Proposition d`exercices

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UNIVERSITÉ PARIS Est-Créteil
FACULTÉ DES SCIENCES ET TECHNOLOGIE
Numéro d'anonymat……………………………..
DS du 20 ma1 2011
LES CALCULATRICES NE SONT PAS AUTORISEES
ÉPREUVE DE BIOCHIMIE L1S2
DURÉE : 1 h 30
Questions de cours
1 Quelle est différence d’action de la soude sur une molécule d’ADN et sur une molécule d’ARN ?
Pourquoi ?
-
L’action de la soude sur l’ARN va résulter en l’hydrolyse alcaline avec les OH qui attaquent les fonctions alcool
des riboses en 2’ ce qui a pour conséquence l’hydrolyse de la liaison phosphodiester et libération des nucléotides
sous forme 2’ ou 3’ phosphorylés.
En revanche, la soude n’a aucune action sur l’ADN du fait de l’absence de fonction alcool en 2’.
2 Quelles sont les spécificités d’une enzyme de restriction ?
Une enzyme de restriction est une enzyme qui catalyse l’hydrolyse de la liaison phosphodiester en deux endroits
précis (un sur chaque chaîne) d’un ADN bicaténaire. Le site de restriction est une séquence reconnue par cette
enzyme. C’est très souvent un palindrome.
Elle va générer des extrémités cohésives ou des extrémités franches.
3 La figure ci-dessous représente une base pyrimidique associée à sa base purique habituelle.
Compléter la figure
– en inscrivant dans chaque cercle le symbole de chaque atome de la molécule
– en donnant le nom des bases ici représentées
– en numérotant les atomes de cycles
– en plaçant les doubles liaisons
– en indiquant en pointillé les liaisons H
– en ajoutant les sucres (à l’endroit des flèches) et en numérotant les atomes des sucres
– en ajoutant les phosphates
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Cytosine
H
Guanine
N
H
0
C
C
1
N
3’ 2’
1’
4’
O
3
2
N
C
5 4
C 6
DURÉE : 1 h 30
N
H
N1
2
C
C
O
H
6 5
4
3
7
C
N
C
C
8
9N
CH2 P
5’
O
1’
2’
4’
3’
N
H
CH2 P
5’
4 Où retrouve-t-on généralement les résidus d’acides aminés à chaîne latérale hydrophobe : dans la
partie centrale ou sur la périphérie d’une protéine globulaire ? Justifier.
Les protéines globulaires étant en majorité des protéines solubles, on retrouvera les résidus d’acides aminés à
chaîne latérale hydrophile en contact avec le milieu aqueux, donc sur la périphérie de la protéine alors que les
chaînes latérales hydrophobes interagiront par interactions hydrophobes pour minimiser les contacts avec le
milieu aqueux et seront donc dans le cœur de la protéine.
5 Que peut-on déduire d’une électrophorèse de protéines dans un gel en présence de dodécylsulfate de
sodium ?
Puisque lors d’une électrophorèse de protéines dans un gel en présence de SDS , on ne sépare les protéines qu’en
fonction de leur masse, à condition d’avoir un mélange de protéines dont les masses moléculaires sont connues,
on pourra estimer la masse moléculaire de protéines inconnues (en reportant sur un graphe : log PM = f(d) avec
d, la distance parcourue par la protéine depuis le dépôt.
6 Etablir l’équation de Michaelis-Menten dans le cas d’une inhibition compétitive en précisant le cas
échéant les relations existant entre les caractéristiques cinétiques (KM et K’M ; Vmax et V’max)
CH
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Exercice 1 : Acides nucléiques
La composition d’un des deux brins d’ADN est A = 27 % et G = 22 %.
Que peut-on dire des pourcentages de T et de C pour le même brin ?
A + G = 27 + 22 = 49. Donc (A+G = 49%)
Ce qui implique que (C+T) = 100- (A+G) = 100 – 49 = 51 %
Peut-on donner avec précision le pourcentage des 4 bases pour l’autre brin ?
Dans la mesure où le deuxième brin est complémentaire du premier on aura %Abrin 1 = %T brin 2 ;
donc sur le brin 2 on aura 27% de T et 22 % de C
Comme on n’avait pu déterminer avec précision le % de T et le % de G sur le premier brin, on ne pourra pas
davantage savoir précisément le % de A et le % de G sur le deuxième brin. On peut seulement dire que l’on aura
(G+C) = 51%
Exercice 2 : Détermination d’un pentapeptide cérébral : la leucine-encéphaline
Certains peptides qui influencent la transmission nerveuse dans certaines parties du cerveau ont été isolés à
partir de cerveaux sains. Ces peptides sont connus comme « opioïdes » parce qu’ils se fixent sur les récepteurs
spécifiques de molécules opiacées telles que la morphine. Les opioïdes miment effectivement certaines
propriétés des opiacées. Ces peptides interviennent dans l’analgésie et dans la modulation de la réponse
immunitaire.
En utilisant les informations ci-dessous, déterminez la séquence de la leucine-encéphaline. Pour chacune des
expériences utilisées, vous préciserez clairement le rôle de chacun des réactifs et indiquerez les conclusions que
l’on peut tirer du résultat obtenu :
1°) Une hydrolyse acide totale libère Gly, Leu, Phe et Tyr dans des proportions 2/1/1/1.
L’hydrolyse acide totale (HCL 6N, 110°C, 24 h) va permettre d’hydrolyser toutes les liaisons peptidiques et de
libérer tous les acides aminés, mais va transformer les amides des chaînes latérales de l’asparagine et de la
glutamine respectivement en acide aspartique et acide glutamique. De plus, cette hydrolyse détruit le
tryptophane.
Pour l’instant rien ne nous permet de dire s’il y a ou non du Trp dans le peptide. En revanche pas de Gln, Glu, Asn
ni Asp.
On sait seulement que l’on a 2 Gly, 1 Leu, 1 Phe, et 1 Tyr
2°) Le traitement ménagé du peptide avec du PITC met en évidence du PTH-Tyr.
Le PITC (ou réactif d’Edman) réagit avec l’amine située à l’extrémité N-terminale du peptide. Cette réaction
provoque l’hydrolyse de la première liaison peptidique et libère le premier résidu sous forme PTH-AA.
La Tyr est donc le premier résidu du peptide.
NTyr - ………….
3°) L’action ménagée de la carboxypeptidase libère une Leu.
La carboxypeptidase est une endoprotéase qui catalyse l’hydrolyse de la dernière liaison peptidique (côté Cteminal). Dans des conditions ménagées, elle ne conduira à l’hydrolyse que de la dernière liaison peptidique. Dans
le cas où on la laisse agir longtemps, elle peut entièrement hydrolyser la protéine (ou le peptide).
On en conclut ici que la leucine est le résidu C-terminal.
NTyr - ………………….. - LeuC
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4°) La digestion du peptide par la chymotrypsine libère deux acides aminés différents et un tripeptide.
La chymotrypsine est une endoprotéase qui catalyse l’hydrolyse de la liaison peptidique qui suit les acides aminés
aromatiques (Tyr, Phe, Trp).
La première hydrolyse est nécessairement la première liaison peptidique (puisque le premier résidu est une Tyr).
Il y a ensuite deux réponses possibles :
 Soit la deuxième liaison hydrolysée est la deuxième liaison ce qui signifie que l’acide aminé en
position 2 est un acide aminé reconnu par la chymotrypsine : ici, c’est donc Phe. Dans ce cas, le
tripeptide est constitué des 2 glycines et de la leucine terminale, ce qui fait pour le peptide :
NTyr – Phe – Gly – Gly – LeuC

Soit la liaison hydrolysée est la dernière liaison ce qui signifie que l’acide aminé en avant-dernière
position est un acide aminé reconnu par la chymotrypsine : ici, c’est donc Phe, et l’acide aminé
libéré est la leucine terminale. Dans ce cas, le tripeptide est constitué des 2 glycines et de la Phe :
NTyr – Gly – Gly – Phe – LeuC
Etant donné les informations dont nous disposons, nous ne pouvons pas savoir quelle est la bonne séquence.
Exercice 3 : Enzymologie
En présence de dibutyl-phtalate, l’activité de la β-glucosidase est inhibée de manière non-compétitive et les
résultats suivant sont obtenus :
Vi (µmol/min)
[substrat] µM
0,05 0,121
1
2,26
0,3
5
0,54
8
0,8
15
0,9
18
1- Quel(s) paramètre(s) caractéristique(s) de l’enzyme va/vont être modifié(s) par la présence de cet
inhibiteur ? justifier votre réponse.
Un inhibiteur non compétitif modifie la Vmax sans changer la KM.
L’inhibiteur non compétitif ne rentre pas dans le site actif de l’enzyme, il n’intervient pas sur
l’affinité de l’enzyme pour son substrat mais ralentit la vitesse de la réaction.
2- A partir de valeurs présentées dans le tableau, quel graphique choisissez-vous de tracer pour
obtenir les résultats les plus précis possible ? Justifier votre réponse.
La façon la plus précise pour obtenir KM et Vmax, est la représentation de Lineweaver-Burk :
1/Vi = f()
La représentation classique de Michaélis-Menten : Vi = f(*S+), permet d’obtenir Vmax en traçant
l’asymptote correspondant au plateau vers lequel tend la courbe. C’est donc une valeur difficile à obtenir
avec précision. Pour KM, comme on l’obtient sur cette même courbe, en prenant l’abscisse du point qui a
pour ordonnée Vmax/2.
Dans la représentation de Lineweaver-Burk, on trace la droite 1/Vi = f(1/[S]) et c’est les
intersections de cette droite avec l’axe des abscisses et l’axe des ordonnées qui donnent respectivement
1/KM et 1/Vmax.
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3- Faites le schéma rapide du graphique choisi, en y faisant aussi figurer la courbe théorique de
l’activité de l’enzyme en absence de dibutyl-phtalate et à une concentration 2 fois supérieure à
celle utilisée.
1/Vi
1/V’max
1/Vmax
1/[S]
-1/KM
4- Si l’on se place à une concentration de substrat égale au KM de l’enzyme, quel est le pourcentage de
sites actifs de l’enzyme qui seront occupés par le substrat ? même question en présence de dibutylphtalate ?
Une concentration de substrat égale au KM de l’enzyme permet d’obtenir la moitié de la vitesse maximale
(définition de KM). On peut donc en conclure que seuls 50% des sites actifs de l’enzyme sont occupés.
Dans le cas où l’on a rajouté l'inhibiteur, puisque celui-ci n'intervient pas sur le site de fixation du substrat, on
a le même pourcentage de sites actifs occupés.