ÉCOLE NATIONALE VÉTÉRINAIRE D’ALFORT Année 2012 RÉSISTANCE AUX CÉPHALOSPORINES DANS LA FLORE COMMENSALE DIGESTIVE DES RUMINANTS THÈSE Pour le DOCTORAT VÉTÉRINAIRE Présentée et soutenue publiquement devant LA FACULTÉ DE MÉDECINE DE CRÉTEIL le…………… par Glenn PANNAUX Né le 15 juin 1986 à Rueil Malmaison (Hauts-de-Seine) JURY Président : Pr. Professeur à la Faculté de Médecine de CRÉTEIL Membres Directeur : Yves MILLEMANN Maître de conférences à l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort Assesseur : Dominique REMY Maître de conférences à l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort Invité : Laurent POIREL INSERM U 914, CHU Bicêtre REMERCIEMENTS Au Professeur de la faculté de médecine de Créteil, Qui nous a fait l’honneur de présider mon jury de thèse. Hommage respectueux. A Mr Yves MILLEMANN Maître de conférences à l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort, Pour son implication, sa gentillesse et son soutien dans la réalisation de ce travail. Sincères remerciements. A Mr Dominique REMY Maître de conférences à l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort Pour la relecture et la correction de ce travail, Merci A Mr Laurent POIREL Du service Résistances Emergentes aux Antibiotiques du CHU de Bicêtre Pour m’avoir guidé au sein de son service et pour avoir encadré les manipulations réalisées pour ce travail Merci A Sébastien DUCROZ, Interne en Pharmacie au service Résistances Emergentes aux Antibiotiques du CHU de Bicêtre, Pour son aide dans la réalisation des manipulations, Merci A l’unité de reproduction de l’ENVA, Pour m’avoir permis de m’ajouter aux effectifs d’étudiants en visite de suivi de fécondité, Merci TABLE DES MATIERES INTRODUCTION..…………………………………………………………………………....5 PREMIERE PARTIE : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE………………………..…..................6 I. LES CEPHALOSPORINES ET LEUR USAGE ............................................................. 11 A. Présentation de la famille .............................................................................................. 11 1. Généralités et historique ............................................................................................ 11 2. Structure des céphalosporines ................................................................................... 12 3. Propriétés physicochimiques ..................................................................................... 12 4. Propriétés pharmacocinétiques .................................................................................. 13 5. Classification et spectre d’action ............................................................................... 14 6. Mécanisme d’action ................................................................................................... 15 B. Utilisations des céphalosporines ................................................................................... 17 1. Utilisation qualitative des céphalosporines ............................................................... 17 2. Utilisation quantitative des céphalosporines ............................................................. 18 II. LA RESISTANCE AUX CEPHALOSPORINES ............................................................ 25 A. Définition de l’antibiorésistance ................................................................................... 25 1. Définition et mesure de la CMI ................................................................................. 25 2. Définitions de l’antibiorésistance .............................................................................. 26 B. Mise en évidence de l’antibiorésistance ou de son support .......................................... 27 1. Utilisation d’antibiogrammes .................................................................................... 27 2. Techniques génétiques ............................................................................................... 28 C. Mécanismes de résistance aux céphalosporines ............................................................ 29 1. Les mécanismes au niveau cellulaire et enzymatique ............................................... 29 2. Supports génétiques de la résistance aux β-lactamines ............................................. 34 D. Suivi des résistances aux β-lactamines.......................................................................... 35 1. Moyens mis en œuvre pour le suivi ........................................................................... 35 2. Apport des réseaux sur la résistance aux β-lactamines (SANDERS et al., 2010) ..... 38 III. ANTIBIORESISTANCE ET FLORE COMMENSALE DES RUMINANTS ............ 39 A. Composition de la flore commensale digestive des ruminants ..................................... 39 1. Méthode « classique » ............................................................................................... 39 2. Méthode récente ........................................................................................................ 41 B. Intérêt de l’étude de la flore commensale par rapport à la flore pathogène .................. 43 1 1. Effet des traitements antibiotiques sur la flore commensale ..................................... 43 2. Interactions flore commensale/flore pathogène ......................................................... 43 3. Théorie du réservoir................................................................................................... 44 C. Précédents de mise en évidence de résistances aux céphalosporines chez la flore commensale .......................................................................................................................... 46 DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE………………………………………45 I. MATERIEL ET METHODES .......................................................................................... 51 A. Objectifs et cadre de l’étude .......................................................................................... 51 1. Les objectifs de l’étude .............................................................................................. 51 2. Le cadre de l’étude .................................................................................................... 51 B. Constitution de l’échantillon d’étude ............................................................................ 52 1. Elevages d’origine (AMATE et GODARD, 2010) ................................................... 52 2. Vaches prélevées ....................................................................................................... 52 3. Prélèvements .............................................................................................................. 54 C. Manipulations en laboratoire ......................................................................................... 55 1. De l’arrivée au laboratoire à l’ensemencement des géloses ...................................... 55 2. Réalisation des antibiogrammes ................................................................................ 56 3. Lecture des antibiogrammes ...................................................................................... 57 II. RESULTATS .................................................................................................................... 59 A. Mise en évidence de bactéries résistantes aux céphalosporines et identification des mécanismes mis en jeu ......................................................................................................... 59 1. Mise en évidence de bactéries résistantes aux céphalosporines ................................ 59 2. Mécanismes en jeu ..................................................................................................... 59 3. Prévalence des différents mécanismes ...................................................................... 61 B. Types de BLSE et céphalosporinases isolées et bactéries productrices ........................ 61 III. DISCUSSION ............................................................................................................... 63 A. Critique du protocole ..................................................................................................... 63 1. Représentativité de l’échantillon ............................................................................... 63 2. Méthode de prélèvement et analyses au laboratoire .................................................. 64 B. Critique des résultats ..................................................................................................... 64 1. Prévalence des BLSE ................................................................................................. 64 2. Types de BLSE isolées .............................................................................................. 64 C. Intérêt de l’étude dans un contexte général ................................................................... 65 2 1. En médecine vétérinaire ............................................................................................ 65 2. En médecine humaine ................................................................................................ 66 CONCLUSION…………………...…………………………………………………………..56 3 4 TABLE DES ILLUSTRATIONS TABLEAUX Tableau 1 : Les céphalosporines P, N et C : spectre, nature et résistance aux pénicillinases .. 11 Tableau 2 : Spectre d’action des différentes générations de céphalosporines (SALVE, 1995 ; PLUMB, 1999 et LIMBERT et al., 1991) ............................................................................... 15 Tableau 3 : Inventaire des céphalosporines disponibles sur le marché vétérinaire français (GOGNY et al., 2011) .............................................................................................................. 18 Tableau 4 : Les différents indicateurs utilisés dans l’expression des résultats de l’exposition des animaux aux antibiotiques (CHEVANCE et al., 2011) ..................................................... 20 Tableau 5 : Ventes d’antibiotiques en 2009 en Wacti (CHEVANCE et al., 2011) ................. 20 Tableau 6 : Evolution des ventes d’antibiotiques entre 1999 et 2009 en Wacti (CHEVANCE et al., 2011)............................................................................................................................... 21 Tableau 7 : Evolution de l’exposition aux céphalosporines entre 1999 et 2009 (CHEVANCE et al., 2011)............................................................................................................................... 23 Tableau 8 : Classifications des β-lactamases et spectre d’activité des enzymes (BABIC et al., 2006 et BUSH et al., 1995) ...................................................................................................... 31 Tableau 9 : Antibiotiques suivis par le Resapath en filière bovine (GUILLEMOT et al., 2006) .................................................................................................................................................. 36 Tableau 10 : Antibiotiques testés dans le cadre du plan de surveillance en France (GUILLEMOT et al., 2006) ..................................................................................................... 37 Tableau 11 : Composition de la flore fécale des ruminants obtenue avec la méthode « classique » (WILSSENS et BUTTIAUX, 1958) ................................................................... 40 Tableau 12 : Composition de la flore fécale des ruminants obtenue avec la technique bTEFAP (DOWD et al., 2008) ................................................................................................................ 42 Tableau 13 : Inventaire des précédents de mise en évidence de BLSE dans la flore commensale de ruminants ........................................................................................................ 47 Tableau 14 : Date, localisation et nombre de prélèvements ..................................................... 53 Tableau 15 : Numéros de travail des vaches prélevées lors des différentes visites ................. 53 Tableau 16 : Détail des antibiotiques utilisés pour les antibiogrammes (VIDAL en ligne ; Site internet Bio-Rad) ...................................................................................................................... 57 Tableau 17 : Mécanismes de résistance aux béta-lactamines mis en évidence dans les différentes exploitations ........................................................................................................... 60 Tableau 18 : Prévalence des vaches porteuses de bactéries productrice de BLSE, céphalosporinases et pénicillinases dans la population étudiée ............................................... 61 Tableau 19 : Enzymes isolées chez les différentes vaches lors des visites et bactéries productrices .............................................................................................................................. 62 Tableau 20 : Type de BLSE isolées ......................................................................................... 62 Tableau 21 : Comparaison des types de BLSE mises en évidence dans les différentes publications .............................................................................................................................. 65 Tableau 22 : Répartition des types de BLSE identifiées chez l’homme en Europe ................. 66 5 FIGURES Figure 1 : Chronologie de la découverte des céphalosporines (SALVE, 1995) ...................... 11 Figure 2 : Noyau céphème ou acide 7 aminocéphalosporanique (ENRIQUEZ, 2002) ........... 12 Figure 3 : Composition de la paroi d’une bactérie Gram – (VERDET, 2011 )........................ 16 Figure 4 : Mécanisme d’action des β-lactamines (VERDET, 2011 )....................................... 16 Figure 5 : Histogramme du tonnage vendu des céphalosporines en médecine vétérinaire entre 1999 et 2009 (CHEVANCE et al., 2011)................................................................................. 22 Figure 6 : Histogramme présentant l’évolution relative de la quantité de céphalosporines vendue chaque année en médecine vétérinaire (base = année 1999) ...................................... 22 Figure 7 : Comparaison des tonnages de béta-lactamines vendus entre 1999 et 2002 en médecine vétérinaire et humaine (GUILLEMOT et al., 2006) ................................................ 23 Figure 8 : Exemple de détermination de la CMI d’un antibiotique, méthode par dilution ...... 25 Figure 9 : Détermination de la CMI par diffusion (ENRIQUEZ, 2002) .................................. 26 Figure 10 : Classification S, I ou R en fonction des diamètres d’inhibition ou de la CMI mesurés (GUILLEMOT et al., 2006) ....................................................................................... 28 Figure 11 : Phylogénie de quelques BLSE (BRADFORD, 2001) ........................................... 33 Figure 12 : Schéma de la région promotrice du gène ampC chez E. coli (PIZETTE, 2007) ... 34 Figure 13 : Mécanisme d’apparition de résistances au sein de la flore pathogène (ANDREMONT, 2006) ............................................................................................................ 45 Figure 14 : « Hypothèse du réservoir » (SALYERS et al., 2007)............................................ 46 Figure 15 : Localisation des exploitations choisies .................................................................. 52 Figure 16 : Répartition des disques imprégnés d’antibiotiques sur la gélose .......................... 56 Figure 17 : Image en « bouchon de champagne » caractérisant la présence de BLSE (GARREC et al., 2011) ............................................................................................................ 58 Figure 18 : Localisation possible de synergies indiquant la présence de BLSE sur l’antibiogramme ....................................................................................................................... 58 Figure 19 : Représentation graphique des mécanismes de résistance identifiés dans les trois exploitations ............................................................................................................................. 60 PHOTOS Photo 1 : Ecouvillon utilisé pour les prélèvements .................................................................. 54 Photo 2 : Souche ayant poussé sur milieu ESBL ..................................................................... 59 Photo 3 : Mise en évidence d’une bactérie productrice de BLSE ............................................ 59 6 INTRODUCTION Les antibiotiques sont des molécules très largement utilisées, tant en médecine humaine qu’en médecine vétérinaire. Parmi eux, les béta-lactamines (dont les céphalosporines) font partie des trois familles antibiotiques les plus utilisées, particulièrement en médecine bovine. Si leur efficacité thérapeutique est incontestable, leur utilisation n’est pas sans conséquences sur les micro-organismes appartenant à la flore commensale des bovins. Le développement de résistances acquises aux antibiotiques a dans un premier temps été étudié dans la flore pathogène (cible des traitements mis en œuvre) car celles-ci interféraient avec le traitement de maladies (échecs thérapeutiques…). Il a par la suite été étudié dans la flore commensale qui subit aussi, mais de manière involontaire, l’influence de tous les traitements administrés à un individu. Initialement, il était admis que la sélection des bactéries résistantes aux antibiotiques s’exerçait directement ; aujourd’hui, l’hypothèse d’un mécanisme en deux temps (sélection de résistance dans la flore commensale puis transfert de celle-ci à la flore pathogène) est favorisée. Par conséquent, l’étude de la résistance aux antibiotiques dans la flore commensale est aujourd’hui primordiale car elle pourrait finalement être indicatrice du niveau général de résistance à un antibiotique donné. Le développement de résistances dans le monde animal est à mettre en relation avec l’utilisation, aujourd’hui fréquente, d’antibiotiques en élevage. La promiscuité actuelle entre l’homme et l’animal dans la société est à l’origine de nombreux échanges génétiques entre eux (les gènes de résistances peuvent entre autres se transmettre de l’animal à l’homme). Un vrai problème de santé publique est alors soulevé. Les pouvoirs publics sont actuellement dans l’optique de réduire la consommation en antibiotiques, en particulier de dernière génération, de manière rapide et importante. L’objectif de cette thèse est donc la mise en évidence de l’existence de résistance aux céphalosporines dans la flore habituelle du tube digestif des ruminants. Dans une première partie, après avoir fait le point sur les céphalosporines et leurs utilisations, les mécanismes de résistance aux céphalosporines ainsi que les études précédentes sur la flore commensale seront décrits. Dans une deuxième partie, les résultats de l’étude menée dans trois élevages de la région parisienne seront présentés. 7 8 PREMIERE PARTIE : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE 9 10 I. LES CEPHALOSPORINES ET LEUR USAGE A. Présentation de la famille 1. Généralités et historique Les céphalosporines sont des antibiotiques appartenant à la grande famille des bétalactamines, aux côtés des pénicillines et monobactames. La mise en évidence de cette famille a été initiée en 1945 par le professeur BROTZU en Sardaigne (GOOTZ, 1990). Il a mis en évidence l’activité antibactérienne du filtrat d’un champignon dénommé Cephalosporium acremonium, isolé à partir d’eau de mer prélevée à proximité d’une décharge publique. Les recherches suivantes ont permis d’isoler trois antibiotiques produits par ce champignon : les céphalosporines P, N et C. Les molécules utilisables en médecine sont des dérivés semisynthétiques de la céphalosporine C ; la première fut la céfalotine, découverte en 1962. La première céphalosporine utilisée en médecine vétérinaire aujourd’hui fut mise au point en 1967 : la céfalexine. D’autres dérivés ont progressivement été découverts pour arriver à l’éventail actuel de céphalosporines. La chronologie de ces découvertes est illustrée figure 1. Figure 1 : Chronologie de la découverte des céphalosporines (SALVE, 1995) Le spectre, la résistance aux pénicillinases et la nature des céphalosporines P, N et C sont présentés tableau 1. Tableau 1 : Les céphalosporines P, N et C : spectre, nature et résistance aux pénicillinases Nom de la molécule à sa découverte Spectre d'activité déterminé à la découverte Résistance aux pénicillinases Type de la molécule découverte Céphalosporine P Céphalosporine N Céphalosporine C Germes gram + Germes gram + et gram Idem céphalosporine N Non Oui Acide fusidique Pénicilline Céphalosporine 11 La découverte des céphalosporines remonte donc à 1945. Tous les dérivés semisynthétiques actuellement utilisés ont ensuite été découverts pendant la seconde moitié du 20ème siècle. 2. Structure des céphalosporines L’ensemble des céphalosporines ont en commun la présence d’un noyau céphème, illustré figure 2, issu de la condensation d’un cycle β-lactame, commun à toutes les βlactamines, et d’un cycle dihydrothiazine (ENRIQUEZ, 2002 et PRESCOTT, 2006). Figure 2 : Noyau céphème ou acide 7 aminocéphalosporanique (ENRIQUEZ, 2002) La structure chimique exacte de la molécule influence son activité. En effet, sur la figure 2, R1 conditionne les propriétés pharmacocinétiques du principe actif et R2 fait varier le spectre d’action de celui-ci (SALVE, 1995 et PRESCOTT, 2006). La présence de centres d’asymétrie conditionne l’activité optique en solution (ENRIQUEZ, 2002). On peut noter la présence de plusieurs groupements chimiques caractéristiques : un groupement amide jouxtant R2 et un groupement acide carboxylique sur le cycle dihydrothiazine. La structure des céphalosporines est donc caractérisée par la présence du noyau céphème dont les groupements déterminent les propriétés physico-chimiques. 3. Propriétés physicochimiques a) Propriétés physiques : Les céphalosporines se présentent sous la forme d’une poudre cristallisée blanche inodore. Elles présentent une activité optique marquée en solution. Le spectre d’absorption UV présente un maximum à 260 nm et d’autres maxima variables en fonction des chaines latérales. Cette absorption est à l’origine d’une dégradation à la lumière, ce qui influe sur les recommandations de conservation. Les céphalosporines sont globalement hydrosolubles (ENRIQUEZ, 2002 et SALVE, 1995). 12 b) Propriétés chimiques : Le cycle β-lactame est un cycle serré, instable et de fait, réactionnel. Il est plus stable chez les céphalosporines que chez les pénicillines. L’hydrolyse acide des molécules est possible dans l’estomac et conduit à l’obtention de dérivés inactifs, par conséquent, seules les molécules stables en milieu acide peuvent être administrées per os (surtout la céfalexine). L’hydrolyse basique peut quant à elle avoir lieu dans les milieux aqueux, ce qui peut compliquer la mise en solution du principe actif lors de la fabrication du médicament. L’hydrolyse enzymatique enfin, ouvre le cycle et permet la condensation du cycle avec des protéines bactériennes. Ce mécanisme est à la base de l’action antibactérienne sauf dans le cas de condensation avec des β-lactamases qui, elles, inhibent son action (ENRIQUEZ, 2002 et SALVE, 1995). La fonction acide du cycle dihydrothiazine donne des pKa compris entre 3 et 5 en fonction des molécules. La céfalexine possède un groupement NH2, c’est donc un amphotère. La fonction acide est importante en ce qui concerne la galénique ; elle permet en effet la formation de sels de sodium hydrosolubles pour la réalisation de solutions aqueuses ou la formation de sels organiques faiblement dissociables et ionisables pour la réalisation de formes retard. La fonction acide carboxylique permet aussi la formation d’esters qui, étant plus liposolubles, ont une meilleure résorption par voie orale. Ce groupement a enfin son importance en terme de pharmacocinétique : en effet, l’acidité s’ajoute à la faible liposolubilité des céphalosporines pour influencer la distribution des molécules qui, de fait, est presque exclusivement extracellulaire. En effet, seules les formes non ionisées traversent les membranes biologiques, or à un pH sanguin de 7, d’après les pKa exposés précédemment, les céphalosporines sont majoritairement sous forme ionisée (ENRIQUEZ, 2002 et SALVE, 1995). Enfin, la fonction amide en C7 est instable et sensible à l’hydrolyse par des amidases bactériennes. Cette sensibilité diminue avec l’encombrement stérique en C7 (SALVE, 1995). L’activité optique des céphalosporines en solution conditionne leur conservation. Leur cyclicité et les groupements caractéristiques qu’elles possèdent influent sur la galénique des spécialités, leur administration et sur les propriétés pharmacocinétiques de ces substances. 4. Propriétés pharmacocinétiques L’absorption digestive de la plupart des céphalosporines (hors céfalexine) est faible, par conséquent la voie parentérale est souvent préférée. La distribution des céphalosporines dans l’organisme est très large (poumons, os, liquides…), elles peuvent par conséquent être utilisées dans de nombreuses affections. Cependant, elles ne passent pas la barrière méningée. Les céphalosporines ont une action majoritairement extracellulaire du fait des propriétés chimiques citées précédemment. 13 Les céphalosporines subissent peu de biotransformations. Leur élimination se fait majoritairement par les urines et est rapide (ENRIQUEZ, 2002). Ceci peut avoir des conséquences sur les bactéries présentes dans l’environnement : en effet, la pression de sélection sur les bactéries du sol est augmentée du fait de ce largage de céphalosporines peu modifiées dans le milieu extérieur. 5. Classification et spectre d’action La classification la plus couramment utilisée pour les céphalosporines a un fondement chronologique (PLUMB, 1999 et PRESCOTT, 2006). En effet, celles-ci sont habituellement classées en trois générations en fonction de leur année de découverte. Récemment, une quatrième génération a été définie (PRESCOTT, 2006). Sa caractéristique est une meilleure résistance aux béta-lactamases (HARDMAN et LIMBIRD, 1998). Quelques exemples de molécules sont donnés ci-dessous : -Céphalosporines de première génération : Céfalexine, Céfapirine, Céfazoline… découvertes à la fin des années 60, -Céphalosporines de deuxième génération : Céfuroxime, Cefamandole… découvertes au début des années 70, -Céphalosporines de troisième génération : Ceftiofur, Céfotaxime, Céfopérazone… découvertes à la fin des années 70, -Céphalosporines de quatrième génération : Cefquinome découverte plus récemment. En dehors de la chronologie, le spectre d’action des générations successives de céphalosporines est différent (PLUMB, 1999). La première génération a un spectre orienté majoritairement vers les bactéries Gram +, la seconde a un spectre intermédiaire, enfin, les troisième génération et quatrième générations voient leurs spectres s’élargir vers les bactéries Gram – comme en témoigne le tableau 2. 14 Tableau 2 : Spectre d’action des différentes générations de céphalosporines (SALVE, 1995 ; PLUMB, 1999 et LIMBERT et al., 1991) Génération de céphalosporines Spectre d'action Gram + Actives contre les Streptocoques (sauf S. faecalis) Actives contre la plupart des Staphylocoques (sauf Staphylocoques résistants à la Méthicilline ) Gram - Activité modérée contre Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella sp., Pasteurella sp., Proteus mirabilis, Actinobacillus sp. et Haemophilus influenzae Gram + Spectre assez similaire aux céphalosporines génération I Gram - Amélioration de l'activité sur les bactéries sensibles aux céphalosporines génération I Quelques céphalosporines actives contre Citrobacter sp, Proteus indole et Bacteroides fragilis Gram + Spectre assez similaire aux céphalosporines génération I Gram - Très bonne activité sur les bactéries déjà sensibles à la première génération. S'ajoutent au spectre Citrobacter sp., Enterobacter sp., et Proteus indole. Quelques C3G sont modérément actives contre Pseudomonas aeruginosa et Bacteroides fragilis Gram + Très bonne activité sur toutes les bactéries Gram + (y compris assez bonne activité contre les Staphylocoques résistants à la Méthicilline) Gram - Activité assez similaire aux céphalosporines génération 3 Première Deuxième Troisième Quatrième (Cefquinome) Les céphalosporines sont classées en quatre générations chronologiques, leur spectre d’action s’élargissant de la première à la quatrième. 6. Mécanisme d’action Les céphalosporines sont des antibiotiques bactéricides. Ils agissent sur la synthèse de la paroi bactérienne (RIVIERE et PAPICH, 2009 et PLUMB, 1999). 15 a) Synthèse de la paroi bactérienne : Elle se déroule en trois grandes étapes. La première se déroule dans le cytoplasme et consiste en la synthèse de précurseurs de la paroi bactérienne. Lors de la deuxième étape, ces précurseurs traversent la membrane plasmique grâce à un lipide membranaire. Enfin, la dernière étape correspond à la polymérisation de la paroi bactérienne à partir des précurseurs ainsi mis à disposition hors de la cellule. Cette synthèse nécessite l’intervention de nombreuses enzymes (SALVE, 1995). La structure de la paroi bactérienne est représentée figure 3. Figure 3 : Composition de la paroi d’une bactérie Gram – (VERDET, 2011) b) Intervention des céphalosporines dans cette synthèse : Les céphalosporines présentent de nombreuses analogies structurales avec l’un des composants de la paroi bactérienne. Elles rentrent par conséquent en compétition avec ce composant lors des réactions enzymatiques de synthèse de la paroi, entrainant un défaut dans l’élaboration de celle-ci. Les enzymes sur lesquelles se fixent les céphalosporines sont appelées Penicillin Binding Proteins (PBP) ; ce sont les mêmes enzymes que celles mises en jeu dans le mécanisme d’action des pénicillines d’où leur nom (RIVIERE et PAPICH, 2009 et PLUMB, 1999). Elles peuvent varier d’une bactérie à l’autre et leur affinité vis-à-vis des bétalactamines varie également. Tout ceci est illustré figure 4. Figure 4 : Mécanisme d’action des β-lactamines (VERDET, 2011) 16 La fixation des céphalosporines sur ces PBP engendre trois effets différents selon l’enzyme considérée (les trois enzymes présentées ici étant les plus couramment retrouvées): -Fixation sur la protéine PBP1 : cette enzyme est responsable de l’intégrité structurale de la paroi et intervient dans l’élongation de la bactérie. La fixation d’une céphalosporine sur cette protéine affaiblit donc la structure de la paroi de la bactérie qui éclate sous l’effet de la pression osmotique, -Fixation sur la protéine PBP2 : cette enzyme est responsable de la forme de la bactérie. La fixation d’une céphalosporine sur cette protéine entraine l’apparition de bactéries de forme anormale (cellules rondes nommées sphéroplastes) qui sont lysées, -Fixation sur la protéine PBP3 : cette enzyme permet la formation du septum dans les bactéries en division. Son inhibition conduit donc à des bactéries très longues qui seront aussi lysées. Dans le cas des céphalosporines, la fixation sur les protéines PBP 2 et 3 est majoritaire (RIVIERE et PAPICH, 2009). L’affinité variable des céphalosporines vis-à-vis des PBP explique en partie les variations du spectre d’action de celles-ci (PLUMB, 1999). En entrant en compétition avec les substrats de la synthèse de la paroi bactérienne, les céphalosporines se lient aux protéines permettant cette synthèse (PBP) et en perturbent ainsi le déroulement. B. Utilisations des céphalosporines 1. Utilisation qualitative des céphalosporines Il existe de nombreuses spécialités vétérinaires contenant des céphalosporines comme en témoigne le tableau 3. La majorité des céphalosporines disponibles sont sous forme injectable. La lecture des Résumés des Caractéristiques du Produit (RCP) permet de constater que leurs utilisations sont très diverses ; elles peuvent permettre le traitement de métrite (Excenel®), d’infections respiratoires (Excenel®, Rilexine®), d’affections de la mamelle (Cobactan intramammaire®), d’affections urinaires (Rilexine®), du pied (Cobactan®), d’arthrites (Cobactan®), d’affections dermatologiques (Rilexine®)… Il existe des spécialités destinées aux animaux de compagnie, aux équidés ainsi qu’aux animaux de rente (GOGNY et al., 2011). Des nouvelles présentations de céphalosporines arrivent régulièrement sur le marché, en témoigne l’arrivée récente de nombreuses formes génériques de ceftiofur (initialement Excenel®) détaillée tableau 3. 17 Tableau 3 : Inventaire des céphalosporines disponibles sur le marché vétérinaire français (GOGNY et al., 2011) Molécule Nom déposé (laboratoire) Année de l'obtention d'AMM Cefaseptin (Vétoquinol) Cephacare (Axience) Rilexine (Virbac) Rilexine injectable (Virbac) Rilexine observance (Virbac) Rilexine HL (Virbac) Rilexine traitement (Virbac) Therios (Sogeval) Ubrolexin (Boehringer Ingelheim) Cefovet (Mérial) Cefovet HL (Mérial) Mastiplan LC (MSD Santé Animale) Metricure (MSD S A) Pathozone (Pfizer) Convénia (Pfizer) Cefenil (Axience) Ceftiocyl (Vétoquinol) Cevaxel (CEVA) Eficur (HIPRA) Excenel (Pfizer) Excenel RTU (Pfizer) Naxcel (Pfizer) Readycef (Virbac) Cobactan 2,5% (MSD S A) Cobactan 4,5% (MSD S A) Cobactan LA 7,5% (MSD S A) Cobactan LC pommade (MSD S A) Virbactan (Virbac) 2010 2008 1992 1992 2006 1989 1990 1997 2008 1997 1997 2007 1996 1985 2006 2009 2010 2008 2008 1991 1997 2005 2010 1995 2008 2006 1998 2004 Génération Céfalexine I Céfazoline I Céfapirine I Céfopérazone Céfovécine III III Ceftiofur III Cefquinome IV 2. Voie d'administration Espèce de destination Orale Orale Parentérale Parentérale Orale Intramammaire Intramammaire Orale Intramammaire Intramammaire Intramammaire Intramammaire Intra-utérin Intramammaire Parentérale Parentérale Parentérale Parentérale Parentérale Parentérale Parentérale Parentérale Parentérale Parentérale Parentérale Parentérale Intramammaire Intramammaire Chien/Chats Chien/Chats Chien/Chats Chien/Chats Chien/Chats Bovins Bovins Chien/Chats Bovins Bovins Bovins Bovins Bovins Bovins Chien/Chats Bovins/Porcins Bovins/Porcins Bovins/Porcins Bovins/Porcins Chevaux/Bovins/Porcins Bovins/Porcins Bovins/Porcins Bovins/Porcins Bovins/Porcins Chevaux Bovins Bovins Bovins Utilisation quantitative des céphalosporines a) Méthode de suivi de l’utilisation des antibiotiques -Différentes méthodes possibles : Des suivis de l’utilisation des antibiotiques sont réalisés annuellement depuis 1999 par l’Agence Nationale du Médicament Vétérinaire (ANMV) en partenariat avec l’Agence Nationale de Sécurité Sanitaire de l’Alimentation, de l’Environnement et du Travail (ANSES). Ces suivis peuvent être réalisés à différentes étapes de l’utilisation du médicament : -lors de sa fabrication, les informations étant alors récupérées auprès des laboratoires -lors de sa prescription grâce aux ordonnances (et surtout aux doubles de celles-ci) rédigées par les vétérinaires praticiens -lors de sa délivrance au comptoir ou dans la voiture du praticien, la facturation permettant de retrouver les quantités délivrées -lors de son administration en clinique grâce aux statistiques de la clinique ou dans les élevages grâce aux registres d’élevage 18 Dans tous les cas, un certain nombre de biais existent et il est assez difficile de compiler des données exactes. Par exemple, il existe un décalage entre la délivrance et l’utilisation : un flacon délivré ne sera pas forcément utilisé en entier (en tout cas pas immédiatement) ; de même, certaines spécialités étant destinées à plusieurs espèces, un flacon délivré n’est pas imputable à une espèce en particulier. Néanmoins, il semble que le recueil d’information au moment de la fabrication soit plus fiable et c’est la méthode qui est privilégiée par l’ANMV et l’ANSES (GUILLEMOT et al., 2006 et CHEVANCE et al., 2011). -Description de la méthode utilisée par l’ANSES et l’ANMV : Des questionnaires sont envoyés aux titulaires d’AMM de médicaments contenant des antibiotiques. Dans ces questionnaires, il leur est demandé de préciser le nombre d’unités vendues pour chaque présentation du médicament ainsi qu’une estimation de la répartition par espèce de destination. Ces données permettront de calculer la quantité d’antibiotiques vendus en unité pondérale, ce qui est plus classiquement utilisé. L’évaluation quantitative de l’exposition à un antibiotique d’une population nécessite également de connaitre la population en question. Pour ce qui nous intéresse, il est nécessaire de connaitre la population « animaux de rente » et la population « animaux de compagnie » (GUILLEMOT et al., 2006 et CHEVANCE et al., 2011). -Expression des résultats : Les résultats peuvent être donnés en utilisant quatre indicateurs différents, chacun ayant ses avantages et ses inconvénients (CHEVANCE et al., 2011) : -Wacti (Weight of ACTive Ingredient) : quantité pondérale de matière active autrement dit le tonnage vendu, -Wacti/WAP (Weight of ACTive Ingredient/ Weight of Animal Population) : quantité pondérale de matière active par rapport à la masse de la population animale, -WAT (Weight of Animal Treated) : poids vif traité, calculé en prenant en compte la durée du traitement et la dose administrée, -ALEA (Animal Level of Exposure to Antibimicrobial) : indicateur du niveau d’exposition. Le tableau 4 donne les avantages et inconvénients de chaque mode d’expression des résultats. 19 Tableau 4 : Les différents indicateurs utilisés dans l’expression des résultats de l’exposition des animaux aux antibiotiques (CHEVANCE et al., 2011) Il existe enfin un dernier indicateur utilisé à l’étranger depuis récemment: les Animal Defined Daily Doses (ADDD). Cet indicateur importé de la médecine humaine désigne la dose moyenne présumée par jour utilisée dans l’indication principale chez un adulte. Il n’est pas encore très utilisé en médecine vétérinaire (GRAVE et al., 2006) car difficile à standardiser donc à utiliser. b) Suivi de l’utilisation des céphalosporines -Etat actuel des ventes : Le tableau 5 indique les ventes d’antibiotiques en France en médecine vétérinaire, exprimées en Wacti en 2009. Tableau 5 : Ventes d’antibiotiques en 2009 en Wacti (CHEVANCE et al., 2011) 20 Il est remarquable que l’ensemble des céphalosporines ne représentent que 0,79% des ventes totales d’antibiotiques en 2009, loin derrière les tétracyclines, sulfamides et pénicillines. Le tonnage vendu atteint tout de même 8,5 tonnes. Les céphalosporines des dernières générations, qui sont majoritairement utilisées pour le traitement des animaux de rente, représentent un tonnage moins important que celles des deux premières générations, qui sont utilisées, elles, chez les animaux de compagnie. Il est également intéressant de noter que le tonnage de céphalosporines vendu en médecine vétérinaire est nettement inférieur à celui vendu en médecine humaine : en 2002, 7,21 tonnes de céphalosporines ont été écoulées en médecine vétérinaire et 13,95 tonnes en médecine humaine (GUILLEMOT et al., 2006). -Evolution des ventes sur les dix dernières années : Le tableau 6 et la figure 5 montre l’évolution des ventes de céphalosporines sur les dix dernières années en tonnage. Tableau 6 : Evolution des ventes d’antibiotiques entre 1999 et 2009 en Wacti (CHEVANCE et al., 2011) 21 Figure 5 : Histogramme du tonnage vendu des céphalosporines en médecine vétérinaire entre 1999 et 2009 (CHEVANCE et al., 2011) 8 7 6 5 Tonnage vendus 4 Céphalosporines 1 et 2 G 3 Céphalosporines 3 et 4 G 2 1 0 1999 2001 2003 2005 2007 2009 Année L’analyse de ce tableau et de ce graphique montre que la consommation de céphalosporines a augmenté modérément en tonnage en 10 ans, même si la tendance est à la diminution ces dernières années. En proportion, l’augmentation de l’usage des céphalosporines de troisième et quatrième génération est bien plus importante témoignant de l’intérêt croissant pour ces nouvelles molécules comme en témoigne la figure 6. Figure 6 : Histogramme présentant l’évolution relative de la quantité de céphalosporines vendue chaque année en médecine vétérinaire (base = année 1999) 3 2,5 Rapport 2 tonnage de l'année / 1,5 Tonnage de 1 1999 0,5 Céphalosporines 1 et 2 G Céphalosporines 3 et 4 G 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 0 Année Le tableau 7 présente l’évolution de l’exposition aux céphalosporines entre 1999 et 2009. 22 Tableau 7 : Evolution de l’exposition aux céphalosporines entre 1999 et 2009 (CHEVANCE et al., 2011) Il est intéressant de constater qu’en ALEA (indice reflétant le mieux l’exposition aux antibiotiques), l’exposition des animaux aux céphalosporines de première et deuxième génération entre 1999 et 2009 a augmenté de près de 50% et l’exposition aux troisième et quatrième générations de près de 250%. Ceci témoigne de l’importance des céphalosporines dans la médecine vétérinaire aujourd’hui et surtout de l’intérêt croissant qui leur a été porté ces dernières années. Cette exposition croissante entraine de fait une pression de sélection croissante qui peut logiquement avoir un effet sur la flore bactérienne des animaux. -Comparaison avec la médecine humaine : La comparaison des tonnages vendus en médecine humaine et en médecine vétérinaire des béta-lactamines (comprenant, entre autre, les céphalosporines) entre 1999 et 2002 est intéressante. Celle-ci est illustrée figure 7. Figure 7 : Comparaison des tonnages de béta-lactamines vendus entre 1999 et 2002 en médecine vétérinaire et humaine (GUILLEMOT et al., 2006) 500 450 400 350 300 Tonnage vendu 250 200 150 100 50 0 Médecine humaine, Pénicillines Médecine vétérinaire, Pénicillines 1999 2000 2001 Année 23 2002 Médecine humaine, Autres béta lactamines (dont céphalosporines) Médecine vétérinaire, Autres béta lactamines (=céphalosporines) L’observation de cette figure nous montre que le tonnage de béta-lactamines (dont les céphalosporines) utilisé en médecine humaine est largement supérieur à celui de la médecine vétérinaire. Ceci est encore plus marqué si l’on compare les ventes d’antibiotiques ramenées au poids total traité : la consommation en médecine vétérinaire de céphalosporines est de 0,42 mg/kg de poids vif alors qu’elle est de 21,15 mg/kg de poids vif en médecine humaine en 2002. En mg/kg, la consommation de céphalosporines est inférieure chez les animaux de rente par rapport aux animaux de compagnie (GUILLEMOT et al., 2006). Ceci nous indique l’importance de l’utilisation de cette classe d’antibiotique en médecine humaine et nous suggère, de fait, le problème que peut représenter l’émergence de résistance à ces antibiotiques, tant chez les hommes que chez les animaux. En effet, l’homme et l’animal font face à l’émergence de phénomènes identiques qui posent des problèmes de santé publique qui sont étudiés et suivis par l’Organisation Mondiale de la Santé Animal (OIE). -Evolution possible des ventes à l’avenir : Comme nous l’avons vu précédemment, de nombreux médicaments génériques contenant des céphalosporines (notamment de 3ème génération) ont été mis sur le marché récemment. En médecine humaine, la commercialisation de génériques de ciprofloxacine a entrainé l’augmentation de l’utilisation de cette molécule (JENSEN et al., 2010). L’augmentation de cette utilisation est associée à une augmentation de la résistance à la ciprofloxacine chez des E. coli d’origine urinaire. Ceci peut amener à craindre, de fait, que l’apparition de génériques de ceftiofur en médecine vétérinaire entraine une augmentation des ventes (notamment due à la diminution des prix) et donc une augmentation des résistances à cette molécule chez les bactéries pathogènes et commensales des animaux traités. Un phénomène similaire a déjà été observé lors de l’arrivée de génériques de fluoroquinolones chez les volailles et les porcs, entrainant une augmentation significative de leur consommation, respectivement +45% et +100% en 10 ans (CHEVANCE et al., 2009 et SANDERS et al., 2010). Cependant, les pouvoirs publics sont actuellement dans une optique de diminution de la consommation d’antibiotiques rapide et importante et pourraient donc prendre des mesures contraignantes concernant l’utilisation des antibiotiques, en particulier de dernière génération (céphalosporines de 3ème et 4ème génération comprises). 24 II. LA RESISTANCE AUX CEPHALOSPORINES A. Définition de l’antibiorésistance 1. Définition et mesure de la CMI La définition de la notion d’antibiorésistance nécessite au préalable d’expliquer ce qu’est la Concentration Minimale Inhibitrice. Afin de déterminer la sensibilité d’une espèce bactérienne à un antibiotique, il est classique de mettre l’espèce bactérienne considérée en présence d’un gradient de concentration de l’antibiotique en milieu de culture. Aux plus faibles concentrations, la croissance bactérienne est quasi normale alors qu’elle est progressivement inhibée par des concentrations plus élevées. La Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) est alors la première concentration inhibant visiblement la croissance bactérienne (ENRIQUEZ, 2002). Ceci est illustré figure 8. Figure 8 : Exemple de détermination de la CMI d’un antibiotique, méthode par dilution Plus le tube est grisé, plus la croissance bactérienne y est importante, lorsque le tube est blanc, il n’y a pas de croissance bactérienne Deux méthodes peuvent être utilisées pour déterminer cette CMI (ENRIQUEZ, 2002 et WALKER, 2006) : -par dilution : c’est celle qui est illustrée figure 8. Une série de dilutions d’un antibiotique donné est ensemencée avec une quantité connue de la bactérie à étudier. Après incubation, le premier tube dans lequel aucune croissance bactérienne n’est visible indique la CMI. -par diffusion : cette méthode est réalisée sur un milieu à 2 dimensions (gélose). Un disque imprégné d’une concentration connue en antibiotique est déposé sur le dit milieu préalablement ensemencé. Il existe de fait un gradient de concentration en antibiotique autour du disque car l’antibiotique a diffusé dans la gélose. La croissance bactérienne ne se fait donc qu’au-delà d’un certain rayon autour du disque. C’est au niveau de la limite ainsi dessinée que la concentration de l’antibiotique correspond à la CMI. Cette méthode est illustrée figure 9. 25 Figure 9 : Détermination de la CMI par diffusion (ENRIQUEZ, 2002) Il existe une dernière méthode pour déterminer la CMI basée sur la diffusion de l’antibiotique sur une bandelette Etest graduée en concentration. Celle-ci permet de lire immédiatement la CMI mais est peu utilisée en médecine vétérinaire du fait de son prix. Elle ne sera donc pas détaillée ici (WALKER, 2006). 2. Définitions de l’antibiorésistance Il existe plusieurs définitions de l’antibiorésistance en fonction du domaine dans lequel on l’étudie (GUILLEMOT et al., 2006): -pour le clinicien : une souche bactérienne est dite résistante à un antibiotique si le traitement mis en place échoue, -en pharmacologie : une souche est dite résistante lorsque les concentrations en antibiotique que l’on peut atteindre au niveau du site d’action sont inférieures à la CMI, -en microbiologie : une souche est dite résistante si elle dispose d’un mécanisme de résistance augmentant la CMI, -pour l’épidémiologiste : une souche est résistante si sa CMI est significativement différente de celle de la population habituelle. Une définition générale et synthétique de l’antibiorésistance a été donné par Chabbert : « Une souche est dite résistante à un antibiotique lorsqu’une modification de son capital génétique lui permet de tolérer des concentrations d’antibiotique nettement plus élevées que celles qui inhibent la croissance in vitro de la majorité des autres souches de la même espèce dites sensibles » (GUERIN-FAUBLEE, 2010). Il existe des résistances dites à « haut niveau » si l’augmentation relative de la CMI chez la souche considérée est importante, et des résistances dites à « bas niveau », si l’augmentation relative de la CMI est faible (GUERIN-FAUBLEE, 2010). 26 Enfin, il convient de bien faire attention au sens du terme « antibiorésistance » utilisé. En effet, il peut désigner le phénomène exposé précédemment dans le sens résistance acquise aux antibiotiques par développement d’un certain nombre de mécanismes non existants dans la population bactérienne « normale » considérée. C’est ce sens là qui sera utilisé dans toute la thèse. Il peut également désigner une résistance naturelle d’une certaine bactérie à un antibiotique, intrinsèque, commune à toutes les souches bactériennes de cette espèce. C’est l’existence de ces résistances naturelles qui permettent de définir le spectre habituel d’un antibiotique. Enfin, il existe également des résistances adaptatives c'est-à-dire une augmentation de la CMI après un premier contact entre l’antibiotique et la bactérie ; elles ne sont pas liées à une modification génétique de la souche bactérienne et disparaissent après soustraction de l’antibiotique du milieu (GUILLEMOT et al., 2006 et GUERIN-FAUBLEE, 2010). B. Mise en évidence de l’antibiorésistance ou de son support 1. Utilisation d’antibiogrammes Il convient, pour déterminer si une souche bactérienne est résistante ou non à un antibiotique, de déterminer sa CMI. Pour cela, nous avons vu précédemment qu’il existait deux méthodes : par dilution et par diffusion. La méthode par diffusion sur gélose est plus utilisée car elle permet de déterminer la CMI d’une souche bactérienne vis-à-vis de plusieurs antibiotiques à la fois sur une seule boite. C’est la mesure des diamètres d’inhibition qui permet d’avoir accès aux CMI de la souche bactérienne. L’obtention des CMI permet de classer la souche bactérienne dans l’une des trois catégories suivantes (ENRIQUEZ, 2002 et GUILLEMOT et al., 2006) : -S : souche Sensible à l’antibiotique testé, -R : souche Résistante à l’antibiotique testé, -I : souche de résistance Intermédiaire à l’antibiotique testé. La classification d’une souche bactérienne dans l’une de ces catégories est obtenue en comparant le diamètre d’inhibition à des diamètres critiques (inférieur ou supérieur), propres à chaque antibiotique. Les CMI obtenues peuvent également être comparées à des concentrations critiques propres à chaque antibiotique dans cette même optique. La démarche est précisée figure 10 (GUILLEMOT et al., 2006 et RIVIERE et PAPICH, 2009). Ces diamètres critiques ou concentrations critiques sont données par des organisations spécialisées (Clinical and Laboratory Standard Institute aux Etats-Unis, Comité de l’Antibiogramme – Société Française de Microbiologie en France qui possède un groupe de travail exclusivement vétérinaire) pour chaque duo bactérie/antibiotique (RIVIERE et PAPICH, 2009). 27 Figure 10 : Classification S, I ou R en fonction des diamètres d’inhibition ou de la CMI mesurés (GUILLEMOT et al., 2006) Pour que les antibiogrammes soient interprétables, il convient de respecter un certain nombre de précautions lors de la réalisation de ceux-ci précisées par le Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CA-SFM). Il existe un comité spécifique vétérinaire. Les antibiogrammes permettent de détecter à la fois les résistances naturelles, dépendant du spectre d’action d’un antibiotique et les résistances acquises. La comparaison simple du profil ainsi obtenu pour la souche bactérienne étudiée avec le profil habituel des autres souches de la même espèce permet de déterminer si la résistance est naturelle (classique et retrouvée chez toutes les souches) ou si elle est acquise. 2. Techniques génétiques La résistance d’une souche bactérienne aux antibiotiques peut être due soit à l’absence de cible de l’antibiotique, soit à la présence de gène de résistance, soit à la modification de gène intervenant dans la perméabilité ou les transports membranaires. Par conséquent, quand ces gènes/modifications génétiques sont connus pour une espèce bactérienne donnée, il est possible de les rechercher chez une souche étudiée grâce à des outils moléculaires. L’outil moléculaire le plus utilisé est l’amplification en chaine par la polymérase ou Polymerase Chain Reaction (PCR). L’intérêt de la PCR est double : elle permet la mise en évidence chez la souche étudiée d’un gène de résistance connu, mais elle peut également permettre à l’échelle d’une population l’estimation de la prévalence de ce gène (GUILLEMOT et al., 2006). 28 C. Mécanismes de résistance aux céphalosporines 1. Les mécanismes au niveau cellulaire et enzymatique Il existe trois grands mécanismes de résistances aux céphalosporines (et même plus généralement, aux β-lactamines) détaillés ci-après. a) Modification des PBP : La modification des Penicillin Binding Proteins, cible des céphalosporines, peut interférer avec l’efficacité de ces antibiotiques. Deux mécanismes sont possibles : soit des mutations permettent l’apparition de PBP de poids moléculaire plus élevé que celles observées classiquement ce qui diminue l’affinité de l’antibiotique pour celles-ci, soit des recombinaisons homologues entre bactéries d’espèces différentes permettent la formation de nouvelles PBP de moindre affinité pour les β-lactamines (RIVIERE et PAPICH 2009 ; PRESCOTT, 2006 et HARDMAN et LIMBIRD, 1998). Ces mécanismes connus en médecine humaine n’ont pas encore été mis en évidence en médecine vétérinaire (HARDMAN et LIMBIRD 1998). b) Incapacité de pénétrer jusqu’au site d’action : Des modifications augmentant l’efflux des céphalosporines permettent d’en empêcher l’activité en diminuant leur concentration au site d’action. De plus, des modifications de la perméabilité membranaire des bactéries peuvent empêcher la pénétration des céphalosporines au niveau de ce site (RIVIERE et PAPICH, 2009 et PRESCOTT, 2006). Un exemple est celui du très faible nombre de porines chez Pseudomonas aeruginosa qui empêche de fait la pénétration des céphalosporines (HARDMAN et LIMBIRD, 1998). c) Production de β-lactamases : Les β-lactamases sont des enzymes synthétisées par un certain nombre de bactéries, responsables de la lyse des β-lactamines. Leur production correspond de loin au mécanisme de résistance aux céphalosporines le plus fréquent chez les bactéries Gram -. Elles agissent notamment sur le cycle serré β-lactame et le coupent. Ces β-lactamases sont très nombreuses : il en existe près de 400 types (LI et al., 2007). Majoritairement produites par les bactéries gram -, celles-ci sont relâchées dans l’espace péri plasmique ce qui leur garantit une bonne activité avant que l’antibiotique n’atteigne son site d’action (HARDMAN et LIMBIRD, 1998). Il existe plusieurs classifications des β-lactamases qui sont détaillées tableau 8 : -classification de Bush, Jacob et Medeiros (PIZETTE, 2007) : elle est fonctionnelle, axée sur les substrats des enzymes et leur sensibilité aux inhibiteurs. Elle répartit les β-lactamases en quatre groupes (1, 2, 3 ou 4), 29 -classification d’Ambler (RIVIERE et PAPICH, 2009 et LI et al., 2007): plus couramment utilisée dans les publications, elle est basée sur la structure primaire des β-lactamases et les classe en quatre catégories (A, B, C ou D). Les β-lactamases de classe A, C et D contiennent un résidu sérine tandis que celles de classe B sont appelées métallo-bétalactamases (BABIC et al., 2006). Les deux classifications et les spectres des enzymes étudiées sont présentés tableau 8. 30 Tableau 8 : Classifications des β-lactamases et spectre d’activité des enzymes (BABIC et al, 2006 et BUSH et al., 1995) Classification d'Ambler Classe Classe A Classe B Classe C Classe D Type d'enzyme Pénicillinases Métallo-β-lactamases Céphalosporinases Oxacillinases Exemples d'enzymes TEMs, SHV, PC1, CTX-Ms, SME-1, KPC-1 IMP-1, VIM-1, Ccr A AmpCs, CMY-2, ACT-1 OXA-1 Classification de Bush-Jacoby-Medeiros Groupe Type d'enzymes Exemples d'enzymes Groupe 1 Céphalosporinases insensibles à l'acide clavulanique AmpCs, CMY-2, ACT-1, MIR-1 Spectre d'activité des enzymes .Bonne activité sur les C1G, variable sur les C2G, mauvaise sur les C3G .Activité médiocre sur les pénicillines .Pas d'activité sur les autres antibiotiques Pénicillinases, Céphalosporinases et β-lactamases à spectre étendu (BLSE) sensibles à l'acide clavulanique Groupe 2 2a Pénicillinases PC 1 (de S. aureus ) 2b Pénicillinases spectre large TEM-1, SHV-1, TEM-2 2be BLSE SHV-2, TEM-10, CTX-Ms 2br Pénicillinases résistantes aux inhibiteurs TEMs, IRTs, TEM-30, TEM-31 2c Hydrolysant la carbénicilline PSE-1 2d Hydrolysant l'oxacilline OXA-10, OXA-1 2f Carbapénèmases KPC-1, SME-1 Groupe 3 Carbapénèmases hydrolysant l'imipénème et résistante à l'Ac. Clav. IMP-1, VIM-1, Ccr A, NDM-1 Groupe 4 Enzymes diverses Légende : Nom de l'enzyme Signification du sigle ACT-1 Ccr-A CMY CTX-M FEC IMP IRT KPC MIR OXA PC-1 PSE SHV-1 SME TEM VIM AmpC Type 1 Carbapenem cephamycin resistance classe A CephaMYcinase CefoTaXiMase Fecal E scherichia c oli Résistance acquise à l'IMiPénème Inhibitor Resistant TEM Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase MIRian Hospital (USA) OXAcillinase Souche PC-1 de S aureus Pseudomonas Specific Enzyme Sulfi-Hydroxile Variable Serratia MarcEscens TEMoneria (nom d'un malade) Verona IMipénèmase 31 .Bonne activité sur les Pénicillines G et A, mauvaise sur les G .Peu d'activité sur les autres antibiotiques .Bonne activité sur les Penicillines G et A .Activité correcte sur les céphalosporines des 2 premières générations .Peu d'activité sur les autres antibiotiques .Bonne activité sur les Pénicillines G et A .Bonne activité sur les céphalosporines toutes générations .Activité variable sur les monobactames .Bonne activité sur les Pénicillines G et A .Peu d'activité sur les autres antibiotiques .Bonne activité des les Pénicillines G, A et carboxypénicillines .Peu d'activité sur les autres antibiotiques .Bonne activité sur toutes les Pénicillines .Bonne activité sur les C1G .Peu d'activité sur les autres antibiotiques . Bonne activité sur les Pénicillines G et A .Bonne activité sur les carbapénèmes et monobactames .Bonne activité sur les Pénicillines G, A, carboxypénicillines et carbapénèmes .Activité variable sur les Pénicillines M et céphalosporines .Variés Béta-lactamases type sérine : classe A, C et D Parmi ces enzymes, il est possible de distinguer des céphalosporinases, des pénicillinases et des enzymes au « spectre » plus large (LI et al., 2007 et BABIC et al., 2006). -Classe A : c’est une classe essentiellement constituée de pénicillinases (peu efficaces contre les céphalosporines donc non développées ici) et de β lactamases à spectre étendu (BLSE) qui sont traitées dans les paragraphes suivants -Classe C : ce sont des céphalosporinases, la plus importante étant la céphalosporinase de type AmpC -Classe D : ce sont des oxacillinases (non développées ici) Métallo-β-lactamases : classe B Ces enzymes nécessitent la présence d’un ou deux ions zinc pour leur activité et dégradent toutes les classes de β-lactamines. Elles sont insensibles aux inhibiteurs de β-lactamases mais de par la particularité de leur fonctionnement, elles sont inhibées par des agents chélateurs type EDTA. Elles sont classées en 3 classes (B1, B2 et B3) aux spectres différents, B1 et B3 ayant un spectre large et B2 étant exclusivement constituée de carbapénèmases (BEBRONE, 2007). β-lactamases à spectre étendu (BLSE) Ces enzymes ont un spectre élargi qui comprend à la fois des pénicillines et des céphalosporines (cf. tableau 8). Elles sont caractérisées par une sensibilité aux inhibiteurs de β-lactamases, en premier lieu, l’acide clavulanique (PIZETTE, 2007). Elles sont beaucoup étudiées aujourd’hui car leur importance quantitative et qualitative évolue rapidement. Il en existe plusieurs types dont la phylogénie est illustrée figure 11. 32 Figure 11 : Phylogénie de quelques BLSE (BRADFORD, 2001) Les principaux types de BLSE sont les TEM, SHV, OXA et les CTX-M (NEUWIRTH et al., 2010 ; PITOUT et LAUPLAND, 2008 et VIDON et BOURDIN, 2005). Il en existe d’autres types : PER (Pseudomonas Extended-spectrum Resistance), VEB (Vietnam Extended-spectrum Beta-lactamase) et GES (Guyana Extended Spectrum) principalement (PIZETTE, 2007). La première vraie prise de conscience du problème de santé publique que peuvent représenter ces enzymes date de 1985, lorsque la première épidémie à entérobactérie productrices de BLSE (TEM et SHV chez K. pneumoniae) a vu le jour (VIDON et BOURDIN, 2005). Les BLSE du type CTX-M, qui sont particulièrement étudiées actuellement, ont été mises en évidence plus tardivement en 1989, en Allemagne, lorsque qu’une CTX-M1 a été trouvée chez une E. coli. Progressivement, d’autres CTX-M ont été découvertes dans différents pays chez des bactéries diverses (S. typhimurium, K. pneumoniae, P. mirabilis…) pour arriver à l’éventail actuellement connu. Enfin, les PER, VEB et GES ont été découvertes courant des années 90. Il existe aujourd’hui plus de 200 BLSE connues (PHILIPON et ARLET, 2006). 33 2. Supports génétiques de la résistance aux β-lactamines Les gènes codant les β-lactamases peuvent être situés soit sur les chromosomes (apparition au cours de mutations génétiques) soit sur des éléments génétiques plus mobiles comme des plasmides (LI et al., 2007)). a) Support des céphalosporinases Il y a deux origines possibles à la présence de céphalosporinases de type AmpC dans le génome des bactéries (PIZETTE, 2007, LI et al., 2007): -origine plasmidique : le gène ampC, naturellement présent sur les chromosomes de nombreuses bactéries (entérobactéries), peut être intégré à des génomes de plasmides. Les dits plasmides peuvent donc à leur tour permettre la synthèse de céphalosporinases type AmpC. Les céphalosporinases plasmidiques peuvent être exprimées à haut niveau si les copies du plasmide sont nombreuses dans la cellule ou si le gène ampC plasmidique est associé à un promoteur fort, -origine chromosomique et hyperproduction : le gène ampC est naturellement présent chez un certain nombre de bactéries mais son expression est limitée par la présence de promoteurs faibles ou d’atténuateurs de transcription. C’est le cas d’E. coli comme on peut le voir figure 12. Figure 12 : Schéma de la région promotrice du gène ampC chez E. coli (PIZETTE, 2007) Un certain nombre d’événements peuvent provoquer une hyper expression de ce gène. Des duplications du gène peuvent avoir lieu dans le génome (EDLUND et NORMARK, 1981) ou des mutations sur le promoteur ou la région de l’atténuateur du gène ampC induisant ainsi une hyperproduction de la céphalosporinase. Des mutations peuvent également avoir lieu dans la région codante et être à l’origine d’une modification de la protéine, en augmentant ainsi l’activité (PIZETTE, 2007). 34 b) Support des métallo-β-lactamases Quelques métallo-β-lactamases de classe B1 sont codées par des gènes situés sur des chromosomes mais la majorité des enzymes de cette classe sont codées par des gènes plasmidiques. Certain de ces gènes sont situés sur des intégrons. Les enzymes de classe B2 et B3 sont en majorité codées par des gènes chromosomiques (BEBRONE, 2007). c) Support des β-lactamases à spectre étendu Parmi les BLSE, les BLSE types TEM et SHV dérivent de pénicillinases à large spectre tandis que les CTX-M dérivent de β-lactamases chromosomiques naturelles transmises grâce à des transpositions (PIZETTE, 2007). Les gènes codant les β-lactamases sont notés bla TEM, bla SHV et bla CTX-M (MADEC et MEUNIER, 2006). Ils sont majoritairement portés par des plasmides (LI et al., 2007) qui peuvent se transférer d’une bactérie à une autre (GUERIN-FAUBLEE, 2010). D. Suivi des résistances aux β-lactamines 1. Moyens mis en œuvre pour le suivi a) Objectifs du suivi (GUILLEMOT et al., 2006) Il existe en France un certain nombre de systèmes de surveillance des résistances chez les bactéries d’origine animale ou d’origine humaine. Ces systèmes ont plusieurs objectifs : -récolter des données concernant la prévalence de résistances dans une population animale/humaine ou concernant le taux de résistance chez différentes espèces bactérienne pour faire état de la situation actuelle, -surveiller les évolutions de ces résistances dans le temps en comparant les données obtenues chaque année (augmentation, diminution ou stabilisation de la prévalence d’une résistance), -surveiller l’émergence de nouvelles résistances pouvant constituer un danger pour la santé humaine/animale. Les données peuvent être récoltées à plusieurs niveaux (pays, région, élevage…), chez des animaux malades, dans le cadre du diagnostic, ou chez des animaux sains. Pour les humains, les données sont généralement collectées en milieu hospitalier. La récolte des informations chez les animaux est intéressante également pour la médecine humaine dans le but de comprendre les interactions existant entre l’Homme et l’animal pour ce qui est de l’apparition des antibiorésistances. b) Les réseaux de surveillance (GUILLEMOT et al., 2006) En France, trois programmes de surveillance des résistances aux antibiotiques chez les bactéries d’origine animale existent : 35 -le réseau « Resapath » (réseau de surveillance de l’antibiorésistance des bactéries pathogènes pour l’animal) : C’est un réseau de laboratoires animé par l’ANSES qui collecte des données sur les résistances chez les bactéries isolées à partir d’animaux malades. Il fait partie de l’ONERBA (Observatoire National de l’Epidémiologie de la Résistance Bactérienne aux Antibiotiques) qui est un organisme fédérant les réseaux de surveillance aux antibiotiques chez l’homme et chez l’animal. Les divers laboratoires d’analyses vétérinaires réalisent des antibiogrammes à partir de prélèvements réalisés sur des animaux malades sur le terrain. La réalisation de ces antibiogrammes se fait selon un protocole bien précis, contrôlé par l’ANSES. Ils transmettent ensuite leurs résultats à l’un des sites de l’ANSES qui centralise ensuite ces résultats. L’inconvénient de ce réseau est que les animaux prélevés peuvent avoir déjà reçu des traitements ce qui représente un biais d’échantillonnage (si l’animal est sélectionné car justement résistant aux traitements précédents) pour les résultats. Ceux-ci sont exprimés sous forme d’un pourcentage de résistance à chaque antibiotique des principaux pathogènes vétérinaires. Les pathogènes et antibiotiques testés en filière bovine sont indiqués tableau 9, on peut y remarquer quelques céphalosporines vétérinaires (Céfopérazone, Ceftiofur et Cefquinome) et humaine (Céfalotine et Céfuroxime). Tableau 9 : Antibiotiques suivis par le Resapath en filière bovine (GUILLEMOT et al., 2006) 36 -les plans de surveillances annuels : Ils sont mis en place par la Direction Générale de l’Alimentation (DGAl) du Ministère de l’Agriculture de l’Alimentation de la Pêche de la Ruralité et de l’Aménagement du Territoire (MAAPRAT) en collaboration avec l’ANSES et permettent le suivi des résistances sur la flore digestive d’animaux sains par recueil de fèces à l’abattoir. Ce suivi est complémentaire de celui du Resapath et constitue un bon indicateur épidémiologique de l’usage des antibiotiques. Sa mise en place est plus récente (2002 pour les bovins). Les résultats sont donc exprimés en taux de résistance des principales bactéries commensales du tube digestif (E. coli, Campylobacter et Enterococcus faecium) dans les différentes filières de production. Les antibiotiques testés sont notés dans le tableau 10. Tableau 10 : Antibiotiques testés dans le cadre du plan de surveillance en France (GUILLEMOT et al., 2006) Il est remarquable dans ce tableau que les céphalosporines placées dans un cadre ne font pas partie du suivi régulier dans la flore commensale. -le réseau de laboratoires « Salmonella » : C’est un réseau animé par l’ANSES plus orienté sur l’étude des Salmonelles. Celles-ci sont en effet responsables de nombreuses toxi-infections alimentaires d’où l’intérêt qui leur est porté. La surveillance se fait à différents niveaux : chez les animaux de rente et leur environnement immédiat, dans l’alimentation à destination humaine et dans l’environnement. Dans ce réseau, les souches chez lesquelles une résistance aux céphalosporines de 3 ème génération est observée sont particulièrement étudiées. 37 2. Apport des réseaux sur la résistance aux β-lactamines (SANDERS et al., 2010) Une série de résultats a été publié par l’ANSES grâce aux réseaux susmentionnés en 2010 présentant les résultats d’un exercice réalisé en 2007 et 2008 (SANDERS et al., 2010). a) Apport des plans de surveillance Les observations les plus intéressantes du rapport de l’ANSES sont : Pour les bactéries zoonotiques : -aucune résistance aux céphalosporines n’a été observée chez les salmonelles d’origine bovine et porcine. Les salmonelles aviaires présentent très peu de résistance à ces antibiotiques également (moins de 1%), -les bactéries du genre Campylobacter d’origine aviaire présentent une résistance importante à l’ampicilline de l’ordre de 40 à 50% (les céphalosporines n’ont pas été testées). Pour les bactéries commensales : -aucune BLSE n’a été isolée sur les 118 E. coli d’origine bovine (attention cependant, seuls les veaux sont étudiés) mais 4,1% des E. coli d’origine aviaire en présentaient. Les E.coli bovines présentent cependant un fort taux de résistance à l’ampicilline (63%), -les Enteroccocus d’origine bovine présentent une faible résistance à l’ampicilline (8%) (les céphalosporines n’ont pas été testées). b) Apport du Résapath sur les bactéries pathogènes Il est remarquable, en ce qui concerne les bactéries pathogènes, que l’évolution des résistances aux céphalosporines est relativement similaire dans les différentes espèces étudiées (volaille, porcs et bovins). En effet, les données indiquent que la résistance au ceftiofur a augmenté entre 2003 et 2008 dans les trois espèces. Les résistances restent tout de même relativement rares chez les bovins mais, elles existent. La résistance à l’amoxicilline est, quant à elle, préoccupante chez les bovins. Les résistances aux céphalosporines sont peu présentes chez les animaux sains. Les résistances à l’ampicilline sont plus fréquentes. Les résistances aux céphalosporines des bactéries pathogènes sont, elles, en constante augmentation. Les données collectées par les réseaux cités ici sont régulièrement complétées par des études ponctuelles. Leurs résultats sont présentés plus loin, partie III. C. 38 III. ANTIBIORESISTANCE ET FLORE COMMENSALE DES RUMINANTS A. Composition de la flore commensale digestive des ruminants La flore commensale intestinale des ruminants est la flore bactérienne résidant en permanence dans l’intestin des ruminants, chez les animaux sains. Selon MADEC et CALAVAS (2010), elle peut être constituée à la fois de germes non pathogènes et de germes pathogènes/zoonotiques qui ne provoquent de maladies que dans certaines situations (rupture de barrière, modification de l’équilibre dans la flore…). Elle est importante car elle intervient dans la fin du processus de digestion des aliments. Elle interagit avec les cellules de l’hôte et les modifications de cette flore (modification des proportions, apparition de bactéries pathogènes) entrainent l’apparition de pathologies qui peuvent être graves (Salmonelloses etc.). Malgré cela, les informations concernant la composition même de cette flore sont très rares (DOWD et al., 2008). Deux types de méthodes différentes ont donné des résultats différents. 1. Méthode « classique » La méthode la plus conventionnelle consiste à récupérer des matières fécales de vaches, les diluer puis filtrer et enfin réaliser des analyses après ensemencement sur des milieux liquides ou des géloses de différents types pour mettre en évidence différents types bactériens. Cette méthode est la méthode « historique » développée par WILSSENS et BUTTIAUX (1958). Les résultats de leur étude menée sur une vingtaine de vaches laitières adultes sont présentés dans le tableau 11. 39 Tableau 11 : Composition de la flore fécale des ruminants obtenue avec la méthode « classique » (WILSSENS et BUTTIAUX, 1958) Espèces Escherichia coli intermedium freundii coli mutabilis Klebsiella aerogenes Dispar Bethesda Paralactobactrum Proteus coliforme intermedium aerogenoïdes hauseri morganii rettgeri Providencia Salmonella Shigella Lactobacillus homofermentaires hétérofermentaires Microbacterium Streptococcus Bacillus Clostridium faecalis faecium bovis lactis licheniformis pumilus subtilis megatherium cereus cereus-mycoïdes brevis sphaericus perfringens butyricum Pseudomonas aeruginosa Alcaligines tolerans Bacterium anitratum Serratia marcescens Micrococci Staphilococcus aureus Candida krusei tropicalis pseudotropicalis albicans Etable l'hiver (18 vaches), % de vaches présentant la bactérie 100 0 37 0 7,4 7,4 40,7 22,2 0 11,1 22,2 11,1 0 0 0 0 37 18,5 25,9 0 100 25,9 14,8 55,5 48,1 44,4 37 33,3 11,1 25,9 18,5 0 100 3,7 18,5 22,2 3,7 100 7,4 66,6 28,6 14,8 0 40 Pâturage l'été (19 vaches), % de vaches présentant la bactérie 100 9,1 18,2 4,5 4,5 4,5 31,8 45,4 18,2 13,6 45,4 4,5 50 13,6 0 0 27,3 18,2 22,7 3 100 36,3 9,1 68,1 68,1 63,6 40,9 9,1 4,5 22,7 13,6 0 0 4,5 9,1 13,6 9,1 100 4,5 18,2 0 0 0 Rapport Etable / Pâturage Abondance de l'espèce si isolée 1 +++ + rares rares + + rares ou + + rares rares rares rares rares ou + rares 2 1,6 1,6 1,3 0,5 0,8 0,5 2,4 1,3 1 1,1 1 0,7 1,6 0,8 0,7 0,7 0,9 3,6 2,4 1,1 1,3 0,8 2 1,6 0,4 1,6 3,6 + + + rare + + ou +++ + ++ ++ ++ + + rare + + ++ + rare rare rare + ou +++ rare + + + Avec cette méthode, les bactéries les plus présentes dans les fèces sont essentiellement des E. coli, des Bacillus sp., des Clostridium butyricum, des Micrococci et quelques Streptocoques. Seuls les E. coli sont représentés par +++ en mettant ainsi en évidence la prépondérance. Des résultats similaires ont aussi été présentés par SØRUM et SUNDE (2001) avec l’abondance d’E. coli, d’Enterococci, de Clostridium perfringens et de Lactobacilli. On peut également remarquer que la flore varie entre l’hiver et l’été. Ces variations tiennent à la différence d’alimentation des bovins entre l’hiver et l’été : en hiver, celle-ci se fait uniquement à l’étable et dans l’étude de WILSSENS et BUTTIAUX (1958), elle est à base de foin, ensilage de maïs, pulpe de betterave et tourteaux ; en été, les vaches étant au champ, la part de cette alimentation diminue au profit d’une alimentation à base d’herbe verte. 2. Méthode récente La question de la composition de la flore fécale des ruminants a été récemment reposée et étudiée avec de nouvelles méthodes. Des technologies de séquençages rapides associées à des méthodes moléculaires ont cette fois été utilisées pour déterminer la composition de cette flore. Une technique appelée bTEFAP (pour bacterial Tag-Encoded FLX Amplicon Pyrosequencing) utilisant l’ADN ribosomal a ainsi été mise au point et utilisée dans cette optique. Les résultats obtenus sont présentés tableau 12, et diffèrent quelque peu de ceux exposés précédemment. 41 Tableau 12 : Composition de la flore fécale des ruminants obtenue avec la technique bTEFAP (DOWD et al., 2008) L’étude a ici été menée sur vingt vaches laitières (Holstein) en bonne santé nourries en ration complète, aux Etats-Unis. Les deux phénomènes les plus marquants sont l’importance des Clostridies qui représentent aux alentours de 20% de la population bactérienne fécale totale et surtout la très faible représentation des E. coli qui représentent seulement 0,7% de la population totale. Cette différence semble s’expliquer par l’existence d’un biais dans la méthode « classique » de mise en culture de la flore fécale : en effet, il semblerait qu’E. coli soit une bactérie se développant particulièrement bien dans un milieu de culture sur gélose, mieux que les autres bactéries commensales fécales. Ceci induit une surreprésentation d’E. coli lors de l’utilisation de cette méthode (DOWD et al., 2008). 42 En conclusion, si la nature des bactéries présentes dans la flore fécale commensale des ruminants ne fait pas forcément débat, l’importance relative des différentes familles bactériennes ne fait pas encore clairement consensus. Dans la suite de la thèse, nous raisonnerons plutôt avec la première composition, utilisant des méthodes d’isolement sur gélose que nous avons également utilisées. B. Intérêt de l’étude de la flore commensale par rapport à la flore pathogène 1. Effet des traitements antibiotiques sur la flore commensale Les traitements antibiotiques aujourd’hui administrés en médecine vétérinaire ont pour cible les bactéries pathogènes. Si les molécules sont actives sur ces bactéries, elles le sont également sur celles appartenant à la flore commensale, en particulier digestive. Les conséquences sont multiples, notamment : élimination des bactéries sensibles à l’antibiotique utilisé, sélection des bactéries résistantes à celui-ci, colonisation possible du compartiment digestif par une flore exogène inhabituelle… (GUILLEMOT et al., 2006). La composition de la flore commensale se trouve donc modifiée. Celle-ci joue habituellement le rôle de barrière par la pression qu’elle exerce, et évite la colonisation du tube digestif par des agents pathogènes. L’utilisation de l’antibiotique peut donc fragiliser cette barrière (MILLEMANN et POIREL, 2010). L’utilisation d’un antibiotique a un deuxième inconvénient majeur : par l’élimination des bactéries sensibles, elle a pour conséquence la sélection de l’antibiorésistance à la molécule utilisée chez les bactéries commensales et l’augmentation de sa prévalence. Ce phénomène est maintenant bien connu (ANDREMONT, 2006 et SØRUM et SUNDE, 2001) et a notamment été vérifié chez les bactéries du genre E. coli chez les veaux à diarrhée. Dans certains cas, l’utilisation d’un antibiotique favorise la résistance à d’autres antibiotiques (résistances croisées) : ceci est dû au fait que des gènes de résistance à différentes familles peuvent être présents sur les mêmes éléments génétiques mobiles (plasmides…) (ANDREMONT, 2006). 2. Interactions flore commensale/flore pathogène Un certain nombre de publications s’intéressent aux échanges génétiques pouvant exister entre bactéries de la flore commensale d’une part, et entre bactéries pathogènes et bactéries commensales d’autre part. En effet, la forte concentration de bactéries présentes dans le tube digestif et la cohabitation des bactéries commensales et pathogènes dans un même milieu favorise les interactions (MADEC et MEUNIER, 2006). 43 L’existence de transferts de plasmides portant des gènes de résistance au sein de la flore commensale a déjà été prouvée dans le tube digestif de rongeurs (SALYERS et al., 2004). Plus précisément, SALYERS au cours de deux études (SALYERS et al., 2004 et SALYERS et al., 2007) a montré que des bactéries différentes de la flore commensale digestive d’humains contenaient des gènes de résistance présentant des homologies très fortes (à plus de 95%). Ceci suggère que ces gènes ont la même origine et donc, qu’ils ont été « transférés » d’une bactérie à l’autre. L’abondance de pareilles observations suggère que les échanges entre bactéries (commensales ou pathogènes) sont des événements relativement fréquents. Les éléments transférés sont généralement des plasmides porteurs des gènes de résistance ou des transposons entiers. ANDREMONT (2006) mentionne également que des échanges entre bactéries commensales et pathogènes (type Salmonella par exemple) ont été démontrés ces cinquante dernières années. 3. Théorie du réservoir L’existence de ces transferts a permis la naissance d’une nouvelle théorie quant à l’apparition des antibiorésistances dans la flore pathogène. Initialement, l’acquisition d’un gène de résistance chez une bactérie de la flore pathogène se produisait soit par mutation, soit par des échanges avec des souches pathogènes existantes déjà résistantes. La nouvelle théorie est illustrée figure 13. C’est un mécanisme en deux phases qui est maintenant privilégié : d’abord, apparition/sélection de résistances dans la flore commensale puis transfert à la flore pathogène (ANDREMONT, 2006). 44 Figure 13 : Mécanisme d’apparition de résistances au sein de la flore pathogène (ANDREMONT, 2006) Légende : atb = antibiotique La découverte de ces mécanismes justifie donc pleinement l’intérêt actuel pour l’étude de la flore commensale. Une hypothèse est même avancée : l’hypothèse du « réservoir », c’est-à-dire que la flore commensale serait le réservoir de l’antibiorésistance, le réservoir de gènes de résistance qu’elle acquiert au cours d’échanges entre bactéries commensales ou avec des bactéries transitoires (SALYERS et al., 2007). Cette théorie est illustrée figure 14. 45 Figure 14 : « Hypothèse du réservoir » (SALYERS et al., 2007) Explication : Des échanges de matériel génétique support de l’antibiorésistance ont lieu entre les bactéries résistantes résidant dans l’intestin d’une part et les autres bactéries commensales de l’intestin ou des bactéries en transit d’autre part. Les bactéries commensales ayant acquis une résistance peuvent se retrouver à leur tour en situation de bactérie en transit à l’occasion d’une transmission oro-fécale, permettant ainsi la diffusion du gène d’antibiorésistance étudié. On voit dans ce mode de fonctionnement que les bactéries commensales de l’intestin représentent un réservoir potentiel d’antibiorésistance par la place centrale qu’elles occupent. C. Précédents de mise en évidence céphalosporines chez la flore commensale de résistances aux Il existe un certain nombre de précédents de mise en évidence de résistances aux céphalosporines (voire plus généralement aux β-lactamines) chez la flore commensale des ruminants. L’intérêt qui est porté aux résistances chez la flore commensale est néanmoins récent comme en témoignent les dates des publications qui sont citées ci-après. L’existence de souches de Staphylococcus aureus Résistant à la Méticilline (SARM) résistantes à toutes les β-lactamines (dont les céphalosporines) a pu déjà être mise en évidence chez des bovins sains (GUERIN-FAUBLEE, 2010). Des résistances aux céphalosporines de troisième et quatrième génération sont apparues chez les colibacilles des animaux en Europe au début des années 2000. Le premier mécanisme mis en évidence à l’origine de cette résistance est l’hyper-expression de la protéine AmpC puis l’expression de BLSE est également apparue (GUERIN-FAUBLEE, 2010). Depuis, de nombreuses études permettant le calcul de la prévalence de ces résistances ont été menées. Le tableau 13 fait un bilan des publications mettant en évidence la présence de BLSE dans la flore commensale des ruminants. 46 Tableau 13 : Inventaire des précédents de mise en évidence de BLSE dans la flore commensale de ruminants Source bibliographique Conditions de prélèvements Ecouvillons rectaux sur vaches saines à l'abattoir Prélèvement de fèces sur vaches au hasard visite 1 LIEBANA et al., Prélèvement de fèces sur 2006 vaches au hasard visite 2 Prélèvement de fèces sur vaches au hasard visite 3 Prélèvements de féces en exploitation, sur vaches MADEC et al., 2008 malades Prélèvements de féces en abattoir, sur vache saine GUERIN-FAUBLEE, Prélèvements féces sur 2010 vache saine MADEC et Prélèvements féces en CALAVAS, 2010 abattoir sur vache saine NEUWIRTH et al., Ecouvillons rectaux 2010 Ecouvillons rectaux, ferme DOLEJSKA et al., conventionnelle 2011 Ecouvillons rectaux, ferme biologique Ecouvillons rectaux sur WASYL et al., 2011 vaches à l'abattoir HORTON et al., Féces de vaches 2011 GESER et al., 2011 Féces de vaches/veaux DUAN et al., 2006 Nombre de prélèvements Espèce bactérienne isolée Prévalence de BLSE trouvée Pays 97 E. coli 3,10% Chine 60 E. coli 51 E. coli 63 E. coli 657 E. coli 3,3% (type CTX-M uniquement) 5,9% (type CTX-M RoyaumeUni uniquement) 23,8% (type CTXM uniquement) 6,20% France 607 E. coli 5,80% E. coli 4,10% France E. coli 4,10% France 271 E. coli 5,20% France 309 E. coli 39% 154 E. coli <1% 174 / 0% Pologne 35 E. coli 64 E. coli 8,6% de fortes excrétrices 17,10% RoyaumeUni Suisse République Tchèque Les publications citées ici sont issues de différents pays témoignant d’une globalité du phénomène (France, Etats-Unis, Hong-Kong…). Les bactéries commensales productrices de BLSE sont systématiquement des E. coli. Dans l’ensemble, les prévalences de vaches porteuses d’E. coli à l’origine de la synthèse de BLSE sont assez cohérentes et s’étalent pour la plupart entre 4 et 10%. D’après une grande partie de ces études, ces prévalences sont en augmentation récemment, phénomène certainement à mettre en rapport avec l’explosion récente de l’utilisation des céphalosporines de troisième et quatrième génération. L’étude de DOLEJSKA et al. (2011) montre que la prévalence de vaches porteuses d’E. coli à BLSE est bien plus élevée dans une ferme utilisant couramment des céphalosporines 3ème et 4ème génération que dans un élevage biologique confirmant à l’échelle locale cette observation : l’utilisation massive de céphalosporines à large spectre pourrait être à l’origine de la sélection d’E. coli productrice de BLSE. 47 L’étude de MADEC et al. (2008) est particulièrement intéressante car elle montre que les prévalences obtenues sur des vaches saines sont sensiblement les mêmes que cellesobtenues chez les vaches malades. Ces E. coli sont donc bien des bactéries de la flore commensale et peuvent constituer un réservoir de résistances pour les bactéries pathogènes. En effet, les gènes à l’origine de la synthèse des BLSE étant sur des plasmides, leur transfert d’une cellule à une autre (par exemple, d’une bactérie commensale à une bactérie pathogène) est aisé. Des transferts ont déjà pu être mis en évidence entre E. coli et Salmonella (GUERINFAUBLEE, 2010). Les études ayant testé des veaux en plus de vaches adultes suggèrent une prévalence bien plus importante chez les jeunes que chez les adultes (LIEBANA et al., 2006). Dans la majorité de ces études, les BLSE mises en évidence sont du type CTX-M. Ces BLSE sont de loin les plus souvent mises en évidence dans toutes les études récentes concernant les BLSE chez l’animal (PITOUT et LAUPLAND, 2008). Quelques BLSE de types SHV et TEM ont également été mises en évidence. 48 DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE 49 50 Le travail présenté ici a pour but de rechercher la présence de résistances aux céphalosporines dans la flore commensale digestives de vaches issues de trois élevages sélectionnés. Une fois mise en évidence, la prévalence des différents mécanismes de résistance est déterminée. L’étude a été menée en partenariat avec l’Unité de Reproduction de l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort (ENVA) pour les prélèvements de fèces, et avec le laboratoire INSERM U914, « Résistances Emergentes aux Antibiotiques » du Centre Hospitalier Universitaire de Bicêtre (94) pour les analyses bactériologiques et moléculaires. Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un contrat d’interface ENVA/INSERM attribué au docteur Laurent POIREL de l’unité INSERM U914. Après une présentation des protocoles suivis pour les différentes étapes des manipulations, les résultats sont exposés et une discussion à leur propos est menée. I. MATERIEL ET METHODES A. Objectifs et cadre de l’étude 1. Les objectifs de l’étude Les motivations à conduire une telle étude sont multiples. Il s’agit de : -mettre en évidence l’existence de bactéries résistantes aux céphalosporines dans la flore commensale digestive des ruminants, -d’identifier les différents mécanismes intervenant dans cette résistance -évaluer la prévalence de ces différents mécanismes, -identifier les bactéries porteuses de ces mécanismes , -replacer les résultats dans un contexte plus général en les comparant aux résultats déjà obtenus en médecine vétérinaire d’une part mais également en médecine humaine. 2. Le cadre de l’étude Cette thèse ne constitue en fait qu’une partie d’une étude plus large sur les résistances aux céphalosporines dans la flore commensale digestive des animaux. Cette étude comporte trois volets : mise en évidence de tels phénomènes dans la flore digestive des animaux de compagnie (chiens, chats, nouveaux animaux de compagnie), des animaux de rente (sujet de la thèse) et de la faune sauvage. L’étude de ces phénomènes s’inscrit dans une problématique encore plus large de santé publique : en effet, la mise en évidence de mécanisme de résistance chez les animaux identiques à ceux observés chez l’homme soulève la question des échanges de bactéries porteuses de gènes de résistance entre l’homme et l’animal et peut amener à la notion d’animal « réservoir de résistances transmissibles à l’homme ». Cette étude montre donc un intérêt à la fois en médecine vétérinaire et en médecine humaine. 51 B. Constitution de l’échantillon d’étude 1. Elevages d’origine (AMATE et GODARD, 2010) Les vaches prélevées au cours des manipulations sont recrutées dans trois élevages laitiers de la région parisienne. Ces trois élevages font l’objet de suivis de fécondité réguliers effectués par l’Unité de Reproduction de l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort. Tout d’abord, la ferme de Bissy située à Bonnelles dans les Yvelines (78) est l’un des plus grands élevages de la région ; trois cents vaches y sont traites avec un niveau d’étable élevé (9500 kg/vache/an). La ferme de La Tremblaye est également située dans les Yvelines, à La BoissièreEcole ; son cheptel est constitué de cent cinquante vaches en lactation et le niveau d’étable y est élevé (10000 kg/vache/an). Enfin, la ferme expérimentale de Grignon dépendant d’AgroParisTech située à Plaisir dans les Yvelines est la dernière ferme concernée par l’étude ; son cheptel de vaches laitières en production est de cent vingt têtes avec un niveau d’étable également élevé (9500 kg/vache/an). Les localisations des différentes exploitations sont présentées figure 15. Figure 15 : Localisation des exploitations choisies 2. Vaches prélevées Trois séries de 50 prélèvements et une série de 53 prélèvements ont été effectuées à l’occasion des suivis de fécondité. Les dates, localisation et nombre de vaches prélevées sont indiquées tableau 14. 52 Tableau 14 : Date, localisation et nombre de prélèvements Date des prélèvements 30 Novembre 2010 20 Janvier 2011 7 Avril 2011 26 Mai 2011 Lieu des prélèvements Ferme Expérimentale de Grignon Ferme de La Tremblaye Ferme de Bissy Ferme de Bissy Nombre de prélèvements réalisés 50 50 50 53 (36) Les vaches prélevées sont des vaches de race Prim’Hostein saines, sans traitement antibiotique au moment des prélèvements, choisies aléatoirement dans l’élevage considéré. Parmi ces vaches, des vaches en lactation ou taries, des primipares ou des multipares sont prélevées indifféremment. Sur les deux dernières séries de prélèvements, 17 vaches ont été prélevées aux deux dates. Pour le calcul des résultats, il a donc été considéré que seules 36 vaches ont été prélevées lors de la dernière série pour ne pas fausser les résultats relatifs à la prévalence. Les numéros des vaches prélevées sont placés dans le tableau 15. Tableau 15 : Numéros de travail des vaches prélevées lors des différentes visites INA-PG, le 30/11/10 Bissy, le 07/04/11 0457 9918 0245 0364 0030 96 335 466 548 3387 0454 9984 0102 0316 0069 140 355 495 550 3479 0455 0382 0329 0351 9911 172 384 505 570 3559 9952 0354 0253 0065 0436 218 385 506 571 3619 9844 0239 0327 8155 0062 279 395 514 572 3640 0450 9677 0334 0357 0106 281 404 515 633 3642 9872 0147 0184 0374 0057 306 412 517 638 4177 0427 0125 0227 0145 0240 311 428 523 3016 4188 0337 0187 0320 0036 0238 323 455 532 3089 4210 0123 0165 9983 0096 9973 334 458 546 3216 5008 La Tremblaye, le 20/01/11 Bissy, le 26/05/11 9459 9039 9361 9380 9400 0033 354 467 546 3071 9472 9188 8899 9218 9224 164 355 484 549 3088 390 495 550 3155 8992 9187 9214 9150 9475 186 9349 9372 9251 9193 9037 193 391 505 556 3207 9255 9080 9225 9389 9466 283 404 511 562 3213 9286 9267 9143 9296 9481 311 412 514 577 3387 421 517 578 3415 8933 9227 9478 9301 9422 321 9405 9116 9239 9370 9547 334 448 524 584 3453 9163 9336 9304 9363 9546 335 455 532 812 3478 9069 9368 9354 9247 9512 3049 4135 345 458 536 4160 4177 4259 En grisé : vaches prélevées à deux reprises 53 3. Prélèvements Les prélèvements réalisés sont des prélèvements de fèces réalisés grâce à l’utilisation d’écouvillons stériles secs placés quelques secondes dans le rectum de la vache. La photographie 1 présente le matériel de prélèvement. Photo 1 : Ecouvillon utilisé pour les prélèvements Les écouvillons sont ensuite conservés à température ambiante dans les quelques heures (2 à 3 heures maximum) suivant le prélèvement en attendant leur acheminement jusqu’au laboratoire. 54 C. Manipulations en laboratoire 1. De l’arrivée au laboratoire à l’ensemencement des géloses Les manipulations de bactériologie ont été réalisées au laboratoire INSERM U914, « Résistances Emergentes aux Antibiotiques » au Centre Hospitalier Universitaire de Bicêtre sous la supervision du docteur Laurent POIREL. A l’arrivée au laboratoire, les écouvillons rectaux sont déchargés dans des tubes contenant 2mL de milieu de culture BCC (Bouillon Cœur Cervelle) permettant ainsi de favoriser la croissance bactérienne. Chaque tube est vortexé pour permettre la formation d’une solution homogène. Les tubes sont alors placés en chambre chaude à 37°C pendant 12 à 24h. Le lendemain, différentes géloses sont ensemencées : à l’aide d’un petit râteau stérile, 150 μL du bouillon cœur cervelle ensemencé la veille sont étalés sur chaque gélose. Au total, pour chaque écouvillon, cinq boîtes sont ensemencées. Elles ont pour base une gélose type Drigalski qui permet d’inhiber le développement des bactéries Gram positif et de favoriser la pousse des Enterobactéries. A cette gélose, sont ajoutés divers composants permettant la sélection de différentes bactéries (VIDAL en ligne) : -Gélose 1 = Gélose à l’Acide Nalidixique à 8μg/mL : l’Acide Nalidixique est un antibiotique de la classe des quinolones ; son addition à la gélose permet de sélectionner des bactéries résistantes à une ou plusieurs quinolones, -Gélose 2 = Gélose à la Gentamicine à 20 μg/mL et à l’Amikacine à 30 μg/mL : la Gentamicine et l’Amikacine sont des antibiotiques de la classe des aminosides ; leur addition à la gélose permet de sélectionner des bactéries résistantes à deux ou plusieurs aminosides, -Gélose 3 = Gélose à l’Imipénème à 1 μg/mL : l’Imipénème est un antibiotique de la famille des carbapénèmes (inclus dans la classe des β-lactames); son addition à la gélose permet de sélectionner des bactéries résistantes à un ou plusieurs carbapénèmes (antibiotiques non utilisés en médecine vétérinaire), -Gélose 4 = Gélose à la Ticarcilline à 50 μg/mL : la Ticarcilline est un antibiotique de la famille des pénicillines ; son addition à la gélose permet de sélectionner des bactéries résistantes à une ou plusieurs pénicillines, -Gélose 5 = Milieu ESBL : c’est un milieu chargé en céphalosporine de 3ème génération (Cefpodoxime) qui permet un criblage des bactéries porteuses de céphalosporinases ou de BLSE. Une fois ensemencées, les géloses sont placées pendant 12h en étuve à 37°C pour incubation puis en chambre froide en attendant la lecture (la croissance bactérienne y est nettement ralentie). 55 2. Réalisation des antibiogrammes Sur chaque gélose ayant permis une croissance bactérienne, une colonie de bactéries de chaque type, lorsque plusieurs types de colonies sont observés sur une même gélose (différenciées par leur aspect macroscopique : taille, couleur…), est prélevée et remise en suspension dans un tube d’eau stérile de 5mL qui est ensuite vortexé. Deux ou trois gouttes de la solution ainsi formée sont diluées dans 10 mL d’eau stérile qui est alors versée sur une gélose de type Müller-Hinton (milieu de culture adapté à la réalisation d’antibiogramme), le surplus étant retiré. La gélose est laissée à sécher quelques minutes puis les disques contenant différents antibiotiques sont immédiatement ajoutés sur la gélose. La répartition des différents disques sur la gélose est indiquée figure 16 et le détail des antibiotiques utilisés tableau 16. Figure 16 : Répartition des disques imprégnés d’antibiotiques sur la gélose Signification des abréviations donnée au tableau 16 56 Tableau 16 : Détail des antibiotiques utilisés pour les antibiogrammes (VIDAL en ligne, Site internet Bio-Rad) Abréviation Nom complet de la molécule Charge du disque Classe d'antibiotique 30 µg Pénicilline + Inhibiteur de bétalactamases Pénicilline Pénicilline Pénicilline Fluoroquinolones Pénicilline + Inhibiteur de bétalactamases Céphalosporine 3ème G Céphalotine 30 µg Céphalosporine 1ère G FOX Céfoxitine 30 µg Céphalosporine 2ème G IPM 10 µg 20 µg + 10 µg CTX Imipénème Amoxicilline / Acide Clavulanique Céfotaxime 30 µg Carbapénème Pénicilline + Inhibiteur de bétalactamases Céphalosporine 3ème G CXM Céfuroxime 30 µg Céphalosporine 2ème G NA ATM Acide Nalidixique Aztréonam 30 µg 30 µg Quinolone Monobactames FEP Céfépime 30 µg Céphalosporine 3ème G TZP Pipéracilline / Tazobactam 75µg / 10 µg PIP 75 TIC AMX CIP 75µg 75 µg 25 µg 5 µg CAZ Pipéracilline Ticarcilline Amoxicilline Ciprofloxacine Ticarcilline / Acide Clavulanique Ceftazidime CF TCC AMC 75 µg / 10 µg Cellules grisées : antibiotiques réservés à la médecine humaine La plupart des antibiotiques utilisés sont réservés à la médecine humaine (en grisé sur le tableau). Ceci est dû aux normes imposées pour la réalisation des antibiogrammes et est tout à fait compatible avec l’objectif de détection de BLSE, céphalosporinases ou pénicillinases chez les animaux. Pour chaque colonie étudiée, une identification est menée en parallèle grâce à des galeries API (galeries API 20E) pour en déterminer la nature. On ne s’intéresse ici qu’aux bactéries gram -, en particulier les entérobactéries. Les géloses ainsi constituées sont placées 12h en chambre chaude à 37°C pour incubation puis en chambre froide en attendant la lecture. 3. Lecture des antibiogrammes Les antibiogrammes ainsi constitués sont alors lus pour être interprétés. En particulier, la présence de bactéries productrices de BLSE ou de céphalosporinases est recherchée. 57 La production de BLSE est mise en évidence par la présence d’une réaction de synergie entre un disque imprégné d’inhibiteur de béta-lactamases (acide clavulanique) et un disque imprégné d’une céphalosporine large spectre, i.e. de 3ème ou de 4ème génération. Cette réaction se manifeste sur l’antibiogramme par une image dite en « bouchon de champagne » ou de « synergie » illustrée figure 17. En effet, la résistance seule aux céphalosporines large spectre sur l’antibiogramme n’est pas suffisante pour parler de BLSE. Une bactérie résistante aux céphalosporines large spectre est soit une BLSE, soit une céphalosporinases non BLSE qui est insensibles aux inhibiteurs de β-lactamases (et donc, ne provoquera pas d’image de synergie). Figure 17 : Image en « bouchon de champagne » caractérisant la présence de BLSE (GARREC et al., 2011) Dans le cas précis de cette étude, nous cherchons l’existence de synergies entre le disque AMC (Amoxicilline / Acide Clavulanique) et les disques CAZ (Ceftazidime), CTX (Céfotaxime) et FEP (Céfépime) ou entre le disque TCC (Ticarcilline / Acide Clavulanique) et le disque CAZ (Ceftazidime) comme illustré figure 18. Figure 18 : Localisation possible de synergies indiquant la présence de BLSE sur l’antibiogramme La détermination du type de BLSE, céphalosporinases ou pénicillinases est ensuite faite par PCR puis séquençage. 58 II. RESULTATS A. Mise en évidence de bactéries résistantes aux céphalosporines et identification des mécanismes mis en jeu 1. Mise en évidence de bactéries résistantes aux céphalosporines Sur les 186 vaches de l’étude, 14 sont porteuses de bactéries possédant des mécanismes de résistance aux céphalosporines. Une des souches ayant poussé sur milieu ESBL (donc porteuse de mécanismes de résistance aux céphalosporines) est illustrée sur la photo 2. Photo 2 : Souche ayant poussé sur milieu ESBL 2. Mécanismes en jeu Parmi les 14 vaches évoquées ci-dessus, 4 hébergent dans leurs fèces des bactéries capables de synthétiser des β-lactamases à spectre étendu et 10 possèdent des bactéries capables de synthétiser des céphalosporinases (acquis ou de manière intrinsèque). L’antibiogramme mettant en évidence une des bactéries productrices de BLSE isolées est placé photo 3. Photo 3 : Mise en évidence d’une bactérie productrice de BLSE 59 Il est également remarquable que 13 autres vaches hébergent des bactéries capables de synthèse de pénicillinases. Le détail du nombre de vaches présentant des bactéries avec les différents mécanismes de résistance susnommés dans les différentes exploitations visitées est donné dans le tableau 17 et la figure 19. Tableau 17 : Mécanismes de résistance aux béta-lactamines mis en évidence dans les différentes exploitations Exploitation Nombre de prélèvements Vaches hébergeant des bactéries avec des BLSE Vaches hébergeant des bactéries avec des pénicillinases Vaches hébergeant des bactéries avec des céphalosporinases INA PG 50 Tremblaye 50 Bissy 86 2 0 2 1 3 9 0 0 10 Figure 19 : Représentation graphique des mécanismes de résistance identifiés dans les trois exploitations 90 Nombre de vaches prélevées 80 70 Nombre de vaches présentant des bactéries productrices de BLSE 60 50 40 Nombre de vaches présentant des bactéries productrices de pénicillinases acquises 30 20 Nombre de vaches présentant des bactéries productrices de céphalosporinases 10 0 INA Tremblaye Bissy 60 3. Prévalence des différents mécanismes Les résultats permettent de calculer la prévalence de bactéries productrices de BLSE, de céphalosporinases et de pénicillinases dans la population étudiée. Ces prévalences sont présentées dans le tableau 18 avec leurs intervalles de confiance à 95%. Pour le calcul de prévalence, il a été considéré que 186 vaches ont été prélevées, les vaches prélevées à 2 reprises ne sont pas comptabilisées afin de ne pas fausser les résultats. Tableau 18 : Prévalence des vaches porteuses de bactéries productrice de BLSE, céphalosporinases et pénicillinases dans la population étudiée Nombre de bovins positifs / Nombre de bovins prélevés Prévalence calculée de bovins présentant ce mécanisme de résistance IC 95% Bactérie productrices de BLSE 4/186 2,15% [0,02%-4,28%] Bactéries productrices de Céphalosporinases 10/186 5,38% [2,07%-8,69%] Bactéries productrices de Pénicillinases 13/186 6,99% [3,25% -10,73%] B. Types de BLSE identifiées et bactéries productrices Le détail des enzymes trouvées en fonction des vaches est donné tableau 19 et une synthèse des différents types de BLSE identifiés est donné dans le tableau 20. 61 Tableau 19 : Enzymes isolées chez les différentes vaches lors des visites et bactéries productrices 1ère série : INA-PG, 30/11/10 Numéro de vache 0354 0057 0457 Type de résistance BLSE Type TEM 52 BLSE Type TEM 52 Pénicillinase 3ème série, Bissy, le 07/04/11 Bactérie isolée E. coli E. coli E. coli Numéro de vache 5008 0571 3559 0455 2ème série : La Tremblaye, 20/01/11 Numéro de vache 9512 9547 9255 4177 0633 0384 0412 0548 0395 3479 0096 4188 0172 0311 Type de résistance Bactérie isolée Pénicillinase Pénicillinase E. coli Pénicillinase E. coli Type de résistance Bactérie isolée Pénicillinase Pénicillinase Pénicillinase Pénicillinase et céphalosporinase BLSE Type CTX-M 27 E. coli Pénicillinase Céphalosporinase Céphalosporinase Céphalosporinase Céphalosporinase Céphalosporinase Céphalosporinase Céphalosporinase Céphalosporinase Céphalosporinase 4ème série, Bissy, le 26/05/11 Numéro de vache 4177 0578 Type de résistance Bactérie isolée BLSE Type CTX-M 27 E. coli BLSE Type CTX-M 32 E. coli Absence de donnée, seules les bactéries productrice de BLSE ayant été identifiées Vaches prélevées à deux reprises Tableau 20 : Type de BLSE isolées Type de BLSE TEM 52 CTX-M 27 CTX-M 32 Nombre de bactéries hébergeant les BLSE 2 1 1 Seule l’identification des souches de bactéries productrices de BLSE a été menée et des bactéries du type E. coli uniquement ont été isolées. Il est intéressant de noter que sur les 17 vaches de la ferme de Bissy qui ont été prélevées à deux reprises à un mois et demi d’intervalle, 1 vache a présenté à 2 reprises une bactérie productrice de BLSE, de même type. En revanche, d’autres vaches prélevées 2 fois n’ont présenté des bactéries productrices de céphalosporinases ou des pénicillinases qu’à une seule des deux visites. Ceci soulève la question de connaitre la persistance de bactéries productrice de BLSE, de céphalosporinases et de pénicillinases dans le tube digestif des ruminants. 62 III. DISCUSSION A. Critique du protocole 1. Représentativité de l’échantillon Pour des raisons pratiques, il a été choisi de prélever 50 vaches par visite (sauf à la dernière). Ceci amène un total de 186 vaches. Ce chiffre assez élevé permet de renforcer la validité et la précision des résultats trouvés. Il est situé dans la bonne moyenne des échantillons utilisés dans des études sur le même sujet présenté première partie III. C qui s’échelonnent entre 35 et 657 prélèvements. En revanche, la ferme de Bissy a été la seule prélevée à deux reprises, les prélèvements étant dépendants de l’emploi du temps des visites de suivis de reproduction effectuées par l’ENVA dans les 3 élevages susmentionnés. Il en résulte un léger biais dans la constitution de l’échantillon. En effet, le nombre de vaches prélevées dans chaque exploitation n’est, de fait, pas proportionnel au nombre de vache total de l’exploitation ; chaque vache du pool complet des environ 570 têtes n’a donc pas la même probabilité d’être tirée au sort (50/120 à l’INA-PG, 50/150 à La Tremblaye et 86/300 à Bissy). Ce biais interfère légèrement avec l’objectif de détermination de la prévalence de bactéries productrices de BLSE dans les élevages considérés. Les élevages étudiés étant assez proches, tant géographiquement que par leurs tailles et leur technicité, on pourra considérer ce biais comme acceptable. De plus, les autres études sur le même sujet présentent le même biais d’échantillonnage (par exemple, pour les prélèvements en abattoirs de l’étude de MADEC et al., 2008, il n’y a pas de représentativité de l’échantillon par rapport aux élevages de provenance des animaux) qu’il est difficile de supprimer. Les prévalences trouvées ne s’appliquent qu’aux exploitations visitées et ne permettent pas de se faire une idée de la prévalence des mécanismes de résistance étudiés au niveau de toute la population bovine française. Le nombre d’exploitations étudiées est trop faible et la proximité géographique de celle-ci est importante. De plus, seuls des élevages laitiers sont étudiés. Cependant, cette étude, mêlée à toutes les autres études dont les résultats ont été présentés dans la première partie, III. C., s’intègre à un champ de recherche qui permet d’avoir une première estimation de l’importance du phénomène à l’échelle nationale. 63 2. Méthode de prélèvement et analyses au laboratoire Les prélèvements de flore commensale digestive ont été faits à l’aide d’écouvillons rectaux comme cela a été le cas dans la majorité des publications utilisées dans la première partie. Cette méthode est plus simple à mettre en œuvre que le prélèvement direct de matière fécale et n’influe pas sur les résultats. Il aurait été idéal que les analyses de laboratoire soient réalisées directement après le prélèvement. Les écouvillons ont du attendre leur acheminement au laboratoire à température ambiante. Cette situation représente un stress pour les bactéries et peut avoir légèrement modifié la composition bactérienne de la flore fécale. Cependant, l’attente ayant été courte (3 heures maximum), on considère l’effet de ce stress comme minime dans l’interprétation des analyses. Les analyses de laboratoire ont été menées en respectant les recommandations des organismes de standard (CA-SFM ou CLSI notamment) ; leur validité ne peut donc être remise en cause. B. Critique des résultats 1. Prévalence des BLSE La prévalence calculée de vaches possédant au sein de leur flore commensale des bactéries capables de synthèse de BLSE est de 2,15% comme il a été mentionné précédemment. La comparaison de cette prévalence avec les valeurs qui ont été trouvées par d’autres auteurs lors des précédentes études (cf. Tableau 12) montre que, si le chiffre que nous avons trouvé ici reste dans la fourchette des valeurs « usuelles », il est néanmoins inférieur à la majorité des dites valeurs. Une justification à ce phénomène peut être la suivante : les 3 élevages étudiés sont des élevages laitiers assez techniques et on peut supposer que l’utilisation des antibiotiques y est plutôt raisonnée, diminuant ainsi la sélection des résistances 2. Types de BLSE identifiées chez les bactéries isolées Sur les 4 bactéries productrices de BLSE isolées ici, 1 bactérie hébergeait le gène permettant la synthèse du type CTX-M 27, une autre celui du type CTX-M 32 et enfin 2 celui du type TEM 52 comme il a été mentionné précédemment. D’après les publications trouvées à ce sujet en médecine vétérinaire, les auteurs ont réussi à isoler majoritairement des BLSE de type CTX-M et quelques TEM. Les résultats de notre étude sont donc en bonne cohérence avec ceux des autres études. La comparaison des résultats concernant les types de BLSE isolés dans notre étude et dans les études déjà mentionnées est présentée tableau 21. 64 Tableau 21 : Comparaison des types de BLSE mises en évidence dans les différentes publications Source bibliographique Types des BLSE Nombre de BLSE isolées DUAN et al., 2006 LIEBANA et al., 2006 MADEC et al., 2008 GUERIN-FAUBLEE, 2010 MADEC et CALAVAS, 2010 NEUWIRTH et al., 2010 DOLEJSKA et al., 2011 WASYL et al., 2011 HORTON et al., 2011 GESER et al., 2011 Notre étude CTX-M 1 CTX-M 14 33 5 8 120 / / 3 20 76 14 120 0 3 11 4 CTX-M CTX-M 15 CTX-M 27 3 20 1 / Toutes Toutes / / / / CTX-M 32 Autres CTX-M / / / / / / TEM-52 / / / / / / / TEM TEM 71 / / / / / 5 / TEM 126 / / 1 / / / / SHV SHV 12 / / 2 / / / / / / / / 2 / / / / 3 / / / 1 1 / Absence de données L’originalité de notre étude par rapport aux autres études vétérinaires est que les BLSE de type CTX-M mises en évidence sont des CTX-M 27 et 32 tandis que dans la majorité des cas, ce sont majoritairement des CTX-M 1 qui ont été identifiées jusqu’à présent. C. Intérêt de l’étude dans un contexte général 1. En médecine vétérinaire Cette étude est intéressante pour la médecine vétérinaire. Elle permet en effet de connaitre la prévalence de mécanismes de résistance aux céphalosporines de dernières générations. L’utilisation importante d’un antibiotique a pour effet d’augmenter la sélection des résistances à cet antibiotique comme nous l’avons évoqué précédemment. Le ceftiofur et le cefquinome sont deux antibiotiques actuellement très utilisés en élevage laitier (à Bissy, La Tremblaye et Grignon entre autres) car leur temps d’attente lait est très court (nul pour le ceftiofur, 12h pour le cefquinome), leur spectre d’action est large et de nombreux médicaments contenant ces principes actifs existent. Il est donc possible d’établir un lien entre cette grande utilisation des céphalosporines de dernière génération avec l’apparition de résistances à ces molécules. L’émergence de ces phénomènes pose problème : le risque d’échec thérapeutique augmente malgré l’utilisation de molécules récentes car les résistances passent des bactéries commensales aux bactéries pathogènes. Ceci peut constituer, à terme, un problème majeur en pratique vétérinaire. Le niveau de résistance actuel reste encore modéré ; il serait cependant intéressant de poursuivre et de répéter ce type d’études dans le temps afin de suivre l’évolution du phénomène et de surveiller la rapidité d’apparition de ces résistances. En effet, l’utilisation des céphalosporines de 3ème et 4ème générations étant récente, l’apparition d’ores et déjà de résistances est préoccupante. Enfin, la persistance des gênes de résistances dans l’environnement (NEUWIRTH et al., 2010) mais aussi chez les animaux eux-mêmes (LIEBANA et al., 2006) pendant plusieurs mois (que nous avons pu mettre en évidence chez un bovin sur un mois) constitue également un élément inquiétant pour l’avenir. 65 2. En médecine humaine Cette étude présente aussi un intérêt tout particulier en médecine humaine. Des BLSE ont été mises en évidence pour la première fois en milieu hospitalier humain au début des années 80 (ZAHAR et al., 2009). Depuis, des études ont montré que la prévalence de bactéries capables de synthèse de BLSE chez les hommes a augmenté de manière importante. L’étude de COQUE et al., 2008 montre qu’en Espagne, le taux de porteurs fécaux de bactéries capables de synthèse de BLSE est passé de 1 à 5% chez des patients de passage à l’hôpital et de 1 à 12% chez les patients hospitalisés entre 1991 et 2003. De plus, un rapport de l’European Antimicrobial Resistance Surveillance System (EARSS) cité dans cette même publication pointe l’augmentation permanente de détection d’E.coli et de klebsielles résistantes aux céphalosporines de 3ème génération, avec des prévalences supérieures à 10% dans de nombreux pays. L’apparition de bactéries productrices de BLSE et de céphalosporinases en milieu hospitalier pose de nombreux problèmes car les béta-lactamines y sont très utilisées et des échecs thérapeutiques de plus en plus nombreux sont à craindre. On peut donc voir l’émergence d’un phénomène similaire en médecine humaine que celui que nous venons de mettre en lumière chez les animaux. Le rapport de l’EARSS cité dans la publication de COQUE et al. (2008) permet de bâtir le tableau 21 ci-après : Tableau 22 : Répartition des types de BLSE identifiées chez l’homme en Europe Pays du Nord Pays du Sud Types de BLSE mis en évidence chez l'homme CTX-M 15 CTX-M 1 CTX-M 15 CTX-M 32 CTX-M 1 Etude mettant en évidence ce type chez l'animal MADEC et al., 2008 MADEC et al., 2008 ; NEUWIRTH et al., 2010 ; DOLEJSKA et al., 2011 MADEC et al., 2008 Notre étude MADEC et al., 2008, NEUWIRTH et al., 2010, DOLEJSKA et al., 2011 France CTX-M 1 MADEC et al., 2008, NEUWIRTH et al., 2010, DOLEJSKA et al., 2011 RoyaumeUni CTX-M 15 MADEC et al., 2008 L’étude de ce tableau permet de constater que plusieurs types de BLSE ont pu être mis en évidence à la fois chez l’homme et chez l’animal. En particulier CTX-M 32 que nous avons mis en évidence dans notre étude, se retrouve chez l’Homme dans les pays du sud de l’Europe. Des transferts pourraient donc avoir lieu entre l’Homme et l’animal qui expliqueraient les conclusions de l’étude de ce tableau. L’animal pourrait alors constituer un réservoir de gènes de résistance humain. Un important problème de santé publique se pose alors. 66 Il est de fait nécessaire de s’intéresser aux modalités pratiques du transfert de ces résistances des bactéries commensales vétérinaires aux bactéries commensales humaines (et vice-versa). Les réponses à cette problématique ne sont pas encore complètements établies à ce jour. Il semblerait néanmoins que la consommation de produit d’origine animale entre en jeu (LIEBANA et al., 2006, EFSA, 2011). La proximité entre les hommes et les animaux (que ce soit de rente ou de compagnie) et le partage d’un même environnement intervient certainement également. 67 68 CONCLUSION L’étude réalisée avait pour but de mettre en évidence l’existence de mécanismes de résistance aux céphalosporines dans la flore commensale digestive des ruminants et de les étudier. Les analyses réalisées à partir de prélèvements effectués dans trois exploitations laitières de la région parisienne ont permis l’identification de différents mécanismes de résistance aux céphalosporines chez les bactéries constitutives de cette flore. En particulier, la présence de céphalosporinases et de β-lactamases à spectre étendu (BLSE) a été démontrée. La prévalence de ces enzymes a été déterminée à partir du pool de vaches prélevées provenant des exploitations susmentionnées. Les prévalences calculées sont relativement faibles (2,15% pour les BLSE) indiquant que les résistances existent mais à un niveau encore mesuré. La situation n’en reste cependant pas moins préoccupante puisque la présence de BLSE entraine des échecs thérapeutiques lors de l’utilisation des molécules pourtant récentes que sont les céphalosporines de dernières générations. Leur utilisation dans les diverses filières animales et l’arrivée récente de formes génériques de ces médicaments laisse craindre que le phénomène ne s’amplifie. Il serait intéressant de répéter ce travail régulièrement dans les années qui viennent pour pouvoir suivre l’évolution de la prévalence de ce type de résistance dans la flore commensale et ainsi, adapter les comportements des vétérinaires et des médecins en terme de prescription d’antibiothérapie afin de limiter l’émergence de ce phénomène. Des recommandations ont d’ores et déjà été formulées (EFSA, 2011). La réduction de l’utilisation des céphalosporines de dernière génération et des fluoroquinolones de manière systématique dans les élevages industriels (porcins et aviaires) est, entre autres, suggérée dans le cadre du plan d’action contre l’antibiorésistance mené par l’Etat. Il pourrait également être intéressant de mettre en parallèle dans les différentes filières le développement des mécanismes de résistance avec les modalités d’utilisation d’antibiotiques, afin de déterminer les pratiques à risques et d’affiner les conseils d’utilisation raisonnée. L’application de telles mesures permettrait d’écarter le danger potentiel tant en médecine vétérinaire qu’en médecine humaine. 69 70 BIBLIOGRAPHIE AMATE C et GODARD A (2010). Influence de l’inflammation génitale sur la réussite à l’insémination chez la vache, Thèse Méd. Vét., Alfort n°60 ANDREMONT A. (2006). Rôle de la flore commensale dans la dynamique d’évolution de la résistance bactérienne. Revue francophone des laboratoires, 379 (suppl), 49-50 Antimicrobial suscpetibility discs in Site officiel Bio-Rad [en ligne], [http://www3.biorad.com], (consulté le 19 octobre 2011) BABIC M, HUJER A M, BONOMO R A (2006). What’s new in antibiotic resistance? Focus on beta-lactamases. Drug resistance updates, 9 (3), 142-156 BEBRONE C (2007). Métallo-β-lactamases (classification, activity, genetic organization, structure, zinc coordination) and their superfamily. Biochemical Pharmacology, 74 (12), 1686-1701 BRADFORD P A (2001). Extended spectrum beta-lactamases in the 21st century : characterization, epidemiology and detection of this important resistance threat. Clin. Microbiol. Rev., 14, 933-951 BUSH K, JACOBY G A, MEDEIROS A A (1995). A functional classification scheme for βlactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob. Agents Chemother., 39 (6), 1211-1233 CHEVANCE A, MOULIN G, CHAUVIN C (Novembre 2009). Suivi des ventes de médicaments vétérinaires contenant des antibiotiques en France en 2008. [En ligne] ANSES et Agence Nationale du Médicament Vétérinaire [http://www.anmv.anses.fr/wpcontent/uploads/2011/06/Rap_2008_FR_FINversion24-11-2009.pdf] (Consulté le 24 octobre 2011) CHEVANCE A, MOULIN G, CHAUVIN C (Février 2011). Suivi des ventes de médicaments vétérinaires contenant des antibiotiques en France en 2009. [En ligne] ANSES et Agence Nationale du Médicament Vétérinaire [http://www.anmv.anses.fr/wpcontent/uploads/2011/06/rapport-2009-final.pdf] (Consultée le 13 juillet 2011) COQUE T M, BAQUERO F, CANTON R (2008). Increasing prevalence of ESBL-producing Enterobacteriaceae in Europe. Eurosurveillance, 13 (47), 1-11 DOLEJSKA M, JURCICKOVA Z, LITERAK I, POKLUDOVA L, BURES J, HERA A et al. (2011). IncN plasmids carrying blaCTX-M-1 in Escherichia coli isolates on a dairy farm. Vet. Microbiol., 149 (3-4), 513-516 71 DOWD S E, CALLAWAY T R, WOLCOTT R D, SUN Y, McKEEHAN T, HAGEVOORT R G et al. (2008). Evaluation of the bacterial diversity in the feces of cattle using 16S rDNA bacterial tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP), BMC Microbiol, 8 (125), 18 DUAN R S, SIT T H, WONG S S, WONG R C, CHOW K H, MAK G C et al. (2006). Escherichia coli producing CTX-M beta-lactamases in food animal in Hong-Kong. Microb. Drug Resist., 21(2), 145-148 EDLUND T, NORMARK S (1981). Recombination between short DNA homologies causes tandem duplication. Nature, 292, 269-271 ENRIQUEZ B (2002). Les antibiotiques en médecine vétérinaire ; pharmacologie et toxicologie expérimentales et cliniques. Polycopié. Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort, Unité Pédagogique de Pharmacie et Toxicologie, 157p. Fiches médicaments in Vidal en ligne [en ligne], [http://www.vidal.fr/fiches-medicaments], (consulté le 19 octobre 2011) GARREC H, DRIEUX-ROUZET L, GOLMARD J-L, JARLIER V, ROBERT J (2011). Comparison of Nine Phenotypic Methods of Extended Spectrum β-lactamase Production by Enterobacteriaceae. J. Clin. Microbiol, 49 (3), 1048-1057 GESER N, STEPHAN R, KUHNERT P, ZBINDEN R, KAEPPELI U, CERNELA N et al. (2011). Fecal carriage of extended-spectrum-β-lactamase-producing Enterobacteriaceae in swine and cattle at slaughter in Switzerland. J. Food Prot., 74(3), 446-449 GOGNY M, MARTEL J L, PELLERIN J L, POULIQUEN H, PUYT J D, VANDAELE E (2011). Dictionnaire des Médicaments Vétérinaires, 16e édition. Editions du Point Vétérinaire, Rueil-Malmaison, 2074 pages. GOOTZ T D (1990). Discovery and development of new antimicrobial agents. Clin. Microbiol. Rev., 3 (1), 13-31 GRAVE K, FRØKJÆR JENSEN V, MCEWEN S, KRUSE H (2006). Chapter 22 : Monitoring of antimicrobial drug usage in animals : methods and application. In : AARESTRUP F M. Antimicrobial resistance in bacteria of animal origin, ASM Press, Washington DC, 445 pages GUERIN-FAUBLEE V (2010). Les mécanismes de résistance des bactéries aux antibiotiques. In : Journées Nationales des GTV, Lille, 26-27-28 juillet 2010, 93-102 GUILLEMOT D, BRISABOIS A, BRUGERE H, GUILLOT J F, LAVAL A, MILLEMANN Y et al. (2006).Usage vétérinaire des antibiotiques, résistance bactérienne et conséquences pour la santé humaine. [En ligne]. Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments [http://lesrapports.ladocumentationfrancaise.fr/BRP/074000079/0000.pdf] (consultée le 13 juillet 2011) 72 HARDMAN J G, LIMBIRD L E (1998). Les bases pharmacologiques de l’utilisation des medicaments, 9th edition. Nieuwegein, Pays-Bas, Mc Graw-Hill, 1069-1098 HORTON R A, RANDALL L P, SNARY E L, COCKREM H, LOTZ S, WEARING H et al. (2011). Fecal carriage and shedding density of CTX-M extended-spectrum β-lactamases producing E. coli in cattle, chicken and pigs : implications for environmental contamination and food production. Appl Environ. Microbiol., 77(11), 3715-3719 JENSEN U S, MULLER A, BRANDT C T, FRIMODT-MØLLER N, HAMMERUM A M, MONNET D L (2010). Effect of generics on price and consumption of ciprofloxacin in primary healthcare: the relationship to increasing resistance. J Antimicrob Chemother., 65, 1286–1291 LI X Z, MEHROTRA M, GHIMIRE S, ADEWOYE L (2007). Beta-Lactam resistance and beta-lactamases in bacteria of animal origin. Veterinary microbiology, 121, 197-214 LIMBERT M, ISERT D, KLESEL N, MARKUS A, SEEGER K, SEIBERT G et al. (1991). Antibacterial activities in vitro and in vivo and pharmacokinetics of Cefquinome (HR111V), a new broad spectrum cephalosporin. Antimicrob. Agents Chemother., 35 (1), 14-19 LIEBANA E, BATCHELOR M, HOPKINS K L, CLIFTON-HADLEY F A, TEALE C J, FOSTER A et al. (2006). Longitudinal farm study of Extended-Spectrum β-lactamasesmediated resistance. J. Clin. Microbiol., 44 (5), 1630-1634 MADEC J Y, MEUNIER D (2006). Résistances aux béta-lactamines : les entérobactéries résistent aux troisièmes générations. Point Vétérinaire, 264, 12-13 MADEC J Y, CALAVAS D (2010). Surveillance de la résistance chez les bactéries de portage chez l’animal de production. In : Journées Nationales des GTV Lille, 26-27-28 juillet 2010, 115-118 MADEC J Y, LAZIZZERA C, CHATRE P, MEUNIER D, MARIN S, LEPAGE G et al (2008). Prevalence of fecal carriage of acquired expanded spectrum cephalosporin resistance in enterobacteriaceae strain from cattle in France. J. Clin. Microbiol., 46, 1566-1567 MAINIL J, DUCHESNES C, MUYLAERT A (2010). Antibiorésistances : une « maladie » génétique contagieuse des bactéries. In : Journées Nationales des GTV Lille, 26-27-28 juillet 2010, 103-107 MILLEMANN Y, POIREL L (2010). Effets collatéraux de l’antibiothérapie sur la flore commensale. In : Journées Nationales des GTV Lille, 26-27-28 juillet 2010, 31-36 NEUWIRTH C, GUENEAU E, RANJARD L, DEQUIET S, JOLIVET C, DEPRET G et al (2010). Détection de sources animales et environnementales de souches d’E. coli productrice de BLSE à l’échelle d’une région française (Bourgogne). In : Journées Nationales des GTV Lille, 26-27-28 juillet 2010, 695-700 73 PITOUT J D, LAUPLAND K B (2008). Extended-spectrum beta-lactamase-producing enterobacteriaceae : an emerging public-health concern. Lancet Infectious Disease, 8 (3), 159166 PIZETTE F (2007). Mécanismes de résistance aux oxyimino-céphalosporines de souches d’E. coli d’origine animale. Thèse Méd. Vét., Lyon n°81, 101 pages PHILIPON A, ARLET G (2006). β-lactamases de bacilles à Gram négatif : le mouvement perpétuel ! Ann. Biol. Clin., 64 (1), 37-51 PLUMB D C (1999). Veterinary drug handbook, 3rd edition. Ames, Iowa, Blackwell, 113 PRESCOTT J F (2006). Beta-lactams antibiotics : cephalosporins. In : GIGUERE S, PRESCOTT J F et al. Antimicrobial therapy in veterinary medicine. Ames, Blackwell, 139158 RIVIERE J E, PAPICH M G (2009). β-lactams antibiotics : penicillins, cephalosporins and related drugs. In : Veterinary pharmacology and therapeutics, 9th edition. Ames, Iowa, WileyBlackwell, 865-894 SALVE P (1995). Les céphalosporines en thérapeutique bovine. Thèse Méd. Vét., Lyon, n°40, 136 pages SALYERS A A, GUPTA A, WANG Y (2004). Human intestinal bacteria as reservoirs for antibiotic resistance genes. Trends in Microbiology, 12 (9), 412-416 SALYERS AA, MOON K, SCHLESSINGER D (2007). The human intestinal tract – a hotbed of resistance gene transfer. Clinical microbiology newsletter, 29 (3), 17-21 SANDERS P, DELANNOY S, BRISABOIS A, BRUNEAU M, CALAVAS D, CHAUVIN C et al. (2010). FARM 2007-2008, Programme français de surveillance de l’antibiorésistance des bactéries d’origine animale – Rapport 2007-2008. [En ligne] Agence nationale de sécurité sanitaire de l’alimentation, de l’environnement et du travail (ANSES). [http://www.anses.fr/Documents/SANT-Ra-FARM2008.pdf]. (Consulté le 30 octobre 2011) Scientific Opinion on the public health risks of bacterial strains producing extended-spectrum β-lactamases and/or AmpC β-lactamases in food and food-producing animal (2011) [En ligne] European Food Safety Authority (EFSA). [http://www.sauvonsnosantibiotiques.org/media/client/gridfichier/efsa_110802_blse.pdf] (Consulté le 30 octobre 2011) SØRUM H, SUNDE M (2001). Resistance to antibiotics in the normal flora of animals. Vet. Res., 32 (3-4), 227-241 VERDET C. Organisation génétique des céphalosporinases acquises [en ligne] Université Paris VI Pierre et Marie Curie [http://www.microbeedu.org/mecanisme/conference/verdet2.pdf] (consulté le 25 octobre 2011) 74 VIDON O, BOURDIN C.(Mars 2005) Béta lactamase à spectre étendu – Intérêt porté aux CTX-M [PPT], Lyon : Université – UMR 5558 [http://umr5558-mq1.univlyon1.fr/deslyon/Bact%C3%A9riologieS%C3%A9minaires/B%C3%A9taLactamasesSpectre Etendu?action=AttachFile&do=get&target=B%C3%A9taLactamases.ppt] (consulté le 09 juillet 2011) WASYL D, HASMAN H, CAVACO L M et AARESTRUP F M (2011). Prevalence and characterization of cephalosporin resistance in nonpathogenic E. coli from food producing animals slaughtered in Poland. Microbial Drug Resistance, 00, 1-4 WALKER R D (2006). Antimicrobial susceptibility testing methods and interpretation of results. In : GIGUERE S, PRESCOTT J F et al. Antimicrobial therapy in veterinary medicine. Ames, Blackwell, 11-25 WILSSENS A, BUTTIAUX R (1958). Les bactéries de la flore fécale de la vache saine. In : Annales de l’institut Pasteur, volume 94, Paris, Masson et Cie, 332-340 ZAHAR J R, BILLE E, SCHNELL D, LANTERNIER F, MECHAI F, MASSE V et al (2009). Extension of β-lactamases producing bacteria is a worldwide concern. Med Sci (Paris), 25 (11), 939-94 75 RÉSISTANCE AUX CÉPHALOSPORINES DANS LA FLORE COMMENSALE DIGESTIVE DES RUMINANTS NOM et Prénom : PANNAUX Glenn Résumé : Les céphalosporines sont des antibiotiques couramment utilisés tant en médecine humaine qu’en médecine vétérinaire. L’apparition et la diffusion de mécanismes de résistance à ces molécules au sein de bactéries pathogènes posent donc de nombreux problèmes car la résistance est à l’origine d’échecs thérapeutiques. Les bactéries pathogènes ne sont pas les seules à héberger de tels mécanismes. La présente étude avait pour but la mise en évidence de résistances aux céphalosporines au sein de la flore commensale digestive des ruminants et l’identification des supports moléculaires de ces résistances. Cent quatre vingt six prélèvements de fèces ont donc été réalisés dans 3 élevages de la région parisienne. Des antibiogrammes ont été réalisés sur les bactéries résistantes aux céphalosporines afin d’identifier les mécanismes entrant en jeu. Sur les 186 vaches prélevées à une seule reprise, 14 hébergeaient des bactéries résistantes aux céphalosporines. Parmi ces bactéries, 4 étaient capables de synthèse de béta-lactamases à spectre étendu (prévalence : 2,15%) et 10 étaient capables de synthèse de céphalosporinases (prévalence : 5,38%). Des mécanismes de résistance aux céphalosporines sont donc bien présents dans la flore digestive des ruminants, mais pour le moment, dans des proportions encore limitées. Les mécanismes découverts étant les mêmes chez l’homme et l’animal, ces résultats posent tout de même problème en termes de santé publique. ANTIBIOTIQUE / CÉPHALOSPORINE / RÉSISTANCE AUX MÉDICAMENTS / FLORE DIGESTIVE / BÉTA-LACTAMASE A SPECTRE ETENDU / SANTÉ PUBLIQUE / RUMINANT / HOMME Mots clés : Jury : Président : Pr. Directeur : Dr. Yves MILLEMANN Assesseur : Dr. Dominique REMY Invité : Dr. Laurent POIREL RESISTANCE TO CEPHALOSPORINS IN GASTROINTESTINAL COMMENSAL FLORA OF RUMINANTS SURNAME : PANNAUX Given name : Glenn Summary : Cephalosporins are antibiotics that are often used in veterinary medicine as well as in human medicine. The emergence and spread of resistance mechanisms against these molecules in pathogenic bacteria are responsible for several problems and lead to a number of therapeutic failures. Nevertheless, commensal bacteria can also harbour such mechanisms. The current study aimed at detecting resistances to cephalosporins in gastrointestinal commensal flora of ruminants and at identifying the molecular supports of those resistances. For that purpose, 186 feces were sampled from 186 cows in 3 different farms from the surroundings of Paris. Antibiograms were performed on bacteria resistant to cephalosporins in order to identify the mechanisms that were involved. Fourteen out of the 186 tested cows harboured bacteria resistant to cephalosporins. Among those bacteria, 4 were able to produce extended-spectrum beta lactamases (prevalence : 2.15%) and 10 were able to produce cephalosporinases (prevalence : 5.38%). Resistance mechanisms to cephalosporins do exist in the digestive flora of ruminants, but for now, to a limited extent. As the mechanisms are the same in human and animals, these results stress the fact that this problem is a growing concern in terms of human public health. Keywords : ANTIBIOTIC / CEPHALOSPORIN / RESISTANCE TO DRUGS / DIGESTIVE FLORA / EXTENDED SPECTRUM BETA-LACTAMASES / PUBLIC HEALTH / RUMINANT / HUMAN Jury : President : Pr. Director : Dr. Yves MILLEMANN Assessor : Dr. Dominique REMY Guest : Dr. Laurent POIREL