Simonnet Jean Semestre 5 Chateigner Aurélien Compte rendu de travaux pratiques Analyse Génétique chez la Drosophile, étude de souches balancées I. Introduction Le but de notre TP est de déterminer les génotypes de drosophiles, résultants de croisement entre deux individus hétérozygotes de la même souche balancée, à partir de l’étude de leurs phénotypes. On déterminera, pour chaque souche, de quel type de mutation il s’agit, ce qu’elle engendre, et à quel stade du cycle de vie de la drosophile elle intervient. On pourra alors expliquer la notion de souche balancée et approcher la notion d’effet maternel, à travers une série de croisement de 1ère et 2ème génération. II. Expériences A. Souche balancée Y Un croisement a été réalisé entre un mâle et une femelle de la souche pure hétérozygote Y//bal Après comptage de mouches résultant de ce croisement, on a dénombré les drosophiles des classes suivantes : Femelles Mâle B. Phénotype [bal] (ailes échancrées, soies courtes et épaisses) 526 648 Phénotype sauvage 16 24 Souche balancée X Un croisement a été réalisé entre un mâle et une femelle de la souche pure hétérozygote X//bal. Après comptage de mouches résultant de ce croisement, on a dénombré les drosophiles des classes suivantes, sans distinction de sexe (inutile) : Phénotype [bal] (ailes échancrées, soies courtes et épaisses) 765 Phénotype sauvage 404 Deux croisements de 2ème génération ont été effectués : - L’un entre un mâle X//X issu du croisement précédent et une femelle sauvage L’autre entre une femelle X//X issue du croisement précédent et un mâle sauvage Pour le premier, on constate que le croisement est viable, des œufs ayant été pondus, et des larves ayant éclos. Pour le second, des œufs ont été pondus, mais ils ne se sont pas développés. 1 Simonnet Jean III. Semestre 5 Chateigner Aurélien Interprétations A. Souche balancée Y Un chromosome balancé ne peut être qu’un autosome étant donné qu’il y a un déséquilibre, au niveau des chromosomes sexuels entre mâles et femelles, qui rendrait impossible cette notion pour le mâle qui possède 2 chromosome sexuels différents. On constate par les faits qu’il n’y a pas d différence entre les mâles et les femelles. Si on fait un test de χ² : (𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂é𝑠𝑠 − 𝑡𝑡ℎé𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜)2 (587 − 526)2 (587 − 648)2 = + = 6,3 𝑡𝑡ℎé𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜 1174 1174 Pour un risque 5% de se tromper, avec un degré de liberté de 1 (car 2 phénotypes : ddl = nombre de classe - 1), le χ² trouvé doit être inférieur à 3,8 pour vérifier l’hypothèse. Ici, ce n’est pas le cas. Cependant, on sait par le fait que ce sont des souches balancées que la mutation est portée par un autosome, on peut donc conclure à une erreur de comptage et d’appréciation entre les mâles et les femelles. Pour étudier cette souche, nous avons fait un tableau de croisement, à partir des génotypes parentaux. Chaque parent apporte soit la mutation balancée, soit la mutation Y : Mâle\femelle /Bal Y/ Bal/ /Y Y//Bal Bal//Bal Y//Y Bal//Y Y//Y : phénotype Y létal On voit que c’est une mutation qui touche le zygote, la mutation homozygote Y, au niveau de l’embryon, l’empêche de se développer. Cependant, certains de ces phénotypes ont été dénombrés, certainement à cause d’erreurs d’appréciation des phénotypes. Bal//Bal : phénotype Bal létal Le double balancé est par définition inviable, les inversions provoquent des anomalies au niveau des gènes, qui ne peuvent donc plus être fonctionnels. Y//Bal et Bal//Y : Phénotype Bal viable Le seul que l’on doit observer normalement. L’hétérozygote Y//Bal donne un phénotype particulier non létal. Principe des souches balancées : On considère 5 marqueurs a, b, c, d et e, situés sur la paire de chromosomes portant la mutation Y. a Y b c d e d c b e Ch normal a Ch balancé Séquence inversée Le chromosome balancé possède donc une inversion (plusieurs en réalité, mais une suffit pour la démonstration). Pour recombiner, lors de la division de méiose, au niveau des gamètes mâles et des 2 Simonnet Jean Semestre 5 Chateigner Aurélien gamètes femelles, le chromosome doit former une boucle appelée boucle d’inversion, au niveau de la région inversée de notre schéma. c C.O. c a b d b d e a e C.O. : crossing over Si un crossing over a lieu sur la boucle, au cours de la méiose, comme indiqué ci-dessus, on aura la configuration suivante des chromosomes : a Y b c b a Ch normal e d c d e Ch balancé On obtient donc un chromosome avec 2 centromères qui sera détruit lors de la division cellulaire et un deuxième qui sera perdu car il ne possède pas de centromère. Les gamètes issus de crossing-over ne seront donc pas viables, seuls ceux de phénotypes parentaux seront conservés. Cette technique permet de conserver des individus hétérozygotes au fil des générations. On a donc une lignée pure hétérozygote. B. Souche balancée X Comme précédemment, la mutation X est présente au niveau d’un autosome. Faisons le tableau de croisement : Mâle\Femelle X Bal X X//X X//Bal Bal Bal//X Bal//Bal On sait que Bal//Bal est létal. Dans 2/3 des cas, on aura X//Bal, et dans 1/3, X//X. On pose donc l’hypothèse que X//X donne le phénotype sauvage observé, étant donné qu’on observe à peu près 1/3 de mouches sauvages en apparence. On n’observe donc que ¾ des descendants théoriques, et ici, 2/3 de ces descendants sont sensé être de phénotype Bal. Nous avons, 765 mouches sur 1109 mouches qui sont de phénotype Bal, d’après les comptages totaux, et 404 de phénotype sauvage en apparence. A la vue de ce total de drosophiles, on aurait théoriquement dû obtenir un nombre de mouches de phénotype Bal de 739, et 370 de phénotype sauvage. Pour valider notre hypothèse, il faut faire un test de χ2. 3 Simonnet Jean Semestre 5 Chateigner Aurélien (𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂𝑂é𝑠𝑠 − 𝑡𝑡ℎé𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜)2 (765 − 739)2 (404 − 370)2 = + = 1,7 𝑡𝑡ℎé𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜 1109 1109 Pour une erreur de 5%, avec 2 phénotypes, et donc un degré de liberté de 1, le χ² doit être inférieur à 3,8 pour vérifier l’hypothèse. On peut donc confirmer notre hypothèse. Interprétation des croisements de deuxième génération : On constate que des œufs ont été pondus, mais qu’il n’y a eu descendance que dans le cas ou c’est le père qui portait la mutation, on observe alors des larves. Les œufs, issus du croisement où la mère porte la mutation, n’ont pas dépassé le stade œuf, ils ne sont pas parvenus au stade larvaire, contrairement à l’autre croisement. On peut supposer que dans le cas où la mère portait la mutation X//X, qu’il y a eu un effet maternel sur le développement de la descendance. Nous avons observé des coupes d’embryon aux stades précoces, et on a constaté une disposition spécifique de denticules, crochets qui serviront au déplacement de la larve. On constate chez le sauvage une disposition en 8 rangées de denticules, à intervalles réguliers, de la partie antérieure à la partie postérieure de l’embryon. Figure 1 : observation au microscope optique d'un embryon sauvage de drosophile A l’inverse, sur la larve mutée, on constate une désorganisation des denticules, il n’y a pas de formation d’une partie antérieure, mais de 2 parties postérieures. Figure 2 : observation au microscope optique d'un embryon muté de drosophile 4 Simonnet Jean Semestre 5 Chateigner Aurélien En effet, l’œuf fécondé se sert des réserves apportées par l’ovocyte de la mère au cours des premiers stades de développement. La mutation X chez la mère provoque une production d’ARN défectueux, qui ne peuvent plus jouer leur rôle, et n’apportent alors pas l’information permettant à l’embryon de continuer son développement. Cette mutation ici présente est appelée bicoïde. On comprend alors facilement que dans le cas de la mutation touchant le père, il n’y a aucun effet sur le développement embryonnaire. IV. Conclusion Dans ce TP, nous avons, à partir de la connaissance des phénotypes parentaux, et par de simples comptages phénotypiques et tableaux de croisements, associé un génotype à un phénotype observable. Le travail réalisé à partir de souches balancées, a permis de montrer, puis de comprendre, que ce sont ces lignées pures hétérozygotes. On peut nuancer cette considération en introduisant la notion d’effet maternel vue également au travers de ce TP, qui montre qu’à partir d’un croisement entre deux individus de cette lignée, on obtient une descendance homozygote, dont les mâles pourront se reproduire et donner des descendants à priori normaux, et où les femelles également se reproduiront mais donneront des œufs non viables. Ceci est dû au fait que la mutation touche un élément de séquence codant pour une substance fournie par la mère et présente dans l’ovocyte, nécessaire au bon développement de l’embryon. 5