TISSUS SANGUIN : Les Mastocytes 03/10/2013 WINNICKI Camille L2 Tissus sanguin et système immunitaire J.VITTE [email protected] 8 pages Les Mastocytes Plan A. Généralités I. Aspect au Microscope Optique II. Aspect au Microscope électronique III. Aspect en Immunofluorescence B. Caractéristiques des Mastocytes I. Physiologie de la dégranulation mastocytaire II. Fonction des Mastocytes C. Médiateur des Mastocytes : la Tryptase Ouvrage conseillé : Immunologie fondamentale et immunopathologie rédigé par enseignants d'immunologie (ASSIM). Version papier : 33€ ou téléchargeable gratuitement sur http://www.assim.refer.org A. Généralités Les mastocytes sont des cellules immunitaires d'origine hématopoïétique comme les cellules myeloïdes ( = monocytes et leurs dérivés, granulocytes ) et pourvues d'une grande plasticité phénotypique. Ils quittent la moelle osseuse sous forme immature puis les précurseurs traversent le sang, où ils ne sont pas identifiables, puis migrent dans les tissus où ils vont maturer en suivant les signaux locaux. Leur maturation est fortement influencée par le micro-environnement ainsi que l'environnement physiologique ou pathologique. Ils ont été décrits en 1878 ( thèse médecine Paul Erhlich, futur prix Nobel) mais ils restent difficiles à étudier car ils possèdent : -un rôle dans les manifestations allergiques établi après 1950 -des fonctions immunitaires restées inconnues jusqu'aux années 2000 Étymologie grec « masto » = nourriture Les mastocytes sont accessibles uniquement par leurs protéines de surface. I. Aspect en microscopie optique Dans les tissus normaux, les mastocytes sont présents au dessous de la surface épidermique (point violets). Ils sont donc très superficiels. 1/8 TISSUS SANGUIN : Les Mastocytes Dans les tissus pathologiques, on observe une augmentation de la granulosité: les cellules sont plus grosses, plus nombreuses et prennent un aspect en oreille de souris. Elles sont porteuses d'une activation. A fort grossissement, le mastocyte activé a des contours irréguliers et l'intérieur de son cytoplasme est remplit de granules. II. Aspect en microscopie électronique Au repos : Après l'activation : ( Dégranulation ) – Transmission, on observe des granules de - Transmission: Diminution du nombre de divers types et très hétérogènes ( gros, petits, dense ) granules, apparition d'espaces clairs autour de certains d'entre eux : cela correspond à des poches, des vacuoles vides qui ont vidé contenu pendant l'activation ( flèche rouges) - Balayage la cellule a une surface lisse et régulière -Balayage : Les flèches jaunes indiquent que parfois des granules entier vont exocyter, ce sont des morceaux entiers de cellules qui partent ( ces exosomes peuvent transporter des médiateurs ou être présentateurs 2/8 TISSUS SANGUIN : Les Mastocytes d'antigène à distance vers des sites éloignés. Dans ce cas, on ne maitrise pas le site de présentation de l'antigène qui n'est donc pas forcement un ganglions) III. Aspect en Immunofluorescence Principe: on utilise des Anticorps ( AC) spécifiques des molécules d'intérêt que l'on souhaite identifier. On a donc une reconnaissance précise des molécules choisies. Ces AC sont identifiés grâce à des marquages avec des fluorochromes distincts ( de couleurs différentes). Après superposition des images : Analyse de colocalisation Cela permet de tirer des conclusions sur les modifications/localisations de protéines avant/après activation. en vert : marquage intracellulaire en rouge: marquage des renforcements membranaires en jaune : zone de colocalisation des protéines intracellulaire et membranaires Pourquoi tous ces granules ?? Il en existe deux types ( /!\ à connaître ) • LES GRANULES SECRETOIRES ◦ Les plus gros : 500nm à 1μm (les mastocytes font entre 10 et 20 µm) ◦ stockage de dizaines de médiateurs préformés (dont l'histamine +++) ◦ libération très rapide au cours de la DEGRANULATION Un mastocyte peut libérer en une fois jusqu'à 100% du contenu de ses granules sécrétoires et participer à de multiples épisodes de dégranulation, avec un temps de régénération des granules de 72h. À la différence des polynucléaires neutrophiles, la dégranulation du mastocyte n'engendre pas une mort cellulaire systématique. Il redevient capable de dégranulation après 3 jours. Sa durée de vie prolongée peut provoquer des crises de dégranulation. • LES VESICULES DE SÉCRETION ◦ Beaucoup plus petites : ne dépassent pas 80nm de diamètre ◦ Présentes dans toutes les cellules qui ont une activité de sécrétion protéique. Pour les mastocytes, elles contiennent des cytokines notamment. B. Physiologie de la dégranulation mastocytaire : • La dégranulation comporte deux étapes 3/8 TISSUS SANGUIN : Les Mastocytes -translocation des granules du cytoplasme vers la membrane plasmique ( phénomène indépendant du calcium) -exocytose dépendante du calcium • • La dégranulation est dose-dépendante ( dépendante de la quantité de stimulus ) La prof a vraiment insisté dessus La cinétique de dégranulation est très rapide : 30% des granules est libéré à 1min ; 60% à 5min ; 100% à 45min ( Elle a dit qu'il fallait avoir un ordre de grandeur c'est à dire que l'activation complète ( dégranulation) totale se fait en 30/45min ) Exemple des allergies à l'arachide : Les sujets supportent des « traces » qui correspondent à des quantités minimales mais à l'ingestion d'une cacahuète le choc anaphylactique survient. Cela prouve bien le caractère dose-dépendant de la dégranulation : Celle-ci se fait à parti d'un seuil, variable d'un individu à l'autre. /!\ A VRAIMENT APPRENDRE L'exocytose peut se dérouler de deux manières -fusion directe d'un granule avec la membrane plasmique , formation d'un «pore» et libération du contenu granulaire dans l'espace extra cellulaire (fusion primaire) -fusion de nouveaux granules avec la membrane d'un granule déjà ouvert à la membrane ( exocytose composée ou cumulative ) ce qui permet une augmentation de l'efficacité. ➔ Ce phénomène accentue le caractère cataclysmique de la dégranultion mastocytaire : des granules profondément enfouis dans le cytoplasme peuvent ainsi libérer leur contenu sans translocation à la membrane plasmique. Maximov A, Science 2009 La fusion vers la membrane suit un processus identique à la synapse : • lorsque la vésicule arrive à la membrane, elle rencontre un système de protéines régulées qui fait que le granule ne fusionne avec la membrane qu'à certaines conditions. On assiste alors à un recyclage de la membrane. • Ensuite, des molécules de la famille « SNARE » vont s'associer à la membrane plasmique pour rapprocher la vésicule de la membrane sans pour autant qu'un contact se fasse entre les deux. 4/8 TISSUS SANGUIN : Les Mastocytes Rapprochement des SNAREs avec une autre molécule : la complexine ce qui permet un rapprochement des membranes granulaire et plasmique, elles se préparent à fusionner. Le Calcium va ensuite permettre la fusion entre la vésicule et la membrane. • /!\ Ce processus de fusion est exergonique ! Il n'y a pas besoin d'énergie dans le processus de dégranulation. L'organisme met donc en place des systèmes pour éviter la dégranulation ( processus qui est à l'inverse consommateur d'énergie ) Le fait que la dégranultion soit exergonique démontre son rôle de protection de l'organisme => il faut que la cellule puisse dégranuler très rapidement ! PHYSIOLOGIE DE LA DÉGRANULATION ( explications plus poussées pour avoir entre 15 et 20 a l'examen dixit la prof) • Le mécanisme général de la fusion vésiculaire chez les eucaryotes multicellulaires semble s'appuyer sur un schéma moléculaire unique, qu'il s'agisse d'exocytose synaptique, endocrine ou des médiateurs mastocytaires préformés ◦ Des protéines SNARE présentes sur les membranes à fusionner s'ammarent et forment un pont moléculaire qui maintient les deux membranes contiguës ◦ Des protéines SM ( Sec1/Munc18) contrôlent la formation du complexe SNARE et coopèrent avec celui-ci pour induire la fusion membranaire. ◦ L'entrée d'une synaptogamine, protéine détecteur de calcium, dans le complexe permet d'introduire la régulation par le calcium; cette régulation calcique peut être modulée par l'intervention d'une complexine qui stabilise le complexe SNARE tout en l'empêchant d'aller jusqu'à la fusion membranaire. ◦ Les protéines impliquées dans les phénomènes de fusion des membranes sont particulièrement bien conservées le plan phylogénétique . Colocalisation de deux protéines impliquées dans la dégranulation Pas besoin de connaître le nom des protéines Principe à retenir: Couplage des protéines d'intérêt à des marqueurs fluorescents et observation de cellules au repos ( granules intacts) et stimulées ( granules fusionnés avec la membrane plasmique ). Au moment de l'activation, tout se retrouve au niveau de la membrane. Vamp7 se trouve sur les granules et va donc suivre leur trajet jusqu'à la membrane durant l'activation => Si Vamp-7 inactivée = les granules ne vont pas a la membrane. Les mastocytes deviennent non fonctionnels. 5/8 TISSUS SANGUIN : Les Mastocytes Colocalisation 1 protéine granulaire et 1 protéine régulatrice « gatekeeper » A 5min : réponse au stimulus A 30min : repos ; corps cellulaire plus allongés. Les cellules sont en phase de récupération Et après la dégranulation ? Un complexe moléculaire appelé signalosome engendre • Une réponse immédiate ( via la PKA qui active la libération d'histamine, tryptase..) • Une réponse intermédiaire ( via la PLA2 qui active le métabolisme des phospholipides membranaires ) • Une réponse tardive ( via la transcription des gènes codant les cytokines et chemokines) ET APRES LA DEGRANULATION? Mastocyte DEGRANULATION histamine, tryptase, chymase… EFFETS IMMEDIATS: vasodilatation, perméabilité vasculaire, adhésion leucocytes, bronchoconstriction SIGNALOSOME TRANSCRIPTION PKC PLA2 ACTIVATION METABOLISME PHOSPHOLIPIDES MEMBRANAIRES PGD2, LTB4, LTC4, PAF SYNTHESE CYTOKINES ET CHEMOKINES: IL-3, 4,5,6,8,10,13, TNF… EFFETS RETARDES: inflammation, recrutement, activation et survie leucocytes, orientation Th1/Th2, remodelage tissulaire… MAINTIEN EFFETS IMMEDIATS + INITIATION EFFETS RETARDES par recrutement leucocytes La dégranulation (phase immédiate) est suivie par la production de métabolites de l’acide arachidonique et l’induction de la synthèse de cytokines et de chémokines, conduisant aux phases retardées, avec afflux et activation in situ de leucocytes et risque de transition vers l’inflammation allergique chronique. Dans l'asthme, on a plusieurs phases : -la crise d'asthme qui est très spectaculaire ; +/- grave ( en fonction de la dégranulation ) 6/8 TISSUS SANGUIN : Les Mastocytes -Puis, poursuite du phénomène: phase inflammation qui conduit au remodelage tissulaire. C'est une phase retardée qui est à l'origine de l'insuffisance respiratoire. II. Fonctions des mastocytes Les mastocytes participent à l'immunité innée et adaptative en tant que cellules sentinelles à l'interface organisme-environnement extérieur, aux fonctions variées : -défense antimicrobienne et antiparasitaire -présentation d'antigène (ce n'est pas du tout leur fonction principale et ce n'est pas ce qu'il faut mentionner en premier si on nous pose une question dessus) -induction et régulation des réponses des lymphocytes T Actuellement, le rôle le plus important du mastocyte en pratique médicale reste la phase effectrice la réponse allergique : dégranulation massive et brutale avec libération de médiateurs préformés vasoactifs, pro inflammatoires et nociceptifs, induite par l'interaction des immunoglobulines (Ig) E, portées par les récepteurs membranaires RfcεI, avec l'allergène multivalent correspondant. Dans la littérature scientifique de ces 10 années, de nombreux articles sur les fonctions des mastocytes chez les animaux ont été publiés. Résultats très souvent contradictoires ce qui complique la tache. On l'explique par un facteur rarement pris en compte : la capacité du mastocyte à modifier ses réponses au cours de la manipulation. On ne peut pas extrapoler les résultats. Ses données sont donc a regarder avec précaution. C. « Le » médiateur préformé du mastocyte a ne jamais oublier : la tryptase Les Sérine-peptidases sont très abondantes dans les granules des mastocytes humains et animaux. La tryptase est quasi spécifique des mastocytes humains. Les tryptases humaines sont retrouvées sous trois formes : alpha, béta et gamma. Seules les tryptases bêta semblent capables de donner des formes matures in vivo. A l'état basal, de faibles taux de zymogènes ( alpha ou beta protryptases ) sont libérés par les mastocytes et détectés dans le sang circulant. Ce taux basal est prédictif des réactions à venir ( si il augmente : suspicion de réactions allergiques à venir). En l'absence d'activation, il y a production de monomère alpha et bêta tryptase qui passent dans la circulation. On oublie la tryptase gamma car elle reste accrochée a la membrane ( absence dans la circulation et espace extracellulaire ). La dégranulation mastocytaire provoque la libération de tryptase active (sous forme de tétramère). Elle est le seule marqueur irremplaçable de l'activité du mastocyte. 7/8 TISSUS SANGUIN : Les Mastocytes La tryptase en pratique médicale • • • • • • • Elle est à prélever si suspicion de choc anaphylactique Quasi – spécifique des mastocytes : 10 à 15 pg/cellules ( 100 fois moins dans les basophiles ) Qu'elle soit en sécrétion continue ou brutale => elle renseigne sur la richesse en mastocytes ( mast cell burden ) de l'individu et sur leur degré d'activité La demi-vie de la tryptase sérique : 2 heures après une dégranulation Sa stabilité dans le prélèvement sanguin est excellente, à +4°C comme à température ambiante Bonne corrélation entre la libération d'histamine et celle de tryptase en cas d'anaphylaxie. La mesure de la tryptase est désormais indispensable en première intention devant une suspicion d'anaphylaxie ( Académie de Médecine 2008) CE QU IL FAUT ABSOLUMENT RETENIR !!! ( pour avoir la moyenne ) – – Le mastocyte est une cellule d'origine hématopoïétique qui subit une maturation tissulaire selon le microenvironnement. Elle est présente aux interfaces organisme-milieu extérieur. C'est une cellule sentinelle dont le rôle le mieux connu est celui d'effecteur de la phase immédiate de la réaction allergique ( mais implication clinique de mieux en mieux connue dans de nombreuses autres pathologies). Elle présente • de gros granules sécrétoires contenant des médiateurs préformés ( incluant l'histamine, principal responsable des symptômes allergiques et la tryptase meilleur marqueur du mastocyte) dont l'exocytose massive caractérise la phase immédiate de la réaction allergique. • de petits granules contenant des médiateurs types cytokines, facteurs de croissance.. sécrétés en dehors de la phase immédiate. 8/8