopsis thaliana.
In Xcc genome, we identified 2 TBDR genes (XCC2828 and XCC4120) whose expression is
induced in the presence of xylan and xylose. Interestingly, in addition to these compounds,
XCC4120 and XCC2828 are also submitted to regulation by arabinose (Blanvillain et al., 2007).
XCC4120 belong to a potential CUT locus involved in xylan utilization; however, no regulatory
gene lies within this cluster. XCC4120 and XCC2828 show significant similarities with 2 TBDR
genes of Caulobacter crescentus, i.e. CC0999 and CC2832 respectively, which have also been
shown to be xylose-induced (Hottes et al., 2004). It is worth noting that the 20-bp palindromic
motif conserved upstream of genes of the C. crescentus xylose regulon was also partially found
upstream XCC2828 and XCC4120 (Blanvillain et al., 2007 ; Hottes et al., 2004).
In the present work, we characterize the transcriptional regulator of the XCC4120 and
XCC2828 loci, and better define the nature of the xylan-derived inducing signal. This study also
reports investigations into the functionality of the XCC4120 locus.
117
Table Ar-1: List of plasmids and bacterial strains used or generated in this study.
Plasmids
pVO155
pFAJ1700
Xcc sequence cloned
relative to the putative
start codon
Features
pUC119 derivative, containing the promoterless gus (uidA ) reporter gene encoding βglucuronidase, used for insertion mutagenesis; KmR AmpR
pTR102-derived expression vector, containing a multiple cloning site and transcriptional
terminators in both orientations; TetR AmpR
Reference
Oke and Long (1999)
Huynh et al. (1989)
pCZ750
pFAJ1700 containing the Kpn I-Asc I lacZ gene from the pCZ367 plasmid; TetR AmpR
Blanvillain et al. (2007)
pCZ917
pFAJ1700 containing LacI, the pTaq propoter; multiple cloning sites and the T7 terminator
(Fse I-Asc I fragment from pSC150); TetR AmpR
This study
pPr-XCC2828
pCZ750-prXCC2828 ; TetR AmpR
from - 1100 to +1
This study
pPr-XCC4120
pCZ750-prXCC4120 ; TetR AmpR
from - 1100 to + 1
This study
pL-XCC4101
pCZ917-XCC2828 ; TetR AmpR
from - 28 to + 1086
This study
R
R
pL-XCC4118
pCZ917-XCC4120 ; Tet Amp
from - 30 to + 993
This study
Strains
Genotype and/or phenotype
Location of insertion or
deletion relative to the
putative start codon
Reference
Xcc568
Wild-type strain; Rifampycin resistant strain derivative of Xanthomonas campestris pv.
campestris LMG568/ATCC33913
XP038
XCC2828 ::pVO155; RifR KmR
Blanvillain et al. (2007)
XP068
XCC4120 ::pVO155; RifR KmR
Blanvillain et al. (2007)
XP108
XP109
XP110
XP111
XP112
XP113
XP114
R
R
+ 538 to + 743
This study
R
R
+ 78 to + 364
This study
R
R
+ 121 to + 409
This study
R
R
+ 171 to + 463
This study
R
R
+ 87 to + 382
This study
XCC4101 ::pVO155; Rif Km
XCC4118 ::pVO155; Rif Km
XCC4119 ::pVO155; Rif Km
XCC4121 ::pVO155; Rif Km
XCC4122 ::pVO155; Rif Km
R
R
R
R
R
R
This study
Xcc 568 (pPr-XCC2828 ); Rif Tet Amp
This study
Xcc 568 (pPr-XCC4120 ); Rif Tet Amp
XP115
R
XCC4101 ::pVO (pPr-XCC2828 ); Rif Km Tet Amp
This study
XP116
XCC4101 ::pVO (pPr-XCC4101 ); RifR KmR TetR AmpR
This study
XP117
∆XCC2828 ; Rif
XP118
∆XCC4120 ; Rif
XP119
∆XCC2828 ∆XCC4120 ; Rif
XP120
∆XCC2828 XCC4120 ::pVO (pPr-XCC4120 ); Rif Km Tet Amp
XP121
XP122
R
R
R
R
R
R
from +1 to + 3144
This study
from +1 to + 2883
This study
This study
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
This study
This study
Xcc 568 (pL-XCC4101 ); Rif Tet Amp
This study
Xcc 568 (pL-XCC4118 ); Rif Tet Amp
R
R
R
R
This study
XP124
R
R
R
R
XCC4101 ::pVO (pL-XCC4118 ); Rif Km Tet Amp
This study
XP125
XCC4118 ::pVO (pL-XCC4118 ); RifR KmR TetR AmpR
This study
XP123
XP126
XCC4101 ::pVO (pL-XCC4101 ); Rif Km Tet Amp
R
R
R
R
XCC4119 ::pVO (pL-XCC4118 ); Rif Km Tet Amp
This study
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
METHODS
Bacterial strains, plasmids and growth conditions
The Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) strains and plasmids used in this study
are listed in Table Ar-1. Xcc cells were grown in MOKA rich medium (Yeast extract 4g/L,
Casamino Acids 8g/L, K2HPO4 2g/L, MgSO4,7H2O 0,3g/L) or in MME minimal medium
(Casamino Acids 8g/L, K2HPO4 10,5g/L, KH2PO4 4,5g/L, (NH4)2SO4 1g/L, MgSO4,7H2O 0,3g/L)
with the appropriate antibiotics as described in (Blanvillain et al., 2007). Escherichia coli cells
were grown at 37°C on LB medium.
Construction of Xanthomonas campestris pv. campestris mutants
Insertion mutants were constructed using the suicid plasmid pVO155 (Oke & Long, 1999).
Oligonucleotide primers used for PCR amplification are listed in Table Ar-2B. Amplicons were
300 bp in average. Location of insertions are indicated in Figure Ar-1. Deletion mutants in
XCC2828 and XCC4120 were constructed using the cre-lox system adapted from Marx and
colleagues (Angot et al., 2006 ; Marx & Lidstrom, 2002). Genes have been deleted from Start to
Stop codons using the primers listed in Table Ar-2B.
Plasmid constructions
The XCC2828 and XCC4120 promoter regions (see Figure Ar-1) were PCR amplified with
appropriately designed primers (Table Ar-2A). These promoter regions were cloned as HindIIIXbaI fragments, into the pCZ750 plasmid (Blanvillain et al., 2007), giving rise to pPr-XCC2828
and pPr-XCC4120, respectively. The XCC4101 and XCC4118 genes were amplified by PCR using
appropriately designed primers (Table Ar-2A). The corresponding PCR products were cloned as
HindIII-XbaI fragments into pCZ917, a pFAJ1700 derivative expression vector containing LacI,
the pTaq promoter, multiple cloning sites and the T7 terminator from pSC150 (Cunnac, 2003 ;
Dombrecht et al., 2001).
Expression studies
β-galactosidase and β-glucuronidase assays : bacterial cultures in the appropriate medium
were harvested at different time points and β-galactosidase or β-glucuronidase assays were
performed as previously described (Blanvillain et al., 2007).
Quantitative RT-PCR (qRT-PCR) were performed as previously described (Blanvillain et
al., 2007). Oligonucleotide primers used for quantitative-PCR amplification will be provided upon
request. As a control for real-time PCR, we used the 16S rRNA as previously described
(Blanvillain et al., 2007).
118
Table Ar-2: Oligonucleotide primer pairs used for promoter or gene cloning (A) or insertion or deletion mutagenesis
(B). Restriction sites are shown in red and stop codons are shown in green. Underlined sequenced are tags
designed for further amplification. L, left; R, right.
A. Cloning
Genes
Promoters
Primer L
Primer R
pPr-XCC2828
TACGAAGCTTTAGGCGCCAGCACCGCCG
TACGTCTAGAACCGTATTGAACTGCGGGCC
pPr-XCC4120
TACGAAGCTTGCCGCTGCACAGCAAGCCA
TACGTCTAGATGGTCTTGGTGAAGCTGGTG
pL-XCC4101
TACGAAGCTTTAGTTCGTCAGCCATTTGAAGAG
TACGTCTAGATTACGGCCCGGCGGAGGGCT
pL-XCC4118
TACGAAGCTTTAGCTCCCGCCACGCACCCCTGA
TACGTCTAGATCACGGCGCACGCACGCCAG
B. Mutagenesis
Insertions
Primer L
Primer R
XCC4101 ::pVO155
GGTTCCACGTAAGCTTCCAAATCACCGAGCATCTGAT
GCGCTAGTCAGTTAGCAGTTGCGTGCGAGCAATTTTT
XCC4118 ::pVO155
TACGGGATCCGCGGGTGCGTCCAAGTTCCT
TACGTCTAGAGCGGCAAACCATTGCTCGAT
XCC4119 ::pVO155
TACGGGATCCGGCAACGCGTACAAGGCATT
TACGTCTAGACACAGCAAGCCAAGCGCATA
XCC4121::pVO155
TACGGGATCCCTGCTGGGCGCATTTGTGTT
TACGTCTAGAAAGCGATACGCCGACAAACT
XCC4122::pVO155
TACGGGATCCGACCCGTCCGCGCACGTGTT
TACGTCTAGAACCGCCACGCCAATCTGAAA
Upstream fragment
Deletions
Primer L
Primer R
∆XCC2828
TACGGAATTCTTTTTCCTGACGGCACGC
TACGCCATGGCTACCTACGTACGACGCATCGATGT
∆XCC4120
TACGGGTACCGGCAGTGGCCAGGCCGAT
TACGGCGGCCGCCTAACGTAATCCCTTCCCTATCAG
Downstream fragment
Primer L
Primer R
∆XCC2828
TACGTACGTATAGGTAGCCGCGGATGGGGCGCAG
TACGGAGCTCGATACGGGCTATGACCG
∆XCC4120
TACGGGGCCCTAGGTGTTGCCGTCACCGGTC
TACGGAGCTCATCCTGCGGCCACTGCAGT
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
Plate assays for detection of xylanase activity
The plate assay for xylanase activity was performed using MME-agar plates containing
0,1% RBB-xylan (Sigma) and 0,1 mM IPTG when needed. Overnight cultures of Xcc strains in
Moka medium were centrifuged. Pellets were resuspended in MME medium and the OD600 was
adjusted to 4. Five microliters of bacterial suspension were spotted on plates which were
incubated at 30°C. The detection of xylanase activity was examined periodically by checking the
halo against the blue background.
Pathogenicity tests
Pathogenicity tests were conducted on Arabidopsis thaliana Sf-2 ecotype as previously
described (Blanvillain et al., 2007 ; Meyer et al., 2005).
[14C]xylose transport experiments
[14C]xylose transport assays were conducted as previously described for [14C]sucrose
transport assays (Blanvillain et al., 2007). [14C]xylose (Amersham Biosciences, specific activity
of 3,15 GBq/mmol) was added to a final concentration of 0.5 µM.
In silico analysis
Location of the signal sequence responsible for protein export across the bacterial inner
membrane localization was determined using the SignalP 3.0 server (Bendtsen et al., 2004)
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) or the PSORTb server (http://www.psort.org/psortb/
index .html) with default parameters for Gram-negative bacteria.
The MotifSampler program (Thijs et al., 2001; Thijs et al., 2002) was used to identify a
motif corresponding to the Xcc X-box upstream of the 2 xylose-induced TBDR genes.
MotifScanner program (Thijs et al., 2002) or the PatScan pattern matcher software (Dsouza et al.,
1997) were used with the identified motif to locate all the putative X-boxes in the Xcc genome.
RESULTS
Identification of a motif putatively related to xylan utilization in Xanthomonas campestris pv.
campestris
As XCC4120 and XCC2828 are both the first gene of putative operons (Figure Ar-1A and
Ar-1B), the DNA regions located upstream these two genes were analyzed. This study allowed the
identification of a single significant 14-bp palindromic motif (TGNTAGCGCTANCA) perfectly
119
Table Ar-3: Candidate X-boxes identified in the promoter regions of Xanthomonas campestris pv.
campestris. Genes matching perfectly to the X-box consensus sequence TGNTAGCGCTANCA are grey
shadowed and genes having an imperfect X-box are not shadowed.
Gene ID
a
Name
a
Putative function
a
Distance from
START codon (bp)
Score
b
Motif
c
XCC4100
d
xylA
xylose isomerase
-109
59367800
TGGTAGCGCTAACA
XCC4120
d
cirA
TonB dependent receptor
-185
59367800
TGGTAGCGCTAACA
XCC4119
d
exuT
Hexuronate transporter
+1
?
TGGTAGCGCTATCA
XCC2828
fecA
TonB dependent receptor
-269
40307300
TGTTAGCGCTATCA
XCC1217
hrpF
translocator of effector proteins
-459
34648.5
TGTTACCTCTACCA
hypothetical protein
-291
8934.93
TGTCAGCGCTAGCA
TonB dependent receptor
-411
7749.68
TGGTAACGCTTACA
hypothetical protein
-105
5164.09
CGGTAGCGATACCA
chemotaxis protein
-147
3272.13
AGATAGCGCTACCT
histidine kinase/response regulator hybrid protein
-554
1115.21
TAATAGCGCGATCA
XCC1206
XCC2828
fecA
XCC1807
XCC1727
d
mcpA
XCC1652
XCC3043
bfeA
TonB dependent receptor
-104
482.471
TTCTAGCGTTAACA
XCC1838
avtA
valine-pyruvate aminotransferase
-55
129.753
TGGCAGCGCAATCA
hypothetical protein
-21
39.1543
TGGTACAGCTTCCA
XCC1253
a
Gene identification (ID), name and putative function from Xanthomonas campestris pv. campestris strain ATCC33913 as reported
by da Silva et al. (2002).
b
Score values have been obtained with the MotifScanner program. ? designates that the XCC4119 gene has not been identified by
the MotifScanner program, thus preventing us to provide a score for the corresponding X-Box.
c
Matches to the X-box consensus sequence TGnTAGCGCTAnCA determined in this study appear in boldface.
d
Genes predicted by Hottes et al . (2004) to have a motif similar to the Caulobacter crescentus xylose-box
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
conserved upstream XCC2828, XCC4119 and XCC4120. We postulate that this motif corresponds
to a possible motif related to xylan utilization and we named it X-box. Although shorter, this motif
is similar to the putative 20 bp xylose-induction motif found upstream xylose-regulated genes in
Caulobacter crescentus (Hottes et al., 2004).
We then explored Xcc intergenic regions to detect putative X-boxes in the genome, using
the MotifScanner program or the PatScan pattern matcher software (see Methods). This analysis
identified a fourth gene having the perfect 14-bp palindromic motif in its upstream region:
XCC4100, encoding a xylose isomerase, thus reinforcing the validity of our X-box consensus
sequence. Moreover, we identified 9 genes showing imperfect X-boxes in their promoter regions
(Table Ar-3). Among the 13 Xcc genes displaying a putative X-box, 4 (XCC1727, XCC4100,
XCC4102 and XCC4119/XCC4120) had already been predicted previously as the strongest
occurrences upstream Xcc genes of the putative C. crescentus 20 bp xylose-induction motif
(Hottes et al., 2004). The XCC2828 TBDR was not identified in this former study.
Interestingly, as observed by Hottes and colleagues (2004), XCC4100 is located close to
other enzymes potentially involved in xylan degradation (XCC4102 encoding an α-glucuronidase,
XCC4103 encoding an acetylesterase, and XCC4105 encoding an α-L-arabinofuranosidase)
(Figure Ar-1C). This 6 gene cluster also comprises one gene, XCC4101, encoding a transcriptional
repressor of the LacI family (Figure Ar-1C). Thus, this regulator was a good candidate for the
regulation of xylan utilization in Xcc.
XCC4101 represses a system of three loci, each containing a perfect X-box
Proteins of the LacI/GalR family are well-studied transcriptional repressors that typically
mediate inducible regulation of operons involved in carbon metabolism (Weickert & Adhya,
1992).
In order to assess whether the XCC4101 repressor has a role in the regulation of xylose
utilization, we constructed an insertion mutant in this gene using the suicid vector pVO155 (see
Methods). We tested whether this protein regulates the expression of the 2 xylan and xyloseinduced TBDR genes (XCC2828 and XCC4120), by monitoring their expression by qRT-PCR in
the XCC4101 mutant background as compared to the wild-type strain. As LacI family regulators
repress transcription in the absence of the effector molecules (Weickert & Adhya, 1992), bacterial
strains were cultivated in non-supplemented minimal medium.
As presented in Figure Ar-2, the results obtained show that XCC2828 and XCC4120 are
over-expressed in an XCC4101 mutant, suggesting a negative control of these TBDR genes by
XCC4101.
120
XCC4101 locus
XCC2828 locus
XCC4120 locus
Table Ar-4: In silico analysis of the putative Xanthomonas campestris pv. campestris enzymes present in the 3 loci studied and represented on Figure Ar-1 (the XCC4120, the XCC2828 and the XCC4101 loci), and of the other
enzymes widespread in the genome and putatively involved in xylan utilization according to the putative function assigned to these genes by da Silva et al . (2002). This table focuses on the proteic domains and the presence or
absence of a signal sequence. According to these analyses, we propose a reannotation of 4 genes, whose corresponding lign is grey shadowed. Putative endo-1,4-β-xylanases are green shadowed. Putative a-Larabinofuranosidases are yellow shadowed. Putative xylose isomerases are turquoise shadowed. The putative xylulokinase is red shadowed. The putative β-1,4-xylosidase is dark blue shadowed.
aa, amino acid; ?, information not found; nc, not checked; hyp. prot., hypothetical protein; Pfam, Protein family; CAZy, Carbohydrate Active Enzymes; nrC, not referenced in the CAZy database; COG, Cluster of Orthologous
Groups; EC, Enzyme Commission (number assigned by the International Union of Pure and Applied Chemistry and the International Union of Biochemistry and Molecular Biology.
Gene ID
Putative function a
Protein
length
(aa)
Pfam domain(s) b
CAZy family c
COG number b
EC
number b
Proposed function
Catalyzed reaction
Signal sequence d
Reannotation ?
XCC4115
endo-1,4-β-xylanase
385
pfam00331.13
GH 10
COG3693.2
EC: 3.2.1.8
endo-β-1,4-xylanase
Endohydrolysis of 1,4-β-D-xylosidic linkages in xylans
between aa 16 and 17: ASA-AC
no
XCC4116
β-galactosidase
963
pfam02837, pfam02836
GH 2N (sugar binding
domain), GH2C (TIM
barrel domain)
COG3250.2
EC: 3.2.1.23
β-galactosidase
Hydrolysis of terminal non-reducing β-D-galactose
residues in β-D-galactosides
no
nc
XCC4117
glucuronate isomerase
471
pfam02614.13
nrC
COG1904.2
EC: 5.3.1.12
glucuronate isomerase
D-glucuronate <=> D-fructuronate. Also converts Dgalacturonate into D-tagaturonate.
no
no
XCC4118
xylanase
330
pfam00331.13
GH 10
COG3693.2
EC 3.2.1.8
endo-1,4-β-xylanase
Endohydrolysis of 1,4-β-D-xylosidic linkages in xylans
between aa 22 and 23: AQA-AP
no
XCC4122
xylosidase/arabinosidase
344
pfam04616.7
GH 43
COG3507.2
EC 3.2.1.55
α-Larabinofuranosidase
Hydrolysis of terminal non-reducing α-Larabinofuranoside residues into α-L-arabinosides
no
no
XCC2829
peptidase
560
pfam01433.13
nrC
COG0308.2
?
peptidase
no
no
XCC2827
hyp. prot. (SapC family)
313
pfam07277.3
nrC
nc
nc
nc
no
nc
XCC2826
hyp. prot. (Transcription factor
jumonji/aspartyl β-hydroxylase /
Pass1-related protein)
343
pfam07277.3
nrC
nc
nc
nc
no
nc
XCC2825
tryptophan halogenase
498
pfam04820.7
nrC
nc
nc
nc
no
nc
XCC4100
xylose isomerase
446
pfam01261.13
nrC
COG2115.2
EC 5.3.1.5
xylose isomerase
D-xylose <=> D-xylulose
no
no
XCC4102
α-glucuronidase
739
pfam07488 (central domain),
pfam07477 (C-terminal domain),
pfam03648 (N-terminal domain)
GH 67
COG3661.2
EC 3.2.1.139
α-glucuronidase
α-D-glucuronoside + H2O <=> alcohol + D-glucuronate
between aa 42 and 43: AHA-EN (if
start codon not reannoted)
4 different Start
codons possible
XCC4103
sialic acid-specific 9-Oacetylesterase
654
pfam02837.13
GH 2
?
EC: 3.1.1.53
sialate Oacetylesterase.
N-acetyl-O-acetylneuraminate + H2O <=> Nacetylneuraminate + acetate
between aa 24 and 25: AAA-AD
no
XCC4105
xylosidase/arabinosidase
556
pfam04616.7
GH 43
COG3507.2
EC 3.2.1.55
α-Larabinofuranosidase
Hydrolysis of terminal non-reducing α-Larabinofuranoside residues into α-L-arabinosides
between aa 11 and 12, or between
aa 21 and 22
?
XCC4106
glucan 1,4-β-glucosidase
896
pfam07691.1 5c (C-terminal
domain) pfam07691.1
GH 3
COG1472.2
EC: 3.2.1.21
β-glucosidase
Hydrolysis of terminal, non-reducing β-D-glucose
residues with release of β-D-glucose
between aa 33 and 34: THA-AT
no
XCC4107
mannitol dehydrogenase
487
nrC
COG0246.2
EC 1.1.1.57
fructuronate reductase
D-mannonate + NAD+ <=> D-fructuronate + NADH
no
no
pfam01232.13 (Rossmann
domain), pfam08125.1 (C-terminal
domain)
Other Xcc enzymes putatively involved in xylan utilization
a
XCC0144
xylanase
329
pfam07859.1, pfam00326.13
pfam00135.13
CE 10
COG0657.2,
COG0400.2,
COG1506.2
?
esterase / lipase
XCC0149
xylosidase/arabinosidase
526
pfam04616.7
GH 43
COG3507.2
EC: 3.2.1.55
α-Larabinofuranosidase
XCC0857
xylanase
405
pfam02055.13
GH 30 (but nrC)
COG5520.2
?
O-glycosyl hydrolase
XCC1178
xylosidase/arabinosidase
549 (+13 aa
extension)
pfam04616.7 (and troncated
pfam02435.13)
GH 43 (and troncated
GH 68)
COG3507.2
EC: 3.2.1.55
α-Larabinofuranosidase
XCC1755
α-xylosidase
967
pfam01055.13, pfam07691.1
GH 31
COG1501.2
EC 3.2.1.20
XCC1757
D-xylulokinase
497
pfam00370.13, pfam02782.13
nrC
COG1070.2,
COG1069.2,
COG0554.2
XCC1758
xylose isomerase
446
pfam01261.13
nrC
XCC2398
xylosidase/arabinosidase
503 (+11 aa
extension)
pfam04616.7
GH 43
XCC2399
hypothetical protein
1445
pfam07532.1
XCC3038
xylanase
339 (-15 aa
removal)
many pfam numbers
CE 10
many COG
numbers
?
esterase / lipase
XCC3975
β-xylosidase
521
pfam01229.13
GH 39
COG3664.2
EC 3.2.1.37
β-1,4-xylosidase
XCC4064
xylosidase
544
pfam04616.7
GH 43
COG3507.2
EC: 3.2.1.55
α-Larabinofuranosidase
between aa 15 and 16: AAA-AP
no
between aa 26 and 27: ATA-AD
no
between aa 24 and 25: AAA-QT
no
Hydrolysis of terminal non-reducing α-Larabinofuranoside residues into α-L-arabinosides
between aa 15 and 16: AMA-GT
(not detected with psort)
Yes (13 aa
extension)
α-glucosidase
Hydrolysis of terminal, non-reducing 1,4-linked α-Dglucose residues with release of α-D-glucose
between aa 14 and 15: AYA-QE
no
EC 2.7.1.17
D-xylulokinase
ATP + D-xylulose <=> ADP + D-xylulose 5-phosphate
no
no
COG2115.2
EC 5.3.1.5
xylose isomerase
D-xylose <=> D-xylulose
no
no
COG3507.2
EC: 3.2.1.55
α-Larabinofuranosidase
Hydrolysis of terminal non-reducing α-Larabinofuranoside residues into α-L-arabinosides
between aa 10 and 11: ACA-AM, or
between aa 19 and 20
Yes (11 aa
extension)
between aa 33 and 34: ASA-GT
no
between aa 25 and 26: ARA-WL
Yes (15 aa
removal)
Hydrolysis of β-1,4-D-xylans, to remove successive Dxylose residues from the non-reducing termining end
between aa 21 and 22: ASA-QP
no
Hydrolysis of terminal non-reducing α-Larabinofuranoside residues into α-L-arabinosides
between aa 36 and 37: AAA-CG, or
between aa 30 and 31
no
Hydrolysis of terminal non-reducing α-Larabinofuranoside residues into α-L-arabinosides
N-terminal homologies with several xylosidases/arabinosidases
according to da Silva et al. , 2002.
b
infomations collected on the Xcc genome sequences available at NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=genome&cmd=Retrieve&dopt=Overview&list_uids=240) or at the Toulouse genopole(http://bioinfo.genopoletoulouse.prd.fr/annotation/ iANT/bacteria/xancp/index.html).
c
according to the CAZy database (http://www.cazy.org/).
d
according to the SIgnalP application (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) and/or the psort application (http://www.psort.org/psortb/index.html).
A
∆XCC4120
XCC4118::pVO XCC4119::pVO XCC4120::pVO
4115
4116
β-galactosidase
Xylanase
4118
4117
Isomerase
4119
Xylanase
XCC4121::pVO
4121
XCC4120
TonB-dependent receptor
Hexuronate
transporter
XCC4122::pVO
4122
Xylosidase /
Arabinosidase
Transporter
pPr-XCC4120
pL-XCC4118
B
∆XCC2828
XCC2828::pVO
2829
2827
XCC2828
Peptidase
TonB-dependent receptor
Hyp. Prot.
2826
Hyp. Prot.
2825
Tryptophan halogenase
pPr-XCC2828
C
XCC4101::pVO
4099
Hyp. Prot.
4100
Xylose
isomerase
4101
Repressor
XCC4102
α-glucuronidase
4103
Sialate Oacetylesterase
4104
4105
Starvation sensing Xylosidase /
protein
Arabinosidase
4106
β-glucosidase
pL-XCC4101
Figure Ar-1: Genetic organization of the Xanthomonas campestris pv. campestris XCC4120 locus (A), the
XCC2828 locus (B), and the XCC4101 locus (C). Putative functions are indicated beneath each gene. Location of
mutations are indicated above the map : vertical white arrowheads indicate pVO155 insertions and deleted
sequences are represented by horizontal dotted bars. Regions cloned in plasmids are indicated below each map :
horizontal thick black bars indicate sequences used for plasmid constructions. Perfect X-boxes are schematized by a
black diamond. Genes repressed by XCC4101 in minimal medium (see Figure Ar-2) are grey-shadowed.
B
A
C
Expression level (Arbitrary units)
Expression level (Arbitrary units)
120
105
90
75
60
45
30
15
Expression level (Arbitrary units)
140
120
100
80
60
40
20
0
0
XCC4115 XCC4116 XCC4117 XCC4118 XCC4119 XCC4120 XCC4121 XCC4122
WT
105
90
75
60
45
30
15
0
XCC2828 XCC2827 XCC2826 XCC2825
XCC4100
XCC4101::pVO
Figure Ar-2: Expression levels of Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) genes of the loci schematized
Figure Ar-1. (A) Genes of the XCC4120 locus. (B) Genes of the XCC2828 locus. (C) Expression level of the
XCC4100 xylose isomerase gene of the XCC4101 locus. Real-time quantitative RT-PCR (qRT-PCR) were
performed in three independent experiments, on RNA extracted from the wild-type strain (WT) or an XCC4101
insertion mutant (XCC4101::pVO) cultivated 6 hours in minimal medium. Calculation of relative expression
includes normalization against the endogenous control gene 16S RNA.
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
Genes surrounding the XCC4120 TBDR gene are likely to form a partial CUT locus
probably involved in xylan metabolism (Blanvillain et al., 2007) (Figure Ar-1A). Thus, the
expression of the genes of this locus, as well as the XCC2828 downstream genes, was also
examined. We showed that XCC2825 to XCC2828, and XCC4116 to XCC4122, are strongly
repressed by XCC4101 (Figure Ar-2A and Ar-2B). Surprisingly, XCC4115, encoding an endo-1,4β-xylanase, does not seam to belong to the XCC4101 regulon (Figure Ar-2A).
The same experiment was conducted on the genes located beside the repressor; as expected,
XCC4100, encoding a xylose isomerase having a perfect X-box in its upstream region, is also
negatively regulated by XCC4101 (Figure Ar-2C). Despite the presence of an imperfect X-box
between XCC4101 and XCC4102, XCC4101 was not found to be auto-regulated (data not shown).
The oligonucleotide primer pairs used for real-time amplification of this gene were designed
upstream the pVO155 insertion site. Furthermore, the expression of XCC4102 to XCC4106 is not
altered by a mutation in the XCC4101 gene (data not shown).
To determine whether XCC4101 is a central regulator of xylan metabolism in Xcc, genes
encoding xylan hydrolyzing enzymes were examined. Although genomic annotation has predicted
nearly 17 genes that putatively encode xylan-degrading enzymes in the Xcc genome, biological
function of all of these genes had not been experimentally elucidated. A study of CAZy and EC
number of these genes allowed 5 major reannotations (see Table Ar-4). It is worth noting that,
although da Silva and collegues (2002) predict five xylanases in the Xcc proteome, we only
predict two members displaying the typical features of xylanase proteins: XCC4115 and
XCC4118. The expression of the genes putatively involved in xylan metabolism was analyzed in
the wild-type background as compared to the XCC4101 insertion mutant. None of them were
found to be repressed by XCC4101 (data not shown).
Altogether, these results suggest that XCC4101 controls the expression of the genes forming
the XCC2825 to XCC2828 locus, the genes forming the XCC4116 to XCC4122 partial CUT locus,
and the gene located in its own upstream region, XCC4100. Its repressor activity seems to be
strictly dependent on the presence of a perfect X-box in the promoter region of the regulated
genes.
XCC4118 is the major Xcc β -1,4-xylanase in vitro
As an insertion mutant in XCC4101 overexpresses the XCC4118 endo-1,4-β-xylanase, we
wanted to check whether we could detect an altered xylanase activity for this mutant. To that
purpose, we used 4-O-methyl-D-glucurono-D-xylan dyed with Remazol Brilliant Blue (RBBxylan), a soluble chromogenic substrate commonly used for specific and rapid assays of endo-1,4121
Table Ar-5: β-1,4-xylanase activity of Xanthomonas campestris pv. campestris wildtype (WT) and mutant strains on minimal medium plates containing 0,1% RBB-xylan.
Values represent the (H2-C2)/C2 ratio, where H is the diameter of the halo and C the
diameter of the bacterial colony, measured 4 days after spotting.
Strain
β-1,4-xylanase activity
[(H2 - C2) / C2]
WT
3,5
XCC4101 ::pVO
11,3
XCC4118 ::pVO
0
XCC4119 ::pVO
0
XCC4122 ::pVO
11,0
WT (pL-XCC4101)
2,5
WT (pL-XCC4118)
16,0
XCC4101 ::pVO (pL-XCC4101 )
4,9
XCC4101 ::pVO (pL-XCC4118)
17,1
XCC4118 ::pVO (pL-XCC4118 )
10,9
XCC4119 ::pVO (pL-XCC4118 )
14,1
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
β-xylanases on agar plates (Biely et al., 1985). The decrease of xylan hydrolyzed by xylanase is
detected as a halo against the blue background in the plate, due to hydrolysis of the RBB-xylan.
As expected, the mutant in XCC4101 showed an extended halo as compared to the wild-type
strain (Table Ar-5). We confirmed that this phenotype was the result of a mutation in the
XCC4101 gene by complementation experiments: an halo similar to that of the wild-type was
restored by providing the XCC4101 gene on the pCZ917 plasmid (see Methods) in the XCC4101
insertion mutant. To check whether this phenotype was due to an overexpression of the XCC4118
xylanase, we constructed an insertion mutant in the XCC4118 gene. Mutants in the XCC4119 to
XCC4122 genes were also constructed and assayed for xylanase activity. As presented in Table
Ar-5, a mutant in the XCC4118 xylanase gene was incapable of degrading xylan, as indicated by
the absence of a clear halo for this strain. A halo even larger than that of the wild-type strain was
restored when the XCC4118 gene was supplied in trans on the expression plasmid pL-XCC4118
in an XCC4118 or an XCC4101 mutant. As observed for XCC4118, the XCC4119 mutant did not
show any degradation halo, and we showed that this phenotype was due to a polar effect of the
insertion on XCC4118 gene expression, since when pL-XCC4118 was supplied in trans in the
transporter mutant, a large halo was restored. Altogether, these phenotypic assays suggest that,
among the two β-1,4-xylanases in Xcc, XCC4118 plays a major role in xylan hydrolysis in vitro.
Mutants in the XCC4120 TBDR gene or in the XCC4121 transporter gene show a halo similar to
that of the wild-type strain (data not shown, have to be reproduced). Interestingly, the mutant in
the XCC4122 α-L-arabinofuranosidase showed a larger halo than the wild-type strain,
ressembling to that of the XCC4101 mutant (Table Ar-5). This suggests that XCC4122 has a
repressor activity on xylan degradation, maybe by generating products with inhibitory activity on
XCC4101 and/or on the degradation pathway.
The XCC2828 and XCC4120 TBDR genes are induced by xylose only at high concentrations
The Xcc SuxA TBDR was shown to transport sucrose across the bacterial outer membrane,
this function being particularly crucial at low concentrations of this sugar. Indeed, suxA is
required for its rapid induction at very low concentrations (about 100 µM), whereas passive
diffusion via porins may occur at higher concentrations, thus allowing suxA induction even when
suxA is mutated (Blanvillain et al., 2007).
Using strains XP038 and XP068 containing a pVO155 insertion in XCC2828 and XCC4120
respectively (Blanvillain et al., 2007) and carrying a transcriptional fusion with the promoterless
uidA reporter gene, we performed β-glucuronidase expression assays in presence of different
xylose concentrations. After six hours of incubation, XCC2828 is only induced from 1 mM
122
B
β -glucuronidase activity
β -glucuronidase activity
A
20
16
12
8
4
0
0
0,1
1
5
10
20
100
200
30
24
18
12
6
0
500
0
Xylose concentration (mM)
0,1
1
5
10
20
100
200
500
Xylose concentration (mM)
Figure Ar-3: Expression of the Xanthomonas campestris pv. campestris XCC2828 (A) and XCC4120 (B) TBDR
genes after 6 hours growth in minimal medium containing different xylose concentrations. The pVO155 insertion
mutants in XCC2828 and XCC4120, carrying a transcriptional fusion with the promoterless uidA reporter gene,
were used to monitor XCC2828 and XCC4120 expression. Bars represent the standard deviations calculated from
two different biological repetitions.
β -gqlqctosidase activity (Miller units)
β -galactosidase activity (Miller units)
A
4500
3750
3000
2250
1500
750
0
7000
B
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
WT
XCC4101::pVO
WT
+ pPr-XCC2828
No supplement
XCC4101::pVO
+ pPr-XCC4120
20 mM xylose
0,125% xylan
Figure Ar-4: Expression of the Xanthomonas campestris pv. campestris XCC2828 (A) and XCC4120 (B) TBDR
genes in the wild-type strain and in a pVO155 insertion mutant in XCC4101, after 6 hours growth in minimal
medium supplemented or not with 20 mM xylose or 0,125% xylan. The pPr-XCC2828 and the pPr-XCC4120
plasmids containing the promoterless LacZ reporter gene were used to monitor XCC2828 and XCC4120
expression, respectively. Bars represent the standard deviations calculated from two different biological
repetitions.
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
xylose, and XCC4120 induction by xylose begins to be significant only at 5 mM (Figure Ar-3).
These results suggest that the XCC2828 and XCC4120 TBDR might have a higher affinity for
molecules different from xylose.
Xylose is not the XCC4101 effector molecule
We have previously characterized SuxR, the LacI family repressor of the sux CUT locus
allowing sucrose utilization in Xanthomonas campestris pv. campestris. In particular, it was
shown that sucrose transport was greatly enhanced in the suxR mutant, thus confirming the
repressor function of SuxR in sucrose transport (Blanvillain et al., 2007). To assess the
involvement of XCC4101 in xylose utilization, we studied xylose transport in the XCC4101
insertion mutant. The xylose uptake rate in this mutant was similar to the rate observed for the
wild-type strain at any time point checked (data not shown), suggesting that XCC4101 does not
regulates xylose transport into Xcc.
It is well-known that the binding of a LacI family repressor to its effector molecule strongly
reduces its DNA binding affinity, releasing the regulator from the operator and allowing
transcription to proceed (Weickert & Adhya, 1992). To study the regulation of XCC2828 and
XCC4120 by XCC4101 in the presence of xylose, the promoter regions of these two TBDR genes
were cloned upstream of the promoterless lacZ gene in a reporter plasmid (see Methods). The
corresponding plasmids (pPr-XCC2828 and pPr-XCC4120, respectively) were introduced into the
Xcc wild-type strain and into the XCC4101 insertion mutant. These strains were used to perform
β-galactosidase expression assays after 6 hours growth in minimal medium supplemented or not
with 20 mM xylose or 0,125% xylan. The expression pattern obtained is similar for both TBDR
genes: in the wild-type strain, maximal repression by XCC4101 is observed without xylose or
xylan in the medium (Figure Ar-4). The expression level in the XCC4101 mutant is lower in the
presence of xylose than in absence of xylose, probably due to the catabolite repression exerted by
this molecule. In contrast, gene expression in Xcc is not submitted to catabolite repression by
xylan, which the bacteria cannot use as a sole carbon source for growth. In the wild-type strain,
the expression of both TBDR genes is not completely de-repressed by XCC4101 in the presence
of xylose or xylan, confirming that xylose is not the XCC4101 effector molecule. Despite the
different concentrations used (20 mM xylose and 0,125% xylan), the strong induction of
XCC2828 and XCC4120 expression in the presence of xylan suggests that intermediate
compounds could be better inducers than xylose.
123
β -Galactosidase activity (Miller units)
β -Galactosidase activity (Miller units)
A
4500
3600
2700
1800
900
0
WT
B
9000
7500
6000
4500
3000
1500
0
WT
XCC4101::pVO
+ pPr-XCC4120
+ pPr-XCC2828
No supplement
xylobiose
xylose
XCC4101::pVO
xylotriose
xylotetraose
arabinose
glucose
no
x1 x2 x3 x4 xn A G
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
XCC4119
::pVO
no
8
XCC4121
::pVO
7
6
5
4
3
2
1
0
no
x1 x2 x3 x4 xn A
Medium supplement
270
240
210
180
150
120
90
60
30
0
XCC4120
::pVO
no
Medium supplement
G
β -glucuronidase activity
β -glucuronidase activity
Medium supplement
x1 x2 x3 x4 xn A G
β -glucuronidase activity
XCC4118
::pVO
8
XCC4122
::pVO
7
6
5
4
3
2
1
0
no
x1 x2 x3 x4 xn A
Medium supplement
G
x1 x2 x3 x4 xn A G
Medium supplement
β -glucuronidase activity
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
β -glucuronidase activity
β -glucuronidase activity
Figure Ar-5: Expression of the Xanthomonas campestris pv. campestris XCC2828 (A) and XCC4120 (B) genes in the
wild-type strain (WT) and in a pVO155 insertion mutant in XCC4101, after 6 hours growth in minimal medium
supplemented or not with 2 mM xylose, xylobiose, xylotriose, xylotetraose or arabinose. The pPr-XCC2828 and pPrXCC4120 plasmids containing the promoterless LacZ reporter gene were used to monitor XCC2828 and XCC4120
expression, respectively. Bars represent the standard deviations calculated from two different biological repetitions.
160
XCC2828
::pVO
140
120
100
80
60
40
20
0
no
x1 x2 x3 x4 xn A G
Medium supplement
Figure Ar-6: Expression of the Xanthomonas campestris pv. campestris XCC4118 to XCC4122 genes after 6 hours
growth in minimal medium supplemented or not with 2 mM xylose (X1), xylobiose (X2), xylotriose (X3),
xylotetraose (X4), xylan (Xn), arabinose (A) or glucose (G). pVO155 insertion mutants containing the uidA (GUS)
reporter gene were used to monitor the expression of the corresponding genes. Since xylan is a complex mixed
polysaccharide, its concentration in a medium cannot be expressed in molarity. For this experiment, we used the
parameter provided by the manufacturer Sigma Aldrich according to which xylan contain 95% xylose, to ajust its
concentration at « 2 mmole equivalent xylose per liter ». Bars represent the standard deviations calculated from two
different biological repetitions.
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
Small-sized xylo-oligosaccharides are much better inducers of the two TBDR genes than
xylose, and are effector molecules for the XCC4101 repressor
We postulated that intermediate compounds between xylose and xylan (xylooligosaccharides) might be candidate effector molecules for the xylan CUT system. If it is the
case, an effect of these molecules at very low concentrations is expected. To test our hypothesis,
similar expression studies were conducted on the two TBDR genes in the presence of xylobiose,
xylotriose and xylotetraose at a concentration of 2 mM. Very interestingly, the xylose dimer,
trimer and tetramer appeared to be much better inducers than the xylose monomer: the induction
level of the TBDR genes is 4 to 6 fold higher in the presence of these molecules than in the
presence of xylose at the same concentration (Figure Ar-5A, WT background). This difference is
probably not related to general metabolic changes and is likely to be due to a direct effect of these
molecules on gene expression, since no apparent difference was observed in terms of growth rate
when Xcc was grown on xylose or xylooligosaccharides (data not shown).
When looking at the XCC4101::pVO mutant background, we observed that the XCC2828
expression level in the presence of 2 mM xylobiose, xylotriose or xylotetraose was identical to
that obtained in the wild-type strain (Figure Ar-5). This result suggest that these xylooligosaccharides are able to abolish the repression exerted by XCC4101. In the mutant
background, the difference in expression levels between the different media can be explained by
the catabolite repression exerted by the some of these molecules: glucose, xylose and xylooligosaccharides are very good carbon sources for Xcc, and thus exert a strong catabolite
repression; as mentioned above, no catabolite repression is observed in the presence of xylan;
finally, arabinose exert a weak catabolite repression, and this is in good correlation with the lower
growth rate obtained when Xcc was grown on this sugar as a sole carbon source, as compared to
xylose or glucose.
In the presence of xylo-oligosaccharides, we also observed a strong, but not total, reduction
of the repression exerted by XCC4101 on XCC4120. This could be related to the difference of
inductibility obtained between the 2 TBDR genes: as mentioned above and as shown on Figure
Ar-3, the induction of the XCC4120 expression requires a higher xylose concentration as
compared to XCC2828. It would be worth checking whether the XCC4120 repression by
XCC4101 is fully abolished in the presence of 5 mM xylotriose or tetraose for example.
Altogether, these data indicate that xylobiose, xylotriose and xylotetraose are the true
inducers of the TBDR genes, and effector molecules for the XCC4101 repressor. In contrast to
xylose which is only able to weaken XCC4101 repressor activity, these small xylooligosaccharides totally prevent the regulator from repressing its target genes.
124
Xylose molecules per cell (x1000)
750
675
600
525
450
375
300
225
150
75
0
0
4
8
12
16
Time (minutes)
WT
∆XCC2828 ∆XCC4120
Figure Ar-7: [14C]xylose transport into Xanthomonas
campestris pv. campestris. Experiments were performed over
15 minutes into the Xcc wild-type strain (WT) and into the
∆XCC2828 ∆XCC4120 double deletion mutant. Bars
represent the standard deviations calculated from three
different biological repetitions.
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
Regulation by xylo-oligosaccharides of the XCC4118 to XCC4122 genes
Using the XCC4118 to XCC4122 insertion mutants carrying the GUS reporter gene, we
studied the expression of these 5 genes in the mutant background in the presence of xylooligosaccharides. Results are presented on Figure Ar-6. The XCC4118 xylanase and the XCC4119
hexuronate transporter genes show the same expression pattern than the two TBDR genes, as they
are all four strongly induced by xylobiose (X2), xylotriose (X3) and xylotetraose (X4).
Interestingly, the XCC4121 transporter gene is induced only by xylobiose and not by
xylotriose or xylotetraose. This suggests that, when this transporter protein is mutated, the trimer
and tetramer cannot enter the cytoplasm and bind the XCC4101 repressor, thus allowing
transcription to proceed. This result strongly suggests that the XCC4121 protein is the only
transporter required for xylotriose and xylotetraose uptake across the inner membrane.
A different expression pattern was obtained for the XCC4122 α-L-arabinofuranosidase
gene. Although this gene is induced by the three sizes of xylo-oligosaccharides, this induction is
two-fold lower in the presence of xylotetraose than in the presence of xylobiose or xylotriose. This
difference was reproducibly observed and requires further investigations to be clarified.
These results have yet to be confirmed by complementation experiments, as in the strains
used for this study, the mutation introduced by pVO155 insertion is potentially polar on the
downstream gene(s).
The ∆XCC2828 ∆XCC4120 double mutant is not altered in xylose transport
We then investigated the role of the XCC2828 and XCC4120 TBDR in xylose and
xylooligosaccharide transport.
Xylose transport could be monitored directly by performing 14C xylose transport assays. To
avoid functional redundancy that could mask each TBDR’s individual contribution, we
constructed a double mutant by deleting the two TBDR genes using the cre-lox system (Angot et
al., 2006 ; Marx & Lidstrom, 2002). Mutations introduced by this system are non polar. The
xylose uptake rates in the wild-type strain and in the ∆XCC2828 ∆XCC4120 double mutant were
compared after an overnight preculture in minimal medium in the absence of xylose. The uptake
pattern in the wild-type strain over 15 minutes reflects an active transport of xylose in the cell;
however, we observed that the double mutant is not altered in 14C xylose transport (Figure Ar-7),
suggesting either that xylose does not enter the bacteria through these 2 TBDR, or that these two
TBDR are not the only pathway for xylose transport across the outer membrane.
125
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
0
20
40
60
80
B - 100 µM
β -Galactosidase activity (Miller units)
β -Galactosidase activity (Miller units)
β -Galactosidase activity (Miller units)
A - 50 µM
1800
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
100
Time (minutes)
0
20
40
60
80
Time (minutes)
WT
+ pPR-XCC4120
100
C- 500 µM
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
0
20
40
60
80
100
Time (minutes)
∆XCC2828 XCC4120::pVO
+ pPR-XCC4120
No supplement
Xylose
Xylotriose
Figure Ar-8: Expression kinetics of the Xanthomonas campestris pv. campestris XCC4120 TBDR gene. The pPrXCC4120 plasmid containing the promoterless LacZ reporter gene was used to monitor XCC4120 expression in the
wild-type strain (WT) and in a ∆XCC2828 XCC4120::pVO double mutant, in minimal medium supplemented or not
with xylose or xylotriose at different concentrations: 50 µM (A), 100 µM (B), and 500 µM (C).
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
Similar experiments have yet to be performed with the XCC4119 and XCC4121 mutants, in
order to check whether these two transporters play a role in xylose transport across the inner
membrane.
XCC2828 and XCC4120 play a role in xylotriose transport into Xcc
As radioactive xylo-oligosaccharides are not commercially available, we tried to monitor
their transport in an indirect manner: we used the pPr-XCC4120 construction to perform timecourse experiments comparing XCC4120 expression in the wild-type strain and in the the
∆XCC2828 XCC4120::pVO double mutant grown in presence of 50, 100 or 500 µM xylotriose.
As shown in Figure Ar-8A, the expression of the XCC4120 TBDR gene is strongly induced upon
50 µM xylotriose, whereas xylose has no effect at this concentration.
Moreover, a slight difference was observed in the induction level of XCC4120 in both
strains: the induction of the TBDR gene was significantly lower in the double mutant (Figure Ar8), suggesting that xylotriose is transported though one or both TBDR, but that xylotriose entry by
an unknown pathway remains important, allowing the induction of the XCC4120 TBDR gene
even when both TBDR genes are mutated. It is worth noting that there was no significant
difference between the profiles obtained at the three different xylotriose concentrations.
XCC4118 is required for full pathogenicity on Arabidopsis thaliana
Mutants in the XCC4118 to XCC4122 genes were assayed for virulence on Arabidopsis
thaliana Sf-2 ecotype. The XCC4118 mutant was slightly delayed in symptom development.
Similarly, the XCC4119 mutant also showed such a delay, probably due to a polar effect of the
pVO155 insertion on XCC4118 gene expression (data not shown). These phenotypes have yet to
be reproduced and complementation experiments have to be performed.
DISCUSSION
Regulation of the XCC2828 and XCC4120 loci: overview
In this work, we show that the two xylose-induced TBDR previously identified (Blanvillain
et al., 2007) belong to loci involved in xylan utilization in Xanthomonas campestris pv.
campestris. These loci define a set of genes positively regulated by xylo-oligosaccharides
(demonstrated for XCC2828 and XCC4118 to XCC4122) and strongly repressed by a
transcriptional regulator of the LacI family, XCC4101 (demonstrated for XCC2828 to XCC2825
and XCC4116 to XCC4122).
126
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
Although we didn’t show the direct binding of the XCC4101 regulator to the promoters nor
its direct association with these molecules, it seems clear that the transcription of the XCC2828
and XCC4120 TBDR genes is maintained at a repressed level in the absence of small sized xylooligosaccharides, with a DP (degree of polymerisation) superior or equal to 2. The xylose
monomer is able to weaken the repression exerted by XCC4101, but not to abolish it, suggesting a
weak affinity of the repressor for xylose. On the contrary, xylobiose, xylotriose and xylotetraose
prevent XCC4101 to regulate the system. Consistent with that, these molecules are much better
inducers than the monomer, showing an effect on gene expression at concentrations inferior to 50
µM, whereas xylose has no effect under 2 mM.
Interestingly, this regulation seems to be strictly dependent on the presence of a perfect 14bp palindromic motif TGNTAGCGCTANCA, which we propose to be the motif recognized by
XCC4101, named X-box. However, the occurence of imperfect X-boxes in the genome suggest
that the XCC4101 regulon might be broader. Many points remain to be elucidated before
publication of these preliminary results. First of all, it will be important to examine the genes
having an imperfect X-box in their promoter: are they also induced by xylose, xylan and xylooligosaccharides? Are they regulated by the XCC4101 repressor? The regulation by the xylanderived molecules also has to be studied for the genes of the XCC4101 locus (especially the
xylose isomerase having a perfect X-box), as well as the other genes potentially involved in
xylan/xylose utilization, listed in Table Ar-4. These expression studies, which will be performed
by qRT-PCR, will enable us to precise the respective regulons of XCC4101 and of the xylanderived molecules, and to qualify the putative overlap between these regulons. In a further step, it
will be necessary to broaden this study using global approaches such as transcriptomics, to
determine whether these regulons are restricted to the small number of genes identified in this
work, or if XCC4101 is a central regulator of extended metabolic pathways. Such studies should
already provide key information about the regulatory networks controlling xylan utilization in
Xcc.
The XCC2828 and XCC4120 TBDR might play a role in xylo-oligosaccharide transport
across the outer membrane
A double mutant for the 2 xylose-induced TBDR is not altered in growth on xylose (data not
shown), nor in
14
C xylose uptake. These results can be explained by two hypothesis: first of all,
there can be multiple transport systems capable of importing xylose into Xcc, as in Caulobacter
crescentus (Stephens et al., 2007) or E. coli (Davis & Henderson, 1987), so that a double mutation
127
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
cannot sufficiently impair xylose uptake to block xylose transport and bacterial growth. Another
possibility is that these TBDR are not involved in xylose uptake, but in the transport of small sized
xylo-oligosaccharides, with a DP superior or equal to 2. Our data are in favour of this second
hypothesis, since the presence of these 2 TBDR is required for full induction of the corresponding
genes by xylotriose. This work thus suggest a new system for xylo-oligosaccharide utilization,
involving TBDR for their transport through the bacterial outer membrane.
Xylo-oligosaccharide transport through the bacterial inner membrane
In Lactobacillus pentosus, a Gram-positive bacterium isolated from a natural fermentation
of green olives, a member of the Galactoside-Pentoside-Hexuronide (GPH) family has been
characterized. This protein, named XylP, is a xyloside transporter specific for isoprimeverose.
Xylosides are disaccharides which form the building blocks of hemicelluloses, i.e. xylobiose in
xylans and isoprimeverose in xyloglucans. XylP does not show any affinity for the
monosaccharide (xylose), and strictly requires a glycosidic linkage at the anomeric carbon
position (Heuberger et al., 2001) for its activity. However, this is not a typical feature of the GPH
family, which includes members able to transport galactosides as well as free galactose (Veenhoff
& Poolman, 1999). In the soil inhabiting Gram-positive bacteria Streptomyces thermoviolaceus, a
gene cluster involved in the xylanolytic system of the bacteria has been characterized (Tsujibo et
al., 2004). This cluster is made of one LacI/GalR regulatory gene, genes encoding the components
of an ABC transporter and a gene encoding an intracellular β-xylosidase. Thanks to a BIACORE
sensor chip, it has been showed that the sugar binding protein of the ABC transporter system,
BlxE, is highly specific for xylobiose (Kd = 8,75.10-9 M) and larger xylo-oligosaccharides (Kd
ranging from 8,42.10-8 M for xylotriose to 1,16.10-6 M for xylohexaose). Xylose shows very weak
affinity towards this protein (Kd = 1,76.10-5 M). Moreover, it was showed that the BlxR regulator
is the transcriptional repressor of this locus and that BlxR-DNA interaction is weakened in the
presence of low xylobiose concentrations (1 to 10 mM), but not affected by high xylose
concentrations (500 mM). The synthesis of the β-xylosidase BxlA and the sugar binding protein
BxlE is induced in the presence of xylobiose but not in presence of xylose. Therefore, it was
presumed that xylobiose was the true inducer of this gene cluster, which leads to the release of the
repressor from the operator. These two studies are the only ones reporting a transport specificity
towards xylo-oligosaccharides of different sizes across the inner membrane. In contrast, nothing is
known about xylo-oligosaccharide transport in Gram-negative bacteria. Thus, our study provides
new insights about this processus in Xcc. Interestingly, the XCC4121 transporter gene is not
induced by xylotriose nor xylotetraose when the corresponding protein is absent, suggesting that
128
Xcc
4115
4116
Xylanase
β-galactosidase
Xoo
4117
4427
4118
4119
XCC4120
4121
4122
Isomerase Xylanase Hexuronate TonB-dependent receptor Transporter Xylosidase /
transporter
Arabinosidase
4428
4429
4430
XOO4431
4432
4433
Isomerase Xylanase Xylanase Hexuronate TonB-dependent receptor Transporter Xylosidase /
XynB
Arabinosidase
XynA transporter
Figure Ar-9: Conservation of the Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) XCC4115 to XCC4122 locus in
Xanthomonas ozyzae pv. ozyzae (Xoo) strain KACC10331.
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
the XCC4121 transporter of the inner membrane is specific for xylo-oligosaccharides with a DP
superior or equal to 3. More experiments are needed to precise the respective roles of this
transporter, as well as the XCC4119 transporter, in xylo-oligosaccharide uptake. For example, it
would be of interest to introduce the pPr-XCC2828 and the pPr-XCC4120 constructions
containing the promoterless LacZ reporter gene to follow the induction by xylo-oligosaccharides
of the two TBDR genes in the wild-type strain as compared to an XCC4119 or an XCC4121
insertion mutant. No induction of the TBDR genes in an XCC4121 mutant in response to X3 and
X4 would indirectly demonstrate that XCC4121 is the only inner membrane transporter required
for xylotriose and xylotetraose entry into Xcc.
In order to precise the respective roles of the TBDR and inner membrane transporters in
xylo-oligosaccharide uptake, it would be of special interest to perform direct transport assays; to
that purpose, it should be possible to label xylo-oligosaccharides with a fluorescent dye (Patrice
Lerouge, personnal communication). Having such compounds would also enable us to monitor
XCC4101 affinity for xylose and different sizes of oligosaccharides. Alternatively, as mentioned
above, we could purify the TBDR and/or regulatory proteins and use a BIACORE sensor chip to
assess their affinity for xylo-oligosaccharides.
Xylan degradation in Xanthomonas species
Xcc has 2 putative endo-1,4-xylanases (XCC4115 and XCC4118) that have been assigned to
Glycosyl Hydrolases family 10 (GH10) in the CAZy classification system. Interestingly, these
proteins are both conserved in Xanthomonas axonopodis pv. citri and Xanthomonas campestris
pv. vesicatoria (Table Ar-6), but XCC4115 is absent in Xanthomonas oryzae pv. oryzae.
XCC4117 to XCC4122 genes are conserved in Xoo (Figure Ar-9). However, the Xoo XynB
xylanase (XOO4429) is followed in the genome by another xylanase, XynA (XOO4428), which is
predicted by Rajeshwari and collegues (2005) to be absent in Xcc. However, the XCC4118 protein
has more homology with XynA (80% identity and 86% similarity) than with XynB (61% identity
and 73% similarity). In Xoo, only XynB possess a signal sequence and has been showed to be
secreted (Rajeshwari et al., 2005). As well, XCC4118 possess a signal sequence (Table Ar-4),
suggesting that this protein is secreted. A mutation in the Xoo secreted XynB xylanase (i) results
of the loss of β-1,4-xylanase activity on RBB-xylan plate, and (ii) slightly affects bacterial
virulence on rice (Rajeshwari et al., 2005). Similar results were obtained in our work with an
insertion mutant in XCC4118 (pathogenicity results not shown), suggesting that in terms of
functionality, XCC4118 and XOO4428 are orthologous genes.
129
Table Ar-6: Occurrence of the Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc ) genes of the XCC4120, XCC2828 and XCC4101 loci in
the Xcc 8004 strain, in other Xanthomonas and in Xylella fastidiosa. Conserved genes are yellow-shadowed. TBDR, TonB-dependent
receptor; MFS, Major Facilitator Superfamily; abs, absent. ?, putative orthologous gene.
XCC4101 locus
XCC2828 locus
XCC4120 locus
Gene ID
a
a
Function a
X. campestris pv.
Orientation Xcc strain 8004 vesicatoria strain
85-10
X. axonopodis
pv. citri strain
306
X. oryzae pv.
oryzae strain
KACC10331
Xylella fastidiosa
strain 9a5c
XCC4114
hypothetical protein
+
XC_4206
abs
abs
abs
abs
XCC4115
endo-1,4-β-xylanase A
-
XC_4207
XCV4355
XAC4249
abs
abs
XCC4116
β-galactosidase
-
XC_4208
XCV4356
XAC4250
abs
abs
XCC4117
hexuronic acid isomerase
-
XC_4209
XCV4357
XAC4251
XOO4427
abs
XCC4118
endo-1,4-β-xylanase A
-
XC_4210
XCV4360
XAC4254
XOO4429
abs
XCC4119
putative hexuronate transporter
-
XC_4211
XCV4361
XAC4255
XOO4430
abs
XCC4120
TBDR
+
XC_4212
XCV4362
XAC4256
XOO4431
abs
XCC4121
transport protein
+
XC_4213
XCV4363
XAC4257
XOO4432
abs
XCC4122
α-L-arabinofuranosidase
+
XC_4214
XCV4364
XAC4258
XOO4433
abs
XCC4123
outer membrane lipoprotein
+
XC_4215
XCV4365
XAC4259
XOO0274
abs
XCC2824
hypothetical protein
+
XC_1288
XCV3142
XAC2993
XOO1265
abs
XCC2825
tryptophan halogenase
-
XC_1287
XCV3144
XAC2995
XOO1263
abs
XCC2826
hypothetical protein
-
XC_1286
XCV3145
XAC2996
XOO1262
abs
XCC2827
hypothetical protein
-
XC_1285
XCV3146
XAC2997
XOO1261
abs
XCC2828
TBDR
-
XC_1284
XCV3147
XAC2998
XOO1260
abs
XCC2829
peptidase
-
XC_1282
XCV3148
XAC2999
XOO1259-8
abs
XCC2830
hypothetical protein
-
XC_1281
XCV3148 D
XAC2999
XOO1258
abs
XCC2831
transcriptional regulator soxR family
-
XC_1280
XCV3149
XAC3000
XOO1257
abs
XCC2832
MFS transporter
+
XC_1279
XCV3150
XAC3001
XOO1255-4-3
abs
XCC4099
hypothetical protein
-
XC_4190
XCV4328
XAC4224
XOO4416
XF0569 ?
XCC4100
xylose isomerase
+
XC_4191
XCV4330
XAC4225
XOO4417
abs
XCC4101
repressor
-
XC_4192
XCV4332
XAC4226
XOO4418
XF1463 ?
XCC4102
α-glucuronidase
+
XC_4193
XCV4333
XAC4227
XOO4419
abs
XCC4103
sialate O-acetylesterase.
+
XC_4194
XCV4334
XAC4228
XOO4420
abs
XCC4104
starvation sensing protein
+
XC_4195
XCV4335
XAC4229
XOO4421
abs
XCC4105
α-L-arabinofuranosidase
+
XC_4196
XCV4336
XAC4230
XOO4422
abs
XCC4106
β-glucosidase
+
XC_4197
XCV4337
XAC4231
XOO4423
XF0845 ?
XCC4107
fructuronate reductase
+
XC_4198
XCV4338
XAC4232
XOO4424
abs
XCC4108
hypothetical protein
+
abs
abs
abs
abs
abs
according to da Silva et al. , 2002
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
A mutant in the XCC4101 repressor gene shows an increased β-1,4-xylanase activity. Given
that XCC4101 only regulates one of the two Xcc xylanases, and that a mutant in XCC4118 shows
no β-1,4-xylanase activity on RBB-xylan plate, we propose that XCC4118 is the major xylanase
of the bacterium in vitro. However, protein purification from the supernatant of an Xcc culture is
required to confirm this hypothesis. Furthermore, enzymatic assays could help us to determine the
precise XCC4118 catalytic mechanism. For example, in the plant pathogenic bacterium Erwinia
chrysanthemi, the unique endoxylanase XynA, which belongs to Glycoside Hydrolase family 5
(GH5), does not cleave linear β-1,4-xylooligosaccharides: its hydrolytic action is absolutely
dependent on the presence of free 4-0-methyl-D-glucuronosyl (MeGlcA) residues as xylan side
chains (Hurlbert & Preston, 2001 ; Vrsanská et al., 2007). The cleavage of the main chain occurs
exclusively at the second xylosidic linkage towards the reducing end from the branch, leading to
products containing MeGlcA linked to the second xylopyranosyl residue. It would be interesting
to know whether Xcc xylanases also display such particularities.
What is the role of the second Xcc xylanase, XCC4115 ? Present in all Xanthomonas species
sequenced so far except Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Table Ar-6), the gene encoding this
protein is not regulated by the repressor of the locus, XCC4101, in our experimental conditions.
Although this protein is not necessary for xylan degradation in vitro, a role for this protein in
planta could not be excluded: its biosynthesis may be induced by plant-derived molecules absent
of our experimental assay, and it would thus be interesting to study in more detail the expression
profile of the corresponding gene.
Finally, in Xoo, loss of both XynB and LipA (a secreted lipase/esterase) severely reduces
virulence, suggesting that, individually, these proteins have only partial effect on virulence
(Rajeshwari et al., 2005). LipA is also present in Xcc but has not yet been characterized.
A mutant in the gene encoding the XCC4122 xylosidase has an over-expressed β-xylanase
activity on RBB xylan plate. It is possible that the XCC4122 enzyme generates a product with
inhibitory activity on XCC4101, thus preventing this regulator to repress xylan degradation. More
investigations are needed to understand this phenomenon, all the more since such an observation
had already been done concerning the sucrose sux locus: a mutant is the amylosucrase gene
XCC3359 gene shows enhanced sucrose transport, at a level similar to the level obtained with the
XCC3356 regulatory mutant (Blanvillain et al., 2007).
130
Xylan
Putative enzymes active on xylan backbone:
Putative enzymes active on xylan side chains:
α-L-Arabinofuranosidases
Endo-1,4-β-Xylanases
XCC4115, XCC4118
XCC4122, XCC4105, XCC0149, XCC1178, XCC2398, XCC4064
α-D-Glucuronidase
XCC4102
Putative esterases
XCC0144, XCC3038, XCC0282, XCC0080, XCC0266, XCC2285
Xylooligosaccharides
β-D-Xylosidase
XCC3975
D-Xylose
Xylose Isomerases
XCC4100, XCC1758
D-Xylulose
D-Xylulokinase
XCC1757
D-Xylulose-5-phosphate
Pentose Phosphate Pathway
Figure Ar-10: In silico prediction of the Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) xylan utilization
pathway. For xylan degradation into small xylo-oligosaccharides (mainly xylobiose), Xcc proteome
displays 2 putative endo-1,4-β-xylanases, 6 putative α-L-arabinofuranosidases and 1 putative α-DGlucuronidase. Esterases acetylxylan-specific have not been identified (or not so annotated) but Xcc
proteome contains many putative esterases. For the cleavage of β-1,4-D-xylosidic linkages in non-reducing
ends of small xylo-oligosaccharides, Xcc has a putative β-D-xylosidase. Finally, xylose conversion into
metabolic precursor of the Pentose Phosphate Pathway could be achieved by 2 putative xylose isomerases
and 1 putative D-xylulokinase.
Chapitre II : Etude de loci impliqués dans le métabolisme de polysaccharides de la paroi végétale chez Xcc
Xylose intracellular catabolism in bacteria
What is the fate of the xylose released during xylan degradation ? In E. coli, the
xylABFGHR gene cluster responsible for xylose utilization has been well-characterized. Xylose
transport through the inner membrane occurs via an ABC transporter system, XylFGH (Song &
Park, 1997), or through the low-affinity xylose-proton symporter XylE (Davis & Henderson,
1987), located elsewhere in the genome. The xylAB operon encodes the metabolic enzymes xylose
isomerase and xylulokinase, respectively, which act intracellularly (Lawlis et al., 1984). Finally,
XylR is a positive regulator for both operons xylAB and xylFGHR, governed by two distinct
xylose inducible promoteurs; the xylR gene has its own weak promoter, which is not activated by
xylose (Song & Park, 1997). In addition to E. coli, many bacteria, including Bacillus species
(Rygus et al., 1991 ; Scheler et al., 1991) and Lactobacillus species (Lokman et al., 1991), use
xylose isomerase to convert D-xylose into xylulose, which is then phosphorylated by a
xylulokinase to enter the pentose phosphate pathway. This mechanism for xylose assimilation is
likely to be functional in Xcc: in silico analysis of the genome reveals the presence of genes
encoding xylose isomerases (XCC1758, in addition to the reported XCC4100 gene) and a Dxylulokinase (XCC1757) (Table Ar-4 and Figure Ar-10). However, this route has not yet been
further examined in this bacteria.
Interestingly, this best-known bacterial pathway is probably not operative in the oligotrophic
freshwater bacterium Caulobacter crescentus, given the absence of homologs for xylose
isomerase and xylulokinase in the genome (Hottes et al., 2004). Recently, Stephens and
colleagues showed that Cc metabolizes D-xylose through a pathway yealding to α-ketoglutarate.
The different steps of this pathway involve successively an NAD+-dependent xylose
dehydrogenase, a xylonolactonase, a xylonate dehydratase and a α-ketoglutaric semialdehyde
dehydrogenase, encoded by the xylose-inducible xylXABCD operon (CC0823 to CC0819). Such a
pathway seems to be restricted to a very small number of bacterial species (Stephens et al., 2007).
Role of the XCC2828 locus ?
Finally, our work provide informations about the respective functions of the genes
surrounding the XCC4120 TBDR in xylo-oligosaccharide metabolism, but the role of the
XCC2828 locus still remains to be elucidated. The XCC2825 to XCC2828 gene organization and
putative functions (Figure Ar-1) are highly conserved in aquatic bacteria showing TBDR overrepresentation (Pseudoalteromonas atlantica, Saccharophagus degradans, Sphingomonas sp.,
Sphingopyxis alaskaensis...) (Blanvillain et al., 2007), suggesting a possible role for this gene
cluster in the degradation of complex polysaccharides in aquatic or oligotrophic environments.
131
CHAPITRE III : ETUDE DE
L’EFFECTEUR DE TYPE III
AVRACXCC8004 DE XCC
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
CHAPITRE III : ETUDE DE L’EFFECTEUR de TYPE III AvrACXcc8004
Ce chapitre rapporte l’étude d’un effecteur de type III de Xcc, effectuée en collaboration
avec l’équipe du Professeur Tang (Key Laboratory of Subtropical Bioresources Conservation and
Utilization - Guangxi University - Nanning, Chine). Il m’a semblé important de débuter ce
chapitre par une introduction générale sur des notions de bases en phytopathologie, à savoir les
déterminants du pouvoir pathogène des bactéries, ainsi que les systèmes de défense mis en place
par les plantes en réponse aux agressions par ces microorganismes. Les résultats obtenus sur
l’effecteur de type III étudié seront exposés dans un second temps.
INTRODUCTION : Les bases de l’interaction plante-microorganisme
Toute bactérie phytopathogène n’est pas capable d’infecter n’importe quelle plante et, dans
la nature, la majorité des plantes est résistante à la majorité des agents pathogènes. Tout dépend en
réalité des espèces végétales et des souches bactériennes considérées.
Quelques notions fondamentales en phytopathologie…
Une plante donnée peut être « hôte » ou « non-hôte » pour une bactérie donnée : une plante
non-hôte développe en réponse à une bactérie « non pathogène » une résistance dite « non-hôte »,
et l’interaction est dite « incompatible ». Une plante hôte peut être « sensible » à une bactérie
« pathogène », et on parle alors d’ « interaction compatible » : la maladie se développe. Le
pouvoir pathogène de la bactérie est la résultante de 2 composantes, l’une qualitative, la
« virulence », qui désigne la capacité d’induire des symptômes, et l’autre quantitative,
l’ « agressivité », qui mesure l’intensité de ces symptômes. Ce découplage virulence/agressivité
est un concept propre aux bactéries phytopathogène, le pouvoir pathogène des bactéries
pathogènes des animaux n’étant pas décrit de la même façon.
Une plante hôte peut également résister à une bactérie dite « avirulente » si son génotype le
permet. On parle d’ « interaction incompatible » de la même façon que dans le cas d’une
résistance non-hôte, mais les mécanismes de défense mis en place sont, au moins en partie,
différents.
Quels que soient la bactérie (pathogène, non pathogène ou avirulente) ou le type
d’interaction (compatible ou incompatible), une plante déclenche en réponse à une bactérie une
réponse appelée « défense basale », qui correspond à l’immunité innée des plantes. Lors d’une
interaction incompatible avec une bactérie avirulente, la plante développe en plus de la défense
132
ME
Lipoprotéines
MI
périplasme
LPS
EF-Tu
Facteur EF-Tu
(peptides elf18, elf26)
Protéines « Cold-shock »
…
Peptidoglycane
Flagelline
(peptide flg22)
Figure III-1 : Les principaux PAMPs (Pathogen-Associated Molecular Patterns) d’une
bactérie à Gram négatif. Ces motifs conservés signalent la présence de la bactérie à
l’hôte (la plante dans notre cas), qui déclenche alors les réponses de défenses basales
constituant l’immunité innée des plantes. Comme les PAMPs sont présents chez toutes
les bactéries, la plante met en place son immunité innée quelle que soit la bactérie (non
pathogène / pathogène / saprophyte / avirulente…). Pour cela, la cellule végétale
possède à sa surface des récepteurs protéiques spécifiques capables de détecter les
PAMPs. LPS, Lipopolysaccharides ; ME, Membrane Externe ; MI, Membrane Interne ;
EF, Elongation Factor.
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
basale une défense « gène-spécifique », qui dépend du patrimoine génétique des 2 partenaires
(Feys & Parker, 2000).
I. La défense basale, ou immunité innée des plantes
I.1. La détection du pathogène
La mise en place de la défense basale repose sur la capacité de la plante à détecter la
présence des bactéries pathogènes ou saprophytes. Plus précisément, la cellule végétale reconnaît
des motifs appelés « PAMPs » (Pathogen-Associated Molecular Patterns), ou de façon plus
générale « MAMPs » (Microbe-Associated Molecular Patterns) [pour revue, voir (Gómez-Gómez,
2004)]. Ces motifs sont également appelés « éliciteurs » dans la mesure où leur détection
déclenche les réponses de défense. Si la reconnaissance des PAMPs et l’induction des réponses de
défense procèdent de façon très similaires chez les animaux et chez les végétaux, il existe
toutefois des particularités propres à chacun [pour revues, voir (Nürnberger et al., 2004 ; Zipfel &
Felix, 2005)]. Dans ce paragraphe, nous nous limiterons à la description des réponses des plantes.
Les PAMPs sont des structures relativement invariantes, présentes généralement sur
l’enveloppe des bactéries et des champignons, absentes des cellules de l’hôte, et qui constituent
donc une véritable signature trahissant la présence de l’agent pathogène. Ainsi, les
lipopolysaccharides (LPS), le peptidoglycane et la protéine du flagelle bactérien (flagelline) sont
les principaux PAMPs des bactéries à Gram négatif, présents à la fois chez les bactéries
phytopathogènes et chez les pathogènes animaux (Figure III-1). Dans le cas de la flagelline, il a
été montré qu’un tout petit peptide de 22 acides aminés, appelé flg22, suffit à l’induction des
réponses de la plante. La détection de flg22 par les cellules d’Arabidopsis thaliana a été
caractérisée initialement dans l’interaction avec Pseudomonas syringae (Felix et al., 1999), et plus
récemment avec Xanthomonas campestris pv. campestris (Sun et al., 2006). Les cellules animales
reconnaissent quant à elles des motifs différents de la flagelline des bactéries qui les infectent.
Tout comme la flagelline, le facteur d’élongation EF-Tu bactérien déclenche lui-aussi les
réponses de défense de la plante (Kunze et al., 2004). Pour cela, un épitope de 18 acides aminés
(elf18) suffit à la fonction d’éliciteur. EF-Tu est l’une des protéines bactériennes les plus
abondantes, représentant 5% des protéines totales chez Escherichia coli (Jacobson & Rosenbusch,
1976). EF-Tu est une GTPase qui joue un rôle majeur lors du processus d’élongation, étape de la
biosynthèse des protéines : elle catalyse la fixation du complexe ARNt (ARN de transfert) - acideaminé au ribosome, et la livraison GTP-dépendante de l’acide-aminé à la chaîne protéique en
133
EF-Tu
PRR de
type RLK
Paroi
Autres PAMPs bactériens
LRR
Membrane
plasmique
EFR
EF-Tu
(elf18)
FLS2
flg22
domaine kinase
Fortification de
la paroi
Réduction du
flux vasculaire
Signalisation
MAPK
WRKYs
PRRs
Noyau
NO / ROS
Fermeture des
stomates
?
Activation des défenses
FRK1 et NHO1
Plus de 300 gènes différentiellement exprimés
Figure III-2 : Les défenses basales des plantes. La cellule végétale possède des récepteurs membranaires (PRR, Pattern
Recognition Receptors) composés d’un domaine LRR extracellulaire et d’un domaine kinase intracellulaire. Chez Arabidopsis
thaliana, les récepteurs FLS2 et EFR reconnaissent respectivement les PAMPs (Pathogen-Associated Molecular Patterns)
peptidiques flg22 de la flagelline et elf18 du facteur d’élongation Tu (EF-Tu). Cette perception conduit à l’activation d’une ou
plusieurs cascades de MAP kinases (MAPK) ; des facteurs de transcription de type WRKY assurent la transduction du signal
dont l’issue est une reprogrammation globale du transcriptome de la plante. Les gènes NHO1 et FRK1 sont souvent utilisés
comme marqueurs moléculaires de l’activation des voies PRR. Le déploiement des défenses basales s’accompagne de
phénotypes cellulaires tels que la réduction du flux vasculaire, la fortification de la paroi végétale (dépôt de callose) et la
production de formes réactives de l’oxygène (ROS) ou de l’azote (NO). (D’après Abramovitch et al., 2006).
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
cours de fabrication (Parmeggiani & Swart, 1985). Le processus de relargage de ce PAMP
intracellulaire n’est pas décrit à l’heure actuelle ; on peut penser qu’il existerait des systèmes
d’export bactériens inductibles au cours de l’infection, ou que les plantes seraient capables
d’endommager l’agent infectieux, conduisant à la libération de certains constituants bactériens
(Kunze et al., 2004).
Les PAMPs bactériens englobent par ailleurs des protéines sécrétées, telles que les
« harpines » (Baker et al., 1993) ou les protéines « Cold Shock » (Felix & Boller, 2003).
Enfin, des fragments de la paroi végétale libérés sous l’action d’enzymes hydrolytiques
bactériennes peuvent aussi jouer un rôle éliciteur dans la mesure où leur détection déclenche
également les réponses de défense basales de la plante (Vorwerk et al., 2004). On ne parle alors
plus de PAMPs mais de « HAMPs » (Host-Associated Molecular Patterns) (De Lorenzo, 2007) ou
de « MIMPS » (Microbe-Induced Molecular Patterns) (Bent & Mackey, 2007 ; Mackey & McFall,
2006). Ainsi, les oligogalacturonides produits lors de la dégradation de la pectine végétale sont
d’excellents éliciteurs des réponses de défense des plantes (Davis et al., 1986).
Les récepteurs capables de reconnaître les PAMPs sont présents à la surface des cellules
végétales et appelés « PRR » (Pattern Recognition Receptor) [pour revue, voir (Parker, 2003)].
Des travaux récents menés chez Arabidopsis thaliana ont conduit à la caractérisation fonctionnelle
de EFR (EF-Tu Receptor), le PRR spécifique du facteur EF-Tu (Zipfel et al., 2006), et FLS2
(Flagellin-Sentitive 2), le récepteur du peptide flg22 de la flagelline bactérienne (Chinchilla et al.,
2006 ; Gómez-Gómez et al., 2001). Ces deux récepteurs possèdent un domaine LRR (Leucine
Rich Repeat) extracellulaire et un domaine kinase cytoplasmique, et sont désignés sous le terme
générique « RLK » (Receptor-Like Kinases) (Figure III-2). La détection des pathogènes par ces
récepteurs donne lieu à des réponses de défense très rapides (Nürnberger & Scheel, 2001).
I.2. Les composantes de la défense basale
Les réponses de défense basales sont déclenchées de façon très précoce (moins de 10
minutes après le contact entre les 2 partenaires) chez une plante hôte ou non-hôte, quelle que soit
la bactérie détectée (Abramovitch et al., 2006). Elles peuvent à elles seules suffire à établir la
résistance de la plante, ou bien être insuffisantes, auquel cas la maladie se développera.
La Figure III-2 illustre les composantes de la défense basale.
Tout d’abord, des réponses globales ont été observées chez certaines plantes, telles que la
réduction du flux vasculaire au niveau des feuilles chez le tabac (Oh & Collmer, 2005), ou la
fermeture des stomates chez Arabidopsis thaliana (Melotto et al., 2006).
134
Tableau III-1 : Classification des protéines PR (Pathogenesis-Related). (D’après Van Loon et
Van Strien, 1999)
Famille
Protéine-type
Plante
Fonction
PR-1
PR-1a
Tabac
antifongique (membrane fongique)
PR-2
PR-2
Tabac
β-1,3-glucanase (paroi fongique)
PR-3
PR-P, PR-Q
Tabac
chitinase de type I, II, IV, V, VI, VII
PR-4
PR-R
Tabac
chitinase de type I, II
PR-5
PR-S
Tabac
thaumatine-like ou osmotine (membrane fongiques)
PR-6
Inhibitor I
Tomate
inhibiteur de protéases (champignons, bactéries,
insectes)
PR-7
P69
Tomate
endoprotéase
PR-8
chitinase
Concombre
chitinase de type III, lysozyme (peptidoglycanes
bactériens)
PR-9
péroxydase formant la
lignine
Tabac
péroxydase (catalyse le dépôt de lignine, donc le
renforcement de la paroi)
PR-10
PR-1
Persil
ribonucléase-like (virus)
PR-11
chitinase de classe V
Tabac
chitinase de type I
PR-12
Rs-AFP3
Radis
défensine (peptide) (champignons, bactéries)
PR-13
THI2.1
Arabidopsis
PR-14
LTP4
Orge
protéine de transfert des lipides (champignons,
bactéries)
PR-15
OxOa
Orge
oxalate oxydase
PR-16
OxOLP
Orge
oxalate oxydase-like
PR-17
TNtPRp27
Tabac
inconnue
thionine (peptide) (champignons, bactéries)
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
Afin d’inhiber la croissance in planta du pathogène, la plante renforce ses parois cellulaires
en augmentant la synthèse de lignine, de protéines de parois riches en glycine (GRP), en proline
(PRP) ou en hydroxyproline (HPRP), de subérine et de papilles riches en callose (polymère de Dglucose) (Hardham et al., 2007 ; Maor & Shirasu, 2005). Elle produit également des molécules
anti-microbiennes telles que des phytoalexines (petites molécules lipophiles) ou des peptides antimicrobiens (thionines et défensines) [pour revues, voir (Barz et al., 1990 ; Castro & Fontes,
2005)].
Au niveau cellulaire, on observe un efflux rapide d’ions K+ associé à une augmentation du
pH extracellulaire, ainsi qu’un pic de calcium et un « burst oxydatif » : celui-ci correspond à la
production massive de formes réactives de l’azote (nitric oxyde, NO) et de l’oxygène [« ROS »
(Reactive Oxygen Species) ou « ROI » (Reactive Oxygen Intermediates)], telles que l’anion
superoxyde O2-, le radical hydroxyl OH° ou le peroxyde d’hydrogène H2O2] (Abramovitch et al.,
2006 ; Torres et al., 2006).
De nombreuses cascades de signalisation sont ensuite enclenchées. La voie des MAPKs
(Mitogen-Activated Protein Kinases) joue notamment un rôle majeur dans la défense basale (Asai
et al., 2002) (Figure III-2). Ces cascades conduisent à l’activation de facteurs de transcription de
type WRKY tels que WRKY29, et à l’expression de nombreux gènes aux fonctions liées à la
défense (Abramovitch et al., 2006).
La signalisation et la reprogrammation de l’expression des gènes suite à la reconnaissance
de la flagelline ont été intensivement étudiées (Navarro et al., 2004 ; Thilmony et al., 2006 ;
Truman et al., 2006). Ainsi, plus de 300 gènes, dont des facteurs de transcription, des protéines
jouant un rôle dans la dégradation d’autres protéines, des protéines liées à la signalisation
hormonale, des phosphatases, des kinases dont des RLK (telles que la « Flagellin-induced
Receptor Kinase 1 » FRK1), des protéines associées à la modification de la paroi végétale, etc.,
voient leur expression modifiée en réponse à la perception de PAMPs.
Parmi les protéines fortement activées, on trouve notamment les protéines PR
(« Pathogenesis-Related »), qui sont des protéines très stables (résistantes aux protéases végétales
et microbiennes) capables d’interagir directement avec des composés structuraux ou des enzymes
impliquées dans le pouvoir pathogène de l’agresseur. Les glucanases et les chitinases sont des
protéines PR [Tableau III-1, d’après (Van Loon & Van Strien, 1999)].
Les voies de signalisation hormonales sont modifiées [voies Acide Salicylique (SA), Acide
Jasmonique (JA) et Ethylène (ET)]. Toutefois, des mutants d’Arabidopsis déficients dans l’une ou
l’autre de ces voies sont toujours capables d’induire leurs défenses basales (Zipfel et al., 2004),
suggérant que ces voies sont partiellement redondantes et que d’autres voies de signalisation sont
135
Effecteurs
de type III
MI
Bactérie
Corps basal
Périplasme
ME
Paroi végétale
MP
Pilus hrp
Translocon
Cellule végétale
Figure III-3 : Représentation schématique de l’appareil de sécrétion de type III des
bactéries phytopathogènes et de son ancrage dans les structures membranaires
végétales. Le corps basal du système de sécrétion de type III (en bleu et gris) est
enchâssé dans la double membrane bactérienne. Il est prolongé par le « pilus hrp » (en
jaune), qui traverserait la paroi végétale, et par le « translocon » (en vert), ancré dans la
membrane plasmique de la cellule végétale. Ces structures assurent le cheminement et
l’injection dans la cellule végétale des substrats du système, appelés « effecteurs de
type III ». MI, Membrane Interne de la bactérie ; ME, Membrane Externe de la bactérie ;
MP, Membrane Plasmique de la cellule végétale.
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
vraisemblablement enclenchées. De plus, la signalisation de la défense basale présente une
composante SA-dépendante et une composante SA-indépendante (DebRoy et al., 2004 ; Hauck et
al., 2003).
La défense basale et la résistance non-hôte sont en partie liées : chez Arabidopsis, les gènes
FRK1 et NHO1 (Non-Host 1), codant respectivement pour une RLK et une glycerol kinase, sont
fortement exprimés suite à un traitement à la flagelline mais également suite à une inoculation par
une bactérie non-hôte (He et al., 2006 ; Li et al., 2005).
Les bactéries phytopathogènes sont capables de contourner les réponses de défense des
plantes en injectant dans la cellule végétale des protéines effectrices qui vont empêcher le
déclenchement de certaines composantes de la défense basale.
II. Le système de sécrétion de type III et ses effecteurs
II.1. Rôle du système de sécrétion de type III
De nombreux pathogènes infectent et se multiplient dans les espaces intercellulaires du
mésophylle de leur hôte végétal (apoplaste). Toutefois, il est aujourd’hui bien connu que ces
bactéries sont capables d’injecter des facteurs de virulence directement dans les cellules végétales.
Pour cela, les bactéries pathogènes à Gram négatif ont développé un système multiprotéique d'une
haute complexité : le système de sécrétion de type III (TTSS, pour Type Three Secretion System).
Cette structure évoque la forme d'une seringue, l'aiguille étant un filament protéique creux appelé
« pilus » (Figure III-3). Ce système de sécrétion est également présent chez de nombreux
pathogènes animaux tels que Salmonella, Shigella et Yersinia [pour revues, voir (Cornelis, 2006 ;
Galán & Wolf-Watz, 2006 ; Mota & Cornelis, 2005 ; Tampakaki et al., 2004 ; Troisfontaines &
Cornelis, 2005)]. Le terme « pilus » est communément employé pour le TTSS des pathogènes
végétaux, tandis qu’on parle plutôt d’« aiguille » chez les pathogènes animaux.
Le système de sécrétion de type III est aujourd’hui reconnu comme l'un des éléments
majeurs de la virulence des bactéries phytopathogènes : sans leur TTSS, ces bactéries sont
incapables de se multiplier in planta, de développer les symptômes de la maladie sur une plantehôte, ainsi que la réaction hypersensible (HR) sur une plante non-hôte ou résistante, réaction de
défense spécifique qui correspond à une mort cellulaire rapide au niveau de la zone infectée
(notion développée dans le § IV.2.A) (Alfano & Collmer, 2004). Ainsi, cette structure moléculaire
est également appelée « système hrp », pour « hypersensitive response and pathogenicity », et les
gènes codant pour ses constituants « gènes hrp ». Les gènes hrp et leurs rôles dans l’interaction
136
A
200 nm
B
C
25 nm
Figure III-4 : Les pili hrp de différentes bactéries phytopathogènes cultivées dans des
milieux inducteurs des gènes hrp (photographies de microscopie électronique). (A)
Pseudomonas syringae DC3000 (d’après Roine et al., 1997). (B) Ralstonia
solanacearum GMI1000 (d’après Van Gijsegem et al., 2000). (C) Xanthomonas
axonopodis pv. vesicatoria (immunolocalisation avec un anticorps anti-HrpE) (d’après
Weber et al., 2005). Les pili hrp sont indiqués par une flèche.
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
avec la plante ont été initialement caractérisés chez l’espèce Pseudomonas syringae pv.
phasealicola (Grimm & Panopoulos, 1989 ; Lindgren et al., 1986).
Le contact entre la bactérie et la cellule végétale est nécessaire à la sécrétion d’un effecteur ;
ceci explique que des effecteurs tels que AvrBs3 ou AvrXa10 de Xanthomonas sp. puissent être
détectés dans le cytoplasme bactérien, mais difficilement dans le surnageant de cultures
bactériennes ou dans le surnageant de co-cultures de bactéries avec des cellules végétales (Brown
et al., 2001 ; Knoop et al., 1991 ; Young et al., 1994).
Le TTSS est un appareil de sécrétion redoutable, permettant à la bactérie d’injecter de
nombreuses protéines effectrices dans le cytoplasme des cellules de l’hôte.
II.2. Structure du TTSS
La structure du système de sécrétion de type III est schématisée sur la Figure III-3.
Le corps basal du TTSS est une structure multiprotéique complexe. Les gènes qui codent
pour les protéines du corps basal sont très conservés chez les pathogènes animaux, et ont pour
cette raison été appelés gènes hrc (conserved hrp genes) (Bogdanove et al., 1996). De façon
intéressante, 8 gènes hrc sur 9 sont homologues aux gènes fli/flh codant pour le système de
sécrétion des protéines du flagelle, suggérant un mécanisme commun d’assemblage (Fenselau &
Bonas, 1995 ; Galán & Collmer, 1999 ; He & Jin, 2003).
Le pilus hrp est un canal creux extracellulaire constitué de l’assemblage de plusieurs unités
d’une protéine majoritaire appelée piline. Cette protéine est codée chez Pseudomonas syringae par
le gène hrpA (Roine et al., 1997), chez Ralstonia solanacearum par hrpY (Van Gijsegem et al.,
2000) et chez Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria (Xav) par hrpE (Weber & Koebnik, 2005).
Les pili hrp ont pu être visualisés chez ces bactéries (Figure III-4). Leur diamètre mesure environ
6 à 8 nm, et leur longueur peut atteindre jusqu’à 2 µM. Cette dernière dimension est nettement
supérieure à celle des aiguilles des pathogènes animaux, et permettrait aux pili des bactéries
phytopathogènes de perforer entièrement la paroi des cellules végétales (He & Jin, 2003). Les
travaux de Jin et de ses collaborateurs sur P. syringae et Erwinia amylovora ont démontré,
notamment par des techniques d’immuno-localisation, que le pilus hrp est bien la voie de transit
des effecteurs de type III (Jin & He, 2001 ; Jin et al., 2001).
137
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
Chez les pathogènes animaux, l’aiguille est complétée d’une structure protéique appelée
translocon, formée d’un assemblage de protéines appelées TTPs (Type III secretion Translocon
Proteins). Chez les bactéries phytopathogènes, l’existence d’un translocon, qui permettrait
l’ancrage de la seringue moléculaire dans la membrane plasmique de la cellule végétale et la
translocation des effecteurs de type III, est supposée. Cependant, ce translocon est encore
relativement peu décrit chez ces bactéries (Büttner & Bonas, 2002). Des TTPs ont été identifiées
uniquement chez Xav (Büttner et al., 2002), X. oryzae pv. oryzae (Sugio et al., 2005), Xcc et R.
solanacearum (Meyer et al., 2006) : il s’agit de la protéine HrpF chez les Xanthomonas, et des
protéines PopF1 et PopF2 chez R. solanacearum.
Deux types de protéines transitent à travers le pilus hrp : les protéines « helper », qui
participent à la structure du TTSS (les TTPs) et/ou au mécanisme de translocation, ainsi que des
protéines dites « effectrices » (cf. § III. de ce chapitre).
II.3. Organisation et régulation des gènes hrp
Au sein des génomes bactériens, les gènes hrp codant pour le système de sécrétion de type
III sont regroupés en un cluster.
Selon le degré de conservation de ces gènes, les clusters hrp peuvent être classés en 2
groupes : le groupe I contient les clusters hrp d’Erwinia amylovora et de Pseudomonas syringae,
et le groupe II ceux des bactéries R. solanacearum et Xanthomonas sp. (Alfano & Collmer, 1997).
Ces 2 groupes de clusters définissent également 2 modes de régulation distincts. Les
caractéristiques structurales et la régulation des clusters hrp du groupe I ne seront pas détaillées
ici. Notons seulement que chez ces bactéries, c’est un facteur sigma de type ECF, HrpL, qui
régule l’expression des autres gènes hrp, à la suite d’une cascade de régulation impliquant les
régulateurs intracellulaires HrpS et HrpR, ainsi que le facteur sigma 54 (Jin et al., 2003 ; Merighi
et al., 2003 ; Xiao & Hutcheson, 1994).
Chez les bactéries du groupe II, c’est un régulateur transcriptionnel de la famille AraC qui
active l’expression des gènes hrp, de façon concomitante avec les effecteurs de type III.
L’expression de ce régulateur, appelé HrpB chez Ralstonia solanacearum et HrpX chez
Xanthomonas, est elle-même activée par un régulateur transcriptionnel de la famille OmpR,
appelé HrpG dans les deux cas (Wengelnik et al., 1996 ; Wengelnik et al., 1999).
Chez les groupes I et II, l’expression des gènes hrp est sous le contrôle de signaux de
régulation communs : in vitro, elle est activée en milieu minimum, milieu reconnu comme
138
1
popA
prhA
popB
2
3
4
popC
75
prhJ
hrpB
hrpG
prhI
prhR
cluster hrp (21 gènes)
Figure III-5 : Organisation du cluster hrp et de ses régions flanquantes chez la bactérie
Ralstonia solanacearum. 1, 2, 3, 4, 5 et 7 désignent les unités transcriptionnelles du
cluster hrp. Les gènes prhI, prhJ et prhR (en vert) sont des acteurs majeurs de la
cascade de régulation conduisant à l’activation des gènes hrpG et hrpB (en jaune), qui
codent pour les deux régulateurs majeurs du système de sécrétion et des effecteurs de
type III de la bactérie. Le gène prhA (en rouge) code pour un récepteur TonB-dépendant
intervenant en amont de cette cascade de régulation. Enfin, popA, popB et popC codent
pour des effecteurs de type III de la bactérie.
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
reproduisant assez bien les conditions rencontrées in planta par les bactéries (Lindgren, 1997).
Les gènes hrp sont également induits in planta ou lors d’une culture bactérienne en présence de
cellules végétales.
II.3.A. Particularités dans la régulation des gènes hrp chez Ralstonia solanacearum
Chez R. solanacearum, le cluster hrp n’est pas situé sur le chromosome mais sur le
mégaplasmide de la bactérie, où les 21 gènes s’organisent en 6 unités transcriptionnelles qui
s’étendent sur 19,1 kb (Figure III-5).
Comme exposé dans le Chapitre I, le gène hrpB est activé à l’issue d’une cascade de
régulation très particulière : le récepteur TonB-dépendant (TBDR) PrhA, ancré dans la membrane
externe, perçoit un signal de la plante qui est transduit, grâce à l’extension N-terminale de PrhA,
au facteur anti-sigma PrhR puis au facteur sigma PhrI. PhrI interagit avec l’ARN polymérase et
active l’expression du gène codant pour PrhJ, régulateur transcriptionnel de la famille
LuxR/UhpA, qui en retour va activer l’expression de HrpG. Enfin, HrpG active l’expression du
troisième et dernier régulateur de cette cascade, HrpB. Cette cascade de signalisation est
déclenchée lors du contact entre la bactérie et des cellules végétales (Figure I-11B du Chapitre I)
(Aldon et al., 2000 ; Brito et al., 1999 ; Brito et al., 2002 ; Marenda et al., 1998). Les gènes
codant pour l’ensemble des protéines impliquées dans cette cascade de signalisation sont
regroupés et localisés de part et d’autre du cluster hrp (Figure III-5).
HrpB modifie la transcription de nombreux gènes en se fixant sur un motif conservé du
promoteur de ces gènes : la hrpII-box, de séquence (TTCG-N16-TTCG) (Cunnac et al., 2004). Ce
régulateur est responsable de l’activation des gènes codant pour les protéines structurales du TTSS
(Genin et al., 1992) ainsi que des gènes codant pour les facteurs d’avirulence et autres effecteurs
de type III de la bactérie (Cunnac et al., 2004 ; Occhialini et al., 2005). Ces études
transcriptomiques récentes ont facilité l’établissement du répertoire d’effecteurs de R.
solanacearum.
Outre l’expression de hrpB, la protéine HrpG contrôle l’expression HrpB-indépendante d’un
grand nombre de facteurs de virulence et de gènes jouant un rôle dans l’adaptation de la bactérie à
son hôte végétal. Le régulon spécifique d’HrpG contient notamment des gènes codant pour des
enzymes de dégradation de la paroi végétale et des gènes impliqués dans la biosynthèse de
phytohormones telles que l’éthylène (Valls et al., 2006).
139
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
II.3.B. La régulation des gènes hrp chez les bactéries du genre Xanthomonas
Chez Xcc, le cluster hrp comprend 21 gènes et s’étend sur 21,7 kb. La régulation des gènes
hrp chez les Xanthomonas a été caractérisée notamment chez Xav. Chez les Xanthomonas, le
régulateur HrpX régule l’expression des gènes hrp et des effecteurs de type III en se fixant sur un
motif appelé PIP-box (Plant Inducible Promoteur-box), de séquence (TTCGC-N15-TTCGC)
proche de celle de la hrpII-box (Fenselau & Bonas, 1995 ; Tsuge et al., 2005 ; Wengelnik &
Bonas, 1996).
Chez Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (Xoc), un mutant présentant le même phénotype
que prhA de R. solanacearum a été identifié : un tel mutant n’est plus capable d’induire les
symptômes de la maladie sur le riz adulte ni la HR sur le tabac. De façon étrange, ce mutant n’est
pas affecté dans son pouvoir pathogène sur de jeunes plantules de riz (Zou et al., 2006). Le gène
de Xoc qui confère ce phénotype n’est identique qu’à 29% à celui de R. solanacearum, n’est pas
situé à proximité du cluster hrp, et code pour un TBDR conventionnel tandis que PrhA est un
TBDR de type « transducer ». Si la protéine de Xoc a tout de même été renommée PrhA, elle ne
peut être considérée comme l’orthologue de la protéine PrhA de R. solanacearum.
Chez Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), la recherche d’éléments régulateurs en amont
de HrpG et HrpX a été entreprise, et a conduit à l’identification d’un régulateur, Trh
(Transcriptional regulator for hrp), responsable de l’activation du gène hrpB puis de l’activation
de plusieurs gènes hrp (Tsuge et al., 2006). Le gène trh, situé loin du cluster hrp mais proche du
gène prhA (gène homologue à Xoc prhA), code pour un régulateur transcriptionnel de la famille
GntR, famille qui contient des activateurs et des répresseurs. Le gène hrpG est induit en milieu
minimum même dans un mutant trh, suggérant qu’il existe au moins un autre régulateur
transcriptionnel responsable de l’activation de hrpB. De plus, un mutant trh n’est pas affecté dans
son pouvoir pathogène, suggérant qu’une expression résiduelle des gènes hrp dans ce mutant
suffit à induire la croissance bactérienne in planta et les symptômes de la maladie (Tsuge et al.,
2006).
II.4. Les harpines, des protéines de coopération avec le TTSS ?
Les premières protéines identifiées comme étant sécrétées par le système de sécrétion de
type III sont de petites protéines (environ 44 kDa), thermostables, riches en glycine et pauvres en
cystéine, appelées « harpines ». Ce nom générique provient de la protéine HrpN d’E. amylovora,
identifiée et caractérisée dans les années 1990 (Wei et al., 1992). Des harpines ont par la suite été
140
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
identifiées chez différentes bactéries phytopathogènes telles que P. syringae pv. syringae, E.
amylovora, E. chrysanthemi, X. axonopodis pv. glycines ou R. solanacearum. Lorsqu’on infiltre
des harpines purifiées dans l’apoplaste, ces protéines ont la propriété d’induire une réaction nonspécifique de type HR sur différentes plantes. Les harpines sont détectées dans le surnageant de
bactéries cultivées dans un milieu inducteur des gènes hrp. Il s’agit donc d’effecteurs
principalement extracellulaires ou de surface.
Une mutation dans le gène hrpN d’E. amylovora affecte considérablement les phénotypes
hrp (i.e. pouvoir pathogène de la bactérie et capacité d’induire une HR), tandis qu’une mutation
dans hrpZ, le gène codant pour une harpine de P. syringae, n’a pas d’effet (He et al., 1993 ; Wei
et al., 1992). Chez R. solanacearum, PopA est capable d’induire une réaction de type HR sur
tabac et pétunia résistant, mais n’est pas importante pour le pouvoir pathogène de la bactérie sur la
tomate ou sur un cultivar sensible de pétunia (Arlat et al., 1994).
Les protéines HrpW d’E. amylovora et de P. syringae représentent un autre type de
harpines : elles sont constituées d’un domaine N-terminal suffisant à l’élicitation de la HR, et d’un
domaine C-terminal caractéristique des pectates lyases. La protéine HrpW de P. syringae peut se
fixer à la pectine, mais aucune activité pectinase n’a pu être associée à HrpW. Un mutant hrpW
n’est pas affecté dans sa capacité de provoquer la maladie ni la HR. De façon intéressante, ce
mutant chez E. amylovora est même capable d’induire une HR à partir d’un inoculum plus faible
que dans le cas de la souche sauvage, suggérant que cette harpine pourrait être impliquée dans la
régulation négative de la HR (Charkowski et al., 1998 ; Gaudriault et al., 1998 ; Kim & Beer,
1998).
Il a été postulé que les harpines pourraient être des protéines de coopération avec le système
de sécrétion de type III, assistant la translocation d’effecteurs à l’interface entre la bactérie et la
cellule végétale (Cornelis & Van Gijsegem, 2000). Par exemple, HrpZ de Ps pv. phaseolicola peut
s’intégrer in vitro à des membranes bi-lipidiques synthétiques, et permettre la formation de pores
conducteurs d’ions (Lee et al., 2001). De plus, HrpZ est sécrétée à l’extrémité du pilus hrp,
suggérant que cette protéine pourrait servir de médiateur pour la translocation (Li et al., 2002).
Alternativement, il est possible que les harpines jouent un rôle dans la libération de
nutriments de la cellule végétale vers l’apoplaste (Jin et al., 2003).
Enfin, l’action des harpines pourrait également être de déstabiliser les membranes des
cellules végétales, permettant ainsi leur mort cellulaire. La harpine HrpZ de Ps pv. syringae a été
observée associée à la paroi végétale (Hoyos et al., 1996). HrpN d’E. amylovora et Pantoae
stewartii sont capables de dépolariser les membranes plasmiques végétales (Ahmad et al., 2001 ;
141
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
Pike et al., 1998), et PopA de R. solanacearum permet la formation de pores et est capable de
s’intégrer dans des liposomes (Racapé et al., 2005).
III. Les substrats du système de sécrétion de type III
Pauvre en eau et en nutriments, l’apoplaste végétal est considéré comme un environnement
hostile pour les bactéries phytopathogènes ; de plus, il est le lieu de la sécrétion des molécules de
défenses des plantes. Les substrats du système de sécrétion de type III, souvent appelés effecteurs
ou T3E (Type Three Effectors), sont des protéines qui contribueraient (i) à entraîner la fuite d’eau
et de nutriments dans l’apoplaste par les cellules végétales, et (ii) à supprimer les réponses de
défense basales et/ou gène-spécifiques de la plante. Les changements induits dans les cellules de
l’hôte amélioreraient ainsi l’environnement des bactéries et permettraient leur prolifération (Jin et
al., 2003). Bien qu’admis par la communauté scientifique, le premier point n’est cependant pas
clairement démontré à ce jour. Enfin, la capacité des effecteurs à interférer avec les voies de
signalisation de la défense de leur hôte laisse supposer qu’ils pourraient agir sur de nombreuses
composantes du métabolisme de la plante.
III.1. Conservation de séquences et domaines particuliers
Les protéines effectrices présentent généralement très peu d’homologies entre elles ou avec
des protéines aux fonctions connues. Cependant, certains effecteurs sont présents chez différents
pathovars d’une même espèce : chez Pseudomonas syringae, par exemple, AvrA et AvrC de Ps
pv. glycinea (Psg) ont au moins un orthologue, respectivement AvrA de Ps pv. tomato (Pst) et
AvrPphC de Ps pv. phaseolicola (Psph). De même, AvrD de Pst a un orthologue chez Ps pv.
lachrymans (Psl) et chez Psph. Enfin, AvrPpiA de Ps pv. pisi (Psp) a un orthologue chez Ps pv.
maculicola (Psm) : AvrRpm1 (Leach & White, 1996).
Certains effecteurs peuvent aussi avoir un ou des orthologue(s) chez des genres bactériens
distincts : par exemple, AvrBs1 de Xav et AvrA de Psg possèdent des régions C-terminales
identiques à 47%.
Enfin, de façon très intéressante, plusieurs effecteurs de Xav, dont AvrRxv, ont des
orthologues chez une bactérie non phytopathogène, i.e. les protéines Yop (Yersinia outer proteins)
de Y. enterocolitica et Y. pestis, également sécrétées par le système de sécrétion de type III de ces
bactéries (Salmond, 1994). Ces protéines définissent une famille appelée AvrRxv/YopJ, qui
comporte des membres chez P. syringae pvs. [HopZ2 (ou AvrPpiG1) et HopZ3 (ou HopPsyV)],
142
répétitions
NLS AD
Figure III-6 : Structure schématique des effecteurs AvrBs3 et AvrBs4 de Xanthomonas
axonopodis pv. vesicatoria. La région centrale de ces protéines est composée de 17,5
répétitions quasi-identiques d’un motif de 34 acides aminés. La région C-terminale de
ces protéines contient des domaines NLS (Nuclear Localization Signal) fonctionnels,
ainsi qu’un domaine activateur de transcription (AD). Les séquences des 2 protéines
présentent 96,6 % d’identité ; les différences résident dans les répétitions centrales,
ainsi que dans une délétion de 4 acides aminés en C-terminal. (D’après Schornack et
al., 2006).
714
Figure III-7 : Structure schématique de l’effecteur AvrBs2 de Xanthomonas axonopodis
pv. vesicatoria et des domaines nécessaires à la sécrétion et à la reconnaissance par la
protéine de résistance correspondante, Bs2, du poivron. Le signal de sécrétion de
AvrBs2, ainsi que d’autres effecteurs de type III d’autres bactéries phytopathogènes,
réside dans la région N-terminale de la protéine, tandis que le domaine « effecteur » de
la protéine, nécessaire à l’interaction avec Bs2, réside en C-terminal. (D’après Mudgett
et al., 2000).
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
E. amylovora [HopZ1 (ou HopPmaD)] et R. solanacearum (PopP1 et PopP2) (Gürlebeck et al.,
2006), dont les particularités seront décrites dans le § III.3.
L’effecteur AvrBS3 de Xav définit une famille multigénique qui possède de nombreux
membres très conservés chez plusieurs espèces de Xanthomonas (Bonas & Van den Ackervaken,
1997). Cette famille est caractérisée par une région interne à la séquence protéique constituée de
répétitions quasi-identiques de 34 acides aminés [Figure III-6, (Schornack et al., 2006)]. Les
protéines de la famille AvrBs3 présentent 90 à 97% d’identité entre elles, la variabilité résidant
uniquement dans la région répétée (Leach & White, 1996). AvrBs4 appartient à la famille AvrBs3
(Figure III-6).
De façon surprenante, les effecteurs de type III ne présentent pas dans leur séquence Nterminale le « classique » peptide signal, courte séquence peptidique clivable, normalement
requise pour l’export des protéines bactériennes au-delà de la membrane cytoplasmique par le
système de sécrétion de type II (Izard & Kendall, 1994). Les signaux de sécrétion des effecteurs
de type III sont longtemps restés inconnus. En utilisant comme gène rapporteur le gène codant
pour l’effecteur de type III AvrRpt2 de P. syringae, il a été montré que le signal de sécrétion de
AvrBs2 de Xav réside dans les 28 acides aminés N-terminaux, et que les 58 acides aminés Nterminaux sont nécessaires à la translocation de cet effecteur (Figure III-7) (Mudgett et al., 2000).
De même, le domaine C-terminal de AvrRpt2 seul ne peut être transloqué dans la cellule végétale,
confirmant l’importance du domaine N-terminal dans la sécrétion des effecteurs de type III
(Guttman & Greenberg, 2001).
Le domaine adenylate cyclase (Cya) calmoduline-dépendant de la cyclolysine de Bordetella
pertussis (Masure, 1992) peut être utilisé, dans une fusion transcriptionnelle, comme système
rapporteur pour montrer la translocation d’une protéine : l’activité adénylate cyclase, responsable
de la synthèse d’AMP cyclique (AMPc), étant dépendante de la présence de la calmoduline
eucaryote, la détection d’AMPc indique donc que la protéine a bien été transloquée dans la cellule
végétale. Ce système a permis de confirmer l’injection d’AvrBs2 (Casper-Lindley et al., 2002),
mais aussi de déterminer le signal de sécrétion de l’effecteur AvrPto de Pst : les 16 acides aminés
N-terminaux de cet effecteur sont suffisants pour la translocation de la protéine dans la cellule
végétale, et les quelques acides aminés suivants permettent une translocation plus efficace. Ce
système a permis de montrer la translocation de nombreux autres effecteurs, notamment chez Pst
(Schechter et al., 2004).
143
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
III.2. Rôle dans le pouvoir pathogène sur plante hôte
D’excellentes revues décrivent la contribution au pouvoir pathogène des nombreux
effecteurs de type III identifiés à l’heure actuelle (Abe et al., 2005 ; Grant et al., 2006 ; Greenberg
& Vinatzer, 2003 ; Gürlebeck et al., 2006 ; Jin et al., 2003 ; Kjemtrup et al., 2000 ; Mudgett,
2005). Ainsi, si la fonction biologique de nombreuses protéines effectrices est encore mal connue,
leur implication dans le pouvoir pathogène lors d’une interaction compatible a été très étudiée.
Si les effecteurs contribuent au pouvoir pathogène des bactéries de façon additive et
partiellement redondante, une implication individuelle d’effecteurs de type III dans l’adaptation
sur plantes hôtes a été rapportée dans plusieurs cas. Par exemple, un mutant avrBs2 de Xav est
affecté dans son pouvoir pathogène sur un cultivar de poivron sensible (ne possédant pas le gène
de résistance Bs2), et un mutant dans l’orthologue d’avrBs2 chez X. campestris pv. alfalfae est
également hypoviulent sur la luzerne (Kearney & Staskawicz, 1990). De même, AvrRpm1 de Psm
participe de façon significative au pouvoir pathogène de la bactérie sur Arabidopsis thaliana
(Ritter & Dangl, 1995).
Les membres de la famille AvrBs3 sont d’importants déterminants de la virulence de X.
campestris pv. malvacearum et X. oryzae pv. oryzae sur coton et riz, respectivement. Des mutants
multiples sont très affectés dans leur pouvoir pathogène : par exemple, le pouvoir pathogène de
Xcm sur coton requiert l’action cumulée d’au moins 7 membres de la famille AvrBs3, mais de
façon intéressante le septuple mutant, totalement non pathogène sur coton, présente la même
croissance in planta que la souche sauvage (Yang & White, 2004 ; Yang et al., 1996).
III.3. Les effecteurs de type III sont capables de supprimer les défenses basales
de la plante
Certains effecteurs de type III sont capables d’interférer avec une ou plusieurs composantes
des voies de réponses de défense basales (Figure III-13).
La réduction globale du flux vasculaire en réponse à un pathogène peut être supprimée par
différents effecteurs de type III de Pst : AvrE, HopM1 (anciennement appelé HopPtoM), HopF2
(anciennement appelé HopPtoF) et HopG1 (anciennement appelé HopPtoG) (Oh & Collmer,
2005).
Certains effecteurs sont connus pour être capables de supprimer une autre réponse basale
importante, i.e. le dépôt de callose chez la plante infectée. C’est le cas des effecteurs AvrE,
HopM1 (DebRoy et al., 2004), AvrPto (Hauck et al., 2003), AvrPtoB (de Torres et al., 2006) et
144
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
AvrRpt2 de Pst (Kim et al., 2005), mais aussi de AvrRpm1 (Kim et al., 2005) de Psm et de
certains effecteurs de Xav (Keshavarzi et al., 2004).
Les voies de signalisation des MAP Kinases (MAPK) sont la cible des effecteurs de Pst
HopAO1 (HopPtoD2), qui présente une activité tyrosine phosphatase (Bretz et al., 2003 ;
Espinosa et al., 2003), AvrPto et AvrPtoB (He et al., 2006).
Comme évoqué précédemment, les effecteurs de la famille AvrRxv/YopJ de Xav (AvrRxv,
AvrXv4, AvrBst et XopJ) sont des protéases à cystéine homologues à la protéine YopJ de Yersinia
pseudotuberculosis (Ciesiolka et al., 1999). Lorsqu’injectée dans des macrophages par le système
de sécrétion de type III de la bactérie, YopJ inhibe la voie de signalisation MAPK, conduisant à
l’apoptose (Monack et al., 1997 ; Palmer et al., 1998 ; Palmer et al., 1999). Plus récemment, il a
été montré que YopJ est une SUMO (Small Ubiquitin Modifier) cystéine protéase, qui régule
négativement la signalisation conduisant au protéasome en supprimant des résidus ubiquitine
sur des cibles végétales particulières, les protéines TRAF (Hochstrasser, 2000 ; Hochstrasser,
2000 ; Sweet et al., 2007 ; Zhou et al., 2005). Chez Xav, la capacité de dé-ubiquitination a été
démontrée pour AvrXv4 (Roden et al., 2004), mais aussi pour une autre cystéine protéase
appartenant à une famille distincte de AvrRxv/YopJ : la protéine XopD (Hotson et al., 2003). Ces
SUMO cystéine protéases sont toutes deux actives dans le cytoplasme de la cellule végétale. De
façon intéressante, ces protéines possèdent des NLS (Nuclear Localization signal), et il a été
suggéré que XopD pourrait par exemple manipuler le transcriptome de la plante en désumoylant
des facteurs de transcription (Gürlebeck et al., 2006). Les protéines GALA de R. solanacearum,
qui possèdent des répétitions riches en leucine (LRR), sont des effecteurs de type III qui miment
les protéines à F-box eucaryotes ; il a été montré que les protéines GALA interfèrent également
avec la voie ubiquitine et la dégradation des protéines végétales par le protéasome (Angot et al.,
2006).
Les effecteurs de type III sont également capables de moduler les voies de signalisation
hormonales : c’est le cas de AvrPto et AvrPtoB de Pst, qui régulent positivement des gènes de la
voie de biosynthèse de l’éthylène (Cohn & Martin, 2005). D’autres effecteurs de cette bactérie
jouent également sur la voie de signalisation de l’acide jasmonique (He et al., 2004). Enfin,
HopPtoM et AvrE de P. syringae pvs., DspA et DspE d’Erwinia amylovora, et WtsE de Pantoea
stewartii subsp. stewartii, suppriment la réponse basale acide salicylique-dépendante (DebRoy et
al., 2004).
145
/ xa5
Xa5
Figure III-8 : Les protéines de la famille AvrBs3 et leur mécanisme d’action putatif dans
la modulation de l’expression des gènes de la plante. (A) AvrXa5 est impliqué dans
l’activation de gènes entraînant la maladie, via une interaction avec le facteur de
transcription TFIIA (Transcription Factor IIA) au sein du complexe de transcription PIC
(Pre-Initiation Complexe). La sous-unité γ du TFIIA est codée par le gène Xa5. Dans des
plantes xa5, les différences dans la séquence du TFIIA abolissent l’interaction AvrXa5PIC (réaction incompatible). (B) AvrXa27 interagit directement ou indirectement avec les
promoteurs de gènes entraînant la maladie (réaction compatible). Dans des plantes
résistantes, le promoteur du gène de résistance Xa27 est spécifiquement reconnu et
activé par AvrXa27. (C) La reconnaissance dans le cytoplasme de la cellule végétale de
la protéine de résistance Bs4 et du gène d’avirulence AvrBs4 ou sa forme AvrBs4∆230
(délétée des domaines AD, NLS et d’une partie des répétitions) entraîne une réaction
hypersensible et la résistance de la plante. Lors d’une interaction compatible, AvrBs4
serait importé dans le noyau où il activerait des gènes entraînant la maladie. (D’après
Schornack et al., 2006).
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
III.4. Les effecteurs de type III sont capables de moduler l’expression des gènes
de la plante
Chez les bactéries du genre Xanthomonas, certaines protéines pourraient vraisemblablement
interagir avec la machinerie transcriptionnelle des cellules végétales : les protéines de la famille
AvrBs3 présentent dans leur région C-terminale des domaines NLS (Nuclear Localization Signal)
(Figure III-6), démontrés comme étant fonctionnels et nécessaires à la fonction de la protéine dans
le pouvoir pathogène de la bactérie. Cela suggère une localisation nucléaire de ces protéines dans
la cellule végétale (Szurek et al., 2001 ; Van den Ackerveken et al., 1996 ; Yang et al., 2000).
L’utilisation d’anticorps anti-AvrBs3 a permis la détection de cette protéine dans le noyau de
cellules végétales infectées par Xav (Szurek et al., 2002), et il est fortement suggéré que les
membres de la famille AvrBs3 pourraient agir dans le noyau comme régulateurs de l’expression
de gènes de la plante.
En plus des NLS, les membres de la famille AvrBs3 possèdent un domaine C-terminal
activateur de transcription (AD, Activation Domain) (Figure III-6), montré comme étant
fonctionnel chez la levure dans le cas de l’effecteur AvrXa10 de Xoo (Zhu et al., 1998 ; Zhu et al.,
1999). L’effecteur AvrBs3 de Xav module l’expression d’au moins 13 gènes de la plante (Marois
et al., 2002). S’il est possible que le domaine AD ne soit important que pour la stabilité et la
conformation de la protéine dans la cellule végétale, plusieurs études suggèrent toutefois un
modèle selon lequel les membres de la famille AvrBs3 pourraient réguler l’expression de gènes de
la plante de façon directe : par exemple, l’effecteur AvrXa7 de Xoo, qui cible le noyau de la
cellule végétale, est capable de fixer l’ADN in vitro (Yang et al., 2000). La Figure III-8 illustre
comment trois membres de la famille AvrBs3 (AvrXa5 et AvrXa27 de Xoo, et AvrBs4 de Xav)
interfèrent avec la machinerie transcriptionnelle de la plante dans le cas d’une interaction
compatible ou incompatible (Schornack et al., 2006). Dans le noyau de cellules de riz, l’effecteur
AvrXa27 est capable d’induire l’expression spécifique de l’allèle dominant du gène codant pour la
protéine de résistance Xa27, les allèles récessifs n’étant alors pas induits (Gu et al., 2005).
AvrXa5 et AvrXa27 appartiennent à une famille d’effecteurs de Xoo appelée TAL (Transcription
Activator-Like), comprenant 22 membres putatifs (Schornack et al., 2006 ; Yang et al., 2006).
D’autres membres de cette famille ont été récemment caractérisés : PthXo1, PthXo6 et PthXo7
induisent respectivement l’expression des gènes du riz Os8N3 (allèle récessif de la protéine de
résistance Xa13), OsTFX1 (un facteur de transcription de type bZIP) et OsTFIIAγ1 (sous-unité γ
du complexe de transcription TFIIA) (Sugio et al., 2007 ; Yang et al., 2006).
146
Génotype de la plante
R (résistante)
r (sensible)
Incompatibilité
Résistance
Compatibilité
Maladie
Pathogène avirulent
Avr
Génotype du pathogène
(avirulent)
R
Plante
résistante
Pathogène virulent
Avr
Avr
*
Plante hôte
**
HR
R
**
**
avr
(virulent)
Compatibilité
Maladie
Compatibilité
Maladie
Figure III-9 : Le modèle gène-pour-gène ou la reconnaissance R/Avr. La présence de
l’allèle dominant du gène de résistance (R) chez la plante, et de l’allèle dominant Avr du
gène d’avirulence chez le pathogène, déclenche la résistance dite « gène-spécifique », et
l’interaction est dite incompatible. Dans le cas où r et/ou avr sont absents ou récessifs, la
maladie a lieu et l’interaction est dite compatible. Le modèle gène-pour-gène est ici illustré
par le modèle de reconnaissance Ligand-Récepteur.
* Réaction Hypersensible (HR) sur une plante résistante (tabac) causée par
Pseudomonas syringae pv. glycinea (Psg) (Photo : Université de marburg, Allemagne ;
http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2000/0075/html/2.1.html).
** Symptômes de la maladie sur plante-hôte (soja) causée par Psg (Photo : Max Planck
Institute for Chemical Ecology, Jena, Allemagne ;
http://www.ice.mpg.de/bol/research/plants/pseudomonas.jpg).
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
Cette fonction de régulation de gènes de l’hôte n’est pas l’apanage des effecteurs AvrBs3
des Xanthomonas : HsvG et HsvB de Pantoea agglomerans pvs. gypsophilae et betae sont des
effecteurs de type III capables de se fixer à l’ADN double brin au niveau de la séquence
consensus ACACC/aAA, et donc vraisemblablement d’activer la transcription de gènes de la
plante (Nissan et al., 2006).
Chez les bactéries du genre Pseudomonas, de nombreux effecteurs de type III capables de
supprimer de façon directe ou indirecte l’expression de gènes de la plante ont été identifiés : on
peut citer AvrPto, HopF2, HopS1, HopAF1 (HopPtoJ), HopT1 (HopPtoT1), HopT1-2, HopAA11, HopAI-1 et HopC1 (HopPtoC1) de Pst, qui suppriment d’induction du gène NHO1 en réponse
à un traitement au peptide flg22 (Li et al., 2005), ou encore AvrRpt2 de Pst et AvrRpm1 de Psm,
qui suppriment l’induction du gène GST6 ainsi que des gènes codant pour les protéines
« pathogenesis-Related » PR1, PR2 et PR5 (Kim et al., 2005).
IV. La défense gène-spécifique
Au cours d’une interaction incompatible, un autre niveau de défense se met en place en plus
de la défense basale, et conduit à la résistance de la plante vis-à-vis du pathogène : il s’agit de la
défense
« gène-spécifique ».
La capacité d’une plante d’induire une défense
gène-
spécifique dépend du patrimoine génétique des 2 partenaires de l’interaction, et suit le célèbre
modèle « gène pour gène », ou modèle R/avr [gène de résistance (R) de la plante / gène
d’avirulence (avr) de la bactérie] décrit par Flor dans les années 1950 (Flor, 1942 ; Flor, 1955 ;
Flor, 1971).
IV.1. Le concept « Gène pour Gène »
Au cours de l’évolution, les génomes végétaux ont sélectionné des gènes particuliers, codant
pour des protéines dites de résistance (protéines R), capables de reconnaître de façon directe ou
indirecte des protéines particulières des microorganismes phytopathogènes, dites protéines
d’avirulence (Avr). La présence simultanée d’une protéine R donnée et d’une protéine Avr
spécifique conduit à la résistance de la plante. En revanche, si l’une ou l’autre de ces protéines est
absente ou que l’un des deux gènes correspondant est présent sous une forme inactive, alors
l’interaction sera compatible, et la maladie aura lieu (Figure III-9). Le modèle « gène pour gène »
gouverne la résistance des plantes envers divers pathogènes, incluant des bactéries, des
champignons, des oomycètes, des virus, des nématodes et des insectes.
147
Effecteurs
de type III
R
Avr
Cible
SAR
Si
gn
al
isa
t
io
n
SAR
HR
H202, SA, JA, ET
noyau
H202, SA, JA, ET
Expression génétique
différentielle
H202, SA,
JA, ET
SAR
Figure III-10 : Modèle décrivant l’activation des défenses gène-spécifiques. La
reconnaissance R/Avr conduit à la Réaction Hypersensible (HR) (mort des cellules
infectées) et à la Résistance Systémique Acquise (SAR) des cellules voisines, de façon
dépendante de l’acide salicylique (SA). La reconnaissance R/Avr est ici illustrée par le
modèle de garde selon lequel la protéine R détecte des modifications induites par la
protéine Avr sur une protéine cible. JA, Acide Jasmonique ; ET, Ethylène.
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
La caractérisation moléculaire des gènes avr bactériens a montré qu’ils codent, à de très
rares exceptions près, pour des effecteurs injectés dans la cellule végétale par le système de
sécrétion de type III.
Si la majorité des protéines R sont spécifiques d’un facteur d’avirulence donné, certaines
sont toutefois capables de reconnaître et d’interagir avec deux protéines d’avirulence : c’est le cas
de la protéine Pto de la tomate, qui reconnaît les protéines d’avirulence AvrPto et AvrPtoB de Pst
(Kim et al., 2002 ; Martin et al., 1993), et de la protéine de résistance RPM1 d’Arabidopsis
thaliana, qui reconnaît les protéines AvrRpm1 et AvrB de Psm et Psg, respectivement (Grant et
al., 1995) (Tableau III-3). De façon intéressante, les deux protéines d’avirulence semblent alors
exercer la même fonction dans la cellule végétale.
IV.2. Les composantes de la résistance gène-spécifique
Lors d’une interaction incompatible, des réponses spécifiques viennent s’ajouter aux
composantes de la résistance basale précédemment décrites (burst oxydatif, voie des MAPK, etc).
Les mécanismes d’activation de ces défenses spécifiques sont schématisés sur la Figure III-10. Un
second burst oxydatif est spécifiquement observé lors de la défense gène-spécifique, et
contribuerait à la Réaction Hypersensible, ou HR.
IV.2.A. La Réaction Hypersensible
La HR est une forme particulière de mort cellulaire programmée (PCD, Programmed Cell
Death), qui a lieu très précocement (en quelques heures) chez la plante, en réponse à un pathogène
avirulent. Elle se caractérise par une nécrose rapide et localisée au niveau du site de l’infection, et
a pour conséquence le confinement du pathogène : en le privant de l’eau et des nutriments
nécessaires à sa croissance, la plante stoppe de façon très efficace le développement de son
agresseur (Dangl et al., 1996 ; Klement & Goodman, 1967 ; Lam et al., 2001) (Figure III-10). La
HR s’accompagne de la production d’un grand nombre de molécules, dont certaines ont été
mentionnées précédemment comme participant à la défense basale (Figure III-11).
IV.2.B. La Résistance Systémique Acquise
Outre ce rôle de confinement, la HR est une source de signaux secondaires permettant la
mise en place d’une résistance systémique. En effet, elle s’accompagne de la production de
nombreux messagers secondaires (H202, SA, JA, ET) qui signalent l’attaque aux cellules voisines
et les placent dans un état de résistance (Figure III-10). L’induction de la SAR (Systemic
148
Infection par un microorganisme avirulent
Burst oxydatif
Production de ROS et de NO
1 heure
Synthèse d’acide salicylique
4 heures
Synthèse d’éthylène
et de jasmonate
Phaseoline (haricot)
Production de
phytoalexines
Rishitine
(pomme de terre)
10 heures
Transcrits de protéines PR
ARNm chitinases, glucanases…
Dépôt de callose et
renforcement de la paroi
Coloration de la callose au
bleu d’aniline
Temps
Figure III-11 : Production de molécules lors de la réaction hypersensible (HR). Très
rapidement après l’infection par un microorganisme phytopathogène, la plante produit
différentes molécules (molécules signales, molécules protectrices ou molécules antimicrobiennes). PR, Pathogenenis-Related.
RLP
RLK
LRR
LRR
TD
TD
Apoplaste
Membrane
plasmique
Cytoplasme
CC
CC
TIR
NB
NB
TD
Domaine
kinase
LRR
RPW8
NB-LRR
(RRS1-R)
LRR
Xa27
NB-LRR
NB
LRR
NLS
WRKY
Noyau
Figure III-12 : Structure des principales protéines de résistance (protéines R) végétales.
Les deux classes principales de protéines R sont les NB-LRR et les RLP (Receptor-Like
Proteins). Parmi les protéines NB-LRR, on distigue deux sous-classes, l’une présentant
un domaine TIR et l’autre un domaine CC. Les RLP sont des protéines membranaires
présentant des LRR extracellulaires ; les RLK (Receptor-Like Kinases) sont des RLP
particulières présentant en plus un domaine kinase cytoplasmique. TIR, Toll/Interleukin
Receptor ; NB, Nucleotide Binding ; LRR, Leucin Rich Repeats ; CC, Coiled-Coil ; TD,
Transmembrane Domain ; NLS, Nuclear Localization Signal ; WRKY est un domaine de
fixation à l’ADN caractérisé par le motif formé par les 4 acides aminés WRKY. (D’après
Chisholm et al., 2006).
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
Acquired Resistance) dépend de l’accumulation d’acide salicylique et est corrélée à l’expression
de protéines PR. La SAR permet ainsi d’augmenter les défenses de la plante lors d’éventuelles
attaques ultérieures [pour revue, voir (Durrant & Dong, 2004)].
La nature précise du signal mobile déclenchant la SAR est incertaine, mais il est très
vraisemblable que celui-ci soit véhiculé par les vaisseaux, et perçu par des cellules à proximité des
vaisseaux (Alvarez et al., 1998).
IV.3. Les protéines R végétales et les protéines Avr bactériennes
IV.3.A. Les protéines de résistance
Le premier gène de résistance (R) cloné est le gène Cf9, qui contrôle la résistance de la
tomate au champignon Cladosporium fulvum (Jones et al., 1994). A l’heure actuelle, plus de 40
gènes R ont été clonés chez différents cultivars végétaux [pour revue, voir (Martin et al., 2003 ;
McDowell & Woffenden, 2003 ; McDowell, 2004)]. En fonction de leur structure modulaire, on
distingue différentes classes de protéines de résistance (Chisholm et al., 2006 ; Nimchuk et al.,
2003), représentées schématiquement sur la Figure III-13.
Classe NB-LRR :
Les protéines de type NB-LRR sont les protéines de résistance les plus répandues. Le
génome d’Arabidopsis thaliana en contient environ 150 (Jones & Jones, 1996) [Tableau III-2,
(Quirino & Bent, 2003)]. Les protéines appartenant à cette classe sont cytoplasmiques et
présentent un domaine NB de fixation aux nucléotides (également appelé NBS, Nucleotide
Binding Site) et un domaine LRR (Leucine Rich Repeat), impliqué dans les interactions protéineprotéine. La sous-classe CC-NB-LRR présente en plus un domaine Coiled-Coil (CC) de fonction
mal connue, et la sous-classe TIR-NB-LRR un domaine TIR (Toll / Interleukin Receptor),
impliqué dans la signalisation de la résistance. La protéine RRS1-R (Resistance to Ralstonia
solanacearum 1-R) d’Arabidopsis thaliana est un nouveau membre de la sous-classe TIR-NBLRR, qui présente deux domaines supplémentaires, un domaine NLS (Nuclear Localization
Signal) ainsi qu’un domaine homologue aux facteurs de transcription WRKY (Deslandes et al.,
2002) (Figure III-12).
Classe RLP (Receptor-Like Proteins) :
Les protéines appartenant à cette classe sont membranaires et présentent un domaine
transmembranaire et un domaine LRR extracellulaire. Les RLK (Receptor-Like Kinases) sont une
sous-classe particulière de RLP, présentant en plus un domaine sérine/thréonine kinase
149
Tableau III-2 : Nombre de protéines putatives du génome d’Arabidopsis thaliana
présentant un domaine NBS (Nucleotide Binding Site) et/ou des LRR (Leucin Rich
Repeats) (D’après Quirino et Bent, 2003).
Tableau III-3 : Gènes d'avirulence pour lesquels un gène de résistance a été identifié chez une plante.
*
indique les gènes codant pour des effecteurs non sécrétés par le système de sécrétion de type III.
Pathogène
P. syringae pv. glycinea
Gène avr
Fonction de la protéine
Gène R
Plante
avrA
Famille YopJ/AvrRxv
RPG2
soja
avrB
kinase
RPG1-b
soja
RPM1
Arabidopsis
avrC
P. syringae pv. maculicola
RPG3
soja
RPM1
Arabidopsis
RPM1
Arabidopsis
R2
pois
avrPpiB1
R3
pois
avrPphD
R5
pois
avrRps4 (avrPpiE)
RPS4
Arabidopsis
Pto (et PRF)
tomate
RPS2
soja
RPS2
Arabidopsis
RPS4
Arabidopsis
RPG4
soja
RPS5 (et PBS1)
Arabidopsis
R3
haricot
R2
haricot
avrRpm1
kinase
avrPpiA1
P. syringae pv. pisi
avrPto
P. syringae pv. tomato
avrPtoB
E3 ubiquitine ligase
avrRpt2
cystéine protease
avrRps4
avrD
enzyme impliquée dans la
biosynthèse de syringolide
hopAR1 (avrPphB)
cystéine protéase
P. syringae pv. phaseolicola
hopX (avrPphE)
avrPphF
X. axonopodis pv. vesicatoria
R1
haricot
avrBs1
Famille YopJ/AvrRxv
Bs1
poivron
avrBs2
agrocipine synthase-like
Bs2
poivron
avrBs3
activateur de transcription
Bs3
poivron
avrBs4
Famille AvrBs3
Bs4
tomate
avrBsT
Famille YopJ/AvrRxv
BsT
Arabidopsis
avrXv3
activateur de transcription
Xv3
tomate
avrXv4
Famille YopJ/AvrRxv - SUMO
cystéine protéase
Xv4
tomate
avrRxv
Famille YopJ/AvrRxv
Rxv
haricot
avrXa3
Famille AvrBs3
Xa3
riz
avrXa5
Famille AvrBs3
Xa5
riz
Xa7
riz
Xa10
riz
Famille AvrBs3 - activateur de
transcription
Famille AvrBs3 - activateur de
transcription
avrXa7
X. oryzae pv. oryzae
avrXa10
*
Xa21
riz
avrXa27
activateur de transcription
Xa27
riz
hax3
Famille AvrBs3
Bs4
tomate
hax4
Famille AvrBs3
Bs4
tomate
X. campestris pv. malvacearum
avrB6
Famille AvrBs3
B1
coton
X. oryzae pv. oryzicola
avrRxo1
RXO1
maïs
R. solanacearum
popP2
RRS1-R
Arabidopsis
avrXa21
X. campestris pv. armoraciae
Famille YopJ/AvrRxv
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
cytoplasmique (Figure III-12). Ainsi, certaines protéines R sont structuralement similaires aux
récepteurs des PAMPs, les PRR.
Autres :
Il existe d’autres types de protéines R. La protéine de résistance Pto de la tomate est une
protéine membranaire, possédant un domaine transmembranaire et un domaine kinase
intracellulaire ; la protéine RPW8 d’Arabidopsis thaliana est une protéine de résistance
membranaire possédant un domaine transmembranaire et un domaine CC intracellulaire. Enfin,
Xa27 est une protéine de résistance du riz qui ne présente pas de similarité avec des protéines
connues (Figure III-12).
IV.3.B. Les protéines d’avirulence
Le premier gène d’avirulence identifié et cloné est le gène avrA de Pseudomonas syringae
pv. glycinea (Staskawicz et al., 1984). Aujourd’hui, plus de 40 gènes d’avirulence ont été
identifiés par différentes approches. Une protéine de résistance correspondante n’a pu être
identifiée que pour un nombre limité de gènes d’avirulence. La Tableau III-3 liste l’ensemble des
couples avr/R connus à l’heure actuelle et indique la fonction du gène avr lorsqu’elle est connue.
Tout comme les îlots de pathogénicité (« Pathogenicity Islands », PAI), les gènes avr sont
reconnus comme étant des éléments génétiques potentiellement mobiles ; leur acquisition au cours
de l’évolution des bactéries et de leurs hôtes résulte probablement de transferts horizontaux
relativement récents. En effet, ils sont fréquemment présents sur des plasmides et/ou associés à
des éléments génétiques transposables ou à des séquences de phages. De plus, dans certains cas,
tels que celui du gène avrB de Pseudomonas syringae, la teneur en G et C (GC%) du gène est
différent du GC% moyen du génome (Collmer, 1998 ; Leach & White, 1996).
Dans la très grande majorité des cas, les protéines d'avirulence sont des substrats du système
de sécrétion de type III. Un appareil de sécrétion fonctionnel est alors nécessaire à l’injection de
ces protéines, donc à leur activité dans la cellule végétale. Toutefois, un cas de gène d’avirulence
TTSS-indépendant a été récemment rapporté : la protéine AvrXa21 de Xanthomonas oryzae pv.
oryzae, qui confère l’avirulence de cette bactérie sur les cultivars de riz possédant le gène de
résistance Xa21, semble en effet être sécrétée par le système de sécrétion de type I. En effet, la
présence des gènes raxA, B et C, codant pour des composants du système de sécrétion de type I,
est nécessaire à la fonction d’avirulence d’AvrXa21, et donc à la résistance de la plante. En
revanche, l’activité de AvrXa21 n’est pas affectée dans un mutant hrp (Lee et al., 2006).
150
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
Comme définis précédemment, les protéines d’avirulence sont des effecteurs particuliers,
reconnus par des protéines R de la plante hôte ; cette reconnaissance « gène pour gène » entraîne
une réaction hypersensible et aboutit à la résistance totale de la plante. La fonction première des
gènes d’avirulence n’est pourtant probablement pas de permettre la reconnaissance du pathogène
par une plante résistante : si tel avait été le cas, ces gènes, qui ne procureraient à la bactérie aucun
avantage sélectif, auraient été perdus au cours de l’évolution. En réalité, le répertoire de gènes
d’avirulence d’une souche bactérienne définit directement son spectre d’hôtes. Ainsi, les protéines
d’avirulence jouent un rôle bivalent dans l’interaction plante-pathogène, en fonction de la
présence ou de l’absence du gène R correspondant chez la plante : si R est présent, les gènes
d’avirulence ont une influence négative sur le pouvoir pathogène de la bactérie, dans la mesure où
la reconnaissance de leurs produits entraîne l’induction des réponses de défenses et la résistance
de la plante. En revanche, comme souligné précédemment, certaines protéines d’avirulence
contribuent significativement au pouvoir pathogène de la bactérie lors d’une interaction
compatible avec une plante hôte, c’est à dire si R est absent. Le gène phtA (membre de la famille
AvrBs3), qui confère l’avirulence de X. campestris pvs. phaseoli et malvacearum sur haricot et
coton, respectivement, avait à l’origine été identifié chez X. axonopodis pv. citri en tant que
facteur important pour la virulence de la bactérie sur citron (Swarup et al., 1992). Ainsi, l’une des
difficultés rencontrées dans la caractérisation des propriétés intrinsèques des gènes d’avirulence
est que leurs produits n’ont de fonction d’avirulence que si les gènes sont présents chez une
espèce, un pathovar ou une souche donnée, cette propriété étant en plus dépendante du cultivar
végétal. Par exemple, un effet des gènes avrA et avrE de Psg dans la virulence de Pst sur la
tomate n’a pu être détectée que pour une seule souche (la souche PT23) (Lorang et al., 1994).
L’homologue de AvrE chez E. amylovora, DspE, ainsi que la chaperone DspF nécessaire à la
sécrétion de DspE, sont des effecteurs importants pour le pouvoir pathogène de la bactérie, mais,
contrairement à avrE, pas pour l’induction d’une HR lors d’une interaction incompatible. Chez
Erwinia, DspE est donc un facteur de virulence mais pas d’avirulence, d’où l’appellation dsp,
pour « disease specific ». Cependant, si le locus dspEF est tranféré chez Psg, la fonction
d’avirulence est retrouvée (Bogdanove et al., 1998 ; Gaudriault et al., 1997) !
AvrBs2 est le premier gène d’avirulence pour lequel une contribution dans le pouvoir
pathogène de la bactérie a été démontrée. Des souches de Xav possédant différents allèles mutants
du gène avrBs2 ont pu être isolés à partir de poivrons malades possédant le gène de résistance
Bs2. L’analyse de la séquence de ces allèles suggère qu’au cours de l’évolution, la fonction
d’avirulence de ce gène aurait tendance à être perdue et la fonction de virulence conservée. Bs2
151
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
exercerait donc une pression de sélection divergente sur le gène avrBs2 (Gassmann et al., 2000 ;
Kearney & Staskawicz, 1990 ; Nimchuk et al., 2001)
IV.4. La reconnaissance R/Avr
La reconnaissance R/Avr a lieu dès lors qu’une protéine d’avirulence Avr est produite dans
une plante possédant le gène de résistance R correspondant. Une agroinfiltration de la protéine
d’avirulence AvrBs3 n’induit une HR sur le poivron ECW-30R (possédant le gène de résistance
Bs3) que si le gène d’avirulence a été placé en aval du promoteur CaMV 35S, qui ne s’exprime
que dans la plante, pas s’il a été placé en aval du promoteur bactérien pLacZ (Van den
Ackerveken et al., 1996). De plus, cette reconnaissance a bien lieu à l’intérieur des cellules
végétales, puisque si des protéines d’avirulence purifiées telles qu’AvrB, AvrBs3 ou AvrXa10
sont infiltrées dans l’apoplaste, aucune HR n’est observée (Gopalan et al., 1996 ; Leach & White,
1996 ; Van den Ackerveken et al., 1996).
Deux modèles ont été avancés pour décrire la reconnaissance entre les protéines R et Avr.
Le modèle Ligand-Récepteur, tout d’abord, propose une reconnaissance et une interaction directe
entre les deux protéines : c’est le cas de la protéine de résistance RRS1-R d’Arabidopsis thaliana,
qui interagit dans le noyau avec la protéine PopP2 de la bactérie Ralstonia solanacearum
(Deslandes et al., 2003).
Ce modèle a été plus tard complété par le « Modèle de Garde ». Dans ce modèle, la protéine
R est proposée comme étant la « gardienne » de la cible végétale de l’effecteur bactérien (de Wit,
2002). Plus précisément, la protéine R détecterait les modifications induites par la protéine Avr
sur une protéine cible. Par exemple, la protéine Prf de la tomate (protéine de résistance de type
NB-LRR) détecterait une modification indéterminée de la protéine sérine-thréonine kinase Pto
exercée par l’effecteur AvrPto (Van der Biezen & Jones, 1998). Ce modèle a été complété grâce à
de récentes données structurales et biochimiques : en l’absence d’AvrPto, Prf réprimerait l’activité
kinase de Pto, empêchant ainsi le déclenchement des réponses de défense. L’interaction entre
AvrPto et Pto permet l’abolition de cette répression, et donc l’induction des réponses de défense et
de la HR (Xing et al., 2007). Un autre exemple illustrant le modèle de garde est celui du couple
RPM1/RIN4, ciblé par les effecteurs AvrRpm1 ou AvrB ; cet exemple est développé dans le
paragraphe suivant.
152
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
Les protéines R et Avr n’interagissent donc pas nécessairement de façon directe. Il est
important de noter que le modèle de garde permet d’expliquer que certaines protéines Avr peuvent
être des facteurs de pathogénie lorsque la protéine R est absente de la plante.
IV.5. Fonctions biologiques des protéines d’avirulence
Par quels mécanismes une protéine d’avirulence est-t-elle capable de déclencher la HR et la
résistance chez une plante possédant le gène de résistance approprié ?
Il a été postulé que certaines protéines Avr pourraient avoir une activité enzymatique
libérant des molécules élicitrices des réponses de défense végétales ; cela pourrait être le cas de la
protéine AvrBs2 de Xav, qui est homologue à une agrocinopine synthase d’Agrobacterium
tumefaciens. Cependant, cette hypothèse n’a été vérifiée qu’une seule fois, dans le cas de la
protéine AvrD de Pst, enzyme impliquée dans la biosynthèse d’un éliciteur spécifique appelé
« syringolide » (Keen et al., 1990). L’expression transitoire du gène avrD in planta n’induit pas
de HR, tandis que le traitement de plantes résistantes avec le surnageant d’une culture de Pst
exprimant avrD est capable d’induire une HR (Keen et al., 1990 ; Midland et al., 1993 ; Smith et
al., 1993).
La fonction biochimique de quelques protéines d’avirulence a été caractérisée récemment :
• AvrPtoB de Pst est une ubiquitine-ligase qui cible la kinase Fen, entraînant ainsi sa dégradation
via le protéasome (Abramovitch et al., 2006 ; Janjusevic et al., 2006 ; Rosebrock et al., 2007).
• HopAR1 (AvrPphB) de Psph est une cystéine protéase qui cible la protéine kinase PBS1,
nécessaire à la résistance gène pour gène HopAR1/RPS5 (Shao et al., 2003).
• AvrRpt2 de Pst est également une cystéine protéase, capable de cliver la protéine RIN4 (RPM1Interacting protein 4) d’Arabidopsis thaliana, un régulateur négatif de la défense basale (Coaker et
al., 2005 ; Kim et al., 2005). AvrB et AvrRpm1 de Psg et Psm, respectivement, sont deux kinases
qui phosphorylent RIN4 (Axtell & Staskawicz, 2003 ; Kim et al., 2005 ; Mackey et al., 2002 ;
Mackey et al., 2003). RIN4 interagit d’une part avec la protéine RPM1, qui confère la résistance
de la plante aux souches de Psm possédant AvrRpm1, et d’autre part avec la protéine RPS2, qui
confère la résistance de la plante aux souches de Pst possédant AvrRpt2. Ainsi, la protéine RIN4
serait « ciblée » par au moins 3 protéines d’avirulence bactériennes et « gardée » par au moins 2
protéines de résistances végétales. Cependant, RIN4 constitue probablement plus un outil
153
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
permettant à la plante de détecter la présence du pathogène plutôt qu’une « cible » véritable
contribuant à la sensibilité de la plante. Dans des plantes mutées pour RIN4, AvrRpm1 et AvrRpt2
conservent leur fonction de virulence, suggérant que RIN4 n’est pas la seule cible de ces
effecteurs (Belkhadir et al., 2004). Des cibles supplémentaires putatives ont pu être identifiées
pour AvrRpt2, via une recherche bioinformatique du site de clivage et des expériences
d’expression transitoire dans le tabac (Chisholm et al., 2005).
Outre la détection d’éventuelles propriétés enzymatiques, la séquence protéique et la
localisation cellulaire des protéines d’avirulence sont à même de fournir des informations clés
pour la compréhension de leur mode d’action, ainsi que pour l’identification des protéines de
résistance et des cibles végétales correspondantes.
Les gènes avrRpm1 et avrB possèdent dans leur séquence nucléique un motif de
myristoylation dirigeant les protéines dans la membrane plasmique de la cellule végétale, où les
attend la protéine de résistance RPM1 (Boyes et al., 1998). Ce motif et la localisation
correspondante sont nécessaires aux fonctions d’avirulence des deux protéines (Nimchuk et al.,
2000). De la même façon, le gène avrPto de Pst présente lui aussi un motif de myristoylation et
une localisation membranaire nécessaires aux fonctions d’avirulence et de virulence du gène. Ce
motif est également présent chez la protéine de résistance Pto (Shan et al., 2000).
Comme mentionné précédemment et comme illustré sur la Figure III-6, les membres de la
famille AvrBs3 possèdent plusieurs domaines. Les répétitions quasi-identiques de 34 acides
aminés de ces protéines confèrent à chaque protéine sa spécificité en tant que facteur d’avirulence
et/ou de virulence (Herbers et al., 1992). Par ailleurs, dans le cas de AvrBs3 de Xav ou AvrXa7 de
Xoo, les signaux de localisation nucléaires de la protéine (NLS) sont nécessaires à ses fonctions
d’avirulence et de virulence (Szurek et al., 2002 ; Yang et al., 2000). En revanche, celles
d’AvrBs4 ne sont pas importantes pour la reconnaissance de ce facteur d’avirulence par la
protéine Bs4 (Ballvora et al., 2001), suggérant que l’interception R/Avr peut avoir lieu à des
étapes différentes du cheminement d’un facteur d’avirulence vers un compartiment cellulaire
donné (Nimchuk et al., 2001). Enfin, le domaine AD est nécessaire à la fonction d’avirulence des
protéines de cette famille (Szurek et al., 2001 ; Yang et al., 2000).
154
Effecteurs de type III
EF-Tu
Autres PAMPs bactériens
EFR
RLK
Paroi
LRR
Membrane
plasmique
FLS2
EF-Tu
(elf18)
uuu
uuu
Protéine Avr
TTSS
flg22
domaine kinase
R
Avr
HR
Cible
Signalisation
MAPK
WRKYs
Fortification de
la paroi
Réduction du
flux vasculaire
NO / ROS
Fermeture des
stomates
Activation des défenses
Noyau
Modulation de l’expression de gènes
Figure III-13 : Modes d’action des effecteurs de type III dans
la suppression des défenses basales et/ou gène-spécifiques.
Ethylène
JA
SA
Les bactéries phytopathogènes sécrètent dans la cellule végétale un grand nombre d’effecteurs (T3E) par leur système de
sécrétion de type III (TTSS). Certaines de ces protéines sont capables de bloquer la défense basale des plantes en agissant
sur différentes composantes telles que les voies des MAP Kinases (MAPK), et en interférant avec la machinerie
transcriptionnelle de la plante. Les phénotypes cellulaires liés à la défense basale (fortification de la paroi…) sont affectés par
différents T3E. Enfin, certains effecteurs ont en plus la capacité de supprimer les défenses gène-spécifiques de la plante, et
notamment la Réaction Hypersensible (HR), en interagissant avec des cibles particulières.
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
IV.6. Certains effecteurs de type III sont capables de supprimer les défenses
gène-spécifiques de la plante
Les bactéries sont très puissantes dans la guerre évolutive qu’elles ont engagée avec les
plantes : en plus d’être capables de déjouer l’immunité innée des plantes, elles ont sélectionné des
effecteurs capables de supprimer les défenses gène-spécifiques des plantes, conduisant alors au
succès de l’infection : ainsi, elles fabriquent des protéines capables de « masquer » la présence
d’une protéine d’avirulence particulière (Figure III-13). C’est le cas des effecteurs de type III
VirPphA ou AvrPphF de Ps pv. phaseolicola, qui masquent la présence d’un gène avr non
déterminé : des souches mutantes pour l’un ou l’autre de ces deux gènes sont capables d’induire
une HR sur un cultivar de haricot sensible (Jackson et al., 1999). VirPphA et AvrPphF sont par
ailleurs des protéines d’avirulence, contrôlant respectivement la résistance du soja et de cultivars
de haricot possédant le gène de résistance R1. En tant que facteur d’avirulence, AvrPphF peut luimême être reconnu par la plante : il est donc responsable soit de l’avirulence, soit de la virulence
de la bactérie en fonction de la plante infectée. Mais c’est à la bactérie que revient le dernier mot :
l’avirulence de AvrPphF peut être masquée par un troisième effecteur de type III, AvrPphC,
facteur majeur d’avirulence sur le soja (Jackson et al., 1999 ; Tsiamis et al., 2000). Ces exemples
illustrent bien la complexité du dialogue moléculaire entre les protéines d’avirulence bactériennes
et les protéines « cibles » ou « gardiennes » végétales.
De nombreux travaux ont conduit à l’identification d’effecteurs de type III capables de
supprimer la HR lors d’interactions incompatibles, comme illustré sur la Figure III-13. Par
exemple, Fujikawa et ses collaborateurs ont montré, grâce à un système hétérologue exprimant les
gènes codant pour le système de sécrétion de type III de Ps pv. syringae, que les effecteurs PthA
de Xanthomonas axonopodis pv. citri et AvrXa7 et AvrXa10 de Xanthomonas oryzae pv. oryzae
peuvent supprimer la HR sur tabac (Fujikawa et al., 2006).
L’expression hétérologue des gènes codant pour les effecteurs HopPtoE, AvrPpiB1Pto,
AvrPtoB et HopPtoF de Pst conduit à la suppression de la HR dépendant du gène d’avirulence
HopPsyA sur le tabac et sur Arabidopsis. Par ailleurs, un mutant dans le gène hopPtoG déclenche
une HR plus forte que la souche sauvage sur plantes non-hôtes (Jamir et al., 2004). Cette étude a
également permis de montrer que, de façon intéressante, des effecteurs suppresseurs des réponses
basales tels que HopPtoJ, HopPtoT1 ou HopPtoC ne sont pas capables de supprimer la HR
HopPsyA-dépendante, suggérant que la défense basale et la défense gène-spécifique sont en partie
indépendantes.
155
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
D’autres effecteurs agissent à la fois sur la défense basale et sur la défense gène-spécifique :
par exemple, comme exposé précédemment, AvrPtoB de Pst limite le dépôt de callose et interfère
avec les voies des MAPK ; il a par ailleurs été montré par des expériences d’expression transitoire
chez le tabac, que cet effecteur est capable de supprimer la HR AvrPto/Pto-dépendante, la HR
Avr9/Cf9-dépendante (conférant la résistance au champignon Cladosporium fulvum), ainsi que
d’autres types de mort cellulaire programmée tels que la PCD induite par le stress chez la levure
(Abramovitch et al., 2003). Il a donc été postulé que la protéine AvrPtoB ciblerait un constituant
conservé chez différents organismes eucaryotes [pour revue, voir (Abramovitch & Martin, 2005)].
AvrPtoB est une E3 ubiquitine ligase dotée d’une structure modulaire. Le domaine Nterminal de la protéine (acides aminés 1 à 308) est suffisant pour l’interaction avec la protéine de
résistance Pto dans la levure, et pour l’élicitation de la HR Pto-dépendante chez la tomate ou le
tabac (Abramovitch & Martin, 2005). Le domaine C-terminal (acides aminés 309 à 553) est quant
à lui suffisant pour l’activité anti-HR, l’activité anti-PCD et l’activité E3 ubiquitin ligase. Cette
dernière activité est requise pour l’activité anti-PCD (Abramovitch et al., 2006), mais pas pour la
fonction inhibitrice de la voie MAPK impliquée dans la défense basale (He et al., 2006).
L’exemple d’AvrPtoB suggère que les effecteurs jouant un rôle dans la suppression des
défenses basales et des défenses gène-spécifiques de la plante pourraient agir de façon très
précoce, en amont d’un « nœud » commun aux deux voies de défense, et/ou avoir de multiples
fonctions indépendantes.
PRE-REQUIS : Les déterminants d’avirulence de la bactérie Xanthomonas
campestris pv. campestris
A l’heure actuelle, un seul déterminant d’avirulence a été identifié chez la bactérie
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). Le gène XCC2109, nommé avrXccFM, confère
l’avirulence de Xcc sur la moutarde de Floride. Toutefois, une HR classique n’est pas observée
après infiltration de feuilles de moutarde : seule une HR vasculaire peut être obtenue en inoculant
des plantules âgées de 7 jours, suggérant que la HR a lieu mais est limitée aux cellules proches des
vaisseaux du xylème. Par ailleurs, la protéine AvrXccFM ne contribue pas à la virulence de la
bactérie sur chou, navet, moutarde ou radis (Castañeda et al., 2005).
156
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
Des travaux menés au laboratoire ont récemment permis de montrer que l’écotype Col-0
d’Arabidopsis thaliana est résistant à Xcc lorsque les bactéries sont introduites dans les vaisseaux
du xylème de la plante, par une technique d’inoculation décrite précédemment (Meyer et al.,
2005). En revanche, suite à une inoculation « classique » par infiltration du mésophylle des
feuilles, la maladie se développe normalement : l’écotype Col-0 est donc sensible à Xcc dans
l’apoplaste du mésophylle. Cette étude suggère l’existence de mécanismes de résistance tissusspécifiques lors de cette interaction.
Notre équipe collabore depuis plusieurs années avec celle du Professeur Ji-liang Tang (Key
Laboratory of Subtropical Bioresources Conservation and Utilization - Guangxi University –
Nanning, Chine) dans l’objectif d’identifier de nouveaux facteurs de virulence chez Xcc. Dans le
cadre de cette collaboration, j’ai été amenée à participer à la caractérisation phénotypique sur
Arabidopsis thaliana de souches de Xcc mutées dans des effecteurs putatifs. Les résultats obtenus
sont présentés dans l’article suivant ; je tiens à préciser que ma contribution à ce travail concerne
l’étude du phénotype et de la croissance bactérienne in planta, la partie « biologie moléculaire » et
les expériences de sécrétion ayant été réalisées par Ji-liang Tang et son équipe, en collaboration
avec notre groupe.
RESULTATS : Etude de l’effecteur de type III AvrACXcc8004
Ces travaux sont regroupés dans un article présenté ci-après, accepté le 19 Octobre 2007
pour publication dans la revue Journal of Bacteriology.
157
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
AvrACXcc8004, a type III effector with a leucine rich repeat domain from Xanthomonas
2
campestris pathovar campestris confers avirulence in vascular tissues of the Arabidopsis
3
thaliana ecotype Col-0
4
(Running title: Tissue-specific Avr recognition)
5
6
Rong-Qi Xu,1‡ Servane Blanvillain,2‡ Jia-Xun Feng,1 Bo-Le Jiang,1 Xian-Zhen Li,1 Hong-Yu
7
Wei,1 Thomas Kroj,2 Emmanuelle Lauber,2 Dominique Roby,2 Baoshan Chen,1 Yong-Qiang
8
He,1 Guang-Tao Lu,1 Dong-Jie Tang,1 Jacques Vasse,
9
Tang1*
2
Matthieu Arlat2,
3*
and Ji-Liang
10
11
1
12
Laboratory of Ministry of Education for Microbial and Plant Genetic Engineering, and College of
13
Life Science and Technology, Guangxi University, 100 Daxue Road, Nanning, Guangxi 530004,
14
People’s Republic of China.
15
2
16
Cedex, France.
17
3
Guangxi Key Laboratory of Subtropical Bioresources Conservation and Utilization, The Key
Laboratoire des Interactions Plantes-Microorganismes, INRA-CNRS, BP52627, 31326 Castanet
Université Paul Sabatier, Toulouse III, Toulouse, France.
18
19
‡ Rong-Qi Xu and Servane Blanvillain contributed equally to this work.
20
21
* Corresponding authors. Mailing address:
22
Matthieu Arlat, Laboratoire des Interactions Plantes-Microorganismes, INRA-CNRS, BP52627,
23
31326 Castanet Cedex, France. Phone: 33-561-285047. Fax: 33-561-285061. E-mail:
24
[email protected].
25
Ji-Liang Tang, College of Life Science and Technology, Guangxi University, 100 Daxue Road,
26
Nanning, Guangxi 530004, People’s Republic of China. Phone: 86-771-3239566. Fax: 86-771-
27
3239413. E-mail: [email protected].
158
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
ABSTRACT
2
Xanthomonas campestris pathovar campestris causes black rot, a vascular disease on
3
cruciferous plants including Arabidopsis thaliana. The gene XC1553 from X. campestris pv.
4
campestris strain 8004 encodes a protein containing leucine-rich repeats (LRRs) and appears
5
to be restricted to strains of X. campestris pv. campestris. LRRs are found in a number of
6
type III-secreted effectors in plant and animal pathogens. These prompted us to investigate
7
the role of XC1553 in the interaction between X. campestris pv. campestris and A. thaliana.
8
Translocation assay using the HR-inducing domain of X. campestris pv. campestris AvrBs1
9
as a reporter revealed that XC1553 is a type III effector. Infiltration of Arabidopsis leaf
10
mesophyll with bacterial suspensions showed no differences between the wild type strain
11
and an XC1553 mutant; both strains induced disease symptoms on Kashmir and Col-0
12
ecotypes. However, a clear difference was observed when bacteria were introduced into the
13
vascular system by piercing the central vein of leaves. In this case, the wild type strain 8004
14
caused disease on Kashmir ecotype, but not on ecotype Col-0. An XC1553 mutant became
15
virulent on Col-0 ecotype and still induced disease on Kashmir ecotype. Altogether, these
16
data show that XC1553, which was renamed avrACXcc8004, functions as an avirulence gene
17
whose product seems to be recognized in vascular tissues.
159
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
INTRODUCTION
2
Flor’s gene-for-gene theory suggested that an incompatible interaction between microbial
3
pathogens and plants is governed by an avirulence (avr) gene of a pathogen and the cognate
4
resistance (R) gene of a host (19). Disease resistance only occurs if an R gene in a plant is
5
matched by a cognate avr gene in a pathogen. The activated plant disease resistance is often
6
associated with the hypersensitive reaction (HR), a type of rapid, localized and programmed cell
7
death at the infection site of plants (31).
8
A number of genes involved in the hypersensitive reaction and pathogenicity (hrp) in many Gram-
9
negative phytopathogenic bacteria have been identified and characterized. The hrp genes have
10
been demonstrated to be required for the pathogens to cause disease in susceptible host plants and
11
to induce HR in resistant host and non-host plants (44). Most hrp genes encode components of the
12
type III secretion system (6, 12). The T3SS of plant pathogenic bacteria translocates effector
13
proteins directly into the plant cells (6). The effectors can act to activate or suppress plant defense
14
signal transduction (1, 11, 21, 50). T3SS effectors have a modular structure, and targeting signal
15
generally resides in the N-terminal 50 or 100 amino acids (22, 51, 63). Many Avr proteins of plant
16
pathogenic bacteria have been shown to be translocated effectors (1, 11, 21, 50).
17
The availability of the genome sequences of major phytopathogenic bacteria facilitates the
18
comprehensive identification of T3SS effector genes. Large scale identification of effectors has
19
been achieved in Pseudomonas syringae pv. maculicola and Xanthomonas campestris pv.
20
vesicatoria by detecting the translocation of transposon-generated Avr effector domain reporter
21
protein fusions into plant cells (24, 59). Candidate genes for encoding effectors can be proposed
22
by bioinformatic analysis of the genome sequence or by experimental approaches based on the
23
following criteria: homologues to known T3SS effectors in other bacterial pathogens; presence of
24
sequence patterns associated with hrp promoters and T3SS targeting domains; genes flanking the
25
hrp gene cluster; genes with similar regulation by hrp regulatory genes; and gene products
160
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
exhibiting typical eukaryotic protein domains or motifs (1, 7, 13, 42, 73). The candidates can be
2
functionally validated as effectors by translational fusion of 5′ coding regions of candidate
3
effector genes with a reporter. The calmodulin-dependent adenylate cyclase domain (Cya) of the
4
Bordetella pertussis cyclolysin has been extensively used as a reporter. Adenylate cyclase activity
5
(production of cAMP) in infected leaves indicates the fusion protein was translocated into plant
6
cells (8, 47, 63). The HR-inducing effector regions of Avr proteins, such as AvrRpt2
7
(∆79AvrRpt2) from P. syringae (10) and AvrBs3 (AvrBs3∆2) from X. campestris pv. vesicatoria
8
(54), have also been employed as reporters. The elicitation of T3SS-dependent and R gene-
9
dependent HR in plant revealed the presence of a functional translocation signal in N-terminal
10
region of the candidate gene product (22).
11
12
The leucine-rich repeat (LRR) motif is a typical protein motif commonly observed in eukaryotic
13
proteins and appears to be involved in the mediation of protein-protein interactions (37). LRR-
14
containing proteins have been shown to be involved in the host defense systems of both plants and
15
mammals and many plant R genes identified to date encode proteins possessing LRR domain (31,
16
37). LRR-containing proteins have also been found in diverse groups of bacteria and some of
17
them have been shown to be T3SS effectors in pathogenic bacteria. In animal bacterial pathogens,
18
some T3SS effector proteins with LRR motif have been shown to be involved in virulence. These
19
effector proteins include the IpaH9.8 protein of Shigella flexneri (57), the YopM proteins of
20
Yersinia (71), and the SspH1 and SspH2 proteins of Salmonella enterica serovar Typhimurium
21
(49). In plant pathogenic bacteria, several LRR proteins have been identified. Examples are PopC
22
(23), LrpE/Hpx5/RSp0842 and GALAs from R. solanacearum (3, 52, 60), HpaF from X. oryzae
23
pv. oryzae (65) and X. axonopodis pv. glycines (36), and HpaG/XCV0408 from X. campestris pv.
24
vesicatoria (55, 67). LrpE of R. solanacearum is probably not an effector since it was shown to be
25
an intracellular protein controlling Hrp pili production and virulence (52). The function of HpaF
26
and HpaG is not clear yet. HpaF of X. oryzae pv. oryzae and HpaG of X. campestris pv.
161
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
vesicatoria were found to be not required for virulence (55, 65), whereas HpaF of X. axonopodis
2
pv. glycines was shown to control pathogenicity (35). Among these LRR proteins, only GALAs
3
and PopC from R. solanacearum have been shown to be T3SS effectors (3, 13, 23, 52). However,
4
only the specific function of GALAs has been analyzed in detail. These LRR containing proteins
5
also contain an F-box-like domain which is important to promote disease on host plants. It was
6
proposed that these effectors act by hijacking the host SCF-type E3 ubiquitin ligases to interfere
7
with ubiquitin/proteasome pathway (3). The role of the LRR domain of these effectors has yet to
8
be characterized.
9
Xanthomonas campestris pathovar campestris is the causal agent of black rot of cruciferous plants
10
including the model plant Arabidopsis thaliana (2). The bacterium is a xylem-colonizing systemic
11
pathogen which generally invades plant leaves through hydathodes and multiplies into vascular
12
tissues. The whole genome sequence of the X. campestris pv. campestris strains 8004 and
13
ATCC33913 have been determined (14, 58). Two genes, i.e. XC1553 (8004) / XCC2565
14
(ATCC33913) and XC4273 (8004) / XCC4186 (ATCC33913), were predicted to encode proteins
15
containing LRRs in both strains (14, 58). In this paper, we demonstrate that XC1553 is
16
translocated by type III secretion system by using the HR-inducing domain of X. campestris pv.
17
campestris AvrBs1 as a reporter and that it is an avirulence protein which seems to be recognized
18
in the vascular tissues of A. thaliana ecotype Col-0.
19
162
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
MATERIALS AND METHODS
2
Bacterial strains, plasmids and growth conditions. The bacterial strains and plasmids used in
3
this work are listed in Table 1. Escherichia coli and A. tumefaciens EHA105 (28) were cultivated
4
in LB medium at 37°C and 28°C, respectively. Xanthomonas strains were grown in NYG medium
5
(15) or XVM2 medium (75) at 28°C. Antibiotics were added to media in the following final
6
concentrations: rifampicin (Rif), 50 µg/ml; kanamycin (Kan), 25 µg/ml; tetracycline (Tc), 15
7
µg/ml for E. coli, 5 µg/ml for Xanthomonas and Agrobacterium; gentamycin (Gm), 10 µg/ml;
8
spectinomycin (Spc), 100 µg/ml.
9
10
DNA and RNA manipulations. DNA manipulations followed the procedures described by
11
Sambrook and associates (61). Plasmids were introduced into E. coli by electroporation and into
12
Xanthomonas strains by triparental conjugation as described by Turner et al. (69).
13
Overnight cultures of the wild type strain 8004 and the XC1553 transposon insertional mutant
14
151H08 grown in XVM2 medium were used to extract the total RNAs with a total RNA
15
extraction kit (Promega, Shanghai) and the reverse transcription was performed using the cDNA
16
synthesis kit (Fermentas Co.). Each kit was used according to the manufacturer’s instructions.
17
The analysis of transcriptional products of XC1552 and XC1553 in X. campestris pv. campestris
18
wild-type strain 8004 and XC1553 Tn5gusA5 insertional mutant 151H08 was carried out by RT-
19
PCR.The synthesized cDNAs from the extracted total RNAs of the wild type strain 8004 and the
20
mutant 151H08 were used as templates to amplify the internal sequences of XC1552, XC1553 and
21
a presumed sequence spanning from 5′ terminal of XC1552 to 3′ terminal of XC1553 with the
22
primer sets 1552F/1552R, 1553F/1553R and 1553-52F/1553-52R (Table S1), respectively.
23
Simultaneously, the PCR with the total DNA or total RNA without the addition of reverse
24
transcriptase was performed as positive or negative control. The amplified 16S rRNA interval
25
sequence was normalized as a control of expression level. The RT-PCR products corresponding to
163
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
transcribed internal sequences of XC1552, XC1553 and presumed sequence spanning from the 3′
2
end of XC1553 to the 5′ end of XC1552 were detected by 1% agarose gel electrophoresis. The
3
predicted size of the products for XC1552, XC1553 and sequence spanning XC1552 and XC1553
4
was 477-bp, 302-bp and 418-bp, respectively. No RT-PCR product was detected for presumed
5
sequence spanning XC1552 and XC1553. The RT-PCR product for XC1552 in 151H08 could still
6
be detected.
7
8
Mutant construction and complementation. The Tn5gusA5 insertional mutants of XC1553,
9
hrcV and hrpF were from the insertional mutant library of X. campestris pv. campestris strain
10
8004 in the authors’ laboratory in Nanning (J. L. Tang et al., unpublished data). The mutants were
11
selected
12
8004/pLAFR1::Tn5gusA5 and by plating on NYG agar containing Rif, Kan, Gm and Spc.
13
Tetracycline-sensitive individual colonies were picked as candidate mutants. The genomic
14
positions of the transposon in the mutants were determined by TAIL-PCR (45) and subsequent
15
sequencing for comparison with the whole genome sequence of strain 8004 (58). The insertional
16
site of Tn5gusA5 was further confirmed by PCR using the primers respectively on transposon and
17
on the gene upstream or downstream of the disrupted gene.
18
Using primer set IG1553F/IG1553R (Table S1), the internal sequences of XC1553 (from positions
19
24 to 560) was amplified from genomic DNA of the strain 8004 by PCR and cloned into suicide
20
plasmid pK18mob (62), generating recombinant plasmids pK1553. The recombinant plasmid was
21
subsequently used for constructing plasmid integrational mutant of XC1553 as described
22
previously for X. campestris pv. campestris (16) and confirmed by PCR and designated as
23
NK1553 (Table 1). A 2045-bp DNA fragment containing the XC1553 coding region and
24
extending 280-bp at the 5′ and 153-bp at the 3′ was amplified by PCR using the total DNA of
25
strain 8004 as template and primer set C1553F/C1553R (Table S1) as primers. The amplified
26
DNA fragment was confirmed by sequencing and cloned into pLAFR3 to generate recombinant
by
mating
X.
campestris
pv.
campestris
strain
8005/pPH1JI
(69)
with
164
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
plasmid pXC1553. This plasmid was transferred into the XC1553 mutants 151H08 and NK1553
2
respectively by triparental conjugation and transconjugants were selected on NYG medium
3
supplemented with rifampicin, kanamycin and tetracycline. The resulting complementary strains
4
for 151H08 and NK1553 were respectively designated as C151H08 and CNK1553 (Table S1).
5
To generate a deletion mutant of avrBs1, a 3271-bp fragment containing avrBs1 coding region
6
and its flanking sequence was amplified by PCR with the primer set DS1F/DS1R (Table S1) and
7
cloned into pT18mobH, a derivative of suicide plasmid pT18mob (Table 1) in which Hind III
8
restriction site was disrupted, generating pTH2081. A 1547-bp DNA sequence containing avrBs1
9
coding region on pTH2081 was replaced by a DNA fragment containing gentamycin resistance
10
gene amplified from plasmid pPH1JI with the primer set GmF/GmR (Table S1), generating the
11
recombinant plasmid pTG2081. The plasmid pTG2081 was then introduced from E. coli into the
12
strain 8004 by triparental conjugation and avrBs1 deletion mutant, named as 8004∆avrBs1, was
13
selected on plates containing Rif and Gm. The mutant was confirmed by PCR and
14
complementation.
15
To complement the avrBs1 deletion mutant, a 1543-bp DNA sequence containing the entire
16
coding region of avrBs1 and its 205-bp upstream sequence was amplified by PCR from the total
17
DNA of the strain 8004 with the primer set PS1F-F/CS1R-R (Table S1), confirmed by sequencing
18
and ligated into the XbaI and BamHI sites of pLAFR6, generating recombinant plasmid pLBs1.
19
The plasmid pLBs1 was introduced into the avrBs1 deletion mutant 8004∆avrBs1 by triparental
20
conjugation.
21
To construct a hrpG deletion mutant, the upstream and downstream fragments flanking hrpG were
22
amplified with the primer sets DG-LF/DG-LR and DG-RF/DG-RR (Table S1) using the total
23
DNA of strain 8004 as template, respectively. Simultaneously, the Kanamycin resistant fragment
24
was amplified with the primer sets Km-F/Km-R (Table S1) using pLAFR1::Tn5gusA5 as
25
template. These three fragments were cloned into the BamHI-XbaI-SalI-SphI sites of the suicide
26
vector pGEM-3Zf(+) one by one, yielding the recombinant plasmid pGDG. After confirmed by
165
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
sequencing, the plasmid pGDG was ligated to the BamHI site of the cosmid pLAFR3, yielding the
2
recombinant plasmid pLGDG. The plasmid pLGDG was transferred into the X. campestris pv.
3
campestris wild-type strains 8004 by triparental conjugation and Kanamycin resistant
4
transconjugants were screened. The plasmid pPH1JI, which is incompatible with pLAFR3, was
5
then introduced by mating from the X. campestris pv. campestris strain 8005/pPH1JI (69). The
6
hrpG deletion mutant was selected on NYG medium supplemented with rifampicin, kanamycin,
7
gentamicin and spectinomycin simultaneously. The mutant colonies were then checked for
8
tetracycline-sensitivity and were further confirmed by PCR. The mutant was named 8004∆hrpG.
9
A hrpX deletion mutant was constructed with the same strategy. The primer sets used, DX-
10
LF/DX-LR and DX-RF/DX-RR, are listed in Table S1 and the obtained mutant was named
11
8004∆hrpX.
12
13
Construction of a promoter-reporting plasmid for XC1553. A promoter-reporting plasmid for
14
XC1553 was constructed by fusing a 400-bp DNA sequence upstream the start codon of XC1553
15
with promoterless gus. The XC1553 promoter region was amplified from the total DNA of the
16
strain 8004 by using a specific primer set PV1553F/ PV1553R (Table S1), producing a DNA
17
fragment with a 16-bp sequence at the 3′ end overlapping with the 5′ end of gus ORF, and gus
18
coding region was amplified by PCR with the primer set gusF/gusR (Table S1) using transposon
19
Tn5gusA5 as template. The two PCR products were fused by fusion PCR using pfu DNA
20
polymerase (Fermentas) without adding any other primers. The fused fragment was confirmed by
21
sequencing and cloned into pLAFR6 to generate the recombinant plasmid pLG1553. The
22
pLG1553 was introduced into the wild type 8004 and the deletion mutants 8004∆hrpG and
23
8004∆hrpX by triparental conjugation.
24
25
Transient expression of the HR-inducing domain of AvrBs1 in pepper. The 205-bp DNA
26
sequence upstream the start codon of avrBs1 and the 1164-bp DNA sequence encoding the C166
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
terminal amino acids 59 to 445 of AvrBs1 (AvrBs159-445) were respectively amplified with primer
2
sets Bs1P-F/Bs1P-R and F59aa-F/F445aa-R (Table S1) using the total DNA of the strain 8004 as
3
template. The amplified two PCR products were fused by recombination PCR. The digested PCR
4
product was cloned into the XbaI and BamHI sites of pBI121, generating recombinant plasmid
5
pBBs159-445P.
6
The 1543-bp DNA sequence containing the entire coding region of avrBs1 and the 205-bp
7
sequence upstream the ORF was amplified by PCR from the total DNA of the strain 8004 with the
8
primer set PS1F-F/CS1R-R (Table S1), and the digested PCR product was ligated into the Xba I
9
and BamH I sites of pBI121, generating recombinant plasmid pBBs1.
10
The plasmid pBBs159-445P, pBBs1 and the vector pBI121 were introduced respectively into the A.
11
tumefaciens strain EHA105 by triparental conjugation. The A. tumefaciens strain EHA105
12
carrying pBBs159-445P, pBBs1 or vector pBI121 was grown in LB medium supplemented with
13
kanamycin at 28°C for 17 h. Bacterial cells were washed, resuspended in the inducing medium
14
(10 mM MES, pH 5.6, 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone (Sigma)) and incubated at 28°C for
15
2 h just before use (51). Pepper seedlings were grown in a greenhouse with 12 h day and night
16
cycle illuminations by fluorescent lamp at temperatures of 25 to 28°C. Bacterial suspension at
17
OD600 = 0.5 in the inducing medium was introduced into leaves of pepper ECW-10R at the stage
18
of 4 fully expanded leaves by infiltration. After infiltration, plants were grown at 28°C, 16 h
19
photoperiod per day, and 80% relative humidity.
20
21
Detection of the XC1553 translocation signal. A 1170-bp DNA segment containing 501-bp
22
DNA sequence upstream the start codon of XC1553 and 651-bp sequence at the 5′ end of the
23
XC1553 ORF was amplified by PCR using the total DNA of the strain 8004 as template with the
24
primer set T1553F/T1553R (Table S1). The sequence encoding AvrBs159-445 was amplified with
25
the primer set 59aa-F/445aa-R. The two amplified fragments were respectively digested with
26
EcoRI/XbaI and XbaI/PstI, and ligated with the EcoRI/PstI digested pUC19. After confirmation
167
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
by sequencing, the verified recombinant fragment was cloned into EcoRI/PstI site of pLAFR6 to
2
generate recombinant plasmid pLTXC1553. The plasmid pLTXC1553 was introduced into
3
8004∆avrBs1 and the hrpF mutant 121D06, respectively, by triparental conjugation. The
4
transconjugants were tested on pepper cultivars ECW-10R or ECW-20R as described below. As a
5
control, the avrBs1 promoter region (205-bp upstream of the avrBs1 ORF) amplified with primer
6
set Bs1P-F/Bs1P-R (Table 1) was fused to the 5′ end of avrBs159-445 and the resulting fragment
7
was cloned into pLAFR6 to generate recombinant plasmid pLBs159-445P. The plasmid pLBs159-445P
8
was transferred into 8004∆avrBs1 by triparental conjugation and the resulting strain was similarly
9
infiltrated into the leaves of ECW-10R or ECW-20R.
10
11
Plant assay. The virulence of X. campestris pv. campestris strains was assayed on the A. thaliana
12
ecotypes Columbia (Col-0) and Kashmir by piercing inoculation or classical mesophyll
13
infiltration as described by Meyer and associates (48). For in planta growth of bacteria two holes
14
were pierced at the leaf base, close to the petiole. At least 4 four-week-old plants were inoculated
15
for each strain tested. Symptoms were recorded as previously described (48). Each strain was
16
tested in at least three separate experiments. For the measurement of in planta growth of bacteria,
17
three leaf discs from different inoculated leaves of one inoculated plant were sampled using a cork
18
borer (diameter 0.65 cm, surface 0.33 cm2) at day 0, 3 and 5 after inoculation, and were ground
19
with a pestle in 500 µl sterile water. Discs collected at the inoculation sites (on the leaf base, close
20
to the petiole) and at the tip of the inoculated leaves were designated as ‘proximal sample’ and
21
‘distal sample’, respectively (Fig. 6). The homogenates were serially diluted and 5 µl drops were
22
spotted three times for each dilution with a multichannel pipette on well dried plates
23
supplemented with rifampicin. Plates were incubated at 30°C for 24 h and then at 4°C for 17 h.
24
Colonies were counted in spots containing 1-30 colonies. Bacterial densities in leaves were
25
calculated and were given in [log (cfu/cm2)].
168
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
The ability of the X. campestris pv. campestris strains to elicit hypersensitive reaction (HR) on
2
pepper was assayed as previously described (4).
3
4
Determination of GUS activity. β-Glucuronidase (GUS) activity was measured by using ρ-
5
nitrophenyl-β-D-glucuronide as substrate as described by Henderson and associates (25) after
6
growth of the X. campestris pv. campestris strains in XVM2 for 18 h or in NYG for 16 h.
7
8
Light microscopy protocol. Plants (Arabidopsis ecotype Sf-2) were inoculated by the piercing
9
inoculation method with the wild type strain Xcc568 (ATCC33913) as described above. Infected
10
plants were fixed and sections were prepared as previously described (70).
11
12
RESULTS
13
14
XC1553 codes for protein with LRRs and seems to be specific to Xanthomonas campestris pv.
15
campestris. Two genes, i.e. XCC4186 and XCC2565, were initially annotated to encode proteins
16
with LRRs which were postulated to be putative effector/avirulence proteins in the genome of X.
17
campestris pv. campestris strain ATCC33913 (14). The XC4273 protein of X. campestris pv.
18
campestris strain 8004 (504 amino acids) is identical to XCC4186 of strain ATCC33913. XC1553
19
in strain 8004 and the protein XCC2565 in ATCC33913 are both 536 amino acids in length and
20
differ in one residue, i.e. R70 in XC1553 is substituted by S70 in XCC2565.
21
BLASTP analysis revealed that XC4273 shares homology (around 42% identity and 59%
22
similarity) over its full length to a number of leucine-rich proteins from Xanthomonas species or
23
pathovars. Mutants of XC4273 displayed the same reaction as the wild type 8004 on both A.
24
thaliana ecotypes Columbia (Col-0) and Kashmir (data not shown). Therefore, we focused our
25
work on XC1553 protein which seems specific to pathovar campestris of Xanthomonas
169
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
campestris since no significant homologues were detected in the genomes of X. campestris pv.
2
vesicatoria strain 85-10 (67), X. axonopodis pv. citri strain 306 (14) or X. oryzae pv. oryzae strain
3
KACC10331 (40). However, homology (around 29% identity and 43% similarity) was detected
4
with 2 LRR containing proteins, Aave1508 (accession number: YP_969871) and Aave4631
5
(accession number: YP_972940) of Acidovorax avenae subsp. citrulli AAC00-1, the causal agent
6
of bacterial fruit blotch (76). The region of homology encompasses the LRR and C-terminal part
7
of these proteins. XC1553 contains 6 LRRs. All LRR repeats can be divided into a highly
8
conserved segment and a variable segment. The highly conserved segment consists of a 11-
9
residue stretch, LxxLxLxxNxL, or a 12-residue stretch, LxxLxLxxCxxL, in which ‘L’ is Leu, Ile,
10
Val, or Phe, ‘N’ is Asn, Thr, Ser or Cys and ‘C’ is Cys or Ser (32). Seven classes of LRRs have
11
been proposed, depending on different lengths and consensus of the variable segments of repeats
12
(17, 32, 46). In Xc1553, the first LRR is imperfect and the length of the other LRRs ranges from
13
23 to 24 amino acid residues. The 23 amino acid LRRs of XC1553 match the 11-residues
14
canonical conserved segment. However, the 24 amino acid LRRs seem to have an unconventional
15
sequence since the C conserved position (Cys or Ser) is occupied by an asparagine residue (N)
16
(Fig. 1) suggesting that XC1553 might have a particular structure.
17
Interestingly, both XC1553 and Aave1508 contain a Fic (filamentation induced by cAMP)
18
domain (Pfam database, PF02661) located to the C-terminal side of the LRR region (Fig. 1, Fig.
19
S1). Although the Fic protein family mostly comprises bacterial proteins, it also includes
20
eukaryotic proteins. In Escherichia coli, the Fic protein is involved in regulation of cell division
21
via folate metabolism (39). However, the exact molecular function of proteins in this family is
22
uncertain. The N-terminal sequence of XC1553 (amino acids 1 to 144) and the sequence located
23
C-terminal to the Fic domain (amino acids 496 to 536) do not share significant homology with
24
any other proteins in the databases.
25
26
170
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
XC1553 is a monocistronic gene. The XC1553 ORF, which is 1611 bp in length, is located in the
2
circular chromosome of strain 8004 from position 1867667 to 1869277 in the complementary
3
strand (GenBank accession No. CP000050). The left hand gene, XC1552, which encodes a
4
putative carboxymethylenebutenolidase has the same transcriptional orientation as XC1553. The
5
right hand gene XC1554 that encodes a conserved hypothetical protein is transcribed in the
6
opposite direction to XC1553 (Fig. 2A). To determine whether XC1552 is transcribed in the same
7
operon as XC1553, the transcriptional products of XC1552 and XC1553 were analyzed in the
8
wild-type strain 8004 and in a Tn5gusA5 insertional mutant of XC1553, 151H08 (see below) by
9
reverse transcriptional-PCR. No RT-PCR product spanning the 3′ end of XC1553 to the 5′ end of
10
XC1552 could be detected in strain 8004. However, an RT-PCR product of XC1552 was amplified
11
from the XC1553 mutant 151H08 (Fig. 2B), indicating that the disruption of XC1553 does not
12
affect the transcription of XC1552. Therefore, XC1552 and XC1553 seem to be transcribed
13
independently.
14
15
The expression of XC1553 is regulated by hrpG and hrpX. hrpG and hrpX are two key hrp
16
regulatory genes in xanthomonads (56, 74, 75). The expression of hrp genes including the
17
regulators hrpG and hrpX in X. campestris has been demonstrated to be induced in minimal
18
medium and repressed in rich medium (75). The two regulatory genes form a cascade, in which
19
hrpG regulates the expression of hrpX, which then regulates downstream hrp or effector genes.
20
The regulation by HrpX is mediated by the binding of this regulator to a cis-regulatory element,
21
the PIP box (TTCGC-N15-TTCGC), present in the promoter region of HrpX-regulated genes (38).
22
Recent studies have shown that imperfect PIP boxes can also drive the expression by HrpX (20,
23
38). The analysis of XC1553 promoter region revealed an imperfect PIP box followed by a -10
24
box-like sequence (TTCAC-N15-TTCGC-N32-TACGTT) 30 nucleotides upstream the start codon
25
of XC1553 (Fig. 2A). To determine if XC1553 is transcriptionally regulated by hrpG or hrpX, the
26
reporter plasmid pLG1553 carrying the fused 400-bp XC1553 promoter region and the
171
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
promoterless gus gene was introduced into the wild type 8004, the hrpG mutant 8004∆hrpG and
2
the hrpX mutant 8004∆hrpX by triparental conjugation, and the GUS activity of the obtained
3
transconjugants grown in minimal medium (XVM2) or rich medium (NYG) was assayed. The
4
results showed that XC1553 is not expressed in rich medium and is activated in XVM2 minimal
5
medium. The expression level of XC1553 in 8004∆hrpG or 8004∆hrpX was significantly lower
6
than that in the wild-type strain 8004 in XVM2 medium, showing that its expression is regulated
7
by hrpG and hrpX (Fig. 3).
8
9
XC1553 is a T3SS-translocated effector. To determine whether XC1553 was a T3SS effector
10
translocated into plant cells, we designed a new HR-inducing Avr reporter system. Many Avr
11
proteins have been demonstrated to be T3SS-translocated effectors (1, 11, 21, 50). The avrBs1 of
12
X. campestris pv. vesicatoria strain 85-10 is responsible for the elicitation of HR on pepper ECW-
13
10R that contains the cognate resistance gene Bs1 (26). Interestingly, X. campestris pv. campestris
14
strain 8004 carries a copy of avrBs1 gene (XC2081) which codes for a protein that is identical
15
with AvrBs1 of X. campestris pv. vesicatoria strain 85-10 strain 85-10 (67). Strain 8004 can cause
16
HR on its nonhost plant pepper ECW-10R (Fig. 4A). The deletion mutant of avrBs1,
17
8004∆avrBs1, completely lost the ability to elicit HR on pepper ECW-10R (Fig. 4A). The
18
complemented strain 8004∆avrBs1/pLBs1, harboring the wild type avrBs1 gene provided in trans
19
in pLAFR6 (pLBs1), caused a normal HR on ECW-10R pepper (Fig. 4A). Furthermore, the hrcV
20
Tn5gusA5 mutant and the hrpF Tn5gusA5 mutant carrying or no pLBs1 could not induce HR on
21
pepper ECW-10R (Fig. 4A). These results indicate that AvrBs1 of strain 8004 is responsible for
22
the pathogen’s elicitation of HR on pepper ECW-10R in a T3SS-dependent manner.T3SS
23
effectors generally have a modular structure, and targeting signal generally resides in the N-
24
terminal 50 or 100 amino acids (51, 63). The Agrobacterium tumefaciens strain EHA105
25
containing pBBs159-445P, which contains a copy of avrBs1 lacking the sequence encoding the first
172
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
58 codons, could cause HR on pepper ECW-10R as did EHA105/ pBBs1, which harbours a
2
derivative of pBI121 carrying avrBs1 gene (Fig. 4B). The strain EHA105 containing the vector
3
pBI121 could not elicit an HR (Fig. 4B). As a control, the avrBs1 deletion mutant of strain 8004
4
containing pLBs159-445p could not cause an HR on pepper ECW-10R (Fig. 4B). These results
5
indicate that the sequence containing the amino acids 59 to 445 of AvrBs1 possesses the
6
functional HR-inducing domain but do not enable its translocation into plant cells.
7
The 1170-bp DNA sequence containing the 651-bp sequence upstream the start codon of the
8
XC1553 ORF and the 501-bp sequence at the 5′ end of its coding region was amplified by PCR.
9
After confirmation by sequencing, the fragment was fused to the 5′ end of avrBs159-445 giving an
10
in frame fusion between the 167 N-terminal amino acids of XC1553 and the truncated version of
11
AvrBs1 lacking its 58 N-terminal amino acids. The resulting fused sequence was cloned into
12
pLAFR6 to generate recombinant plasmid pLTXC1553. This plasmid was introduced respectively
13
into 8004∆avrBs1 and 121D06 (8004 hrpF::Tn5gusA5), a mutant affected in X. campestris pv.
14
campestris T3SS translocon (47). The resulting transconjugants, 8004∆avrBs1/pLTXC1553,
15
121D06/pLTXC1553
16
8004∆avrBs1/pLTXC1553 induced the HR in the Bs1-expressing pepper cultivar ECW-10R (Fig.
17
4C) but not in cultivar ECW-20R which does not possess a functional BS1 resistance gene (data
18
not shown). Strain 121D06(hrpF)/pLTXC1553 did not induce the HR on ECW-10R or ECW-20R
19
cultivars. These indicate that XC1553 carries a translocation signal in its N-terminal region and
20
might thus be considered as a T3SS effector.
were
infiltrated
into
leaves
of
different
pepper
plants.
21
22
XC1553 confers avirulence to the X. campestris pv. campestris strain 8004 on the A. thaliana
23
ecotype Col-0. A Tn5gusA5 insertion mutant of XC1553, named 151H08, was obtained from the
24
mutant collection of strain 8004 obtained in the authors’ laboratory in Nanning, China (Table 1).
25
The transposon inserted at the 143th nucleotide of XC1553 ORF in this mutant (J. L. Tang et al.,
26
unpublished data). A mutant carrying a single crossing over insertion in XC1553 was also
173
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
constructed using the suicide plasmid pK18mob (62) harboring an internal sequence of XC1553
2
(from positions 24 to 560) and was designated NK1553.
3
By using the leaf clipping inoculation method on Chinese Manshenshong radish, XC1553 mutants
4
induced disease symptoms similar to those provoked by the wild type strain (data not shown).
5
These mutants and the wild type strain 8004 were then tested on A. thaliana ecotypes Col-0 and
6
Kashmir by piercing inoculation or by leaf infiltration (48). As observed for strain
7
ATCC33913/Xcc568 (48), strain 8004 induced typical disease symptoms on both Col-0 and
8
Kashmir ecotypes, after infiltration of bacterial cells in the leaf mesophyll (Fig. 5). The 151H08
9
and NK1553 mutants gave similar results by this way of inoculation (Fig. 5), whereas hrp mutants
10
did not give any symptoms on both ecotypes (data not shown) (48). The growth of both mutants
11
were similar to those of the wild type on both ecotypes. However, we observed that 5 days after
12
the inoculation the growth of X. campestris pv. campestris strains was significantly lower in Col-0
13
ecotype than in Kashmir ecotype. However, this differential behavior was not dependent on the
14
XC1553 gene (Fig. 5C).
15
We then performed inoculation with the piercing method which seems to allow the delivery of
16
bacterial cells into xylem tissues. Indeed, using this method, we observed an active propagation of
17
X. campestris pv. campestris cells in or along vascular tissues of susceptible Arabidopsis ecotypes
18
(Sf-2 and Kashmir) (48). This observation was made by using ATCC33913/Xcc568 reporter strain
19
carrying the LUX operon of Photorhabdus luminescens (48). We now performed a microscopic
20
study, to analyze bacterial propagation (Xcc568) in the susceptible Arabidopsis Sf-2 ecotype, after
21
piercing inoculation. Cross sections of infected leaves made at various times showed that bacteria
22
mainly colonize and multiply into xylem vessels (Fig. S2).
23
Using the piercing method, the wild type strain 8004 induced typical black rot disease symptoms
24
on Kashmir ecotype, but caused no symptoms on Col-0 (Fig. 6). Such a differential behavior was
25
already observed for strain ATCC33913/Xcc568 (48). Interestingly, XC1553 mutants became
26
virulent on the Col-0 ecotype, inducing typical V-shaped lesions (Fig. 6A). The complemented
174
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
strains of XC1553 mutants, C151H08 and CNK1553, which respectively correspond to mutants
2
151H08 and NK1553 carrying the recombinant plasmid pXC1553 which contains the entire
3
XC1553 gene were then tested on Arabidopsis. C151H08 and CNK1553 caused no symptoms on
4
Col-0 as observed for the wild-type strain (Fig. 6), proving that the phenotype of 151H08 and
5
NK1553 mutants is due to the mutation in XC1553, and confirming that this gene is
6
monocistronic.
7
Internal growth curve assays showed that the growth of the wild type and C151H08
8
complemented strains seems to stop or slow down in Col-0 ecotype, 3 days after piercing
9
inoculation (Fig. 7), whereas XC1553 mutants continue to grow reaching population levels
10
significantly higher than those of the wild-type strain at both the inoculation site (proximal) (Fig.
11
7A) and the tip of the leaf (distal) (Fig. 7B). It is worth noting that the growth rate of C151H08
12
complemented strain is significantly lower than that of the wild-type strain, suggesting an effect
13
of XC1553 gene copy number. In contrast to these effects, the wild-type strain 8004, the mutant
14
151H08 and the complemented strain C151H08 can grow equally well in A. thaliana ecotype
15
Kashmir (Fig. 7C-D).
16
Altogether, these results reveal that XC1553 behaves as an avirulence gene on the A. thaliana
17
ecotype Col-0, and that either wounding or initial vascular colonization are important for its
18
recognition. Thus, XC1553 gene was renamed avrACXcc8004 following the unified nomenclature
19
proposed by Lindeberg and colleagues (43).
20
21
DISCUSSION
22
AvrACXcc8004 is a novel effector translocated into plant cells by X. campestris pv. campestris
23
T3SS. By using the HR-inducing domain of AvrBs1 protein of X. campestris pv. campestris 8004
24
as a reporter we provide evidence for the T3SS-dependent translocation of AvrACXcc8004. Analysis
25
of the N-terminal 90 amino acids of XC1553/AvrACXcc8004 revealed that this portion contains
175
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
26.7% serine and proline, having the features of positive serine and proline bias in the N-terminal
2
region of T3SS effectors of Gram-negative plant and animal bacterial pathogens (22, 24).
3
The expression of avrACXcc8004 is regulated by HrpG and HrpX regulatory genes. An imperfect
4
PIP box was identified in the promoter region of avrACXcc8004. Recently, it has been demonstrated
5
that HrpX binds to the PIP box (perfect or imperfect) present in the promoter region of four hrp
6
operons of X. campestris pv. vesicatoria strain 85-10, suggesting that HrpX directly activates
7
most HrpX-regulated genes via binding to corresponding PIP boxes (38). Base substitutions
8
experiments showed that point mutations in the PIP boxes may diminish or abolish the binding of
9
HrpX. However, a study of the hrpC operon in X. oryzae pv. oryzae showed that base
10
substitution(s) in the PIP box did not always reduce promoter activity and could even confer
11
considerable activities (20, 68). Moreover, several genes having imperfect PIP boxes were shown
12
to be regulated by HrpX (20). Therefore, it is probable that avrACXcc8004 expression is directly
13
activated by HrpX.
14
15
AvrACXcc8004 is an effector protein displaying LRR and Fic domains. In plant pathogenic
16
bacteria, the number of effector proteins containing LRRs is rather limited, and the function of
17
only one of them, i.e. the GALA family of R. solanacearum, has been studied in some detail (3,
18
52). AvrACXcc8004 is clearly different from GALAs since it doesn’t contain an F-box domain.
19
AvrACXcc8004 possesses a Fic-like domain (PF02661, Pfam database). Proteins displaying a Fic
20
domain are widely distributed in bacteria but are also found in Archaea and Eukaryota in the Pfam
21
database (18). However, surprisingly, although this domain is found in fungi and numerous
22
animals, it was not detected in proteins or proteomes of plants. The function of proteins carrying
23
the PF02661 domain is not known.
24
8004 possesses three proteins with the PF02661 domain (i.e. XC0055, XC0223 and
25
AvrACXcc8004). Interestingly, the other Xanthomonas species (X. oryzae pv. oryzae, X. axonopodis
26
pv. citri and X. campestris pv. vesicatoria) represented in the Pfam database carry only one gene
176
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
with a Fic domain, which is the ortholog of XC0223. Thus, the two proteins, XC0055 and
2
AvrACXcc8004, seem specific of X. campestris pv. campestris strains. These two proteins are not
3
highly conserved one to another, they only display similarities in their Fic regions (25% identity,
4
40% similarity). It is also worth noting that the central highly conserved motif, HPFXXGNG
5
(where H stands for histidine; P, proline; F, phenylalanaine; G, glycine; N, asparagine; X, any
6
amino acid residue), found in Fic proteins is not perfectly conserved in AvrACXcc8004, since a
7
glycine residue is replaced by an alanine residue (A) (Fig. S1). Whether this difference has any
8
effect on the function of this domain is not known.
9
One protein, Aave1508, carrying both a LRR and an imperfect Fic domain was identified in A.
10
avenae subsp. citrulli AAC00-1, another phytopathogenic bacterium, suggesting the existence of a
11
AvrACXcc8004 family in phytopathogenic bacteria. The DNA region encompassing avrACXcc8004
12
coding sequences, appears to be unique to X. campestris pv. campestris strains (Fig. 2).
13
Moreover, the G+C content of this region is 57% and thus differs significantly from the
14
average value of 64.94% of the whole genome of X. campestris pv. campestris 8004. This
15
suggests that AvrACXcc8004 might have been acquired by horizontal gene transfer.
16
17
Is AvrACXcc8004 an avirulence effector recognized in vascular tissues? Using the piercing
18
inoculation method, we observed a differential behaviour of strain 8004 towards Col-0 and
19
Kashmir ecotypes, since this strain is avirulent on Col-0 whereas it induces disease symptoms on
20
Kashmir. When this strain was infiltrated into the mesophyll using leaf infiltration method, we
21
didn’t observe such a differential behavior between these two ecotypes, both being susceptible to
22
strain 8004. A mutant in XC1553/avrACXcc8004 became virulent on Col-0 after inoculation by the
23
piercing method, whereas we didn’t detect any changes when this mutant was infiltrated into the
24
leaf mesophyll of Col-0 or Kashmir ecotypes. How to explain the difference observed between
25
these two ways of inoculations? Our microscopic observations clearly show that the piercing
26
method allows the colonization of xylem vessels (Fig. S2). Thus, although this method bypasses
177
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
the normal entry route via hydathodes, it allows the delivery of this vascular pathogen into xylem
2
tissues. Therefore, our data could suggest the existence of a specific recognition of AvrACXcc8004
3
in xylem tissues of Col-0. However, we cannot totally exclude the possibility that wounding
4
induced by the piercing method plays a role in the recognition of AvrACXcc8004 and the resistance
5
of Col-0. The fact that X. campestris pv. campestris is recognized as a vascular pathogen prompts
6
us to favor the hypothesis suggesting that AvrACXcc8004 induces a vascular resistance. However,
7
further work is necessary to show that this is really the case.
8
Interestingly, the phenotype of avrACXcc8004 mutant on resistant host can be compared with those
9
of the avrXccFM mutant of X. campestris pv. campestris strain 528T and the avrXa10 mutant of
10
Xanthomonas oryzae pv. oryzae, a vascular pathogen of rice, on their corresponding resistant
11
host-plants. The X. campestris pv. campestris strain 528T elicited neither disease symptoms nor a
12
typical HR on the leaves of the host plant Florida Mustard. The avrXccFM mutant of 528T became
13
virulent on Florida Mustard but was as virulent as the wild-type strain 528T on susceptible host
14
plants (9). Similarly, the avrXa10 mutant of X. oryzae pv. oryzae became pathogenic on resistant
15
rice cultivar but was as virulent as the wild-type strain on susceptible rice cultivar (5). However,
16
our work brings a new dimension to these studies, by demonstrating that avrACXcc8004 is not
17
recognized in mesophyllic tissues but shows its avirulence function after wounding vascular
18
tissues. Further studies are necessary to clearly establish the molecular and physiological bases of
19
this recognition. Is the resistance response triggered by this avirulence gene similar to those
20
already described in mesophyllic tissues and resulting in HR elicitation? Are these resistance
21
mechanisms present or expressed only in vascular tissues and absent in the mesophyll? Previous
22
studies have shown that resistance of Brassica plants to X. campestris pv. campestris is not
23
usually associated with a typical mesophyllic HR (9), but is rather proposed to be associated with
24
a vascular HR (VHR). This VHR shares some resemblance with the mesophyllic HR, but is more
25
difficult to observe (34). Although we didn’t determine whether the vascular/wounding resistance
26
of Col-0 is associated with a VHR, it is highly probable that the resistance observed in this work
178
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
is typical of X. campestris pv. campestris /Brassica incompatible interactions. It will now be
2
interesting to compare the behaviour of the wild type and avrACXcc8004 mutants on the set of
3
natural Brassica hosts used to propose the existence of six races for X. campestris pv. campestris
4
(72). The characterization of avrACXcc8004 gene which seems to behave as a typical avirulence
5
gene in vascular tissues may be a step forward in understanding vascular resistance. The further
6
study of avrACXcc8004 and the characterization of the putative corresponding R gene in Col-0,
7
which is now underway, will undoubtedly increase our understanding of the molecular basis of
8
this specificity.
9
Related questions are whether AvrACXcc8004 has a function in virulence in vascular tissues and
10
what are its potential targets inside plant cells. Our experiments did not reveal a major
11
contribution of this effector protein in disease induction in Kashmir and Col-0, but other
12
Arabidopsis ecotypes have to be tested. We also tested the virulence of the avrACXcc8004
13
mutants by the leaf-clipping method (16) on Chinese radish Manshenshong and did not observe
14
any difference with the wild type strain (data not shown). It is well established that the
15
contribution of most avr genes of X. campestris pv. campestris to virulence in susceptible hosts
16
can be very small (9, 77). In addition, as reported for other phytopathogenic bacteria, it seems that
17
the effect of individual effectors for disease induction on susceptible host plants is difficult to
18
assess. This might be due to the existence of either functional redundancy and/or host specificity
19
(21).
20
ACKNOWLEDGEMENTS
21
This work was supported by PRA (Programme de Recherches Avancees) project (PRA-BT02-
22
03), the ‘973’ Program of the Ministry of Science and Technology of China (2006CB101902), the
23
National Natural Science Foundation of China (30130010) and the Département Santé des Plantes
24
et Environnement de l’Institut National de la Recherche Agronomique (INRA). SB was supported
25
by a grant from the Ministère de la Recherche et de l’Enseignement Supérieur.
179
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
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Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
Figure legends
1
2
Fig. 1. Structure of XC1553, alignment of leucine-rich repeat (LRR) motifs.
3
4
A. Structure and alignment of LRRs of XC1553. White boxes represent LRR. The gray box in
5
XC1553 represents the Fic domain as defined by Pfam. Alignments of LRRs are shown under the
6
structure of XC1553. Alignments of all LRRs are shown on the top and alignments of LRRs
7
belonging to the two classes of conserved segments are shown below. Numbers indicate amino
8
acid positions. Specific LRR numbers are shown to the left. The bars below consensus sequences
9
indicate the highly conserved segment of LRRs containing 11 or 12 residues (see text), which are
10
indicated with black or green LRR numbers, respectively. The conserved leucine residues (L) of
11
the LRRs are shown in red. These are sometimes replaced by an aliphatic residue (V, I, or M)
12
which are highlighted in blue. Other LRRs conserved amino acids are indicated in green. Bold
13
letters indicate more than 65% conservation of a given residue at a given position. The consensus
14
amino acid sequence is shown below. x = any residue and α = aliphatic residue.
15
16
B. Comparison of the consensus sequence of the LRR domain of XC1553 with those of XC4273
17
(X. campestris pv. campestris) (14, 58), HpaF (X. axonopodis pv. glycines) (36), PopC (R.
18
solanacearum) (23), LrpE (R. solanacearum) (52) and GALA (R. solanacearum) (13) subfamilies
19
as well as with the consensus sequence of the seven classes of LRRs defined by Kajava (33),
20
Enkhbayar et al. (17) and Matsushima et al. (46).
21
22
Fig. 2. Genetic organization and analysis of the XC1553 locus in the genome of X. campestris pv.
23
campestris and comparison with syntenic regions in X. campestris pv. vesicatoria and X.
24
axonopodis pv. citri.
25
190
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
A. Representation of XC1553 and its flanking genes and of the corresponding regions in the
2
genomes of X. campestris pv. vesicatoria strain 85-10 and X. axonopodis pv. citri strain 306.
3
Arabic numbers represent the nucleotide position in 8004 genomic sequence (accession no.
4
NC_007086). Big arrows represent the predicted protein-coding genes. Orthologous genes in X.
5
campestris pv. campestris, X. campestris pv. vesicatoria or X. axonopodis pv. citri have the same
6
color. DNA regions showing significant sequence identity (above 85%) between X. campestris pv.
7
campestris, X. campestris pv. vesicatoria or X. axonopodis pv. citri are represented by boxes with
8
the same motif and colinear regions are delimited by gray boxes. The PIP and –10 box found
9
upstream XC1553 coding sequences is indicated by three vertical bars. The DNA sequence
10
displaying homologies with IS1478 insertion sequence is indicated by a black box. Horizontal
11
black bars indicate sequences used in plasmid construction. The small arrows above and below
12
coding sequences represent the position and direction of primers used for analysis of
13
transcriptional products. The black triangle above the XC1553 ORF presents the integration site of
14
pK18mob derivative in the mutant NK1553. The small flag above the XC1553 ORF stands for the
15
direction and position of transposon Tn5gusA5 in the mutant 151H08.
16
17
B. Analysis of transcriptional products of XC1552 and XC1553 in X. campestris pv. campestris
18
wild-type strain 8004 and XC1553 Tn5gusA5 insertional mutant 151H08 by RT-PCR. The
19
predicted size of the products for XC1552, XC1553 and sequence spanning XC1552 and XC1553
20
was 477-bp, 302-bp and 418-bp, respectively.
21
22
Fig. 3. XC1553 of X. campestris pv. campestris strain 8004 is transcriptionally regulated by hrpG
23
and hrpX. β-Glucuronidase (GUS) activities were determined after growth of X. campestris pv.
24
campestris strains in minimal medium XVM2 for 16 h or in rich medium NYG for 12 h. Data are
25
the mean ± standard deviation of triplicate measurements.
26
191
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
Fig. 4. XC1553 of X. campestris pv. campestris strain 8004 is a T3SS-translocated effector.
2
3
A. AvrBs1 of X. campestris pv. campestris strain 8004 is responsible for its elicitation of HR on
4
nonhost plant pepper ECW-10R. (1) sterilized water; (2) hrcV Tn5gusA5 insertional mutant
5
050B12; (3) wild-type strain 8004; (4) 8004∆avrBs1; (5) hrpF mutant 121D06/pLBs1; (6)
6
8004∆avrBs1/pLBs1. Photograph was taken 48 h post inoculation.
7
B. Amino acids 59 to 445 of X. campestris pv. campestris AvrBs1 contain functional domain to
8
induce HR on pepper ECW-10R. Bacterial cells were infiltrated into pepper leaves by using
9
needleless syringe. Photographs were taken 3 days post infiltration.
10
C. XC1553 of X. campestris pv. campestris strain 8004 is a T3SS-translocated effector. Bacterial
11
cells of X. campestris pv. campestris strains were introduced into leaves of pepper ECW-10R by
12
infiltration. (a) sterilized water; (b) 050B12 (hrcV Tn5gusA5 insertional mutant); (c)121D06
13
(hrpF Tn5gusA5 insertional mutant); (d) wild-type strain 8004; (e) 8004∆avrBs1; (f)
14
8004∆avrBs1/pLBs159-445P; (g) 8004∆avrBs1/pLTXC1553; (h) 121D06/pLTXC1553.Photographs
15
were taken 48 h post infiltration.
16
17
Fig. 5. Symptoms caused by X. campestris pv. campestris strains after infiltration into the
18
mesophyll of A. thaliana Columbia Col-0 (A) or Kashmir (B) leaves. (1) wild-type strain 8004;
19
(2) 151H08 (avrACXcc8004::Tn5gusA); (3) C151H08 (15H08 mutant carrying pXC1553 plasmid
20
which contains the entire avrACXcc8004 gene). Photographs were taken 5 days after wound
21
(piercing) inoculation.
22
C. In planta bacterial growth of X. campestris pv. campestris strains after infiltration of Columbia
23
(Col-0) or Kashmir mesophyllic tissues. Each data point represents the mean and standard
24
deviation calculated from four replicates. The experiments were repeated at least twice with
25
equivalent results.
26
192
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
Fig. 6. Analysis of the interaction phenotype of plant and bacterial strains after piercing
2
inoculation on A. thaliana Columbia (Col-0) or Kashmir leaves. Four fully expanded leaves of
3
each plant were inoculated by piercing three holes in the central vein with a needle dipped in a
4
bacterial suspension. At least 4 plants were inoculated for each strain tested. These experiments
5
were repeated at least three times, and gave similar results. Disease index were determined as
6
described by Meyer et al. (48) : 0, no symptoms; 1, chlorosis surrounding the wounding site; 2,
7
strong V-shaped chlorosis; 3, developing necrosis; 4, leaf death. The average disease index scores
8
and the standard deviations were calculated from the values of four plants with four inoculated
9
leaves per plant.
10
A. Symptoms caused by X. campestris pv. campestris strains on Col-0 inoculated leaves. (1) wild-
11
type strain 8004; (2) 151H08 (15H08 mutant carrying pXC1553 plasmid which contains the entire
12
avrACXcc8004 gene); (3) C151H08 (15H08 mutant carrying pXC1553 plasmid which contains the
13
entire avrACXcc8004 gene). Photographs were taken 5 days after wound inoculation.
14
B. Disease progress on Col-0.
15
C. Symptoms caused by X. campestris pv. campestris strains on the inoculated Kashmir leaves.
16
Photographs were taken 7 days after wound inoculation. (1) wild-type strain 8004; (2) 151H08;
17
(3) C151H08.
18
D. Disease progress on Kashmir.
19
20
Fig. 7. In planta bacterial growth of X. campestris pv. campestris strains after piercing inoculation
21
of A. thaliana leaves.
22
A. Bacterial growth at the inoculation site (proximal samples) of Columbia (Col-0) leaves.
23
B. Bacterial growth at the tip of the Col-0 inoculated leaves (distal samples).
24
C. Bacterial growth at the inoculation site (proximal samples) of Kashmir leaves.
25
D. Bacterial growth at the tip of the Kashmir inoculated leaves (distal samples).
193
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
E. Diagram of an Arabidopsis leaf showing the proximal and distal zones used for growth curve
2
assays.
3
Each data point represents the mean and standard deviation calculated from four replicates. The
4
experiments were repeated at least twice with equivalent results.
194
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
1
Table 1. Bacterial strains and plasmids used in this work
Strain or plasmid
Relevant characteristics a
Reference or source
X. campestris pv. campestris
8004
Wild type, Rifr
(15)
121D06
As 8004, but hrpF::Tn5gusA5, Rifr Kanr
This work
050B12
As 8004, but hrcV::Tn5gusA5, Rifr Kanr
This work
151H08
As 8004, but XC1553::Tn5gusA5, Rifr Kanr
This work
8004∆hrpX
hrpX deletion mutant of 8004, Rifr Kanr
This work
8004∆hrpG
hrpG deletion mutant of 8004, Rifr Kanr
This work
8004∆avrBs1
avrBs1 deletion mutant of 8004, Rifr Gmr
This work
8004∆avrBs1/pLAFR6
8004∆avrBs1 harboring plasmid pLAFR6, Rifr Gmr
Tcr
This work
8004∆avrBs1/pLBs1
8004∆avrBs1 harboring plasmid pLBs1, Rifr Gmr Tcr
This work
8004∆avrBs1 harboring plasmid pLBs159-445P, Rifr
Gmr Tcr
8004∆avrBs1 harboring plasmid pLTXC1553, Rifr
Gmr Tcr
121D06 harboring plasmid pLTXC1553, Rifr Kanr
Tcr
This work
This work
8004 harboring plasmid pLG1553, Rifr Tcr
This work
8004∆hrpG harboring plasmid pLG1553, Rifr Kanr
Tcr
8004∆hrpX harboring plasmid pLG1553, Rifr Kanr
Tcr
This work
NK1553
As 8004, but XC1553::pK18mob, Rifr Kanr
This work
CNK1553
NK1553 harboring plasmid pXC1553, Rifr Kanr Tcr
This work
C151H08
151H08 harboring plasmid pXC1553, Rifr Kanr Tcr
This work
EHA105
Agropine strain, Rifr
(28)
EHA105/ pBI121
EHA105 harboring plasmid pBI121, Rifr Kanr
This work
EHA105/ pBBs159-445P
EHA105 harboring plasmid pBBs159-445P, Rifr Kanr
This work
8004∆avrBs1/pLBs159-445P
8004∆avrBs1/ pLTXC1553
121D06/ pLTXC1553
8004/pLG1553
8004∆hrpG /pLG1553
8004∆hrpX /pLG1553
This work
This work
A. tumefaciens
195
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
EHA105 harboring plasmid pBBs1, Rifr Kanr
This work
JM109
RecA1 endA1 gyrA96 thi supE44 relA1 ∆(lacproAB)/F′ [traD36 lacIq lacZ∆M15]
(78)
EDB767
Helper strains, harboring pRK2073, recA met, Spcr
(53)
pLAFR3
Broad-host-range IncP cloning cosmid, Mob+ Tra- ,
contains plac; Tcr
(64)
pLAFR6
Broad host range cloning vector, Tcr
(29)
pRK2073
Helper plasmid, Tra+, Mob+, ColE1, Spcr
(41)
pPH1JI
Tra+, Mob+, IncP replicon, Spcr Gmr
(27)
pBI121
Plant expression vector, Kanr
(30)
pK18mob
Suicide plasmid in X. campestris pv. campestris,
Mob+, Tra-, Kanr
(57)
pT18mob
A tetracycline resistant derivative of pK18mob, Tcr
(66)
pT18mob but Hind III restriction site was destroyed,
Tcr
pK18mob containing a 537-bp internal fragment of
XC1553, Kanr
pT18mobH containing avrBs1 ORF and its flanking
sequences, Tcr
pTH2081 but avrBs1 ORF was replaced by Gmr
gene, Gmr Tcr
pLAFR6 containing avrBs1 promoter plus avrBs159r
445 fusion, Tc
pBI121 containing avrBs1 promoter plus avrBs159-445
fusion, Kanr
This work
EHA105/ pBBs1
E. coli
Plasmids
pT18mobH
pK1553
pTH2081
pTG2081
pLBs159-445P
pBBs159-445P
This work
This work
This work
This work
This work
pLBs1
pLAFR6 containing entire avrBs1 gene, Tcr
This work
pBBs1
pBI121 containing entire avrBs1 gene, Kanr
This work
pXC1553
pLAFR3 containing entire XC1553 gene, Tcr
This work
pLAFR6 containing fused XC1553 promoter and
This work
promoterless gus, Tcr
pLAFR6 containing XC1553 translocation fusion
This work
pLTXC1553
fragment, Tcr
a
1
Rif = rifampicin, Kan = kanamycin, Tc = tetracycline, Gm = gentamycin, Spc = spectinomycin,
pLG1553
2
and ORF = open reading frame.
196
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
FIGURES
Fig. 1
A
XC1553
1
144
283
382
495
536
Fic
LRR1 144 GTQLTL RDLNLSQLPPGLHRLAH
LRR2
LRDLDVADNVNLTRLPEDLSLCKH
LRR3
LERINA DGCSIAALPSKIGALKN
LRR4
LSEISL AFNELRTLPDSIGQCSS
LRR5
LTTIVV PGCKINKLPASLANLTQ
LRR6
LKKLDVAANIELSELSPHMNLDDV 283
Consensus
α xxLxx
LxxLxV xxxxLxxLPxxα
I
LRR1
LRR3
LRR4
LRR5
GTQLTLRDLNLSQLPPGLHRLAH
LERINADGCSIAALPSKIGALKN
LSEISLAFNELRTLPDSIGQCSS
LTTIVVPGCKINKLPASLANLTQ
Consensus
LxxIxα
α xxNxα
α xxLPxxα
α xxLxx
LRR2
LRR6
LRDLDVADNVNLTRLPEDLSLCKH
LKKLDVAANIELSELSPHMNLDDV
Consensus
α xLxxx
LxxLDVAxNxxLxxLxxxα
B
Consensus sequence
of LRRs motifs
of
Plant pathogenic
bacteria
XC4273
XC1553
HpaF
PopC
LrpE
GALA
Typical
RI
Consensus sequence
of the seven classes
of
LRR motifs
197
CC
Bacterial
SDS22-like
Plant
Specific
TpLRR
LxxLxL
LxxLxV
I
LxxLxL
LxxLxL
LxxLxL
LxxLxL
xxxxLxxLPxSα
α xxLxx
xxxxLxxLPxxα
α xxLxx
xxxxLxxLPxSα
α GxLxx
xNxxLxxLPxxα
α GxLxx
xxxxLxxLPxxLGxLxx
xxNxIGxxGAxALAxxxx
LxxLxL xxNxLxxLpxxoFxzxLxx
LxxLxL xxNxLxxxgoxxLxxoLxxzxx
C
LxxLxLxxCxxITDxxoxxLα
α xzxcxx
LxxLxV xxNxLxxLPeLPxx
D
LxxLxL xxNxIxxIxxLxzxLxx
LxxLxL xxNxLtgzxIPxxLGxLxzx
s
LxxIxL xxxLxxIgxxAFxxCxx
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
Fig. 2
A
pLG1553
pXC1553
1866786
8004
1867448
NK1553
1867667
XC1552
151H08
1869277
XC1553
1869901
1871274
XC1554
PIP Box
500 bp
Xanthomonas campestris
pv. vesicatoria
XCV2888
XCV2887
Xanthomonas axonopodis
pv. citri
XAC2736
XAC2735
B
XC1552 XC1553 XC1552XC1552-53
Total DNA
8004 cDNA
151H08 cDNA
8004 RNA no RTase
151H08 RNA no RTase
198
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
Fig. 3
G U S a ct i v i t y ( m l. m i n . O D
600
)
0. 04
0. 035
NYG
0. 03
XVM2
0. 025
0. 02
0. 015
0. 01
0. 005
199
53
15
LG
/p
pX
÷h r
4¡
0
80
80
04
¡
h÷r
80
04
pG
/p
/p
LG
LG
15
15
53
53
0
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
Fig. 4
A
1
4
2
5
3
6
B
8004¡
avrBs1
a vrBs1
8004 ÷
EHA105
1
4
pLBs1
pBBs1
5
2
pLBs159
59--445P
pBBs15959-445P
-
6
3
pLAFR6
C
pBI121
a
e
b
f
g
c
d
h
200
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
Fig. 5
A
C
7,0
1
2
Bacterial density [log (cfu/cm 2)]
6,5
3
B
6,0
5,5
5,0
WT 8004 in Colombia
4,5
151H08 in Colombia
WT 8004 in Kashmir
4,0
151H08 in Kashmir
3,5
3,0
2,5
2,0
0
2
4
6
Time (days after inoculation)
1
2
3
Fig. 6
A
B
3,5
Disease index
3,0
2,5
WT 8004
2,0
151H08
1,5
8004/pLAFR3
1,0
151H08/pLAFR3
0,5
1
2
3
C151H08
0,0
5
6
7
8
Time (days after inoculation)
C
D
Disease index
4,0
WT 8004
3,0
151H08
2,0
C151H08
1,0
0,0
1
2
3
5
6
7
Time (days after inoculation)
201
8
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
Fig. 7
A
B
Columbia Col-0 - distal
Columbia Col-0 - proximal
8,0
2
WT 8004
7,0
151H08
8004/pLAFR3
6,5
151H08/pLAFR3
C151H08
6,0
5,5
5,0
2
4
6
Time (days after inoculation)
Kashmir - proximal
8,0
6
WT 8004
5
151H08
8004/pLAFR3
151H08/pLAFR3
4
C151H08
3
2
E
Petiol e
0
C
Bacterial density [log (cfu/cm )]
2
Bacterial density [log (cfu/cm )]
7
7,5
1
Inoculation
site
Proximal
C
Distal
0
2
4
6
Time (days after inoculation)
D
Kashmir - distal
7,0
2
Bacterial density [log (cfu/cm )]
2
Bacterial density [log (cfu/cm )]
Arabidopsis leaf
7,5
7,0
WT 8004
151H08
6,5
C151H08
6,0
5,5
5,0
6,0
WT 8004
5,0
151H08
C151H08
4,0
3,0
2,0
0
2
4
Time (days after inoculation)
6
0
2
4
6
Time (days after inoculation)
202
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
Supplementary online materials
Table S1. The PCR primer sets used in this study
Sequencea
Primer set
1553F/1553R
5′-aaaccaactgctgctccccg-3′/5′-cccaatccatcgcaagacgc-3′
1552F/1552R
5′-gggtcactggaccacgctcgacacc-3′/5′-tgctccccgaagtggaacatcaccg-3′
1553-52F/1553-52R
5′-atttcttggggaaagcgcg-3′/5′-cgaagatctcctgaatcacc-3′
IG1553F/ IG1553R
5′-ggatatgagcaccttcatccagcag-3′/5′-aggctcaagtcttctggcagacgcg-3′
C1553F/C1553R
5′-cccgaattccgtctttcactgcccctatg-3′/5′-agaggatccaagatgttgccaccaggc-3′
DS1F/DS1R
5′-gcgtctagaatcgcatttcgtttcgaggccgc-3′/5′-gcggaattcaacacgttcatcaagcggttccc-3′
GmF/GmR
5′-ccaagcttaattgacataagcctgttcggttcg-3′/5′-ccaagctttgacaatttaccgaacaactccgc-3′
PS1F-F/CS1R-R
5′-gctctagactcagaatttcgtaatgaacgg-3′/5′-gcggatccttacgcttctcctgcatttgtaac-3′
PV1553F/PV1553R
5′-agtgaattcgcctgtggtgcttgattgagatcc-3′/5′-ctacaggacgtaacatcgatgaagaactagtttttatg-3′
GusF /GusR
5′-atgttacgtcctgtagaaacccc-3′/5′-ataggtaccggctttcccccccccccctgcag-3′
Bs1P-F/Bs1P-R
5′-gctctagactcagaatttcgtaatgaacgg-3′/5′-cattagttcgatatttatattaattg-3′
F59aa-F/F445aa-R
5′-tataaatatcgaactaatggctttgcacacctcatcgttagag-3′/5′-gcggatccttacgcttctcctgcatttgtaac-3′
59aa-F/445aa-R
5′-gggtctagagctttgcacacctcatcgttagag-3′/5′-gggctgcagttacgcttctcctgcatttgtaacatg-3′
T1553F/T1553R
5′-aaagaattcagccgactttggggttcagctg-3′ /5′-aaatctagataggtgcgcaaggcggtgca gtc-3′
DG-LF/DG-LR
5′-ggggatcccggtgttcggcacgcagatgcg-3′/5′-ggtctagatcgcgcgcccacgccggcggta-3′
DG-RF/DG-RR
5’-gggtcgacggctcatgaagactt-3’/5’-gggcatgc ttcaatggtcgttcg-3’
Km-F/Km-R
5’-ggtctagactgcaggggggggggg-3’/5’-gggtcgac ttagaaaaactcatcg-3’
DX-LF/DX-LR
5’-acagttgaattcctttagcgggtggtcagt-3’5’-acagttggtacc agaatcaacaaggcatcg-3’
DX-RF/DX-RR
5’-acagtttctagatgaactgttggccgatgg-3’5’-acagttgtcgac agtcgtggatctcctgtt-3’
a
203
Added restriction sites are underlined.
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
Table S2. The PCR primer sets used in this study
Sequencea
Primer set
1553F/1553R
5′-aaaccaactgctgctccccg-3′/5′-cccaatccatcgcaagacgc-3′
1552F/1552R
5′-gggtcactggaccacgctcgacacc-3′/5′-tgctccccgaagtggaacatcaccg-3′
1553-52F/1553-52R
5′-atttcttggggaaagcgcg-3′/5′-cgaagatctcctgaatcacc-3′
IG1553F/ IG1553R
5′-ggatatgagcaccttcatccagcag-3′/5′-aggctcaagtcttctggcagacgcg-3′
C1553F/C1553R
5′-cccgaattccgtctttcactgcccctatg-3′/5′-agaggatccaagatgttgccaccaggc-3′
DS1F/DS1R
5′-gcgtctagaatcgcatttcgtttcgaggccgc-3′/5′-gcggaattcaacacgttcatcaagcggttccc-3′
GmF/GmR
5′-ccaagcttaattgacataagcctgttcggttcg-3′/5′-ccaagctttgacaatttaccgaacaactccgc-3′
PS1F-F/CS1R-R
5′-gctctagactcagaatttcgtaatgaacgg-3′/5′-gcggatccttacgcttctcctgcatttgtaac-3′
PV1553F/PV1553R
5′-agtgaattcgcctgtggtgcttgattgagatcc-3′/5′-ctacaggacgtaacatcgatgaagaactagtttttatg-3′
GusF /GusR
5′-atgttacgtcctgtagaaacccc-3′/5′-ataggtaccggctttcccccccccccctgcag-3′
Bs1P-F/Bs1P-R
5′-gctctagactcagaatttcgtaatgaacgg-3′/5′-cattagttcgatatttatattaattg-3′
F59aa-F/F445aa-R
5′-tataaatatcgaactaatggctttgcacacctcatcgttagag-3′/5′-gcggatccttacgcttctcctgcatttgtaac-3′
59aa-F/445aa-R
5′-gggtctagagctttgcacacctcatcgttagag-3′/5′-gggctgcagttacgcttctcctgcatttgtaacatg-3′
T1553F/T1553R
5′-aaagaattcagccgactttggggttcagctg-3′ /5′-aaatctagataggtgcgcaaggcggtgca gtc-3′
a
Added restriction sites are underlined.
204
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
Fig. S1. Alignment of Fic domain of XC1553 with other Fic domains. Alignment of the highly
conserved motif of the Fic domain of XC1553 (from amino acids 451 to 495) as defined by the
Pfam hidden Markov model, PF02661, with those of PA0574 (Pseudomonas aeruginosa;
accession no. NP_249265), pNL1_p034 (Novosphingobium aromaticivorans; NP_049082),
LD47713p (Drosophila melanogaster; AMM11387); HypE (Homo sapiens; NP_009007),
Aave1508 (Acidovorax avenae subsp. citrulli AAC00-1; YP_969871), Fic (Escherichia coli K12;
NP_417820), XC0050 and XC0223 (X. campestris pv. campestris). The corresponding PF02661
consensus sequence is also aligned (bottom). Black boxes correspond to identical amino acids or
conserved residues present in at least 50% of the sequences, dark gray indicates conserved
substitutions and light gray shows semiconserved substitutions [following the ClustalW alignment
sequence criteria (Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ (1994) CLUSTALW: improving the
sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positionspecific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res 22: 4673-4680.)].
Pseudomonas aeruginosa
Novosphingobium aromaticivorans
Drosophila melanogaster
Homo sapiens
Xanthomonas campestris 8004
Acidovorax avenae
Xanthomonas campestris 8004
Xanthomonas campestris 8004
Escherichia coli
PF02661 consensus
205
PA0574
pNL1_p034
LD47713p
HypE
XC1553
Aave1508
XC0223
XC0050
Fic
191
188
358
345
451
561
186
209
117
SLDPFLRAGIAHFWFVTLHPFDDGNGRLTRAITDLALAQ--GEQQA
PLPGLTRSGLAHLYFVTIHPFEDGNGRIGRAIAEKALSQAIGQPSL
TLHPVNYAALAHYKLVHIHPFVDGNGRTSRLLMNTLLMRA-GYPPV
NLHPVEFAALAHYKLVYIHPFIDGNGRTSRLLMNLILMQA-GYPPI
ALGHIEFAAQLHQRLVSLHPFDDANGRTARLAMDWALQRH-GLPPA
RMNPAELSAATVQRLISIHPFADANGRTARLAGDWVLMSH-GLPPA
DIDPLIRMAVAHYQFEAIHPFTDGNGRTGRVLNLLMLIEQ-GLLDL
TLPPLVRIALVHAQFETIHPFLDGNGRIGRLLIAALLEHWQLLPEP
KAKFVERLAHYYCEINVLHPFRVGSGLAQRIFFEQLAIHA-GYQLS
234
233
401
389
495
605
230
254
161
56
TEDPLERAILAHYLFNYIHPFRDGNGRTARLLMNLLLLRA-GYPPF
100
Chapitre III : Etude de l’effecteur AvrACXcc8004 de Xcc
Fig S2 : Invasion of A. thaliana xylem vessels by X. campestris pv. campestris. Cross section of
A. thaliana Sf-2 leaf infected with strain XCC568 (ATCC33913) by the piercing method. The
interaction between SF-2 and ATCC33913 is compatible and results in typical disease symptoms
similar to those observed between Kashmir ecotype and strain 8004 (Meyer, D., E. Lauber, D.
Roby, M. Arlat, and T. Kroj. 2005. Optimization of pathogenicity assays to study the Arabidopsis
thaliana – Xanthomonas campestris pv. campestris pathosystem. Mol. Plant Pathol. 6:327333).The micrograph was taken 7 days after-inoculation. The leaf studied here was given a
disease index score of 2. Bacterial cells are clearly visible in xylem vessels of a minor vein. Note
that xylem tissues often appear degraded (red arrowheads). Scale bars = 20 µm.
206
DISCUSSION GENERALE
ET PERSPECTIVES
Discussion générale et perspectives
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Une nouvelle fonction pour les Récepteurs TonB-dépendants
A partir de l’observation de la sur-représentation des récepteurs TonB-dépendants chez les
espèces du genre Xanthomonas, les travaux effectués dans l’équipe au cours de ma thèse ont
permis de définir de nouvelles fonctions pour les TBDR, protéines connues surtout pour leur rôle
dans l’acquisition du fer. Parmi les 64 TBDR de Xcc possédant les deux domaines pfam
caractéristiques de cette famille protéique, nous avons pu montrer que seulement 9 sont
potentiellement impliqués dans l’acquisition du fer. Nous avons caractérisé SuxA, un TBDR de
Xcc impliqué dans le transport actif du saccharose, un sucre majeur chez les végétaux supérieurs.
Outre la publication, au cours de cette thèse, du transport de maltodextrines à travers le TBDR
MalA de Caulobacter crescentus (Neugebauer et al., 2005), notre étude est la première à
démontrer clairement le transport à travers des TBDR de molécules autres que des complexes fersidérophore, des sidéromycines (ou de la vitamine B12).
Au cours de l’évolution, les TBDR ont-t-ils perdu leur spécificité pour les sidérophores au
profit d’une fonction divergente dans le transport de macromolécules diverses, ou vice versa ? Le
fait que certains sidérophores puissent être utilisés pour l’acquisition du fer, mais aussi comme
source de carbone pour la croissance chez certaines bactéries, suggère l’existence de mécanimes
évolutifs conservés, touchant probablement les fonctions intrinsèques des TBDR.
De nouveaux déterminants contrôlant l’adaptation de Xanthomonas campestris pv.
campestris à la plante
Il est communément admis que, dans le transport de molécules, les porines ont un seuil
d’exclusion intrinsèque autour de 600 Da. Le saccharose (342 Da) peut passer à travers des
porines : ceci est montré chez les entérobactéries, et notre étude suggère par ailleurs que, chez
Xcc, si le saccharose est présent à forte concentration dans l’environnement de la bactérie, celui-ci
entre dans la cellule par diffusion facilitée, c'est-à-dire très vraisemblablement via une (ou
plusieurs) porines. Des travaux sont actuellement en cours au laboratoire afin d’identifier
d’éventuelles porines spécifiques du saccharose chez Xcc. Mais pourquoi Xcc a-t-il sélectionné un
récepteur TonB-dépendant pour le transport de ce sucre, alors que ce transport est possible par des
voies non consommatrices d’énergie (les porines) ?
L’affinité du récepteur TonB-dépendant SuxA pour son substrat est très supérieure (environ
3000 fois) à celle des porines ScrY des entérobactéries, spécifiques du transport de saccharose. De
plus, nous avons pu montrer que ce TBDR contribue très significativement au pouvoir pathogène
207
Discussion générale et perspectives
de la bactérie sur chou et sur Arabidopsis thaliana. Il semble donc que le transport de saccharose à
très haute affinité soit une étape critique dans le cycle infectieux de Xcc.
La capacité de transport des TBDR, en termes de taille de substrats, laisse supposer que ces
protéines pourraient intervenir dans le transport de molécules d’origine végétale de différentes
classes (polysaccharides, mais aussi peptides, produits phénoliques…) chez Xcc. A partir de
données d’expression et de l’analyse in silico des régions génomiques encadrant les TBDR, nous
avons pu identifier un substrat putatif pour une dizaine de TBDR. De nombreux TBDR ont donc
une fonction totalement inconnue pour le moment, et restent à étudier afin d’évaluer leur
contribution dans l’adaptation de la bactérie à son hôte végétal. Dans cet objectif, il serait très
intéressant de se doter d’une « banque » de molécules végétales la plus large possible, et d’étudier
l’expression de nos gènes TBDR en réponse à ces molécules. Cette banque permettrait également
de réaliser des « cocktails » de molécules, et ainsi de comprendre en quoi certaines molécules bien
particulières signalent à la bactérie la présence de la plante, entraînant l’induction de voies
spécifiques d’acquisition de nutriments et/ou de programmes de pathogénicité. Enfin, nous
pourrions inclure dans cette banque des extraits de tissus végétaux (racines, feuilles, parois
végétales…) qui pourraient permettre de faciliter des études d’expression préliminaires sur un très
grand nombre de gènes.
Un nouveau type de locus : les « CUT loci »
SuxA appartient à un nouveau type de locus, comportant des gènes codant pour des
enzymes de dégradation de carbohydrates végétaux, des transporteurs et/ou des régulateurs
transcriptionnels. Ces loci, désignés « CUT-loci » pour Carbohydrate Utilization loci containing
TBDR, sont nombreux chez Xcc : on dénombre 7 CUT loci complets et 12 CUT loci partiels,
renfermant au total 24 TBDR. L’étude fonctionnelle du locus sux ainsi que ces observations
suggèrent fortement que les CUT loci pourraient avoir un rôle majeur dans l’adaptation de Xcc à
la plante, mais aussi, et de façon très intéressante, dans son pouvoir pathogène. Si l’existence de
tels loci a déjà était suggérée chez d’autres bactéries (Bacteroides thetaïotaomicron,
Porphyromonas gingivalis, Azospirillum irakense, Sphingopyxis macrogoltabida, Sphingomonas
sp., Pseudomonas putida) à travers plusieurs publications récentes (cf. Introduction du Chapitre I),
nos études sont les premières montrant leur fonctionnalité dans l’utilisation de molécules
végétales.
208
Discussion générale et perspectives
Vers une meilleure compréhension de la fonction intrinsèque des CUT loci…
Outre le locus sux, ces travaux de thèse rapportent l’étude de deux couples de CUT loci : le
premier couple est impliqué dans l’utilisation du xylane chez Xcc. Ils contiennent des gènes
codant pour des enzymes capables de dégrader cette molécule complexe de la paroi végétale, et
des
systèmes
de
transport
membranaires
vraisemblablement
chargés
d’importer
des
oligosaccharides de xylose (monomère constitutif du xylan), avec une spécificité pour des tailles
bien précises de ces oligomères. De façon remarquable, le monomère de xylose a beaucoup moins
d’effet sur l’expression des gènes de ces deux CUT loci que le xylobiose, le xylotriose ou le
xylotetraose notamment. Nos résultats suggèrent l’existence de voies spécifiques pour le
métabolisme des polysaccharides dérivés du xylane chez Xcc, faisant intervenir un ou plusieurs
récepteurs TonB-dépendants pour le passage de la membrane externe.
Le deuxième couple de CUT loci étudié semble jouer un rôle dans l’utilisation de produits
dérivés de la pectine. Toutefois, seule l’étude de l’expression des TBDR de ces loci et de leur
régulation a été effectuée ; leur rôle en tant que transporteurs doit maintenant être démontré, et
l’étude des multiples enzymes présents dans ces loci doit être menée de façon approfondie.
Vers une meilleure compréhension du rôle des CUT loci dans le pouvoir pathogène de Xcc…
Si la contribution au pouvoir pathogène de Xcc des quatre loci étudiés dans le Chapitre II
n’est pas aussi « évidente » que dans le cas du locus sux, ces loci jouent probablement un rôle
dans l’interaction avec la plante que nos tests n’ont pas pu évaluer pour le moment ; il est à
présent nécessaire d’affiner ces tests préliminaires et de les étendre à différentes plantes hôtes. Il
sera également très intéressant de construire des mutants multiples et de réaliser des expériences
de compétition entre ces différents mutants et la souche sauvage de Xcc. Enfin, l’un des objectifs
majeurs sera aussi de mettre au point différents tests permettant d’évaluer l’étape précise du cycle
infectieux de Xcc qui implique ces CUT loci. En effet, notre principale méthode d’étude du
pouvoir pathogène, qui conduit à une inoculation des bactéries directement dans le xylème des
cellules végétales, biaise le cycle de vie de Xcc en ce sens que les étapes de vie épiphyte et
d’infection, pourtant cruciales, sont contournées.
Toutefois, l’obtention de phénotypes d’hypovirulence n’est pas la seule façon de montrer le
rôle d’un gène ou d’un groupe de gène dans le pouvoir pathogène d’une bactérie : l’établissement
d’une connexion avec des déterminants de virulence connus, tels que le système de sécrétion de
type III, peut également être très significatif. Nous avons pu montrer que plusieurs gènes TBDR
de Xcc sont régulés, positivement ou négativement, par les deux régulateurs centraux du système
209
Discussion générale et perspectives
de sécrétion de type III, HrpG et HrpX. Ce lien entre des TBDR et le TTSS, déterminant majeur
de la virulence des bactéries phytopathogènes, suggère d’ores et déjà l’importance de ces TBDR
dans l’interaction avec la plante. En effet, le régulon de ces régulateur est reconnu chez Ralstonia
solanacearum comme contenant d’important facteurs de virulences (Cunnac et al., 2004 ;
Occhialini et al., 2005 ; Valls et al., 2006), et des données de transcriptomique obtenues dans
l’équipe du Professeur Tang en Chine semblent confirmer ceci chez Xcc. Il est nécessaire à
présent d’approfondir ce lien, et de déterminer quelle est la fonction précise des deux TBDR
fortement activés par HrpG et HrpX.
Existe-t-il chez Xcc comme chez R. solanacearum un TBDR en amont d’une éventuelle
cascade de régulation conduisant à l’induction des gènes hrp ? Nous avons entrepris dans l’équipe
de comparer l’expression des deux gènes hrpG et hrpX dans le contexte sauvage et dans le
contexte muté pour chaque gène TBDR, afin de voir si la mutation d’un TBDR affecte
l’expression de ces gènes régulateurs. Nos résultats préliminaires n’ont pas permis d’identifier de
TBDR en amont des gènes hrp chez Xcc, mais il serait intéressant de faire varier les conditions
(milieu de culture, durée d’induction…) dans lesquelles nous nous sommes placées pour le
moment, avant d’exclure tout à fait l’hypothèse d’un mécanisme de régulation similaire à celui
observé chez R. solanacearum, et de façon moins claire chez Xanthomonas oryze pv. oryzicola
(Zou et al., 2006).
Le décryptage des réseaux de régulation contrôlant l’adaptation de Xcc à la plante…
Pour deux CUT loci (le locus sux et le locus XCC1750), nous avons pu montrer que le
régulateur interne au locus contrôlait effectivement l’expression du locus, au moins en partie.
Dans le cas des loci « xylane », une protéine régulatrice a pu être identifiée par des indices tels
que l’occurrence de motifs conservés dans les promoteurs ou d’enzymes potentiellement
impliqués dans la dégradation de ce polysaccharide complexe. Ainsi, nous avons montré que le
régulateur XCC4101 est responsable de la répression des deux loci en l’absence de
xylooligosaccharides.
Par ailleurs, des données préliminaires obtenues dans l’équipe indiquent également une
régulation de certains CUT loci par des régulateurs centraux du métabolisme et/ou de l’interaction
avec la plante, tels que Clp, KdgR, HrpG ou HrpX. Comment la régulation par ces régulateurs
« globaux » s’articule-t-elle avec celle exercée par les régulateurs plus « locaux » déjà identifiés ?
Le décryptage des réseaux de régulation contrôlant l’expression de ces loci, et plus généralement
210
Discussion générale et perspectives
l’interaction avec la plante, nécessite à présent des approches globales, et l’heure de la
transcriptomique a sonné pour cette thématique. L’objectif est en effet à présent de comparer les
transcriptomes de souches mutantes pour chacun de ces régulateurs avec celui de la souche
sauvage, mais aussi d’étudier les changements globaux d’expression en réponse à différentes
molécules végétales. Cette vaste entreprise, dont le coup d’envoi est imminent, apportera
vraisemblablement de nouvelles dimensions à nos travaux.
Les CUT loci capturent-t-ils des éliciteurs d’origine végétale ?
Même si cela reste à démontrer clairement, certains TBDR des deux couples de CUT loci
étudiés dans le Chapitre II semblent impliqués dans l’import de molécules dérivées de la paroi
végétale. Comme mentionné à plusieurs reprises en introduction des Chapitres II et III, les
produits dérivés de la paroi végétale, et notamment les oligogalacturonides, sont connus comme
étant de très bons « PAMPs », ou éliciteurs de réponses de défense des plantes. González & Allen
(2003) suggèrent de façon originale que les enzymes pectinolytiques produits par la bactérie R.
solanacearum pourraient jouer un rôle dans la dégradation des éliciteurs oligogalacturoniques,
protégeant ainsi la bactérie des réponses antimicrobiennes de la plante. Ce concept très intéressant
pourrait s’étendre aux TBDR de Xcc, qui, en capturant de façon très efficace des molécules
potentiellement élicitrices des réponses de défense végétales, pourraient jouer un rôle majeur dans
la virulence de la bactérie. Dans l’objectif d’approfondir cette hypothèse, il pourrait être
intéressant de suivre les réponses basales de la plante (production de formes réactives de
l’oxygène et de l’azote, dépôt de callose…) ainsi que l’expression des gènes marqueurs des voies
de défense (protéines PR, mais aussi marqueurs des voies SA, JA, ET) suite à une infection par la
souche sauvage de Xcc en comparaison avec des mutants dans les CUT loci.
L’existence de mécanismes conservés chez les bactéries de l’environnement pour
l’exploitation de polysaccharides complexes
Si nous n’avons pas pu détecter d’indices en faveur d’une potentielle mobilité de ces loci
(différences de GC%, présence systématique de séquences d’insertion ou de phages…), une
acquisition de ces clusters de gènes par transfert horizontal ne peut être exclue.
En effet, nos analyses in silico de 228 génomes de bactéries à Gram négatif ont permis de
montrer que certains « CUT loci » de Xcc sont partiellement conservés chez d’autres bactéries. De
façon très intéressante, les bactéries chez lesquelles ces loci sont partiellement conservés
présentent également un nombre très élevé de protéines TBDR. Simple coïncidence ? Non ! Une
proportion très restreinte de bactéries montre une sur-représentation des protéines TBDR : on
211
Discussion générale et perspectives
trouve dans cette « classe » des bactéries de l’environnement au sens large (Sphingomonas sp.,
Stenotrophomonas maltophilia ; cette dernière n’étant pas disponible, elle n’a pas été incluse dans
notre analyse mais les premières séquences génomiques disponibles au NCBI prédisent un nombre
très élevé de TBDR), des bactéries aquatiques (Caulobacter crescentus), des bactéries marines
(Saccharophagus degradans, Pseudoalteromonas sp.), mais aussi des bactéries symbiotiques ou
pathogènes de l’humain telles que Bacteroides sps. thetaïotaomicron et fragilis, respectivement.
Ces bactéries ont toutes la capacité de dégrader des polysaccharides complexes avec une très
grande efficacité, et en particulier des polysaccharides dérivés de tissus végétaux ou de crustacés
(chitine).
Les TBDR et les CUT loci pourraient donc vraisemblablement jouer un rôle crucial dans
l’acquisition de molécules végétales avec un degré d’efficacité incomparable, et ainsi dans
l’adaptation de bactéries taxonomiquement très éloignées et vivant dans des environnements très
différents. L’importance des TBDR dans l’environnement est soulignée à travers des résultats de
travaux de métagénomique récents : grâce à l’expédition « Sorcerer II Global Ocean
Sampling » (GOS) et à une approche de séquençage à grande échelle, l’Institut Craig Venter
(Rockville, Etats-Unis) a mis en évidence 6,12 millions de protéines issues de la microflore
marine, qui se répartissent en 297 254 clusters distincts sur la base d’homologies de séquences. De
façon très intéressante, avec 11 890 séquences non redondantes, la famille des TBDR figure parmi
les 25 clusters les plus représentés (Rusch et al., 2007 ; Yooseph et al., 2007). Cette étude appuie
de façon remarquable nos travaux, qui mettent également en évidence une sur-représentation des
TBDR chez les bactéries marines, et est en accord avec l’hypothèse d’un rôle majeur de ces
récepteurs chez les bactéries de l’environnement.
Notre étude donc signe l’émergence d’un nouveau domaine de recherche englobant
différents axes de recherche en microbiologie, tels que les interactions pathogènes mais aussi
symbiotiques, avec des végétaux mais aussi des animaux, le cycle des composés organiques ou
encore la bioremédiation. Il a récemment été montré qu’il est possible d’augmenter les capacités
de bioremédiation de certaines espèces de Sphingomonas (S. wittichii, qui dégrade la dioxine, et S.
subartica, qui dégrade le polypropylène glycol) en leur permettant, par génie génétique, de
synthétiser à leur surface des « super-channels » (cf. introduction du Chapitre I), structures
complexes comportant des TBDR, impliquées dans l’import de macromolécules chez
Sphingomonas sp. A1 (Aso et al., 2006).
212
Discussion générale et perspectives
La poursuite de l’étude de la conservation de ces loci chez les différentes bactéries et sa
constante mise à jour en fonction des avancées dans le séquençage de nouveaux génomes
bactériens nous permettront à l’avenir de préciser le rôle des TBDR et des CUT loci dans le
pouvoir adaptatif des bactéries. Les CUT loci sont-ils réellement le reflet des capacités adaptatives
des bactéries envers différents environnements ? Par ailleurs, font-ils l’objet de transferts
horizontaux entre bactéries ? Ces questions fondamentales en termes d’évolution sont complexes à
résoudre techniquement. Un bon moyen pourrait être de commencer par les aborder au sein du
genre Xanthomonas, dont les différentes espèces présentent des hôtes et des modes de vie très
différents. Nous avons déjà pu mettre en évidence que certains CUT loci sont très bien conservés
parmi les différentes espèces dont les génomes sont séquencés (Xcc, Xac, Xav et Xoo) : c’est le cas
du locus sux ou du locus XCC4120 par exemple. En revanche, certains, tels que le locus XCC0120
sont strictement spécifiques de Xcc dans la mesure où les gènes encadrant le TBDR ne sont pas
présents chez les autres Xanthomonas. En approfondissant ces observations in silico et en les
associant à des résultats expérimentaux sur les différentes espèces, nous devrions être en mesure
d’apporter des éléments clés concernant la spécificité d’hôte, de tissus, de symptômes ou de niche
écologique propre à chacune.
La caractérisation d’un facteur d’avirulence de Xanthomonas campestris pv. campestris,
présentant de façon unique une spécificité tissulaire : AvrACXcc8004
De nombreux facteurs d’avirulence ont été identifiés et très bien caractérisés chez des
bactéries phytopathogènes telles que P. syringae pvs., R. solanacearum, X. axonopodis pv.
vesicatoria ou X. oryzae pv. oryzae. Ces gènes avr déterminent la résistance de différentes plantes
à ces bactéries. En revanche, antérieurement à notre étude, un seul déterminant d’avirulence avait
été identifié chez X. campestris pv. campestris : avrXccFM, déterminant d’avirulence de la souche
528T sur la moutarde de Floride. Notre étude propose de façon unique la caractérisation d’un
facteur d’avirulence contrôlant l’interaction entre deux organismes modèles dont les génomes sont
entièrement séquencés : la souche 8004 de Xcc, avirulente dans le système vasculaire de l’écotype
Col-0 d’Arabidopsis thaliana. Le produit de ce gène est injecté dans les cellules végétales par le
système de sécrétion de type III. Par ailleurs, la spécificité tissulaire de cette résistance établie par
notre étude est un élément nouveau dans la compréhension des interactions incompatibles : en
effet, cette caractéristique n’avait jusqu’à présent jamais été rapportée pour un pathosystème.
Xcc est connu en tant que pathogène vasculaire depuis les années 1970 (Wallis et al., 1973),
et pourtant les déterminants moléculaires de cette spécificité tissulaire sont très mal compris à
213
Discussion générale et perspectives
l’heure actuelle. Notre étude s’inscrit donc dans les balbutiements d’un axe de recherche qui
s’avère très prometteur. A court terme, nous envisageons bien-sûr de déterminer avec précision la
fonction du gène codant pour ce nouvel effecteur de type III, avrACXcc8004. Ce gène code pour une
protéine possédant des répétitions riches en leucine (LRR) et un domaine Fic. Il sera tout d’abord
intéressant d’étudier la contribution de ces deux domaines à la fonction d’avirulence de la
protéine, en construisant des mutants délétés de ces régions. Par ailleurs, la présence dans cet
effecteur bactérien de LRR, motif eucaryote typiquement impliqué dans les interactions protéineprotéine, suggère fortement que cette protéine pourrait interagir avec des protéines végétales in
planta. Afin d’identifier les cibles d’AvrACXcc8004, nous effectuerons tout d’abord un premier
crible de type double-hybride dans la levure transformée par une banque d’ADNc de l’écotype
Col-0 d’Arabidopsis thaliana.
Les cibles putatives d’AvrACXcc8004 identifiées par ce crible pourront par la suite être
validées in vitro par co-immunoprécipitation ou par des expériences de GST-pull down par
exemple, et in vivo par des techniques telles que le FLIM/FRET ou le système split ubiquitine. Il
sera par ailleurs intéressant d’étudier l’effet d’une sur-expression de ce gène dans différentes
plantes hôtes et non-hôtes, ainsi que la localisation de cet effecteur in planta.
Enfin, les études menées dans le groupe de Dominique Roby montrent que cette résistance
est contrôlée par un QTL (Quantitative Trait Locus) majeur chez l’écotype Col-0 d’Arabidopsis
thaliana. Le clonage positionnel du gène responsable de cet effet quantitatif est en cours dans ce
groupe ; la caractérisation fonctionnelle de ce gène devrait elle aussi fournir des informations
fondamentales sur l’aspect « spécificité tissulaire ».
214
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244
AUTHOR : Servane BLANVILLAIN
TITLE : Study of Xanthomonas campestris pv. campestris TonB-dependent receptors and of a
novel type III effector from this phytopathogenic bacterium.
PhD SUPERVISOR : Matthieu ARLAT
PhD CO-SUPERVISOR : Emmanuelle LAUBER
SUMMARY
The bacterium Xanthomonas campestris pathovar campestris (Xcc) causes black rot, a
vascular disease on cruciferous plants including Arabidopsis thaliana. TonB-dependent
receptors (TBDRs) are outer membrane proteins mainly known for the active transport of iron
siderophore complexes in Gram-negative bacteria. Analysis of the Xcc genome predicts 72
TBDRs. Such an overrepresentation is common in Xanthomonas species but is limited to a
small number of bacteria. Here, we show that only 9 Xcc TBDRs are likely to be involved in
iron uptake. A genome context survey of the other TBDRs suggested that several Xcc TBDRs
belong to loci potentially involved in the utilization of various plant carbohydrates, named
CUT loci (Carbohydrate Utilization containing TBDR loci). We studied the sucrose CUT
locus, which is required for full pathogenicity on Arabidopsis, and in which the TBDR
transports sucrose with a very high affinity, suggesting that it might be a sucrose scavenger.
We also focused on a CUT system constituted by two loci involved in xylan degradation and
xylo-oligosacharide transport. We identified the transcriptional regulator of this system and
characterized the plant inducing signals. The study of two other CUT loci, putatively involved
in pectin utilization, was initiated. Finally, we noticed that several TBDRs/CUT loci are
conserved in bacteria sharing the ability to degrade a wide variety of complex carbohydrates
and displaying TBDR overrepresentation. We therefore propose that TBDR
overrepresentation and the presence of CUT loci designate the ability to scavenge
carbohydrates, thus controlling interaction with plants and/or adaptation to diverse
environments.
A distinct project led to the characterization of an Xcc protein containing Leucine-Rich
Repeats (LRRs), named AvrACXcc8004, which we demonstrated to be injected into plant cells
through the Type III Secretion System. Moreover, our results suggest that avrACXcc8004
functions as an avirulence gene whose product is not recognized in mesophyllic tissues and
has a specific action in vascular tissues of Arabidopsis thaliana ecotype Col-0.
MOTS-CLES : Xanthomonas campestris pv. campestris, TonB-dependent receptors,
pathogenicity, CUT locus, sucrose, plant cell wall, Arabidopsis thaliana, type III effector,
hrp, avirulence gene, xylem.
AUTEUR : Servane BLANVILLAIN
TITRE : Etude des récepteurs TonB-dépendants et d’un nouvel effecteur de type III de la
bactérie phytopathogène Xanthomonas campestris pv. campestris.
DIRECTEUR DE THESE : Matthieu ARLAT
CO-DIRECTEUR DE THESE : Emmanuelle LAUBER
RESUME
La bactérie Xanthomonas campestris pathovar campestris (Xcc) est responsable de la
pourriture noire, une maladie vasculaire atteignant de nombreuses crucifères dont la plante
modèle Arabidopsis thaliana. Les récepteurs TonB-dépendants (TBDRs) sont des protéines
de la membrane externe des bactéries à Gram négatif, connues pour leur rôle dans le transport
actif des complexes fer-sidérophore. Le génome de Xcc renferme 72 TBDRs ; cette surreprésentation est partagée par les autres espèces de Xanthomonas mais est limitée à un petit
nombre de bactéries. Nos travaux ont permis de montrer que seulement 9 TBDRs de Xcc sont
impliqués dans l’acquisition du fer. En revanche, l’analyse des gènes encadrant les autres
TBDRs suggère que certains pourraient appartenir à des loci potentiellement impliqués dans
l’utilisation de carbohydrates végétaux, appelés CUT loci (Carbohydrate Utilization
containing TBDR loci). Le CUT locus du saccharose a été étudié de façon approfondie ; ce
locus contribue au pouvoir pathogène de Xcc sur Arabidopsis, et contient un TBDR qui
transporte du saccharose avec une très forte affinité. Nous avons également étudié un système
de deux loci impliqués dans la dégradation du xylane et dans le transport de
xylooligosaccharides ; nous avons identifié le régulateur transcriptionnel et défini les signaux
végétaux inducteurs de ce CUT système. L’étude de deux autres CUT loci potentiellement
impliqués dans l’utilisation de la pectine a été initiée. Enfin, nous avons observé que certains
TBDRs/CUT loci sont conservés chez des bactéries ayant en commun la capacité de dégrader
efficacement des polysaccharides complexes, et présentant également une sur-représentation
des TBDRs. Nous proposons donc que la sur-représentation des TBDR et la présence de CUT
loci traduisent la capacité d’une bactérie à exploiter activement des carbohydrates et
contrôlent l’interaction avec la plante et/ou l’adaptation à divers environnements.
Un projet distinct a consisté en la caractérisation d’une protéine de Xcc possédant des
Répétitions Riches en Leucine (LRR), appelée AvrACXcc8004, qui est injectée dans les cellules
végétales par le Système de Sécrétion de Type III de la bactérie. Nos résultats suggèrent
qu’avrACXcc8004 fonctionne comme un gène d’avirulence dont le produit n’est pas reconnu
dans le mésophylle des feuilles, et présente une spécificité d’action dans les vaisseaux du
xylème de l’écotype Col-0 d’Arabidopsis thaliana.
MOTS-CLES : Xanthomonas campestris pv. campestris, récepteurs TonB-dépendants,
pouvoir pathogène, CUT locus, saccharose, paroi végétale, Arabidopsis thaliana, effecteur de
type III, hrp, gène d’avirulence, xylème.