Chapitre 2.1.13.

CHAPITRE 2.1.13.
PESTE PORCINE CLASSIQUE
(hog cholera)
RÉSUMÉ
La peste porcine classique (PPC), aussi connue sous la dénomination de hog cholera, est une
maladie virale contagieuse du porc. Le virus responsable est un membre du genre Pestivirus de la
famille des Flaviviridae, et se révèle très proche des virus de la maladie des muqueuses et de la
maladie de la frontière (border disease). Il n’existe qu’un sérotype de virus PPC.
La maladie peut évoluer sous forme aiguë, chronique, latente, ou inapparente selon divers facteurs
tenant au virus ou à l’hôte, parmi eux l’âge de l’animal, la virulence de la souche virale et la période
d’infection (pré- ou post-natale) jouent un rôle prépondérant. Les porcs adultes sont moins
sévèrement atteints que les jeunes et ont de meilleures chances de survie. Chez les truies
gestantes, le virus peut traverser la barrière placentaire et atteindre les fœtus. L’infection in utero
par des souches virales de basse ou faible virulence peut aboutir à ce que l’on a appelé le
syndrome de la « la truie porteuse », entraînant une mortalité pré-natale ou post-natale précoce, la
naissance de porcelets malades ou d’une portée en apparente bonne santé mais infectée. Une
épizootie de PPC a des répercussions lourdes sur le commerce des porcs et de leurs produits.
Le tableau clinique très polymorphe de la PPC interdit le plus souvent la réalisation d’un diagnostic
purement clinique ou lésionnel. Les méthodes de laboratoire sont alors essentielles pour un
diagnostic précis. La mise en évidence du virus dans le sang et des anticorps dans le sérum,
constituent les méthodes de choix du diagnostic de la PPC chez le porc vivant, tandis que la
recherche du virus ou de l’antigène dans des prélèvements d’organes, est de loin préférable quand
le porc est mort.
Identification de l’agent pathogène : L’immunofluorescence (IF) appliquée sur des coupes au
cryostat d’organes provenant de porcs atteints, est utilisée pour la détection de l’antigène PPC.
Une série d’anticorps monoclonaux (AcMs) est utilisée pour déterminer si la fluorescence est due à
des antigènes pestivirus PPC ou non PPC. L’isolement du virus PPC peut être tenté sur la lignée
cellulaire de rein de porc (PK-15) ou sur une autre lignée sensible. La production virale en culture
de cellules est recherchée par coloration en immunofluorescence ou immunoperoxydase ; les
isolats positifs sont ensuite caractérisés grâce aux AcMs et par un séquençage génétique partiel.
Les protocoles des réactions d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) pour l’identification
de l’acide nucléique du virus PPC sont utilisés dans plusieurs laboratoires. L’isolement et
l’identification des souches virales pathogènes suspectes doivent être conduits dans des
laboratoires répondant aux normes de sécurité.
Épreuves sérologiques : La recherche des anticorps spécifiques du virus est particulièrement
utile dans les élevages suspectés d’être infectés depuis au moins 30 jours, par le virus de la PPC.
Les méthodes sérologiques sont aussi valables pour les enquêtes de contrôle et de détermination
de prévalence ; elles sont essentielles si un pays souhaite être reconnu internationalement comme
indemne de la maladie en l’absence de vaccination.
Dans la mesure où des réactions croisées avec des anticorps Pestivirus de ruminants sont parfois
rencontrées chez les porcs d’élevage, les épreuves de dépistage doivent être complétées par des
épreuves de confirmation spécifiques du virus PPC. L’ELISA est relativement spécifique du virus
PPC, mais la méthode définitive de différentiation est l’épreuve de neutralisation comparative qui
compare le titre en anticorps vis-à-vis des différentes espèces de Pestivirus.
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Manuel terrestre de l’OIE 2005
Chapitre 2.1.13. — Peste porcine classique (hog cholera)
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
Les vaccins contre la PPC utilisent des virus vivants atténués par passages sur cultures de cellules
ou sur des espèces réceptives qui ne sont pas de la famille des suidés. La production de ces
vaccins à virus vivants modifiés repose sur la validation du système lot-semence tenant compte de
l’identité virale, de la stérilité, de la pureté, de l’innocuité, de la non transmissibilité, de la stabilité et
de l’immunogénicité. Si le virus PPC est utilisé pour la production de vaccin ou lors d’épreuves
virulentes, les locaux doivent répondre aux normes de confinement de l’OIE correspondant aux
agents pathogènes du groupe 4.
Des vaccins inactivés de type conventionnel, impliquant le virus entier, ne sont pas disponibles.
Ces dernières années des « vaccins avec marqueur sérologique » ont été développés, qui, à la
différence des vaccins à virus vivants atténués, induisent des anticorps qui peuvent être distingués
de ceux induits par le virus naturel en utilisant une épreuve de diagnostic appropriée. Les « vaccins
avec marqueur sérologique » proposés à l’heure actuelle, utilisent la glycoprotéine majeure de
l’enveloppe (E2-sous-unité) du virus PPC et sont produits sur cellules d’insecte grâce à la
méthodologie de recombinaison de l’ADN.
A. INTRODUCTION
Les virus responsables de la peste porcine classique (PPC), de la diarrhée virale bovine (BVD, Bovine Viral
Diarrhoea ou maladie des muqueuses) et de la maladie de la frontière (BD, Border Disease) sont des membre de
la famille des Flaviviridae, appartenant au genre Pestivirus, et sont très proches au plan antigénique et structurel.
Les signes cliniques et les lésions découvertes à l’autopsie de porcs morts de PPC sont très variables en raison
de facteurs liés, à la fois au virus et à l’hôte. Bien plus, les infections congénitales de la truie par des pestivirus de
ruminants peuvent conduire à une maladie cliniquement indistinguable de la PPC (22, 24, 25).
L’atteinte de tous les groupes d’âge, accompagnée de fièvre, d’entassement, d’inappétence, d’abattement, de
faiblesse, de conjonctivite, de constipation suivie par une diarrhée et d’une démarche chancelante, sont les
signes essentiels. Plusieurs jours après l’apparition des signes cliniques, une coloration pourpre apparaît sur les
oreilles, l’abdomen et à l’intérieur des cuisses. La mort survient en 1 à 2 semaines dans la forme aiguë. Une mort
brutale, en l’absence de signes cliniques, n’est pas symptomatique de la PPC.
Dans certaines circonstances en rapport avec l’âge de l’animal et son état ainsi qu’avec la souche de virus en
cause, des atteintes subaiguë ou chronique peuvent se développer et se prolonger sur 2 à 4 semaines ou même
des mois. La forme chronique conduit à un retard de croissance avec anorexie, fièvre intermittente et diarrhée.
Les infections congénitales persistantes peuvent restées méconnues pendant des mois et peuvent être limitées à
seulement quelques porcelets de l’élevage. Les signes cliniques sont équivoques : dépérissement apyrétique.
Les infections chroniques persistantes conduisent toujours à la mort de l’animal. Les taux de mortalité dans un
élevage, peuvent être légèrement supérieurs à ceux attendus. La PPC affecte le système immunitaire et la
principale caractéristique en est une leucopénie généralisée, qui peut souvent être détectée avant l’apparition de
la fièvre. L’immunosuppression peut entraîner l’apparition d’infections secondaires.
Dans les formes aiguës, les lésions macroscopiques sont souvent discrètes ou absentes. Dans les cas typiques,
les nœuds lymphatiques sont hypertrophiés et marbrés de rouge, des hémorragies apparaissent sur l’épicarde et
dans les reins, la vessie, la peau et le conjonctif sous-cutané. Dans les cas chroniques, des ulcères nécrotiques
dits « en boutons de culotte » peuvent être observés dans la muqueuse du tractus gastro-intestinal, l’épiglotte et
le larynx, en plus des lésions précédentes.
Les lésions microscopiques histologiques ne sont pas pathognomoniques. Il peut s’agir de dégénérescence
parenchymateuse du tissu lymphatique, de proliférations cellulaires du tissu interstitiel vasculaire, et d’une
méningo-encéphalomyélite non suppurée, avec ou sans manchons péri-vasculaires.
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
Le polymorphisme et l’intensité variable des signes cliniques et lésionnels ne permettent pas de conduire un
diagnostic précis. D’autres maladies, telles que la Peste porcine africaine, les troubles du sevrage, le syndrome
de dépérissement et le syndrome dermatite et néphropathie du porc, ainsi que des infections septicémiques telles
que les salmonellose, pasteurellose, actinobacillose et les infections à Hemophilus suis, peuvent être confondues
avec la PPC aiguë. En fait, ces bactéries sont souvent responsables d’infections secondaires et, l’isolement de
ces germes peut cacher la cause réelle de la maladie, le virus de la PPC.
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C’est pourquoi, une tentative de diagnostic clinique ou lésionnel doit toujours être confirmée par des recherches
de laboratoire. Cela est d’autant plus nécessaire à la vue des lourdes conséquences que l’existence d’un foyer de
PPC peut causer pour le commerce international des porcs et de leurs produits.
Les méthodes de laboratoire pour le diagnostic de la PPC visent la mise en évidence du virus, de son acide
nucléique ou de ses antigènes ainsi que des anticorps qui lui sont spécifiques. Pour une interprétation correcte
des résultats des épreuves, le vétérinaire doit accorder une attention particulière à l’apparition simultanée et
groupée d’au moins 2 signes parmi les plus fréquents de la maladie signalés ci-dessus. La réalisation de
prélèvements au hasard ne convient pas au diagnostic. Etant donné que la fièvre est un des premiers signes de
PPC et s’accompagne d’une virémie (6), la recherche du virus dans le sang récolté sur acide éthylène-diaminetétra-acétique (EDTA) ou dans des tissus, prélevés sur un animal fiévreux, est la méthode de choix pour détecter,
précocement, les élevages infectés. De plus, les prélèvements sanguins destinés à la recherche du virus peuvent
être réalisés sur un nombre plus important de porcs.
La PPC fait l’objet d’un contrôle officiel et le virus présente un haut risque de diffusion à partir du laboratoire : une
analyse de risque doit être effectuée pour déterminer le niveau de biosécurité nécessaire au diagnostic et à la
caractérisation du virus. Les locaux doivent répondre aux normes de Confinement correspondant au Groupe
déterminé par l’évaluation du risque comme cela est souligné dans l’appendice I.1.6.1. du Chapitre I.1.6., « La
biosécurité au laboratoire de microbiologie vétérinaire », de ce Manuel terrestre. Les pays ne pouvant avoir accès
à un tel laboratoire national ou régional, devront adresser les prélèvements à un Laboratoire de référence de
l’OIE.
Les anticorps apparaissent durant la troisième semaine d’évolution de la maladie et persistent toute la vie chez
les sujets survivants. Les prélèvements destinés à la recherche des anticorps sont effectués dans des tubes
ordinaires non héparinés, chez les porcs convalescents et chez les porcs de l’élevage qui ont été en contact avec
le virus, au moins 30 jours après l’apparition suspectée du virus.
1.
Identification de l’agent pathogène
a)
Méthodes immunologiques
•
Épreuve d’immunofluorescence
L’immunofluorescence (IF) est rapide et peut permettre de détecter l’antigène du virus PPC sur des coupes
au cryostat d’amygdale, de rate, de rein, de nœud lymphatique ou de portion distale de l’iléon. Les tissus
doivent être prélevés sur plusieurs animaux (3) et transportés sans conservateur, sous froid mais non
congelés. Les coupes au cryostat sont colorées directement avec une immunoglobuline anti-PPC conjugué
à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou indirectement à l’aide d’un conjugué FITC secondaire puis
examinées au microscope à fluorescence. Au début de l’infection, le tissu amygdalien est le plus propice car
il est le premier à être infecté par le virus quelle que soit la voie de pénétration (18). Dans les cas subaiguës
ou chroniques, l’iléon est souvent positif et, parfois, constitue le seul tissu révélant une fluorescence. Un
résultat négatif en IF ne peut permettre d’éliminer l’infection PPC. Lorsque la suspicion de PPC persiste, il
doit être réalisé d’autres prélèvements ou des essais d’isolement du virus en cultures de cellules (par
exemple sur rein de porc [PK-15] ou sur d’autres lignées d’origine porcine aussi sensibles et reconnues
exemptes de contamination par Pestivirus).
•
Protocole
Introduire des coupes témoins positif et négatif dans chaque série de prélèvements d’organe à examiner.
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i)
Découper un fragment d’amygdale, de rate, de rein et d’iléon d’environ 1 x 1 x 0,5 cm, et le placer soit
avec un composé de cryo-montage, soit avec de l’eau distillée, sur le support de tissu du cryostat.
ii)
congeler le fragment d’organe sur le support du cryostat.
iii)
Effectuer des coupes ne dépassant pas 4 µm d’épaisseur et les étaler sur des lamelles couvre-objet
dont un coin est coupé. Toutes les coupes sont montées avec le coin coupé de la lamelle dans la
même direction (par exemple angle supérieur droit).
iv)
Après séchage, fixer les coupes ainsi montées, pendant 10 min à la température ambiante, dans de
l’acétone (qualité analytique), ou à l’air pendant 20 min à 37°C.
v)
Immerger rapidement les coupes dans une solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS),
éliminer le fluide en excès à l’aide d’un papier filtre, et les placer (angle supérieur coupé à droite) sur
un support dans une chambre humide dont le fond renferme une petite quantité d’eau.
Manuel terrestre de l’OIE 2005
Chapitre 2.1.13. — Peste porcine classique (hog cholera)
vi)
Répartir l’immunoglobuline anti-PPC à la dilution recommandée, sur la totalité de la surface de la
coupe et incuber pendant 30 min à 37°C dans la chambre humide close. Si le conjugué FITC
secondaire est nécessaire, laver la coupe 5 fois, pendant 2 min chacune, dans du PBS à la
température ambiante, puis ajouter le conjugué FITC à la dilution requise et incuber comme
précédemment.
vii)
Laver les coupes 5 fois, pendant 2 min chacune, dans du PBS, à la température ambiante.
viii) Eliminer le PBS restant par contact de la lamelle avec un papier filtre fin, et monter la lamelle (avec la
coupe entre la lamelle et la lame) avec un tampon de montage, sur une lame pour examen
microscopique.
ix)
Eliminer l’excès de fluide de montage avec du papier filtre et examiner les coupes pour rechercher les
foyers fluorescents, en utilisant un microscope à lumière ultra-violette. Une coupe PPC-positive montre
des cellules émettant une fluorescence verte brillante. Dans les amygdales, la fluorescence de la
bordure épithéliale des cryptes est particulièrement marquée. Dans le rein, la fluorescence est plus
intense dans les tubules proximaux et distales du cortex rénal et les tubes collecteurs de la médulla.
Dans l’iléon, la fluorescence est plus accusée dans les cellules épithéliales des glandes de Lieberkün,
tandis que dans la rate, la réactivité est plus diffuse avec des concentrations de cellules lymphoïdes
dans les gaines lymphoïdes péri-artérielles (PALS).
L’IF utilise une immunoglobuline anti-PPC préparée à partir d’un anticorps polyclonal du virus PPC
incapable de distinguer les antigènes des différents pestivirus. Les conjugués utilisés pour l’IF sur les
coupes au cryostat ou les cultures de cellules inoculées, doivent être élaborés à l’aide de gamma-globulines
obtenues chez des porcs exempts d’agents pathogènes spécifiques (EAPS). La dilution de conjugué utilisée
(au moins 1/30) doit ménager un maximum de brillance sur un minimum de coloration de fond.
Les souches vaccinales de virus vivant modifié (VVM) se multiplient surtout dans les nœuds lymphatiques
régionaux et dans l’épithélium des cryptes amygdaliennes. Les porcs vaccinés avec des souches VVM
peuvent produire une IF positive durant les 2 semaines suivant la vaccination (15, 19). L’inoculation du lapin
est utilisée pour différencier les souches de PPC lapinisées de celles du terrain. A l’opposé des souches de
terrain, les souches lapinisées, inoculées par voie intraveineuse, entraînent une réaction fébrile et induisent
une réponse immunitaire chez le lapin.
Les porcs infectés par les pestivirus des ruminants peuvent donner, en IF, des réactions faussement
positives. Les infections congénitales dues aux pestivirus des ruminants peuvent entraîner des signes
cliniques et des lésions identiques à ceux et à celles de la PPC chronique (22, 24, 25). Les infections par le
virus PPC ou les pestivirus des ruminants peuvent être différenciés en soumettant les sérums de la truie et
de la portée, ou des autres sujets en contact avec un porcelet IF positif, à une épreuve de séroneutralisation
vis-à-vis de chacun des virus. Une autre méthode de différentiation de ces virus consiste en l’inoculation de
porcelets séronégatifs avec une suspension du matériel suspect, suivie, 5 semaines plus tard, d’épreuves
de séroneutralisation pratiquées sur leur sérums pour la recherche des anticorps respectifs. Cependant, les
épreuves de séroneutralisation peuvent prendre plusieurs jours et les méthodes d’inoculation à l’animal
réclament plusieurs semaines.
•
Épreuve d’immunoperoxydase pour la différentiation des pestivirus par les anticorps monoclonaux
Le recours à une série de 3 anticorps monoclonaux (AcMs), soit conjugués à la peroxydase de raifort
(HRPO) ou à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), soit utilisés en association avec un conjugué antisouris et détectant de façon spécifique respectivement toutes les souches PPC de terrain, les souches
vaccinales PPC et les pestivirus des ruminants, permettrait une différentiation précise entre les souches de
terrain et vaccinales PPC, d’une part, et entre virus PPC et les autres pestivirus, d’autre part (10, 26, 28).
Une condition essentielle est que l’AcM anti-virus PPC reconnaisse toutes les souches terrain et que l’AcM
anti-vaccin reconnaisse toutes les souches vaccinales utilisées dans le pays. Aucun AcMs ne réagit
sélectivement avec tous les pestivirus de ruminants (10). Le recours à un AcM différenciant la souche
vaccinale PPC n’est pas nécessaire dans les zones où l’on ne vaccine pas. Une immunoglobuline
polyclonale anti-PPC conjuguée à la peroxydase (HRPO) sert de témoin positif. Des précautions doivent
être prises lorsque l’on utilise un seul AcM en confirmation unique de la nature PPC d’un isolat.
•
Protocole
i)
Réaliser au cryostat au moins 8 coupes (4 µm) d’amygdale positive en IF ou d’un autre organe positif
si l’on ne dispose pas d’amygdale.
ii)
Fixer les coupes sur des lamelles couvre objet dans l’acétone (qualité analytique) pendant 10 min et
laisser sécher à l’air.
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Chapitre 2.1.13. — Peste porcine classique (hog cholera)
iii)
Préparer des dilutions appropriées des différents conjugués AcMs-peroxydase en PBS + 0,01 % de
Tween 80 + 5 % de sérum de cheval, pH 7,6 (un FITC-AcMs peut aussi être utilisé, aussi bien qu’un
AcM non conjugué, pourvu qu’un second conjugué soit utilisé).
iv)
Après rinçage en PBS, recouvrir 2 coupes avec la dilution des conjugués monoclonaux respectifs et
2 coupes avec la dilution du conjugué polyclonal (témoins).
v)
Incuber à 37°C pendant 1 h en chambre humide.
vi)
Laver les coupes pendant 10 s, 6 fois, en PBS.
vii)
Colorer les coupes avec la solution de substrat chromogène∗ fraîchement préparée, pendant 5 à
15 min à température ambiante.
viii) Rincer les coupes dans une solution en eau distillée d’acétate de sodium 0,05 M, pH 5,0, et les monter
sur des lames pour examen microscopique.
ix)
Examiner les coupes au microscope. Une coloration rouge foncé du cytoplasme des cellules
épithéliales bordant les cryptes amygdaliennes indique la mise en évidence d’un virus par le conjugué
correspondant et est considéré positive.
x)
Interprétation de l’épreuve :
Anticorps
polyclonal
Anticorps monoclonal spécifique de
Interprétation
Souche PPC
Souche vaccinale
PPC
Souche BVD/BD
+
+
–
–
Souche terrain PPC
+
+
+
–
Souche vaccinale PPC
+
–
–
+
Souche BVD/BD
+
–
–
–
Autre pestivirus non-PPC*
* L’existence de nouvelles souches de PPC doit toujours être pris en compte et tout isolat de cas où la PPC est
encore suspectée doit être envoyé à un Laboratoire de référence de l’OIE.
•
Méthode immuno-enzymatique de capture
Pour un diagnostic rapide de la PPC chez des porcs vivants, des épreuves immuno-enzymatique (ELISA)
de capture ont été mises au point pour détecter les élevages suspects d’avoir été récemment infectés. Les
ELISAs sont du type sandwich double-anticorps, avec des anticorps monoclonaux et/ou polyclonaux dirigés
contre diverses protéines virales et utilisables sur du sérum, la fraction leucocytaire sanguine, ou du sang
total prélevé sur anticoagulant (des homogénats de tissu centrifugés peuvent être ajoutés ici dans la mesure
où ils constituent un matériel utilisable en ELISA) (7). La technique est relativement simple à effectuer, ne
réclame pas d’équipement nécessaire à la culture de tissu, est automatisable et peut donner des résultats
en une demi-journée. L’inconvénient d’être moins sensible que l’isolement viral, spécialement chez le porc
adulte et lors de formes modérées ou sub-cliniques, est compensé par la possibilité de tester tous les porcs
fiévreux suspects d’un élevage. Néanmoins, la faible spécificité de ces épreuves doit aussi être considérée.
b)
Isolement du virus
L’isolement du virus en cultures de cellules est une méthode plus sensible mais plus lente pour le diagnostic
de la PPC que l’immunofluorescence sur coupes en congélation. L’isolement est, au mieux, réalisé en
cellules à division rapide PK-15 ensemencées sur des lamelles simultanément avec une suspension
d’amygdale à 2 % dans le milieu de culture. D’autres lignées de cellules de porc peuvent être utilisées, mais
elles doivent avoir démontré qu’elles sont au moins aussi sensibles que les cellules PK-15 pour l’isolement
du virus PPC. Les cultures sont examinées par IF pour recherche des foyers fluorescents, après 24 à 72 h.
∗
Solution de substrat chromogène
Solution stock de chromogène : 0.4 % de 3-amino-9-ethyl carbazole; N,N-dimethyl-formamide (1 ml).
Prendre garde aux composés toxiques.
B.
0,05 M d’acétate de sodium, pH 5,0 ; 19 ml (filtré stérilement à travers une membrane).
C.
Solution stock de substrat (30 % de peroxyde d’hydrogène).
Conserver les solutions stock A et C dans l’obscurité et à 4°C et la solution B à température ambiante. La solution stock A peut
être conservée à 4°C Durant au moins 6 mois et la solution C durant au moins 1 an. Juste avant d’utiliser les solutions, diluer
1 ml de la solution A dans 19 ml de la solution B. Ajouter alors 10 µl de la solution stock C. Mélanger bien et colorer les coupes.
A.
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Manuel terrestre de l’OIE 2005
Chapitre 2.1.13. — Peste porcine classique (hog cholera)
L’amygdale est le tissu de choix pour l’isolement du virus chez les porcs morts ou sacrifiés en vue du
diagnostic. A défaut, la rate, le rein ou les nœuds lymphatiques peuvent être utilisés.
Un protocole d’isolement est détaillé ci-dessous :
i)
Préparer une solution stock glutamine-antibiotiques concentrée 100 fois : dissoudre la glutamine
(2,92 g) dans 50 ml d’eau distillée (solution A) et la stériliser par filtration. Dissoudre chacun des
6
antibiotiques suivants dans 5 à 10 ml d’eau distillée stérile : pénicilline (10 Unités Internationales
5
4
[UI]) ; streptomycine (1 g) ; mycostatine (5 x 10 U) ; polymyxine B (15 x 10 U) ; et kanamycine (1 g).
Mélanger ces solutions d’antibiotiques (solution B). Mélanger stérilement les solutions A et B, ajuster à
100 ml avec de l’eau distillée stérile, et stocker en aliquots de 5 ml à –20°C.
ii)
Couper 1 à 2 g de tissu en petits fragments et, en utilisant un mortier et un pilon, les broyer dans une
petite quantité de milieu de culture en présence de sable stérile, pour obtenir une pâte homogène. A
défaut, utiliser un broyeur mécanique approprié à 4°C.
iii)
Faire une suspension à 20 % (poids/volume) en ajoutant de la solution saline de Hanks (BSS,
Balanced Salts Solution) ou du milieu essentiel minimum de Hanks (MEM) ; 1 ml de la solution stock
glutamine-antibiotiques est ajouté pour chaque 10 ml de suspension. Le mélange est conservé 1 heure
à la température ambiante.
iv)
Centrifuger à 1 000 g pendant 15 min.
v)
Une monocouche de cellules PK-15 est trypsinisée, la suspension de cellules est centrifugée à 160 g
6
pendant 10 min, et les cellules sont reprises à la concentration de 2 x 10 cellules/ml dans du milieu de
croissance (MEM d’Eagle avec des sels de Earle ; 5 % de sérum fœtal de veau exempt de pestivirus
ruminants et d’anticorps anti-pestivirus ; et 0,2 ml de solution stock glutamine-antibiotiques par 10 ml
de suspension cellulaire).
vi)
Mélanger 9 parties de suspension cellulaire (étape v) à une partie du surnageant tissulaire (étape iv) et
ensemencer 1,0 à 1,5 ml dans 6 à 8 tubes de Leighton avec lamelles ou tout autre dispositif de culture
de cellules appropriées. Trois tubes reçoivent 1,0 à 1,5 ml de suspension cellulaire seule en tant que
témoins. Après achèvement de l’ensemencement des prélèvements, 3 tubes sont inoculés avec le
virus PPC comme témoins positifs. Des précautions doivent être prises pour éviter une contamination
croisée avec la suspension virale positive connue. Des cultures négatives doivent aussi être
préparées.
vii)
1, 2 et 3 jours après l’ensemencement, 2 cultures, ainsi qu’une culture témoin positive et négative, sont
lavées 2 fois, pendant 5 min chaque fois, dans du BSS Hanks, MEM Hanks ou du PBS, fixées à
l’acétone froid (qualité analytique) pendant 10 min, et colorées directement avec un conjugué anti-PPC
à la dilution appropriée ou indirectement, comme décrit à la Section B.1.a.
Si la suspension d’amygdale à 2 % se révèle toxique pour les cellules, l’épreuve sera renouvelée en
utilisant une plus forte dilution ou un autre organe.
viii) Après 3 lavage en PBS, de 5 minutes chacun, les lamelles sont montées en tampon
carbonate/bicarbonate glycériné à 90 %, pH 8,0, et examinées pour recherche de foyers fluorescents.
A la place des tubes de Leighton, des plaques à 6 puits avec lamelles peuvent être utilisées. A défaut, il est
possible d’utiliser pour l’isolement viral, des plaques de micro-titrage à fond plat ou des plaques M24. Dans
ce cas, les plaques sont fixées et colorées comme décrit plus loin dans l’épreuve de neutralisation utilisant
la peroxydase (NPLA).
Le sang total (sur héparine ou EDTA) des porcs cliniquement atteints est un bon prélèvement pour le
diagnostic précoce de la PPC. La fraction leucocytaire ou d’autres composants peuvent être utilisés, mais
pour des raisons de sensibilité et de simplicité, le sang total est préféré (9). Le protocole est le suivant :
*
i)
Congeler un échantillon de sang total à –20°C puis, le décongeler au bain-marie à 37°C.
ii)
Ensemencer 300 µl de sang hémolysé sur une couche monocellulaire de PK-15 parvenue à environ
75 % de confluence∗ dans une plaque M24, et laisser absorber pendant 1 h à 37°C.
iii)
Eliminer l’inoculum, laver la monocouche cellulaire, une fois, avec du BSS Hanks ou du MEM Hanks,
et ajouter le milieu de culture.
L’inoculation simultanée, tout en étant légèrement plus sensible, convient moins du fait que l’anticoagulant peut gêner
l’adhésion des cellules à la surface de la plaque.
Manuel terrestre de l’OIE 2005
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Chapitre 2.1.13. — Peste porcine classique (hog cholera)
iv)
Après 3 à 4 jours d’incubation, les plaques sont lavées, fixées et colorées comme décrit plus loin pour
le NPLA, en utilisant à chaque étape, un volume de 300 µl pour tenir compte d’une surface cellulaire
plus large.
Note : Cette méthode est moins sensible que celle, conventionnelle, d’isolement du virus pour la détection
de la forme aiguë de PPC.
•
Transcription inverse couplée à une amplification en chaîne par polymérase
De nombreuses méthodes de transcription inverse couplée à une amplification en chaîne par polymérase
(RT-PCR) ont été décrites et sont encore développées. Une alternative internationalement admise à l’ELISA
de capture antigénique et à la méthode d’isolement viral est une RT-PCR nichée (14). Cette méthode est
rapide et plus sensible que les ELISAs de capture, l’isolement viral ou la RT-PCR, ce qui la rend
particulièrement efficace pour le diagnostic pré-clinique. Elle offre l’avantage supplémentaire de réduire le
risque de diffusion contaminante car les tubes restent fermés entre les étapes successives des réactions
RT, première PCR et PCR « nichée » (17). Des méthodes PCR en temps réel sont aujourd’hui en
développement. Il n’existe pas encore de méthode RT-PCR standardisée à l’échelle internationale. Des
exemples de protocole peuvent être obtenus par la littérature ou auprès des Laboratoires de référence de
l’OIE pour la PPC (se reporter à la liste de la partie 3 de ce Manuel terrestre). En raison de sa rapidité et de
sa sensibilité, la RT-PCR constitue une approche utile pour l’étude des cas suspects de la maladie et est
désormais acceptée par l’Union Européenne (UE) (1), bien qu’il soit recommandé, en raison de la facilité
d’apparition de fausses réactions positives, que chaque résultat positif enregistré lors de premiers foyers,
soit systématiquement confirmé par d’autres épreuves. Cette épreuve peut être appliquée sur des
échantillons de sang individuels ou de mélange aussi bien que sur des organes et a été utilisée avec succès
pour le contrôle des épizooties.
L’épidémiologie moléculaire de la PPC repose sur la comparaison des différences génétiques existant entre
les isolats de virus. L’amplification en RT-PCR de l’ARN PPC suivi du séquençage des nucléotides, est la
voie la plus simple d’obtenir les données « séquence » pour faire ces comparaisons. Un certain nombre de
régions différentes du génome PPC peut être ciblé pour les études épidémiologiques (16). Deux régions ont
été très étudiées et fournissent une large série de données « séquence » avec lesquelles les nouveaux
isolats peuvent être comparés. Une de ces régions se trouve dans la région 5’-non codante (5’NCR) du
génome (150 nucléotides) et l’autre, dans le gène de la glycoprotéine majeure E2 (190 nucléotides). En bref,
la méthode retenue consiste à extraire l’ARN viral de cultures infectées de cellules PK-15, à effectuer la
RT-PCR pour amplifier une des deux cibles dans la région 5’NCR ou dans le gène E2, puis à déterminer la
séquence nucléotidique des produits et à la comparer avec les informations séquentielles déjà stockées
dans les bases de données. Une base de données de ces séquences peut être obtenue auprès du
Laboratoire de référence de l’OIE pour la PPC (Hanovre, Germany). Les isolats de virus PPC provenant de
foyers primaires, doivent être envoyés à un Laboratoire de référence de l’OIE pour les études en
épidémiologie moléculaire. Une autorisation d’importation doit être obtenue avant l’expédition.
2.
Épreuves sérologiques
La mise en évidence des anticorps spécifiques du virus est particulièrement utile dans les élevages suspects
d’infections par des souches de basse virulence. En raison de l’effet immunosuppresseur du virus PPC, les
anticorps ne peuvent être révélés avant 21 jours post-infection. Les recherches sérologiques visent à détecter les
foyers résiduels d’infection, tout particulièrement parmi les nouveau-nés de l’élevage, mais sont aussi utiles en
phase terminale d’éradication.
Puisque l’incidence de l’infection par les pestivirus des ruminants peut être élevée dans les élevages, seuls les
épreuves capables de différencier les anticorps PPC des anticorps BVD/BD sont appropriées. La
séroneutralisation virale et l’ELISA utilisant des AcMs, satisfont l’exigence de sensibilité, mais les résultats positifs
en ELISA doivent être confirmés par une épreuve comparative en séroneutralisation.
Les épreuves de séroneutralisation sont réalisées en cultures de cellules selon la méthode virus constant / sérum
variable. Comme le virus PPC n’est pas cytopathogène, tout virus non neutralisé doit être détecté, après sa
multiplication, par un système révélateur. L’épreuve de neutralisation virale en immunofluorescence (FAVN) (13)
et l’épreuve de NPLA (20) sont les techniques les plus utilisées. Ces 2 épreuves peuvent être conduites en
plaques de micro-titrage. Le système peroxydase présente l’avantage de pouvoir être lu à l’œil nu.
a)
Épreuve de neutralisation virale en fluorescence (épreuve prescrite pour les échanges
internationaux)
i)
280
Ensemencer une suspension de cellules PK-15 à une concentration de 2 x 105 cellules/ml dans, par
exemple, des boîtes de Petri contenant des lamelles étalées sur le fond, ou dans des tubes de
Leighton munis de lamelles ou dans des plaques de micro-titrage à fond plat.
Manuel terrestre de l’OIE 2005
Chapitre 2.1.13. — Peste porcine classique (hog cholera)
ii)
Incuber les cultures à 37°C pendant 1 à 2 jours en atmosphère de CO2, jusqu’à obtenir 70 à 80 % de
confluence. Un incubateur ordinaire peut être utilisé pour les tubes de Leighton bouchés.
iii)
Inactiver les sérums à 56°C pendant 30 min. Dans le cadre d’échanges internationaux, il est préférable
d’utiliser une dilution initiale de 1/5 (dilution finale de 1/10).
iv)
Incuber un volume égal de sérum dilué et de suspension virale contenant 200 DICT50 (Dose de virus
infectant 50 % de la culture tissulaire) par 0,1 ml, à 37°C, pendant 1 à 2 h. Ainsi une quantité constante
de 100 DICT50 de virus PPC est utilisée dans chaque puits réaction.
v)
Enlever les lamelles des boîtes de Petri ou des tubes de Leighton, laver rapidement dans du milieu
sans sérum, couvrir les couches de cellules avec le mélange sérum/virus (de l’étape iv) et incuber à
37°C pendant 1 h en atmosphère humide.
vi)
Placer la lamelle dans un tube de Leighton propre et incuber les cultures en milieu de maintien
pendant 2 jours supplémentaires.
vii)
Enlever les lamelles des tubes de Leighton, laver les couches cellulaires 2 fois, pendant 5 min, dans
du PBS, pH 7,2, fixer dans l ‘acétone pur pendant 10 min, et colorer avec la dilution appropriée de
conjugué pendant 30 min, à 37°C, avant lavage.
viii) Monter les lamelles sur des lames pour examen microscopique dégraissées, à l’aide d’un tampon
carbonate/bicarbonate pH>8 glycériné, et examiner en fluorescence.
Lorsque l’épreuve FAVN est effectuée en plaques de micro-titrage, le protocole du NPLA (voir ci-dessous)
peut être appliqué jusqu’à l’étape viii). Les plaques sont alors colorées avec la dilution du conjugué pendant
30 min, à 37°C, et examinées en fluorescence. Note : pour la recherche de la fluorescence, il est
recommandé d’examiner les plaques à l’aide d’un objectif de longue focale.
b)
Épreuve de neutralisation en immunoperoxydase (épreuve prescrite pour les échanges
internationaux)
La NPLA est réalisée en plaques de micro-titrage à fond plat. Les sérums sont d’abord inactivés à 56°C
pendant 30 min. Dans le cadre des échanges internationaux, il est recommandé d’utiliser une dilution
sérique initiale de 1/5 (dilution finale au 1/10). Pour les contrôles de surveillance dans un pays, une dilution
de 1/10 peut suffire. Les témoins appropriés de spécificité et de sensibilité des réactions, doivent être
incorporés dans chaque épreuve.
•
Protocole
i)
Répartir des dilutions de sérum en milieu de croissance (MEM Eagle avec 5 % de sérum de veau fœtal
et des antibiotiques) sous un volume de 50 µl, chacune dans 2 puits d’une plaque de micro-titrage. Le
sérum de veau fœtal doit être exempt de virus BVD et d’anticorps correspondants. Un troisième puits
peut être inclus pour chaque échantillon. Ce puits contient du sérum mais pas de virus et est utilisé
comme témoin sérum (cyto-toxicité et/ou coloration non spécifique).
ii)
Ajouter 50 µl de suspension virale à chaque puits, diluée en milieu de croissance pour contenir environ
100 DICT50/50 µl, et mélanger les contenus sur un agitateur de plaques pendant 20 s.
iii)
Incuber les plaques dans une étuve à CO2 pendant 1 h à 37°C.
iv)
5
Ajouter dans tous les puits, 50 µl de milieu de culture contenant 2 x 10 cellules/ml.
v)
Laisser les cellules se multiplier en atmosphère à 5 % de CO2 jusqu’à la confluence, obtenue
habituellement en 3 à 4 jours.
vi)
Eliminer le milieu de culture et rincer les plaques une fois en NaCl 0,15 M.
vii)
Eponger les plaques en les tapotant sur une serviette.
viii) Les couches monocellulaires peuvent être fixées de plusieurs façons, soit :
•
Les plaques sont incubées pendant 45 min à 37°C, puis pendant au moins 45 min à –20°C. Les
plaques sont retirées du congélateur, les puits sont remplis avec 100 µl de paraformaldéhyde à
4 % en PBS et ré-incubées pendant 5 à 10 min à température ambiante. Le paraformaldéhyde
est éliminé et les plaques rincées en NaCl 0,15 M ; soit :
•
Les plaques sont incubées à 70 ou 80°C pendant 1 à 2 h ; soit :
•
Les plaques sont fixées à l’acétone à 20 % en PBS pendant 10 min suivi d’un séchage complet à
25 ou 30°C pendant 4 h. (Ceci peut être obtenu plus rapidement à l’aide d’un sèche-cheveux –
après 3 à 5 min le séchage complet est obtenu comme en atteste la couleur blanchâtre de la
mono-couche cellulaire).
Manuel terrestre de l’OIE 2005
281
Chapitre 2.1.13. — Peste porcine classique (hog cholera)
ix)
Ajouter à chaque puits, 50 µl d’un sérum de porc hyperimmun anti-PPC, dilué en NaCl 0,5 M contenant
1 % de Tween 80 + 0,1 % d’azide de sodium, pH 7,6. Incuber 15 min à 37°C. La dilution de l’antisérum à utiliser doit être déterminée par titrage préalable : c’est à dire qu’un sérum donnant un titre
NPLA de 1/30 000, doit être utilisé au 1/100.
x)
Laver les plaques 5 fois en NaCl 0,15 M contenant 1 % de Tween 80, pH 7,6.
xi)
Ajouter à chaque puits, 50 µl d’une IgG anti-porc conjugée à la peroxydase (IgG-HRPO)
convenablement diluée en NaCl 0,5 M avec 1 % de Tween 80, pH 7,6, puis incuber à 37°C pendant
10 min.
xii)
Laver les plaques 5 fois en NaCl 0,15 M contenant 1 % de Tween 80, pH 7,6.
xiii) Ajouter 50 µl de solution du substrat chromogène à chacun des puits et laisser se développer la
coloration pendant 15 à 30 min à température ambiante. Cette solution est décrite dans la Section
B.1.a. « protocole d’immuno-peroxydase pour la différentiation des pestivirus par les anticorps
monoclonaux ».
xiv) L’épreuve est lue à l’œil nu. Les couches de cellules infectées sont totalement ou partiellement
colorées en rouge-brun. Dans les cas douteux, la couche cellulaire doit être examinée au microscope à
faible grossissement. Le cytoplasme des cellules infectées est coloré en rouge foncé.
xv)
Les témoins suivants sont inclus dans l’épreuve : témoin cellules, témoin sérum positif et titrage
rétrospectif du virus utilisé. Le titrage rétrospectif doit confirmer que le virus a été utilisé à une
concentration située entre 30 et 300 DICT50/50 µl.
Parfois, les sérums de porcs infectés par le virus BVD réagissent en FAVN ou NPLA à faible dilution comme
s’ils étaient infectés par le virus PPC. L’importance de la réactivité croisée dépend de la souche de virus
BVD responsable et du délai entre l’infection et le prélèvement (27). L’habituel titre élevé en anticorps atteint
après exposition au virus PPC, y compris aux souches de basse virulence, permet de recourir à des
dilutions initiales comparativement plus hautes dans les épreuves NPLA pour la recherche des anticorps
PPC, de façon à éviter la plupart, des réactions croisées, mais pas toutes (20, 21). En cas de doutes
persistants, la réalisation des épreuves comparatives utilisant une souche de virus PPC, une souche de
virus BVD et une souche de virus BD, représentatives de la région ou du pays, se révèle utile. Les épreuves
de neutralisation comparative évaluent les titres obtenus avec la même série de dilution de raison 2 du
sérum suspect, chacune des dilutions étant testée en double contre 100 DICT50 de chacun des virus choisis.
Les épreuves comparatives sont effectuées selon les protocoles décrits pour l’épreuve FAVN ou NPLA ; les
lignées cellulaires utilisées doivent être sensibles au virus BVD et BD. Les titres de neutralisation sont
exprimés sous la forme de la réciproque de la plus haute dilution du sérum qui prévient la réplication virale
dans la moitié des doubles puits. Une différence de 4 fois ou plus entre les valeurs de 2 titrages doit être
considérée comme significative d’une infection par l’espèce virale donnant le titre le plus élevé.
c)
Méthode immuno-enzymatique (épreuve prescrite pour les échanges internationaux)
Les techniques indirectes, de blocage ou de compétition peuvent être retenues et effectuées sur des
supports appropriés. Les épreuves choisies doivent minimiser les réactions croisées avec le virus BVD et
les autres pestivirus. Cependant l’épreuve doit assurer l’identification de toutes les infections PPC et à
toutes les étapes de la réponse immunitaire à l’infection.
Antigène : L’antigène doit dériver ou correspondre aux protéines virales de l’une des souches
recommandées du virus PPC. Les cellules utilisées pour préparer l’antigène doivent être exemptes de
toutes infections par l’un des autres pestivirus.
Antisérums : Les anti-sérums polyclonaux des épreuves de compétition ou de blocage doivent être produits
sur porc ou lapin par infection à l’aide de l’une des souches de virus PPC recommandées ou avec la souche
C lapinisée. Les anticorps monoclonaux doivent être dirigés contre ou correspondre à une protéine
immunodominante du virus PPC. Les épreuves indirectes doivent utilisées une immunoglobuline
anti-porcine qui détecte à la fois les IgG et les IgM.
La sensibilité de l’ELISA doit être suffisamment élevée pour reconnaître positifs tous les sérums d’animaux
convalescents, c’est-à-dire au moins 21 jours post-inoculation, qui réagissent à l’épreuve de
séroneutralisation. L’ELISA peut seulement être utilisé sur des échantillons de sérum ou de plasma
provenant de porcs individuels. Si la méthode utilisée n’est pas spécifique de la PPC, les échantillons
positifs devront être examinés à l’aide d’épreuves discriminant le virus PPC des autres pestivirus.
La complex-trapping blocking ELISA (4) est une méthode en 1 étape valable pour l’utilisation de robots
automatisant l’ELISA. Les sérums sont testés non dilués. L’épreuve est rapide, facile à réaliser et détecte
282
Manuel terrestre de l’OIE 2005
Chapitre 2.1.13. — Peste porcine classique (hog cholera)
les anticorps contre les souches de basse virulence du virus PPC de façon précoce après l’infection.
Comme les AcMs sont spécifiques de la PPC, la complex-trapping blocking ELISA ne détectera que
rarement les anticorps contre le virus BVD, bien que le problème puisse persister avec les anticorps contre
le virus BD. Les sérums positifs font l’objet d’une confirmation en NPLA.
Des informations complémentaires sur les trousses de diagnostic commercialisées peuvent être obtenues
auprès des Laboratoires de référence de l’OIE.
C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS
BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE
Il n’existe pas de vaccin à virus complet inactivé efficace contre la PPC.
C1. Vaccins à virus vivant modifié
Les vaccins VVM sont produits à partir de souches de virus PPC atténuées par passages soit sur cultures de
cellules, soit sur une espèce animale réceptive n’appartenant pas à la famille des suidés. La production est
conduite en culture de cellules ou chez des animaux non-suidés selon le système lot-semence. Celui-ci doit être
validé en ce qui concerne l’identité, la stérilité, la pureté, l’innocuité, la non transmissibilité, la stabilité et
l’immunogénicité.
Les lignes directrices pour la production des vaccins vétérinaires sont données au Chapitre I.1.7., « Principes de
fabrication des vaccins à usage vétérinaire ». Ces lignes directrices du Chapitre I.1.7. sont d’ordre général et
peuvent être complétées par des dispositions nationales ou régionales.
Les locaux dédiés à la production vaccinale doivent répondre aux normes de biosécurité. Si le virus PPC est
utilisé pour la production ou pour les épreuves de virulence, cette partie des locaux où ces activités sont menées
doivent répondre aux normes de confinement des agents pathogènes du groupe 4 comme cela est souligné dans
l’appendice I.1.6.1. du Chapitre I.1.6., « La biosécurité au laboratoire de microbiologie vétérinaire » de ce Manuel
terrestre.
Pour produire un lot semence et un vaccin fini de haute qualité, les conditions optimales de rendement en virus
doivent être déterminées. Pour la production vaccinale en cultures de cellules, des courbes expérimentales de
croissance doivent être effectuées afin d’étudier les effets de la composition du milieu, de la régulation du pH et
de la concentration de l’atmosphère en CO2, initiant la concentration des cellules ensemencées, le rapport entre
la surface de la couche cellulaire et le volume de milieu, la phase de croissance cellulaire au moment de
l’infection virale, l’état stationnaire ou roulant des flacons durant la réplication virale, etc. Pour les vaccins
produits chez l’animal, l’âge, la souche, le poids, l’importance de l’inoculum (nombre de DI50 animal [Dose
infectant 50 % des animaux considérés]), la pathogénie de l’infection et les signes cliniques, sont les facteurs qui
doivent être étudiés pour déterminer le pic de la production virale et les tissus à récolter.
Indépendamment de la méthode de production, le substrat doit être récolté de façon aseptique et doit être soumis
à un cycle de congélation-décongélation destiné à libérer les virus associés aux cellules. Les débris cellulaires et
les fragments de tissus sont éliminés par filtration ou légère centrifugation. Un stabilisant est ajouté, tel que du
lactose à une concentration finale de 5 %. Le vaccin est homogénéisé avant lyophilisation pour assurer
l’uniformité du lot.
Le virus vaccin du produit fini ne doit pas différer de plus de 5 passages du matériel utilisé pour valider le
lot-semence. Le vaccin commercial doit être produit en lots lyophilisés comme un produit homogène.
1.
Gestion des semences virales
a)
Caractéristiques de la semence virale
Pour valider un lot-semence pour un vaccin PPC à VVM, des échantillons de lot-semence doivent être
soumis à des essais pilotes. Mis à part les tests d’identité, de stérilité, de pureté et de stabilité de
l’atténuation, les essais pilotes peuvent aussi être réalisés avec des échantillons représentatifs du produit
fini commercial. Ces échantillons doivent correspondre au même lot-semence ayant subi les tests précisés
ci-dessus.
En l’absence d’autres spécifications, tous les porcs utilisés en essais pilotes ont un âge compris entre 6 et
8 semaines, sont en bonne santé, exempts d’anticorps contre les virus PPC et BVD, de la même race et du
Manuel terrestre de l’OIE 2005
283
Chapitre 2.1.13. — Peste porcine classique (hog cholera)
même élevage, regroupés au hasard, si nécessaire, et placés dans les mêmes conditions. Les truies
gestantes doivent être de caractéristiques identiques.
Le virus semence doit être stérile et doit induire des anticorps spécifiques neutralisant une souche virulente
de virus PPC, chez les porcs.
b)
Méthode de culture
La production est effectuée en cultures de cellules ou chez un hôte réceptif n’appartenant pas à la famille
des suidés.
c)
Validation de la semence candidate comme semence vaccinale
i)
Pureté
Le vaccin doit être virologiquement pur.
Trois porcs séronégatifs sont inoculés, chacun par voie intramusculaire, avec une quantité de virus lotsemence équivalent à 10 fois la quantité contenue dans une dose de vaccin. Ceci est répété
3 semaines plus tard à la même dose et par la même voie. Des échantillons de sérum sont prélevés
2 semaines après la dernière inoculation et testés par la méthode la plus sensible pour l’absence
d’anticorps vis-à-vis des virus de la peste porcine africaine, de la maladie d’Aujeszky, de la BVD, de la
fièvre aphteuse (tous les types), de la gastro-entérite transmissible, de la maladie vésiculeuse des
suidés, du syndrome respiratoire et reproduction porcin, de la grippe porcine (types H1N1 et H3N2),
des adénovirus porcins, des entérovirus porcins (types 1 et 2) et des parvovirus et circovirus porcins.
ii)
Innocuité
Pour les tests d’innocuité, 10 porcs séro-négatifs sont chacun inoculés par voie intramusculaire avec
10 doses de vaccin. Dix autres porcs servent de témoins. Tous les porcs sont observés durant les
3 semaines suivantes. Les températures corporelles sont enregistrées et des échantillons de sang sont
prélevés sur anti-coagulant, quotidiennement durant la première semaine. Les poids sont relevés à
l’inoculation et 2 semaines plus tard. Aucun animal ne doit mourir ni montrer des signes de maladie
dus au virus (lot-semence) vaccinal. La moyenne journalière des températures corporelles du groupe
ne doit pas atteindre 40,5°C ou plus durant toute la période de l’essai. Le gain de poids moyen ne doit
pas tomber significativement (p < 0,05) en dessous de celui des témoins. La leucopénie (nombre de
6
globules blancs < 7 x 10 cellules/ml) peut être écartée si elle intéresse un seul sujet, pendant 1 jour.
Dix porcs sont soumis à une immuno-suppression par injections quotidiennes, à chacun, de 2 mg/kg
de poids vif de prednisolone, pendant 5 jours consécutifs. Le troisième jour, chaque animal est inoculé
avec l’équivalent d’une dose de vaccin et gardé en observation les 3 semaines suivantes. Aucun
animal ne doit mourir ou devenir malade à cause du virus vaccinal.
Dix truies à 25–35 jours de gestation, sont inoculées par voie intramusculaire avec l’équivalent d’une
dose de vaccin. Un autre groupe de 10 sujets de même race et origine et au même stade de gestation,
sert de témoin. La vaccination ne doit pas interférer avec une gestation conduite à son terme et le
nombre de porcelets nés du groupe test ne doit pas être significativement plus faible (p < 0,05) que
celui issu des truies témoins.
Pour les essais terrain, un minimum de 200 porcs est utilisé, engendrés et élevés par au moins
20 mères, et séro-négatifs vis-à-vis de la PPC et de la BVD. Les portées sont également distribuées
sur au moins 2 fermes. La moitié des porcelets de chaque portée est inoculée par voie intramusculaire,
à l’âge de 7 à 14 jours, avec l’équivalent d’une dose de vaccin. Les congénères non inoculés servent
de témoins. Tous les porcelets sont pesés au moment de l’inoculation et 2 semaines plus tard, et sont
mis en observation durant 3 semaines. Un taux de mortalité excédant 5 % dû à des causes autres que
la vaccination, invalide l’essai. Aucun animal ne doit mourir ou montrer des signes de maladie en
rapport avec le virus vaccin. Le gain moyen de poids des porcs inoculés dans les portées, ne doit pas
être inférieur à 20 % de celui des témoins, durant les 2 semaines post-inoculation.
iii)
Non transmissibilité
Pour confirmer la non transmissibilité, 24 porcs séro-négatifs sont divisés en 4 groupes de taille égale.
Cinq porcs de chaque groupe sont inoculés par voie intramusculaire avec l’équivalent d’une dose de
vaccin. Les porcs restants représentent les témoins contact. Tous les porcs sont éprouvés 6 semaines
5
plus tard avec au moins 10 DIP50 (Dose infectant 50 % des porcs) d’une souche virulente de virus
PPC. Tous les porcs contact doivent être sérologiquement négatifs au moment de l’infection et doivent
succomber dans les 3 semaines. Tous les porcs vaccinés doivent rester bien portants et survivre.
284
Manuel terrestre de l’OIE 2005
Chapitre 2.1.13. — Peste porcine classique (hog cholera)
iv)
Stabilité de l’atténuation
Pour confirmer la stabilité de l’atténuation du virus, 2 porcs sont inoculés par voie intramusculaire avec
une quantité de virus lot-semence équivalent à 100 doses de vaccin, puis sacrifiés 6 à 7 jours
plus tard. Les amygdales de chaque porc sont rassemblées et mises en suspension à 10 % en PBS,
pH 7,2. Cette dernière est utilisée pour inoculer 2 autres porcs par voie intramusculaire avec 2 ml, et
ceux-ci sont sacrifiés à leur tour 6 à 7 jours plus tard. Ce protocole est répété 5 fois. Durant ces
passages, le tissu amygdalien peut être stocké à 4°C, si le stockage est de moins de 24 h, ou à –70°C
pour des périodes plus longues. Simultanément, la présence de l’antigène PPC est vérifiée à chaque
passage par l’IF direct sur des coupes au cryostat des amygdales ou par isolement du virus sur un
substrat approprié. Si la présence du virus PPC ou de son antigène ne peut être démontrée après
certains passages, une seconde série de passage est réalisée pour révéler l’infection, en commençant
avec les derniers 2 porcs des séries précédentes.
Cinq porcs sont inoculés par voie intramusculaire avec le sixième passage du virus lot-semence,
équivalent à une dose de vaccin, ou, si ce passage n’a pas été atteint, le plus haut passage des
2 séries où le virus ou l’antigène viral a été détecté. Cinq porcs supplémentaires sont de façon similaire
inoculés avec une dose de virus lot-semence, équivalent à une dose de vaccin. Tous les porcs sont
pesés au moment de l’inoculation et de nouveau 2 semaines plus tard. Le sang est prélevé
quotidiennement sur anti-coagulant durant la première semaine, et tous les porcs sont mis en
observation pendant 3 semaines. Aucun animal ne doit mourir ou devenir malades en raison du virus
vaccin. Le gain moyen de poids des 2 groupes durant les deux premières semaines, ne doit pas
6
différer significativement (p < 0,05). Une leucopénie (nombre de globules blancs < 7 x 10 /ml) est
tolérée, au plus chez un porc de l’un ou l’autre groupe, pendant 1 jour.
v)
Immunogénicité
Pour démontrer l’efficacité immunogène, 10 porcs reçoivent chacun une quantité de virus équivalent à
une dose de vaccin, et 2 autres porcs sont conservés séparément comme témoins non inoculés. Tous
5
les porcs sont éprouvés 7 jours plus tard avec 10 DIP50 d’une souche virulente de virus PPC. Seuls
les témoins doivent mourir.
Pour tester la durée de l’immunité, 10 porcs reçoivent chacun une dose, et 2 autres sont maintenus
séparément comme témoins. Six mois plus tard, les sérums des porcs vaccinés font l’objet d’une
recherche d’anticorps anti-PPC ; au moins 8 porcs doivent être positifs. Tous les porcs sont alors
5
éprouvés avec au moins10 DIP50 d’une souche virulente PPC et observés durant 3 semaines. Seuls
les témoins doivent mourir.
Pour tester la protection contre le développement du syndrome truie-porteuse, 20 truies gestantes à la
même phase de gestation sont réparties au hasard en 2 groupes. Les truies d’un groupe sont
vaccinées 1 ou 2 fois avec une quantité de virus équivalente à une dose de vaccin, et sont éprouvées
par voie intranasale, 4 semaine après la dernière vaccination, avec une souche de terrain de basse
virulence, en même temps que les truies non vaccinées témoins. Toutes les truies sont sacrifiées
4 semaines après l’épreuve et les fœtus sont examinés pour la présence du virus PPC ou de l’antigène
viral. La vaccination doit réduire de façon significative la transmission transplacentaire du virus.
Sous les conditions de conservation spécifiées par le fabricant pour le produit fini, un volume de virus
équivalent à une dose de vaccin doit maintenir son immunogénicité au moins jusqu’au terme de la
durée de conservation annoncée.
2.
Méthode de fabrication
Chaque lot de vaccin PPC à VVM doit provenir du même lot-semence utilisé pour les essais pilotes. Aussi
chaque lot doit-il être préparé selon le protocole de production et sous les conditions établies pour
l’enregistrement du produit fini. Les propriétés de chaque lot et celles du lot-semence doivent être vérifiées
comme étant uniformes.
3.
Contrôles en cours de fabrication
Le protocole de production dépendra de la souche vaccinale, des modalités de production (animaux ou cultures
de cellules), et des infrastructures disponibles. Les normes pour les vaccins en cultures de cellules peuvent varier
selon le système de production adopté, à savoir, des cultures primaires, des lignées cellulaires, des cultures en
couches monocellulaires ou en suspension.
Manuel terrestre de l’OIE 2005
285
Chapitre 2.1.13. — Peste porcine classique (hog cholera)
4.
Contrôle des lots
Tous les porcs utilisés dans les contrôles de lots doivent être âgés de 6 à 8 semaines et exempts d’anticorps visà-vis des virus PPC et BVD. Ils doivent être de même origine, race, élevage, et répartis au hasard en autant de
groupes que nécessaire.
a)
Identité
Le vaccin doit induire des anticorps neutralisants vis à vis d’une souche virulente de virus PPC.
b)
Stérilité
Les tests de stérilité et d’absence de contamination du matériel biologique peuvent être trouvés dans le
Chapitre I.1.5., « Contrôle de la stérilité ou de l’absence de contamination des matériels biologiques ».
c)
Innocuité
Trois porcs reçoivent chacun, par voie intramusculaire, 10 doses de vaccin reconstitué, en une seule
injection. Les porcs sont observés pendant les 3 semaines suivantes et les températures corporelles sont
relevées quotidiennement pendant la première semaine. Aucun porc ne doit succomber ou présenter des
signes de maladie attribuable au vaccin ; la moyenne quotidienne des températures ne doit jamais dépasser
40,5°C, et les porcs doivent croître normalement.
d)
Pureté
Le lot doit être virologiquement pur. Pour apprécier cela, 3 porcs reçoivent chacun par voie intramusculaire
10 doses de vaccin. Des échantillons de sérums sont prélevés au moment de l’inoculation et, de nouveau,
5 semaines plus tard. Ces sérums sont testés pour la recherche d’anticorps anti-BVD (neutralisation
pendant 1 h à 37°C) et anti-parvovirus porcins (inhibition de l’hémagglutination utilisant 4 unités
hémagglutinantes). L’ensemble des 3 porcs doit rester en bonne santé. Les tests de pureté virologique ne
sont pas nécessaires lorsque les vaccins sont produits sur lapins.
e)
Activité
L’activité est exprimée en nombre de doses protégeant à 50 % (DP50) contenues dans une dose de vaccin.
Une dose de vaccin correspond à au moins 100 DP50.
Deux groupes de 5 porcelets, âgés de 6 à 8 semaines, reçoivent par voie intramusculaire, respectivement,
une dilution en solution saline tamponnée pH 7,2, de 1/40 et de 1/160 du vaccin reconstitué. Les porcs
vaccinés ainsi que 2 témoins, sont éprouvés par voie intramusculaire avec 105 DIP50 d’une souche virulente
de virus PPC, 2 semaines plus tard. Les porcs sont observés durant les 2 semaines suivantes, période
durant laquelle les 2 témoins doivent mourir. A partir des porcs qui survivent sans montrer de signes
cliniques de PPC, le nombre de DP50 contenues dans le vaccin est calculé par les méthodes statistiques.
Ce test d’activité peut être remplacé par un essai d’infectivité, à condition que le fabricant puisse démontrer
qu’il existe une relation distincte et reproductible entre le contenu en virus du vaccin et la protection qu’il
confèrera aux porcs vis-à-vis de l’épreuve virulente.
f)
Stabilité
La période de validité d’un lot de vaccin PPC lyophilisé ne doit pas être inférieure à 1 an.
C2. Vaccins avec marqueur sérologique
En dépit de l’existence de vaccins VVM contre la PPC, inoffensifs et efficaces, leur utilisation a été déconseillée
dans l’UE et dans quelques autres pays indemnes de PPC ou pays voisins, en raison du fait que les anticorps
induits par de tels vaccins ne peuvent être distingués des anticorps induits par le virus sauvage. Un « vaccin avec
marqueur sérologique » ne présente pas cet inconvénient : il peut entraîner une réponse immunitaire protectrice
qui peut être distinguée de la réponse immunitaire induite par une souche de terrain. Un pré-requis pour la
distinction entre animaux naturellement infectés et vaccinés est la disponibilité d’une épreuve sérologique
d’accompagnement qui soit hautement discriminant afin de permettre de déceler les infections résiduelles.
Les exigences minimales pour les vaccins marqués et les épreuves discriminantes d’accompagnement ont été
formulées comme suit (5) :
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Manuel terrestre de l’OIE 2005
Chapitre 2.1.13. — Peste porcine classique (hog cholera)
a)
Vaccin
Le vaccin doit fournir une protection contre toutes les contaminations naturelles. L’efficacité de la
vaccination doit être expérimentalement démontrée par des essais dans lesquels la transmission de virus
sauvage au sein de groupes de porcs vaccinés est étudiée. La protection due à la vaccination doit être
obtenue le plus rapidement possible. Une protection rapide et fiable doit être, si possible, obtenue après une
seule administration. Bien plus, il doit être vérifié que la contamination de truies gestantes vaccinées ne
conduit pas à une infection trans-placentaire et à la naissance de portées congénitalement infectées par le
virus PPC. La durée de l’immunité doit être d’au moins 6 mois.
De nombreux vaccins marqués sont en développement, mais jusqu’à maintenant seulement deux ont été
enregistrés dans l’UE. Ceux sont des vaccins sous-unités qui utilisent la glycoprotéine E2 du virus PPC
comme immunogène et ont subi des évaluations indépendantes (8, 23). La sous-unité E2 est produite sur
cellules d’insecte infectées par un baculovirus génétiquement modifié, contenant le gène E2 du virus PPC.
Ainsi les vaccins ne renferment aucun virus PPC et le baculovirus vecteur est chimiquement inactivé. Les
préparations finies sont adjuvées avec des huiles minérales pour former une émulsion double
(eau/huile/eau) ou simple (eau dans l’huile).
b)
Épreuve discriminante d’accompagnement
L’épreuve sérologique d’accompagnement doit être très sensible car la vaccination va réduire la prévalence
de la maladie. Elle doit être utilisée comme une épreuve d’élevage. Si une forte sensibilité réduit la
spécificité de l’épreuve, déjà compromise par la présence d’anticorps vis-à-vis d’autres pestivirus, de bons
et rapides tests de confirmation doivent être disponibles pour différencier les résultats positifs des fausses
réactions.
Les épreuves d’accompagnement des vaccins sous-unités E2 sont des épreuves ELISAs dans lesquelles la
détection des anticorps dépend de la protéine Erns (11, 12). Une telle épreuve a été récemment
adoptée par la Commission européenne (2) dans le but de déterminer si des élevages, vaccinés avec le
vaccin sous-unité E2, pouvaient avoir été exposés à un virus terrain.
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*
* *
NB : Il existe plusieurs Laboratoires de référence pour la peste porcine classique (se reporter à la liste de la
partie 3 de ce Manuel terrestre ou consulter le site internet de l’OIE pour une liste actualisée : www.oie.int).
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