Chapitre I : Mise en place du plan d ’organisation de la Grenouille : de la cellule-œuf à l ’organisme adulte La polarité de la cellule-œuf héritée de l ’ovocyte II Ovocyte II de Xénope en vue équatoriale. Au centre, un ovocyte II de Xénope vu par le pôle animal. Photo M. Delarue. L'OEUF DE BATRACIEN - SFRS UPMC - CNRS I/M - 2003 Document 1. L’œuf de Grenouille en vue latérale gauche. [PATTIER J.-Y., “ Croissance et développement des animaux ”, Ellipses Ed., 1991]. Après avoir traversé les gangues entourant l'ovocyte, le spermatozoïde perce la « membrane » vitelline puis vient au contact de la membrane plasmique (A à D). La fusion du spermatozoide et de l'ovocyte entraîne une série de réactions cytoplasmiques et membranaires dont la plus visible est le soulèvement de la « membrane » vitelline en une « membrane » de fécondation (D et E). Les enveloppes protectrices de l’ovocyte II puis de l’œuf L'espace contenu entre la membrane plasmique et la membrane de fécondation porte le nom d'espace périvitellin (E). L’ovocyte secondaire est polarisé Répartition des ARN Coupe méridienne d'ovocyte II de pleurodèle On observe une nette différence de charge en vitellus entre le pôle animal et le pôle végétatif. (coloration par le bleu de toluidine) Les ARN sont bien plus nombreux dans l'hémisphère animal. La majeure partie des ARN cytoplasmiques étant ribosomiques, la coloration reflète le gradient ribosomique. L’ovogenèse chez la Grenouille Croissance et accumulation de réserves (3e année d’ovogenèse) Le noyau, ou vésicule germinative, apparaît très volumineux. On distingue quelques segments de bivalents chromosomiques (stade diplotène de la 1ère division méiotique). Deux chromosomes en écouvillon appariés (chiasmas : régions des crossing over). Chaque chromosome est constitué de deux chromatides portant des boucles d'ADN déployées dans le nucléoplasme, au niveau desquelles la transcription est active. Fragment d’un ovaire d'amphibien prélevé par biopsie Observer les ovocytes à différentes étapes de leur croissance. Croissance des plaquettes vitellines à partir des vésicules de pinocytose (A à C). D : organisation cristalline d’une plaquette vitelline issue de l'assemblage des protéines et des lipides en agrégats. Morphologie externe d'un ovocyte secondaire de Xénope (à gauche) et dessin d'interprétation (à droite). Fécondation Vue postérieure d ’une femelle de Xénope avec des grappes d’ovocytes sortant du cloaque. Disposition aléatoire des ovocytes avant fécondation. Rotation d’équilibration En détail : création de l ’espace périvitellin qui désolidarise l ’ovocyte de ses enveloppes. PA : pôle animal PV : pôle végétatif. Même vue 30 min après la fécondation. La rotation d ’équilibration a eu lieu : tous les ovocytes fécondés présentent leur pôle animal vers l ’observateur. Le croissant gris marque la face dorsale une heure après la fécondation. Il apparaît du côté opposé à la pénétration du spermatozoide. Rotation de symétrisation La calotte pigmentaire de l’hémisphère animal bascule vers le point d ’entrée du spermatozoïde laissant à l ’opposé de celui-ci des trainées de pigment cortical qui affectent la forme d ’un croissant (« croissant gris » CG). Acquisition des axes de polarité chez le Xénope Comparaison entre l’ovocyte avant la fécondation et l’œuf fécondé une heure après l ’entrée du spermatozoïde. Ant : antérieur ; D : dorsal ; Post : postérieur ; V : ventral. La segmentation Quelques stade de clivage depuis le stade 2 cellules jusqu ’au stade blastula. Voir document 2 Morulas dans leur gangue. La transition blastuléenne C’est le moment où les premières transcriptions zygotiques apparaissent. Blastula de Xénope et coupes histologiques réalisées dans les hémisphères animal et végétatif. Mise en place de la matrice extracellulaire Au stade blastula ou au tout début de la gastrulation, selon les espèces, une matrice extracellulaire riche en fibronectine et laminine est organisée sur le plafond du blastocoele. Culture des différentes régions de la blastula de Xénope Au stade blastula, des explants sont prélevés dans les 3 régions : calotte ectodermique, zone marginale et endoderme. Après 3 jours de culture isolée, les résultats sont les suivants : - calotte ectodermique --> épiderme atypique - zone marginale dorsale --> mésoderme de type dorsal (chorde, somites) - zone marginale ventrale --> mésoderme de type ventral (vésicules rappelant le coelome entouré par les lames latérales, cellules sanguines) - cellules endodermiques --> endoderme indifférencié Voir document 3 Expérience de Vogt avec les marques colorées (1929) L’évolution des marques est suivie depuis le début de la gastrulation jusqu ’au stade bouchon vitellin. Une dissection fine permet ensuite de les retrouver à l’intérieur de l’embryon, et d’établir la carte des territoires présomptifs. Les techniques modernes utilisent des composés fluorescents pour marquer les cellules de l’embryon. Couleur des taches : 1 : bleu 2 : vert 3 - 4 - 8 : rouge 5 - 6 - 7 : jaune Document 3. Suivie des mouvements gastruléens par la technique des marques colorées. Vue externe en FD et vues en CS. Expériences de Nieuwkoop (document 10) Les recombinaisons entre la calotte ectodermique et des explants endodermiques au stade blastula produisent du mésoderme. Parallèlement, les cultures témoins d’ectoderme et d’endoderme isolés ne conduisent jamais à la formation de mésoderme. Principe général de l'induction du feuillet mésodermique Des signaux (flèches bleues) provenant de l'endoderme et dirigés vers l'ectoderme induisent le mésoderme dans la zone marginale. Expériences de Dale et Slack, 1987 (document 11) Recombinaisons effectuées entre les blastomères animaux de la rangée A avec un blastomère végétatif. 16 % 42% 42% Une régionalisation de l’induction mésodermique est mise en évidence. Facteurs de transcription Facteurs de croissance Document 12. Les principales étape de l’induction du mésoderme. [PEYCRU P. et coll., “ Biologie 1ère année BCPST ”, Dunod Ed., 2007]. Coupe transversale au début de la gastrulation. Coupe transversale à la fin de la gastrulation. Voir l’organisation étagée de l’ectoderme, du mésoderme et de l’endoderme. Voir l’organisation concentrique des feuillets embryonnaires. La gastrulation Quelques stades de la gastrulation vus par l ’hémisphère végétatif. (document 4) A : stade encoche blastoporale ; B : stade anse de panier ; C : stade fer à cheval ; D : stade bouchon vitellin. Jeune gastrula en vue dorsale (A) et en vue de profil (B). Gastrula au stade jeune bouchon vitellin vu par le pôle végétatif. LD : lèvre dorsale, LL : lèvre latéral, LV : lèvre ventral, PV : pôle végétatif. Couleur des taches : 1 : bleu 2 : vert 3 - 4 - 8 : rouge 5 - 6 - 7 : jaune Document 3. Suivie des mouvements gastruléens par la technique des marques colorées. Vue externe en FD et vues en CS. Suivi des mouvements cellulaires par injection de traceurs de lignage cellulaire A gauche, deux cellules de la lèvre dorsale du blastopore sont marquées. Elles se dirigent vers le blastopore, puis entrent dans l’embryon en s’enroulant autour du bord du blastopore. Ci-dessous, un groupe de 4 cellules de la lèvre dorsale du blastopore est marqué. 2 autres cellules de l ’endoderme sous-blastoporal sont également marquées. L’intervalle de temps entre chaque prise de vue permet d’évaluer leur vitesse de déplacement : environ 20 µm / h pour les cellules de la lèvre dorsale. Suivi des mouvements cellulaires par la technique des marques colorées (expérience de Vogt, 1929) (document 3) 1 - marque rouge montrant les mouvements d’épibolie des tissus ectodermiques ; 2 - marque bleue montrant l’invagination (= involution) des tissus mésoblastiques de la lèvre dorsale du blastopore (Bl) ; 3 - marque rouge montrant l’internalisation (=embolie) des tissus endodermiques du pôle végétatif (PV) ; 4 - marque bleue montrant les mouvements de convergence des tissus mésodermiques de la zone marginale vers le blastopore puis leur involution. La gastrulation : mouvements internes (document 5) La gastrulation : mouvements internes (document 5) Mécanisme de l’épibolie chez le Xénope Au début de la gastrulation, l’épithélium du pôle animal est tristratifié. Les deux couches cellulaires profondes s’intercalent. En revanche, la couche cellulaire externe (en bleu) ne participe pas à l’intercalation et s’aplatit à la surface de l’embryon. Importance de la MEC lors du processus de migration des cellules Document 6. Mise en évidence du rôle de la matrice extracellulaire pendant la gastrulation. Importance de la MEC lors du processus de migration des cellules Matrice extracellulaire observée sur le plafond du blastocoele, révélée par immunofluorescence indirecte chez le pleurodèle. Au début de la gastrulation, la MEC forme un réseau de fibrilles espacées (1). A la fin de la gastrulation, le réseau de fibrilles s’est considérablement accru et densifié (2). La matrice extra-cellulaire, organisée sur le plafond du blastocoele de cette jeune gastrula est rendue fluorescente par la technique d’immunofluorescence. Au cours de la gastrulation, l’extension de la MEC reflète les mouvements d’épibolie de l’ectoderme. La MEC se trouve « coincée » entre l’ectoderme dorsal et le chordomésoderme invaginé. Ventralement, le blastocoele subsiste à l’état résiduel. A la fin de la gastrulation, toute la MEC issue du plafond du blastocoele sera recouverte par du mésoderme aussi bien dorsalement que ventralement. Importance de la MEC lors du processus de migration des cellules Document 7. Démonstration du rôle des fibronectines par blocage de celles-ci par des anticorps. Le blocage de la migration cellulaire entraîne le blocage de l’invagination, qui entraîne à son tour le blocage de la gastrulation. Les trois tissus fondamentaux (ectoderme, mésoderme et endoderme) restent apparents à l’observateur. On remarque cependant des plissements de l’ectoderme qui traduisent la persistance des mouvements d’épibolie. Importance de la MEC lors du processus de migration des cellules Document 8. Guidage de la gastrulation par les fibronectines. [PATTIER J.-Y., “ Croissance et développement des animaux ”, Ellipses Ed., 1991]. Une molécule d’intégrine Deux chaînes a et b sont associées dans la reconnaissance de la fibronectine au niveau du site de liaison à la cellule. Représentation schématique d ’une coupe sagittale dans une jeune gastrula de pleurodèle. (document 9) Les cellules au niveau du blastopore s’allongent considérablement. On leur donne le nom de cellules en bouteille. Gastrula âgée de Xénope et coupes histologiques réalisées au niveau du bouchon vitellin, de la lèvre dorsale du blastopore, de l’archentéron et du front de migration. Schéma d ’interprétation d’une coupe sagittale dans la région dorsale rendant compte des mouvements d ’involution. Importance de la MEC lors du processus de migration des cellules Schéma interprétatif de la migration d’une cellule mésodermique sur la MEC. La cellule adhère grâce à des pseudopodes qui interagissent avec les fibrilles de la MEC au niveau des points focaux. La migration cellulaire s’effectue par des interactions avec le substrat, au niveau de contacts appelés points focaux (en rouge) (1). Tout en restant adhérente aux points focaux, la cellule émet des pseudopodes exploratoires parmi lesquels des expansions plus fines appelées lamellipodes (2) établissent de nouveaux contacts. De nouveaux points focaux sont crées (3). Le corps cellulaire avance d’autant (4) puis déconnecte les points focaux postérieurs (5). La neurulation (document 13) Document 13. La neurulation chez la Grenouille. [PATTIER J.-Y., “ Croissance et développement des animaux ”, Ellipses Ed., 1991]. Jeune bourgeon caudal et bourgeon caudal âgé (document 14) CT de 4 étapes de la neurulation montrant l’enroulement de la plaque neurale Au centre de la plaque neurale, des cellules montrent une constriction apicale. De proche en proche, les cellules voisines effectuent la même transformation. Il en résulte un raccourcissement de la face externe de la plaque neurale qui génère une courbure : la gouttière neurale se forme. Rôle du cytosquelette dans la neurulation (document 16) Le changement de forme des cellules dépend du cytosquelette. Avant les mouvements de neurulation, les cellules du neurectoderme présentent une morphologie en colonne sous-tendue par des microtubules abondants (à gauche). La constriction apicale de ces cellules est générée par la contraction de l ’actine devenue fibrillaire (à droite). Expérience de Holtfreter (1955) Expérience de Boucault (1974) (document 17) (document 18) Du bourgeon caudal au têtard : organogenèse Morphologie externe : La forme change ---> 3 régions (tête, tronc et queue) La queue se développe : la nage permettra une vie libre Ebauches d’organes visibles sous l’épiderme Morphologie interne : différenciation des organes - Evolution du tube neural --> encéphale + m.e. - Mise en place des organes sensoriels ds région céph ant, - Segmentation du mésoderme en somites (métamérie) - Lames latérales et coelome - Edification du tube digestif + mise en place des viscères ---> Plan d’organisation fondamental des Vertébrés - m.e., chorde, - endoderme et cavité archentérique, - somites + pronéphros + lames latérales - épiderme limitant Jeune bourgeon caudal et bourgeon caudal âgé (document 14) Document 15. Coupes transversales au stade bourgeon caudal chez la Grenouille. [PATTIER J.-Y., “ Croissance et développement des animaux ”, Ellipses Ed., 1991]. Récapitulation de l’origine des différents organes (document 19) Organogenèse : Diagramme de la formation du cerveau à deux stades de l'organogenèse, depuis la région antérieure (prosencéphale, télencéphale) jusqu'à la région postérieure (rhombencéphale, myélencéphale). Jeune bourgeon caudal et bourgeon caudal âgé (document 14) Document 15. Coupes transversales au stade bourgeon caudal chez la Grenouille. [PATTIER J.-Y., “ Croissance et développement des animaux ”, Ellipses Ed., 1991]. Expérience de Spemann et Mangold (document 20) Expérience d ’exogastrulation chez le Triton (document 21) Induction du mésoderme axial sur le neuroderme (document 22) La régionalisation des somites : exemple de l’édification de la colonne vertébrale Le développement de l’embryon de Poulet A gauche : à 25-26 h, les bourrelets neuraux céphaliques sont affrontés (neurulation), le mésoderme dorsal commence à se découper en somites. A droite : à 38 h d ’incubation, la neurulation se poursuit et on reconnaît dans la région antérieure le cerveau passant du stade 3 au stade à 5 vésicules, avec les vésicules optiques latéralement. Une dizaine de somites est formée. Document 23. Expression des gènes à homéoboîte. a. Gènes Hom chez la Drosophile, b. Gènes Hox chez la Souris, c. Expression des gènes Hox chez la Souris. Les gènes qui dérivent probablement d’un même gène ancestral sont représentés de la même couleur. [PEYCRU P. et coll., “ Biologie 1ère année BCPST ”, Dunod Ed., 2007]. Faces antérieures de têtes de drosophile de type sauvage (A) et mutante homéotique (B). La mutation Antennapedia a modifié les antennes en pattes. MEB. Drosophile mutante homéotique pour le gène Ultrabithorax. Cette mutation transforme le troisième segment thoracique en un deuxième segment thoracique. Document 24. Représentation schématique d’une portion de fibre musculaire striée. Document 25. Formation de la fibre musculaire striée squelettique. [PEYCRU P. et coll., “ Biologie 1ère année BCPST ”, Dunod Ed., 2007]. Le membre chiridien des Tétrapodes Courbes de croissance (stature et poids) pour les garçons Croissance des différentes parties du corps. Les os longs proviennent de l ’ossification d’ébauches cartilagineuses Ici, des phalanges. Le cartilage est coloré en bleu (1). L’ossification endochondrale est en cours sur l ’une des phalanges (2). Aspect général d’un bloc de tissu osseux Document 26. Organisation de l’os long. [WHEATER P.R. et coll., “ Histologie fonctionnelle ”, MEDSI Ed., 1979]. Le périoste Tissu conjonctif spécialisé, richement vascularisé, qui recouvre la totalité des os, à l'exception des surfaces articulaires. Il sert d'insertion au tendons et aux ligaments. Il comprend histologiquement deux couches : - Une couche externe fibreuse dense peu épaisse (fibres de collagène de direction longitudinale surtout). - Une couche interne à prédominance cellulaire richement vascularisée, avec une innervation sensitive. Elle renferme : - Des fibres élastiques, - Des fibres collagènes, - Des cellules ostéogènes, les ostéoblastes, et d’ostéoclastes, détruisant l’os et assurant son remodelage. Les aspects cellulaires de l’ossification enchondrale. C : cartilage hyalin banal. Cs : cartilage sérié. Les chondrocytes se multiplient et forment des files de cellules. Ils élaborent de la substance fondamentale. Ch : cartilage hypertrophié. Les cellules augmentent de taille. Elles élaborent du collagène. Cc : cartilage calcifié. Les chondrocytes initient la calcification de la substance fondamentale puis dégénèrent, laissant la place à des travées. LE : ligne d’érosion. Les ostéoclastes détruisent le cartilage calcifié, creusant un diverticule en doigt de gant dans le cartilage calcifié. Zo : zone ostéoïde. Les vaisseaux et les ostéoblastes progressent dans les diverticules. Les ostéoblastes apposent du tissu osseux le long des parois. Op : os primaire endochondral. Structure de l’os compact Document 27. Structure de l’os compact. [WHEATER P.R. et coll., “ Histologie fonctionnelle ”, MEDSI Ed., 1979]. Aspect général d’un bloc de tissu osseux Document 26. Organisation de l’os long. [WHEATER P.R. et coll., “ Histologie fonctionnelle ”, MEDSI Ed., 1979]. Document 28. Les étapes de l’ossification enchondrale. [PEYCRU P. et coll., “ Biologie 1ère année BCPST ”, Dunod Ed., 2007]. Les aspects cellulaires de l’ossification enchondrale. C : cartilage hyalin banal. Cs : cartilage sérié. Les chondrocytes se multiplient et forment des files de cellules. Ils élaborent de la substance fondamentale. Ch : cartilage hypertrophié. Les cellules augmentent de taille. Elles élaborent du collagène. Cc : cartilage calcifié. Les chondrocytes initient la calcification de la substance fondamentale puis dégénèrent, laissant la place à des travées. LE : ligne d’érosion. Les ostéoclastes détruisent le cartilage calcifié, creusant un diverticule en doigt de gant dans le cartilage calcifié. Zo : zone ostéoïde. Les vaisseaux et les ostéoblastes progressent dans les diverticules. Les ostéoblastes apposent du tissu osseux le long des parois. Op : os primaire endochondral. Axolotl (Ambystoma mexicanum) Larve d ’Amphibien à l ’éclosion : stade des bourgeons branchiaux Document 29. Le DPE des Amphibiens Anoures : morphologie des différents stades larvaires. [PATTIER J.-Y., “ Croissance et développement des animaux ”, Ellipses Ed., 1991]. Document 30. CT de têtard (région antérieure). [PATTIER J.-Y., “ Croissance et développement des animaux ”, Ellipses Ed., 1991].