DU TORINO - TP

Diplôme Universitaire
de Carcinologie Thoracique Intégrée :
Travaux Pratiques
Stratégies diagnostiques
dans le traitement du
cancer du poumon
Coordonnateur : Eric Morel (UP-Sud)
Participants :
Guillaume Bernadat (UP-Sud)
Ludovic Lacroix (IGR)
Isabelle Turbica (UP-Sud)
Organisation de la journée
9:30 – 10:00
Salle EH36
Cancer du poumon : aspects de biologie moléculaire et diagnostic. Elaboration d’un
protocole d’analyse d’un échantillon par PCR. Exposé des cas cliniques.
Ludovic Lacroix
10:00 – 12:00
Salle EH36
Extraction d’ADN à partir des lignées cellulaires HCC827 et H1975 mutées sur le
gène de l’EGFR.
Réalisation des PCR. Préparation des gels de migration.
Ludovic Lacroix / Eric Morel / Isabelle TURBICA
12:30 – 13:30
Déjeuner
13:30 – 14:30
Salle EH36
Etude de la séquence nucléotidique de l’EGFR : manipulation de bases de
données et d’un logiciel pour l’élaboration d’amorces de PCR diagnostique,
permettant de mettre en évidence des mutations ponctuelles L858R et la
délétion E746-A750 du récepteur EGFR
Ludovic Lacroix / Eric Morel / Isabelle TURBICA
14:30 – 15:30
Salle EH36 / EH28
Digestion enzymatique des amplicons et/ou analyse des produits de PCR par
migration sur gel de polyacrylamide résolutif. Détermination du seuil de
sensibilité de la technique
Ludovic Lacroix / Eric Morel / Isabelle TURBICA
15:30 – 16:30
Salle DH90
Initiation à la biologie structurale et modélisation moléculaire.
16:30 – 17:30
Analyse des études de cas en corrélation avec les résultats de PCR obtenus en
travaux pratiques.
Détermination sur station de travail, de la structure par radiocristallographie
du complexe entre l’EGF et la partie extracellulaire de son récepteur ainsi
que la localisation des mutations affectant cette dernière, pouvant être
visualisées. Afin de mieux comprendre l’impact de certaines de ces
mutations, les interactions de petites molécules à visée thérapeutique (type
erlotinib) avec les formes naturelle et mutante du récepteur pourront ensuite
être simulées à l’aide d’un logiciel d’amarrage moléculaire et comparées.
Guillaume Bernadat
Ludovic Lacroix / Eric Morel / Isabelle TURBICA
29/04/2016
2
Techniques de base
Techniques d’analyse de mutations
(ponctuelle ou petite delins)
Techniques
sans a priori
Techniques
ciblées
Pic EGFR sauvage
Délétion
de 21bp
Délétion
de 9 bp
• Séquençage (direct /Sanger)
• Gold standard
• Seuil 20% Cell.Tum
• « long »
• HRM (criblage)
• Pyroséquençage
• NGS
•
•
•
•
•
Discrimination allélique
Q-PCR (CAST /Scorpion…)
PCR allèle spécifique
Analyse de fragments/restriction
…
• Variées/variables
• Seuil de 20 à 1%
• rapide
Direct sequencing « Gold standard Method» :
(+) 5’- A T C T
• Sanger Sequencing :
based on ddNTPs (dye terminator)
- Amplitaq DNA polymerase : Cycle sequencing
T A G
A ... - 3’(+)
(-) 3’- T A G A A T C
T ... - 5’(-)
amorce 5’- dA dT ddC
amorce 5’- dA dT dC ddT
amorce 5’- dA dT dC dT ddT
amorce 5’- dA dT dC dT dT ddA
amorce 5’- dA dT dC dT dT dA ddG ....
A
T
C
G
Laser
Analyse de chromatogramme en fin de journée
Méthodes du TP
Analyse de fragments
WT
PCR
207 pb
Del 18bp
exon19
190 pb
migration
Bouin
Formol
Nb section
( 30µm)
1
2
5
8
L C
L C
L C
L C
1
L C
Formol
Nb5section
1CTR 2
8
( 30µm)
L C L C L C L LC C L NC
2
207 pb
190 pb
L
Méthodes du TP
Analyse de fragments de restriction
222 pb
WT
PCR
c.2573 G>T
221 pb
175 pb
Digestion
Sau91
47 pb
47 pb 88 pb
222 pb
87 pb
migration
Formol
Nb section
( 30µm)
Nb
1 section
2
(Nb
30µm)
section
L C L C
( 30µm)
Bouin
Bouin
Formol
Formol
Bouin
Formol
Nb
section
5
1
82
5
8
1CTR
28
5CTR 8
1
2
51
82
5
( 30µm)
L 1C L 2C LL5CC LL8CC LL1CC L L2CCL LC5C L LNC8C L LCTR
C C L NC
L C L C L C L C221L pb
C L C L C L C L C N
175 pb
86 pb
L
Plan expérimental
Organisation des manipulations

Extraction d’ADN
> Caco-2 - Lignée Control –EGFR WT (Colorectal adenocarcinoma)
> HCC827
• H.sapiens, lung, adenocarcinoma, 39yrs, female, Caucasian …
• EGFR NM_005228; c.2236_2250del15. p.Glu746_Ala750del
> NCI-H1975
• H.sapiens, lung, adenocarcinoma, female…
• EGFR NM_005228; c.2573T>G; p.Leu858Arg (p.L858R)
(et c.2369C>T; p.Thr790Met ou p.T790M)

PCR (Exon 19 et Exon 21)

Digestion avec des enzymes de restriction (pour exon 21)

Dépôt sur Gel (QIA-Xcel)

Analyse des résultats
29/04/2016
9
EXTRACTION
Lyse des cellules et extraction de l’ADN total
Utilisation du kit d’extraction d’ADN total: Extract-N-Amp™ Tissue
PCR kit (SIGMA)

>
>
>
>
>
>
100µL Extraction Solution
25µL Tissue Preparation Solution (proteinase K)
Vortexer 1min
Incubation 20 min à température ambiante
Incubation 3 min, 95°C
100µL Neutralizing solution
29/04/2016
10
PCR
Lignée
Exon
amplifié
Dilution de
l’échantillon
Caco-2 (WT)
Exon19
207pb
1
Exon 21
222 pb
1
Exon 19
195pb
1
Exon 19
1/2
Exon 19
1/10
Exon 21
222pb
1
Exon 19
207pb
1
Exon 21
222 pb
1
HCC -827
H-1975
Limite de sensibilité?
29/04/2016
11
Préparation des tubes PCR

Réactifs
> Les réactions de PCR sont réalisées en micro tubes DNAse et RNAse free.
> Les amorces sont en solution mère à une concentration de 100 mM puis
diluées pour l’expérimentation à 10 mM.
> La polymérase permettant l’élongation des brins est fournie dans
l’Extract-N-Amp™ Tissue PCR kit: « JumpStart Taq antibody »

Mix
Constituants
par tube
H2O
Volume
(µL)
4.4
Echantillon
4
Amorce FW
0.8
Amorce Rev
0.8
Polymérase
10
Total
20
Pre-mix pour
n tubes
Volume
(µL)
Amorce FW
0.8x(n+1)
Amorce Rev
0.8x(n+1)
Polymérase
10x(n+1)
Ajouter 11.6 µL/tube
29/04/2016
12

Programme de la PCR
> Thermocycleur:
> Programme:
Etapes
Température (°C)
Dénaturation
94
Dénaturation
95
Hybridation
60
Elongation
72
Elongation finale
72
Conservation
10
29/04/2016
Durée
3 min
30 sec
45 sec
1 min
10 min
infini
X40 cycles
13
Digestion

Taille des fragments générés par la digestion des amplicons
« exon21 »
Fragment non muté: 47pb + 175pb
Mutation L858R: 47pb + 88pb + 87pb

Mix digestion
29/04/2016
Constituants
par tube
Volume
(µL)
Amplicon
10
H2O
7
Enzyme
Sau96I
1
Tampon 10x
2
Total
20
Pre-mix pour n
tubes
Volume
(µL)
Enzyme Sau96I
1x(n+1)
Tampon 10x
2x(n+1)
Ajouter 3 µL/tube
14
Migration
•Automate d’électrophorèse capillaire QIAxcel
Advanced
•Prélèvement de 0.1µL d’échantillon dans les
capillaires
•Migration de l’ADN dans un gel contenant un
intercalant (bromure d’éthidium)
•Détection de fragments entre 5000 et 15 pb
Résolution entre 3 et 5 pb pour les fragments<500pb
Etude de la séquence nucléotidique
de l’EGFR
Interrogation de bases de données
Base de données protéiques: ExPASy – UniProtKB
N° d’accession: P00533


Base de données nucléotidiques: NCBI
N° d’accession: NM_005228.3 (RefSeq) molécule de mRNA

Base de données nucléotidiques:
Refseq NG_007726.3 molécule d’AND

www.ensembl.org

Prédiction de la taille des amplicons: utilisation du logiciel
A Plasmid Editor
29/04/2016
17