clavelée et variole caprine
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CHAPITRE 2.7.14. CLAVELÉE ET VARIOLE CAPRINE RÉSUMÉ La clavelée et la variole caprine sont des maladies virales affectant les ovins et les caprins. Elles se caractérisent par une hyperthermie, une éruption généralisée de papules ou de nodules, des vésicules (rares), des lésions internes (particulièrement au niveau des poumons), et peuvent se terminer par la mort. Ces deux maladies sont dues à des souches de capripoxvirus, qui peuvent infecter indifféremment les ovins et les caprins. Bien que la plupart des souches étudiées entraînent une maladie plus sévère selon l’espèce, on a isolé quelques souches dont le pouvoir pathogène est identique pour les deux espèces. Il a été suggéré d'englober sous le terme d'infection à capripox, la clavelée, la variole caprine, la variole ovine-caprine du Kenya, la dermatite caprine indienne et les formes nodulaires de clavelée et de variole caprine d'Afrique du Nord. L'infection à capripox est enzootique en Afrique au nord de l'équateur, au Moyen-Orient, en Turquie, en Iran, en Afghanistan, au Pakistan, en Inde, au Népal, dans certaines régions de la République Populaire de Chine, et, depuis 1984, au Bangladesh. Récemment, l’infection a fréquemment fait des incursions dans le sud de l’Europe. Identification de l'agent pathogène : au laboratoire, la façon la plus rapide de confirmer une infection à capripox consiste à détecter les virions caractéristiques de l'infection à capripox à l'aide d'un microscope électronique à transmission. Le diagnostic de l'infection à capripox prend également en compte les commémoratifs d'infection généralisée par un capripox. Le virion de capripox est distinct de l'autre poxvirus infectant couramment les ovins et les caprins – un parapoxvirus responsable de l'ecthyma contagieux du mouton. Un antigène précipitant peut être identifié par la méthode d'immunodiffusion en gélose (IDG), à partir d'un prélèvement de nœud lymphatique effectué en phase précoce de l'infection à capripox, et de sérums immuns spécifiques ; cependant, il existe des réactions croisées avec le parapoxvirus. Un capripoxvirus se multipliera en culture tissulaire d'origine ovine, caprine, ou bovine, même si les isolats sauvages peuvent nécessiter jusqu'à 14 jours pour se multiplier, ou un, voire plusieurs passages supplémentaires en culture tissulaire. Le virus entraîne des inclusions intracytoplasmiques nettement visibles après coloration à l'hématoxyline-éosine. L'antigène peut également être détecté en culture tissulaire à l'aide de sérums spécifiques, et des techniques d'immunoperoxydase et d'immunofluorescence. L'antigène du capripoxvirus et les corps d'inclusion sont visibles sur des coupes congelées ou des coupes de paraffine colorées de lésions prélevées avant ou après la mort de l'animal. Une méthode immuno-enzymatique de détection de l’antigène (ELISA) utilisant un sérum polyclonal de détection dirigé contre un antigène immunodominant recombinant de capripoxvirus a été développée. Une détection du génome utilisant des amorces spécifiques de capripoxvirus pour le gène de la protéine de fusion et le gène de la protéine d’attachement ont également été décrits. Épreuves sérologiques : l’épreuve de séroneutralisation virale est l’épreuve sérologique la plus spécifique, mais, l'immunité contre une infection à capripox est surtout à médiation cellulaire. L’épreuve n'est donc pas suffisamment sensible pour identifier les animaux ayant été en contact avec le virus et qui n'ont élaboré que de faibles quantités d'anticorps neutralisants. Les épreuves d'immunodiffusion en gélose (IDG) et d'immunofluorescence indirecte sont moins spécifiques du fait des réactions croisées des anticorps dirigés contre d'autres poxvirus. La méthode du Western blot se basant sur la réaction entre l'antigène P32 du capripoxvirus avec Manuel terrestre de l’OIE 2008 1157 Chapitre 2.7.14. — Clavelée et variole caprine les sérums à analyser est à la fois sensible et spécifique, mais elle est coûteuse et difficile à mettre en œuvre. L'utilisation en ELISA de cet antigène exprimé par un vecteur approprié, constitue une épreuve sérologique de référence acceptable. Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique : des vaccins à virus vivant et inactivé ont été utilisés pour lutter contre l'infection à capripox. Toutes les souches étudiées jusqu'à présent ont un important site de neutralisation en commun, et protègent les unes contre les autres. Les vaccins à virus inactivé procurent au mieux une immunité à court terme. A. INTRODUCTION La clavelée et la variole caprine (infections à capripox) sont enzootiques en Afrique du nord et du centre, au Moyen-Orient, et en Inde. Elles sont dues à des souches de capripoxvirus. Elles entraînent une maladie caractéristique du point de vue clinique chez les races d'ovins et de caprins extrêmement sensibles, et est habituellement difficile à confondre avec une autre maladie. Chez les animaux indigènes, la maladie est rarement généralisée ou mortelle, bien qu'elle puisse se manifester sous ces formes dans des régions ou des villages où elle est restée longtemps absente, à l'occasion d'un passage à l'élevage intensif ou en association avec d'autres agents infectieux, comme le virus de la peste des petits ruminants ou le virus de la fièvre aphteuse. Les infections à capripox gênent considérablement l'introduction de races exotiques d'ovins et de caprins, ainsi que le développement de l'élevage intensif. Des souches de capripoxvirus responsables de la dermatose nodulaire contagieuse (comme la souche Neethling) affectent les bovins, mais rien ne prouve que ces souches ne puissent infecter les ovins et les caprins dans les conditions naturelles. La répartition géographique de la dermatose nodulaire contagieuse et celle de la clavelée et de la variole caprine sont différentes. Les souches de capripoxvirus circulent entre les ovins et les caprins, mais la plupart entraînent des signes cliniques plus sévères chez l'une ou l'autre des espèces ; d'autre part, ces souches peuvent se recombiner et présenter alors un spectre d'hôtes intermédiaire et plusieurs niveaux de virulence. Certaines souches ont un effet pathogène équivalent chez les ovins et les caprins. L'infection à capripox peut s'étendre et s'établir dans de nouveaux pays. En 1983, elle s'est étendue à l'Italie, en 1985 et 1989 à Chypre, et en 1988 et à de nombreuses occasions par la suite à la Grèce, mais elle ne s'est établie dans aucun de ces pays. En revanche, en 1984 elle s'est étendue au Bangladesh où elle a persisté. Lors des dix dernières années, d’autres incursions fréquentes en Grèce et en Bulgarie ont été signalées. En 2005, un foyer d’infection à capripox au Vietnam laisse penser que l’aire de distribution de cette dernière est beaucoup plus grande que ce qui était précédemment reconnu. La période d'incubation varie de 8 à 13 jours après que l'animal sensible ait été en contact avec un animal infecté. Elle peut être réduite à 4 jours si l'infection est expérimentale : par inoculation intradermique ou par transmission mécanique par des insectes. Certaines races européennes de moutons, comme celle de Soay, peuvent mourir d'une infection aiguë avant même de développer des lésions cutanées. Chez d'autres races, la température rectale commence par augmenter et dépasse 40 °C, puis, 2 à 5 jours plus tard, des taches apparaissent en premier – petites zones érythémateuses bien délimitées qui sont plus visibles sur la peau non-pigmentée, et qui évoluent en papules – épaississements cutanés indurés de 0,5 à 1 cm de diamètre, qui peuvent recouvrir tout le corps ou se limiter au museau, à l'ars ou au périnée. Les papules peuvent être couvertes de vésicules remplies de liquide, mais ceci reste rare. Une forme d'infection à capripox hémorragique sans épaississement cutané a été observée chez certaines races européennes de caprins. Dans ce cas, toutes les papules se rejoignent à la surface du corps, et cette forme de la maladie est toujours mortelle. 24 h après l'apparition des papules généralisées, les animaux affectés présentent une rhinite, une conjonctivite, et une hypertrophie des nœuds lymphatiques, plus particulièrement des préscapulaires. Les papules sur les paupières entraînent une blépharite plus au moins sévère. Les papules sur les muqueuses oculaires et buccales s'ulcèrent, le jetage et le larmoiement décharges deviennent alors mucopurulents, et la muqueuse de la bouche, de l'anus, et du prépuce ou du vagin se nécrosent. La respiration devient laborieuse et bruyante du fait de la pression exercée au niveau de la partie supérieure de l'appareil respiratoire par l’hypertrophie des nœuds lymphatiques rétropharyngiens, et du fait de l'apparition de lésions sur les poumons. Si la mort de l'animal n'intervient pas pendant cette phase aiguë de la maladie, les papules commencent à se nécroser du fait de l'ischémie qui fait suite à des embolies vasculaires à la base des papules. Au cours des 5 à 10 jours qui suivent, les papules forment des croûtes qui persistent jusqu'à 6 semaines, et laissent de petites cicatrices. Ces lésions cutanées peuvent être attaquées par les mouches, et une pneumonie 1158 Manuel terrestre de l’OIE 2008 Chapitre 2.7.14. — Clavelée et variole caprine secondaire est courante. L'anorexie est rare, sauf si des lésions buccales empêchent l'animal de se nourrir. L'avortement est rare. Lors de l'autopsie d'un animal gravement atteint, les lésions cutanées sont souvent moins visibles que de son vivant. Les muqueuses apparaissent nécrosées et tous les nœuds lymphatiques du corps sont hypertrophiés et œdémateux. Les papules, qui sont éventuellement ulcérées, peuvent être présentes au niveau de la muqueuse de la caillette, et parfois sur la paroi du rumen et du gros intestin, sur la langue, le palais et le voile du palais, la trachée et l'œsophage. Des zones plus claires d'environ 2 cm de diamètre peuvent, dans certains cas, être observées sur les reins et le foie, voire les testicules. Les poumons sont entièrement recouverts de lésions sévères dont le diamètre peut atteindre 5 cm et qui affectent plus particulièrement les lobes diaphragmatiques. Les symptômes et les lésions post mortem varient beaucoup selon la race de l'hôte et la souche du capripoxvirus. Les races indigènes sont moins sensibles et ne présentent souvent que quelques lésions mineures qui peuvent être confondues avec des piqûres d'insectes ou de l'ecthyma contagieux. Toutefois, plusieurs types d'animaux contractent souvent une infection à capripox généralisée voire mortelle : les agneaux ne possédant plus d'anticorps maternels, les animaux qui ont été isolés, et les animaux issus de villages isolés et qui ont été transférés dans des régions d’enzootie, et plus particulièrement s'ils ont subi le stress d'un transport à longue distance et ont été mélangés à d'autres ovins ou caprins porteurs d'agents pathogènes. Une importante mortalité touche systématiquement les races importées non-immunisées de moutons et de chèvres, après infection avec un capripoxvirus. L'homme n'est pas sensible aux infections à capripox. B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC 1. Identification de l'agent pathogène • Récolte, envoi et préparation des prélèvements Les prélèvements destinés à l'isolement du virus et à la détection de l'antigène doivent être effectués par biopsie ou après la mort, au niveau des papules cutanées, des lésions pulmonaires ou des nœuds lymphatiques. Les échantillons destinés à l’isolement du virus et à l’épreuve de détection d’antigène par une méthode immuno-enzymatique (ELISA) doivent être prélevés au cours de la première semaine d’apparition des signes cliniques, avant l’apparition des anticorps neutralisants. Les échantillons destinés à la détection du génome par réaction d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) pourront être prélevés lorsque les anticorps neutralisants sont présents. Une couche leucocytaire obtenue à partir de sang recueilli sur héparine ou EDTA, et prélevée au cours de la phase virémique (avant la généralisation des lésions ou dans les quatre premiers jours) peut également servir à isoler le virus. Les prélèvements destinés à l'examen histologique doivent inclure des tissus issus de la zone périphérique des lésions, et doivent être placés, immédiatement après leur prélèvement, dans 10 fois leur volume de formol à 10 %. Les tissus placés dans du formol ne nécessitent aucune précaution de transport particulière. Les échantillons de sang récoltés dans des tubes avec anticoagulant et à partir desquels on obtient la couche leucocytaire servant à isoler le virus, doivent être immédiatement placés sous glace, et traités dans les plus brefs délais. En pratique, les prélèvements de sang peuvent être conservés à 4 °C jusqu'à 2 jours avant d'être traités, mais ils ne doivent être ni congelés ni conservés à température ambiante. Les tissus servant à isoler le virus, à la détection de l'antigène et à la détection du génome doivent être conservés à 4 °C, sous glace, ou à –20 °C. Si les prélèvements doivent être transportés sur une longue distance sans réfrigération, le milieu doit contenir 10 % de glycérol. La taille des prélèvements doit être suffisante pour que le milieu de transport ne puisse pénétrer : c'est la partie centrale de la biopsie qui doit être utilisée pour isoler/détecter le virus. Les prélèvements destinés à l'examen histologique doivent être préparés selon les techniques de référence et colorés à l'hématoxyline-éosine (H&E). Le matériel prélevé au niveau des lésions et destiné à l'isolement du virus et à la détection de l'antigène est homogénéisé. Pour une telle homogénéisation, une technique est décrite ci-après pour exemple : les tissus sont découpés en petits morceaux à l'aide de ciseaux et de pinces stériles, puis broyés avec un pilon et un mortier, du sable stérile et un volume équivalent de solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS) stérile contenant de la pénicilline sodique (1 000 unités internationales [UI]/ml), du sulfate de streptomycine (1 mg/ml), de la mycostatine (100 UI/ml) ou de la fongizone (2,5 µg/ml) et de la néomycine (200 UI/ml). La suspension est congelée-décongelée 3 fois puis un peu clarifiée dans une centrifugeuse de paillasse, à 600 g pendant 10 min. Les couches leucocytaires peuvent être obtenues à partir de 5 à 8 ml de sang non-coagulé, par centrifugation à 600 g pendant 15 min. On recueille la couche leucocytaire avec soin, puis elle est introduite dans 5 ml d'eau froide bi-distillée, à l'aide d'une pipette Pasteur stérile. On attend 30 s puis on la mélange à 5 ml de milieu de croissance enrichi et froid. Le mélange est centrifugé à 600 g pendant 15 min. On élimine le surnageant et le culot cellulaire est mis en Manuel terrestre de l’OIE 2008 1159 Chapitre 2.7.14. — Clavelée et variole caprine suspension en milieu de culture, par exemple le milieu d’Eagle Glasgow modifié (GMEM). On centrifuge à nouveau à 600 g pendant 15 min, puis le culot obtenu est mis en suspension dans 5 ml de GMEM frais. Une autre solution consiste à séparer la couche leucocytaire sur gradient de Ficoll à partir d'un échantillon récolté sur héparine. a) Culture La multiplication du capripoxvirus s'effectue en culture tissulaire d'origine ovine, caprine ou bovine, bien que les cultures de première o useconde explantation de cellules de testicule d'agneau (TA) ou de rein d'agneau (RA) s'avèrent plus sensibles, en particulier celles issues de moutons à laine. La technique suivante est un exemple de procédure : on ensemence soit 1 ml de suspension cellulaire de couche 2 leucocytaire, soit 1 ml de surnageant clarifié d'un prélèvement par biopsie dans des flacons de 25 cm contenant des cellules TA ou RA confluentes à 90 %. On laisse l'absorption se faire pendant 1 h à 37 °C. La culture est ensuite lavée avec du PBS tiède puis recouverte avec 10 ml d'un milieu approprié, comme du GMEM, contenant des antibiotiques et 2 % de sérum de veau fœtal. Si l'on dispose de tubes de culture cellulaire contenant des cellules TA ou RA et une lamelle couvre-objet, ou de lames porte-objet de culture cellulaire, on les inocule également. Les flacons doivent être examinés quotidiennement pendant 14 jours, en vue de détecter un effet cytopathogène (ECP), et le milieu doit être remplacé s'il se trouble. Un ECP caractéristique apparaît sur les cellules infectées : la membrane cellulaire se rétracte et se détache des cellules périphériques, les cellules finissent par s'arrondir et la chromatine nucléaire migre en position marginale. Au début, seules de petites zones d'ECP sont visibles, quelquefois dès le quatrième jour après l'infection; 4 ou 6 jours plus tard, ces zones finissent par s'étendre à tout le tapis cellulaire. Si aucun ECP n'est visible après 7 jours, la culture doit être congelée-décongelée 3 fois, puis le surnageant décanté doit être ensemencé sur des cellules TA ou RA fraîches. Aux premiers signes d'ECP dans les flacons, ou avant cela si on utilise un grand nombre de lamelles couvre-objet infectées, on retire une lamelle couvre-objet que l'on fixe à l'acétone et que l'on colore à l'hématoxyline-éosine. La présence de corps d'inclusion intracytoplasmiques éosinophiles est le signe d’une infection par un poxvirus. Leur taille est variable et au plus équivalente à la moitié de celle du noyau. Ils sont entourés d'un halo clair. La formation de syncytiums n’est pas caractéristique d’une infection à capripoxvirus. Il est possible d'empêcher l'ECP ou de le retarder en ajoutant au milieu de culture un sérum spécifique anti-capripoxvirus, ce qui apporte une présomption quant à l’identité de l’agent. Quelques souches de capripoxvirus ont été adaptées à la culture en cellules de rein de singe vervet d’Afrique (VERO), mais elles ne sont pas conseillées pour un premier isolement. • Microscopie électronique Avant d'être centrifugée, la suspension obtenue lors de la biopsie finale est préparée en vue d'un examen au microscope électronique. Sur une goutte de suspension, reposant sur un parafilm ou sur une plaque de cire, on dépose une grille hexagonale pour microscope électronique à mailles de 400 avec un substrat de carbone pileoforme pré-activé par une décharge lumineuse en vapeurs de pentylamine. La grille est transférée 1 min plus tard dans une goutte de tampon Tris/EDTA, pH 7,8, pendant 20 s, puis dans une goutte d'acide phosphotungstique à 1 %, pH 7,2, pendant 10 s. La grille est égouttée sur papier filtre, séchée à l'air, et placée sous le microscope électronique. Le virion capripox a la forme d'une brique, il est recouvert de petits éléments tubulaires, ses dimensions sont d'environ 290 × 270 nm. Une membrane, provenant de la cellule hôte, peut envelopper quelques-uns des virions : on en examinera donc le plus possible pour vérifier leur aspect (19). Les virions du capripoxvirus ne peuvent être distingués de ceux de l'orthopoxvirus. Cependant, exception faite du virus de la vaccine, aucun orthopoxvirus n'entraîne de lésions chez les ovins ni chez les caprins. Les virions du parapoxvirus, responsable de l'ecthyma contagieux, sont plus petits, ovales, et couverts d'un élément tubulaire unique et continu, qui donne un aspect strié à chaque virion. • Histologie La biopsie fixée dans le formol est préparée, colorée à l'hématoxyline-éosine, et montée en coupe. On examine ensuite un grand nombre de coupes au microscope optique. Lors de l'examen histologique, la phase aiguë des lésions cutanées se manifeste surtout par un infiltrat cellulaire massif, une vasculite et un oedème. Les lésions plus précoces se caractérisent par un manchon périvasculaire marqué. Au début, l'infiltration comprend des macrophages, des neutrophiles, et parfois des éosinophiles, puis, lorsque les lésions s'étendent, elle inclut d'avantage de macrophages, de lymphocytes et de plasmocytes. La présence d'un nombre variable de « cellules claveleuses » dans le derme est un trait caractéristique de toutes les infections par capripoxvirus. Ces cellules claveleuses peuvent également être présentes dans d’autres organes où des lésions microscopiques de capripoxvirus sont présentes. Il 1160 Manuel terrestre de l’OIE 2008 Chapitre 2.7.14. — Clavelée et variole caprine s'agit de grandes cellules en étoiles comportant des inclusions intracytoplasmiques éosinophiles mal définies et des noyaux vacuolés. La vasculite s'accompagne d'une thrombose et d'un infarcissement qui entraînent un oedème et une nécrose. Les modifications de l'épiderme sont caractérisées par une acanthose, une parakératose, et une hyperkératose. Les autres organes sont modifiés de la même manière, ainsi que par une importante infiltration cellulaire et une vasculite. Les lésions au niveau de l’appareil respiratoire se caractérisent par une ulcération. • Inoculation à l'animal Une préparation de surnageant décantée obtenue à partir d'une biopsie (voir Section B.1.a Culture), peut aussi être utilisée pour inoculer des agneaux sensibles. Ces agneaux doivent être examinés quotidiennement pour détecter toute réaction cutanée éventuelle. b) Méthodes immunologiques • Épreuves d'immunofluorescence On peut également identifier l'antigène du capripoxvirus par immunofluorescence sur des lames couvre-objet ou des lames de culture tissulaire infectées. Elles sont lavées, sèchées à l'air, puis elles sont fixées dans l'acétone pendant 10 min. Avec l’épreuve indirecte utilisant des immun-sérums ovins et caprins, on observera un fond très coloré et des réactions non-spécifiques. Toutefois, un conjugué direct peut être préparé à partir des sérums prélevés sur des ovins et des caprins convalescents ou sur des lapins hyperimmunisés avec du capripoxvirus purifié. L’épreuve doit comprendre une culture tissulaire non-inoculée qui servira de témoin négatif car les réactions croisées avec des anticorps dirigés contre les cellules en culture peuvent poser des problèmes. La technique d’immunofluorescence sur section tissulaire peut également être utilisée sur des coupes préparées avec un cryostat. • Immunodiffusion en gélose Les antigènes précipitants de capripoxvirus ont été mis en évidence par une épreuve d'immunodiffusion en gélose (IDG), mais le fait que le capripoxvirus et le parapoxvirus aient ces antigènes en commun reste un inconvénient. On prépare de l'agarose (1 %) dans un tampon borate, pH 8,6. On la fait fondre par chauffage, puis on dépose 2 ml de la solution obtenue sur une lame porte-objet en verre (76 × 26 mm). Une fois la gélose solidifiée, on creuse des puits en rosette autour d'un puits central. Les puits ont un diamètre de 5 mm, et sont distants de 7 mm (distance entre le centre du puits central et celui des puits périphériques). On remplit les puits de la manière suivante : 3 puits périphériques reçoivent 18 µl de broyat de lésion, en alternance avec les autres puits qui eux reçoivent de l'antigène témoin positif. Le puits central, quant à lui, reçoit 18 µl de sérum témoin positif anti-capripoxvirus. On place les lames dans une chambre humide à température ambiante pendant 48 h. Les lames sont ensuite examinées à l'aide d'une boîte lumineuse pour voir si des lignes de précipitation sont visibles. Si une ligne de précipitation avec le sérum témoin rejoint celle produite par l'antigène témoin positif, le prélèvement testé est considéré comme positif. Cependant, cette épreuve ne permettra pas de différencier une infection à capripox de l'ecthyma contagieux. Pour la préparation de l’épreuve d’IDG, on utilise 2 flacons de 125 cm3 contenant des cellules TA dont l'un est inoculé avec du capripoxvirus. Le contenu de ce flacon est récolté lorsque l'ECP atteint 90 % (8 à 12 jours). Le flacon est congelé-décongelé 2 fois, puis agité pour en extraire les cellules. Le contenu extrait est ensuite centrifugé à 4 000 g pendant 15 min. La majeure partie du surnageant est décantée et conservée, le culot est replacé en suspension dans le surnageant restant. On lyse les cellules à l'aide d'une sonde à ultrasons pendant environ 60 s. Le broyat est alors centrifugé comme précédemment, le surnageant obtenu étant mélangé au surnageant déjà isolé. On ajoute à ce mélange de surnageant un volume équivalent de sulfate d'ammonium saturé, pH 7,4, on abandonne ensuite la solution à 4 °C. Au bout de 1 h, la solution est centrifugée à 4 000 g pendant 15 min, le précipité est recueilli puis replacé en suspension dans une solution saline à 0,8 %. La solution obtenue sera utilisée pour l’épreuve d’IDG. Le flacon non-inoculé est traité exactement de la même façon et constituera l'antigène témoin de la culture tissulaire (17). • Épreuve immuno-enzymatique Après clonage de la protéine de structure P32 de capripoxvirus fortement antigénique, il est possible de produire des réactifs diagnostiques à partir de l'antigène recombinant exprimé, qu'il s'agisse d'obtenir de l'antisérum polyclonal monospécifique P32 ou des anticorps monoclonaux. Ces réactifs ont facilité l'élaboration d'un ELISA de haute spécifité (5). A l'aide d'antisérum hyperimmun de lapin, obtenu par inoculation du capripoxvirus purifié à des lapins, il est possible de piéger, sur une plaque ELISA, l'antigène capripox à partir d'une biopsie ou du surnageant d'une culture tissulaire. La présence de l'antigène peut être mise en évidence à l'aide de sérum de cobaye dirigé contre la protéine de structure P32 spécifique du groupe, de peroxydase de raifort conjuguée à de l'immunoglobuline de lapin anti-cobaye, et d'une solution chromogène/substrat. Manuel terrestre de l’OIE 2008 1161 Chapitre 2.7.14. — Clavelée et variole caprine c) Méthodes de reconnaissance des acides nucléiques Il est impossible de distinguer les différentes souches de capripoxvirus bovins, ovins, caprins par les méthodes sérologiques. En revanche, les souches peuvent être identifiées si l'on compare les fragments de génome obtenus après digestion de leur ADN purifié par l'enzyme Hind III, (2, 16). Grâce à cette technique et au séquençage du génome, des différences ont été observés entre les isolats de plusieurs espèces (12), mais les résultats obtenus ne sont pas toujours les mêmes, ce qui prouve l'existence d'une circulation des souches virales entre les espèces et de recombinaisons entre souches de virus sauvage (10). La PCR peut être utilisée pour détecter le génome de capripoxvirus dans des échantillons de biopsies ou de cultures cellulaires. Les amorces pour le gène codant la protéine virale d’attachement et le gène codant la protéine virale de fusion sont spécifiques des capripoxvirus, et la nature des produits de PCR peut être confirmée en utilisant les sites de reconnaissance des enzymes de restriction (11, 13). 2. Épreuves sérologiques a) Séroneutralisation virale Un sérum à tester est soit titré à l'aide d'un capripoxvirus à titre constant (100 DICT50 [dose de virus infectant 50 % de la culture tissulaire]), soit une souche virale de référence est titrée à l'aide d'une dilution constante de sérum à tester de façon à déterminer un index de neutralisation. Du fait de la sensibilité variable de la culture tissulaire vis-à-vis du capripoxvirus et donc de la difficulté de garantir les 100 DICT50, l'index de neutralisation reste la méthode préférée. Ce test utilise des plaques de microtitrage pour culture tissulaire comportant 96 puits à fond plat. Il peut également être effectué dans des tubes de culture tissulaire avec les changements appropriés de volumes utilisés, bien que la lecture soit plus difficile dans les tubes. Les résultats obtenus par séroneutralisation virale avec les cellules VERO se sont avérés plus fiables (20). • Protocole i) e Les sérums à tester, y compris un témoin positif et un témoin négatif, sont dilués au 1/5 en milieu de Eagle/HEPES (hydroxyéthylpiperazine-2-N, acide éthanesulfonique -2-N), puis inactivés à 56 °C pendant 30 min. ii) On introduit ensuite 50 µl du premier sérum inactivé dans les puits des colonnes 1 et 2, rangs A à H de la microplaque. On place le deuxième sérum dans les colonnes 3 et 4, le troisième dans les colonnes 5 et 6, le sérum témoin positif dans les colonnes 7 et 8 et le sérum témoin négatif dans les colonnes 9 et 10. Les colonnes 11 et 12 ainsi que tous les puits du rang H, contiennent 50 µl de milieu Eagle/HEPES sans sérum. iii) Dans des tubes à vis, on dilue une souche de référence de capripoxvirus (il s'agit habituellement d'une souche de vaccin connue pour sa capacité à bien se multiplier en culture tissulaire), avec un titre supérieur à 6 DICT50 par ml (exprimé en log10), de façon à disposer d'une série de dilutions de 5,0 ; 4,0 ; 3,5 ; 3,0 ; 2,5 ; 2,0 et 1,5 DICT50 par ml (ce qui équivaut à 3,7 ; 2,7 ; 2,2 ; 1,7 ; 1,2 ; 0,7 et 0,2 DICT50 pour 50 µl). iv) En commençant par le rang G et la plus diluée des préparations virales, on ajoute 50 µl de virus dans chacun des puits du rang. On fait de même pour chaque dilution virale, le rang A comportant la dilution virale ayant le titre le plus élevé. v) Les microplaques sont couvertes et incubées à 37 °C pendant 1 h. vi) On prépare les cellules TA provenant de monocouches précultivées, sous forme de suspension de 105 cellules/ml dans du milieu de Eagle contenant des antibiotiques et 2 % de sérum de veau foetal. Après avoir incubé les microplaques, on ajoute 100 µl de suspension cellulaire dans tous les puits, exception faite des puits H11 et H12, qui jouent le rôle de puits témoins pour le milieu. Les autres puits du rang H jouent le rôle de témoins cellules et de témoins sérum. vii) Les microplaques sont couvertes et incubées à 37 °C pendant 9 jours. viii) A l'aide d'un microscope inversé, on procède à un examen quotidien des monocouches à partir du 4ème jour pour détecter un éventuel ECP. Aucun ECP ne doit apparaître dans les cellules du rang H. Si on a utilisé la souche de vaccin 0240 KSGP du capripoxvirus, on procède à la lecture finale le 9ème jour. Le titre de chaque paire de dilution virale est déterminé par la méthode de Kärber (14). Si l'on attend plus longtemps, le virus réalise immanquablement une « percée », le virus neutralisé au préalable finissant par se dissocier de l'anticorps. ix) 1162 Interprétation des résultats : l'index de neutralisation est la différence exprimée en log10 entre le titre du virus dans le sérum négatif et dans le sérum à éprouver. L’épreuve est positive si l'index Manuel terrestre de l’OIE 2008 Chapitre 2.7.14. — Clavelée et variole caprine est ≥ 1,5. L’épreuve peut être rendue plus sensible lorsque le sérum d'un même animal est examiné avant et après l'infection. L'immunité vis-à-vis de l'infection à capripox est principalement à médiation cellulaire. L'obtention d'un résultat négatif, notamment à la suite d'une vaccination où la réaction est nécessairement faible, ne signifie donc pas obligatoirement que l'animal dont on a prélevé le sérum n'est pas protégé contre le virus. Il existe une méthode à virus constant et sérum variable. Elle emploie plusieurs dilutions de sérum de 1/5 à 1/500 et sur des cellules musculaires de veau foetal. Cette méthode permet d'éviter le problème posé par la « percée » du virus, car ces cellules sont moins sensibles au capripoxvirus que les cellules TA. b) Immunodiffusion en gélose L’épreuve d’IDG ne peut être recommandée en tant qu’épreuve sérologique pour le diagnostic de l'infection à capripox, du fait des réactions croisées existant avec l'anticorps de l'ecthyma contagieux, dont le diagnostic différentiel est le plus important. Ces réactions entraînent de faux résultats positifs. c) Épreuve d'immunofluorescence indirecte L’épreuve d'immunofluorescence indirecte s'effectue en culture tissulaire infectée par le capripoxvirus, soit sur des lamelles couvre-objet, soit sur lame porte-objet. Cette épreuve met également en jeu une culture tissulaire témoin non-infectée, et des sérums témoins positifs et négatifs. La culture infectée et la culture témoin sont fixées dans de l'acétone à –20 °C pendant 10 min puis conservées à 4 °C. On effectue des dilutions de sérums à analyser dans du PBS, avec une première dilution de 1/5. Les dilutions positives sont identifiées à l'aide d'une gamma globuline anti-bovin conjuguée à de l'isothiocyanate de fluorescéine (8). Des réactions croisées peuvent survenir avec l'ecthyma contagieux, la stomatite papuleuse bovine et probablement d’autres infections à poxvirus. d) Analyse par Western blot L'analyse par Western blot d'un sérum contre un lysat cellulaire infecté par le capripoxvirus constitue un moyen sensible et spécifique de déceler la présence d'anticorps contre les protéines de structure du capripoxvirus, même si cette épreuve reste coûteuse et difficile à mettre en œuvre (7). Les cellules TA infectées par le capripoxvirus doivent être récoltées lorsque l'ECP atteint 90 %. Elles sont ensuite congelées-décongelées 3 fois, les débris cellulaires sont centrifugés et se rassemblent en culot. Le surnageant est décanté et les protéines sont alors séparées par SDS-PAGE (électrophorèse en gel de dodécyl sulfate de sodium-polyacrylamide). On recommande l'utilisation d'un système vertical et discontinu de gel, comprenant un gel concentrant, contenant de l'acrylamide (5 %) dans du Tris (125 mM), pH 6,8, et du SDS (0,1 %), ainsi qu'un gel de résolution contenant de l'acrylamide (10 à 12,5 %) dans du tampon Tris (560 mM), pH 8,7 et du SDS (0,1 %), ce gel est associé à un tampon de migration contenant du tampon Tris (250 mM), de la glycine (2 M) et du SDS (0,1 %). Avant leur utilisation, les échantillons de surnageant doivent être préparés : on les fait bouillir pendant 5 min avec un tampon de lyse approprié. Il est possible de substituer à l'antigène obtenu sur culture tissulaire un virus purifié ou des antigènes P32 recombinants (6, 11). Des marqueurs de poids moléculaire doivent être testés en parallèle avec les échantillons de protéines. Les protéines séparées dans le gel SDS-PAGE doivent être transférées par électroblot sur une membrane de nitrocellulose (MNC). A la suite de ce transfert, on rince soigneusement la MNC dans du PBS et on la bloque dans 3 % d'albumine de sérum bovin (ASB) dans du PBS, ou dans 5 % de lait écrémé en poudre dans du PBS, sur un agitateur rotatif, à 4 °C, pendant une nuit. On peut procéder de deux manières : soit on découpe des bandes de MNC à l'aide d'un appareil spécial et on effectue simultanément des épreuves avec plusieurs échantillons, soit on découpe les bandes qui peuvent être incubées chacune séparément. La MNC est lavée minutieusement 5 fois en renouvelant le PBS à chaque fois, pendant 5 min, sur un agitateur rotatif. Elle est ensuite incubée à température ambiante, toujours sur l'agitateur, pendant 1 h et demi, avec le sérum approprié à une dilution de 1/50 dans du tampon bloquant (3 % d'ASB, 0,05 % de Tween 20 dans du PBS ; ou 5 % de lait en poudre et 0,05 % de Tween 20 dans du PBS). La membrane est à nouveau lavée soigneusement puis replacée en incubation (dans du tampon bloquant), cette fois avec des immoglobulines conjuguées à une immunoglobuline anti-espèce marquée à la peroxydase de raifort, à une dilution déterminée par titrage. Après une incubation supplémentaire à température ambiante pendant 1 h 1/2, on lave la membrane et on ajoute une solution de tétrahydrochlorure de diaminobenzidine (10 mg dans 50 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, et 20 µl d'eau oxygénée à 30 % [v/v]). Le tout est incubé à température ambiante entre 3 et 7 min, sur un agitateur. La membrane est observée en permanence. On arrête la réaction par un lavage avec du PBS, avant que la couleur de fond ne devienne trop intense. Il convient d'utiliser des sérums témoins négatif et positif à chaque étape de la réaction. Les prélèvements testés qui sont positifs et les témoins positifs donneront des protidogrammes correspondant aux réactions obtenues avec des protéines ayant pour masse moléculaire : 67, 32, 26, 19 Manuel terrestre de l’OIE 2008 1163 Chapitre 2.7.14. — Clavelée et variole caprine et 17 kDa, c'est à dire les principales protéines de structure du capripoxvirus. Les prélèvements testés qui sont négatifs donneront d'autres profils de protidogrammes. Un sérum hyperimmun contre le parapoxvirus (stomatite papuleuse bovine) réagira avec certaines des protéines de capripoxvirus, mais pas avec la protéine ayant une masse moléculaire de 32 kDa, spécifique du capripoxvirus. e) Méthode immuno-enzymatique Un ELISA pour capripoxvirus a été développé à partir d'une expression de la protéine de structure P32 du capripoxvirus et d'anticorps monoclonaux dirigés contre cette protéine (6, 11). C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE Des vaccins à capripoxvirus vivant atténué et à capripoxvirus inactivé ont été utilisés pour protéger les ovins et les caprins contre l'infection à capripox (voir références 4 et 15). Jusqu'à présent, toutes les souches de capripoxvirus étudiées, qu'elles soient d'origine ovine, caprine ou bovine, ont en commun un site de neutralisation majeur. L'infection par une souche de virus protège donc l'animal contre les autres souches de capripoxvirus (3). C'est pourquoi il est possible d'utiliser une seule souche de capripoxvirus pour protéger à la fois les ovins et les caprins contre toutes les souches sauvages du virus, qu'elles soient d'origine africaine ou asiatique (18, 20). Il existe deux formes antigéniques du capripoxvirus, le virion intact recouvert de petits éléments tubulaires, et le virion intact qui est recouvert, en plus, par une membrane issue de la cellule hôte. Cette dernière forme est généralement élaborée par les animaux infectés, alors que l'autre est produite en cultures tissulaires infectées congelées puis décongelées. Les virus-vaccins tués obtenus en culture cellulaire sont des virions pratiquement nus, qui, lorsqu'ils sont utilisés comme vaccin, ne provoquent pas de réaction immunitaire contre le virion lié à la membrane cellulaire. Ceci explique en partie le peu de réussite obtenue avec des vaccins à virus inactivé. D'autre part, les virus-vaccin inactivés stimulent moins la réaction immunitaire à médiation cellulaire qu'une réplication de virus-vaccins vivants alors que cette réaction est celle qui protège le mieux contre une infection par poxvirus. De nombreuses souches de capripoxvirus ont été largement utilisées pour produire des vaccins à virus vivant (9), par exemple : la souche 0240 de la variole ovine-caprine du Kenya, les souches roumaine et RM-65 utilisées principalement chez les ovins et les souches de Mysore et de Gorgan utilisées chez les caprins. Une vaccination avec la souche 0240 protège les ovins et les caprins contre l'infection à capripox pendant plus d'un an, et vraisemblablement de façon définitive contre une épreuve virulente mortelle. La souche 0240 ne doit pas être utilisée chez les taurins. Une nouvelle génération de vaccins à virus capripox est en cours d'élaboration. Elle utilise le génome du capripoxvirus en tant que vecteur d'autres agents pathogènes des ruminants, par exemple les gènes du virus de la peste bovine ou ceux de la peste des petits ruminants (PPR). Une vaccination avec le vaccin recombinant assure donc à l'animal une protection à la fois contre l'infection à capripox, la peste bovine et la PPR (1). 1. Gestion des semences virales a) Caractéristiques de la semence virale Des précisions sur l'origine, les passages en culture tissulaire ou sur animal doivent être fournies avec toute souche de capripoxvirus utilisée pour la production du vaccin. L'emploi de cette souche ne doit présenter de danger pour aucune race d'ovins et de caprins auxquelles le vaccin est destiné, y compris les femelles gravides. D'autres conditions sont nécessaires : le virus ne doit pas être transmissible, il doit rester atténué après un passage supplémentaire en culture tissulaire, et assurer à l'animal une protection totale d'un an au moins, après une épreuve virulente effectuée à l'aide d'une souche de virus sauvage. Il convient de préparer suffisamment de virus-vaccin, et de le conserver afin de pouvoir disposer d'une semence de travail fiable pour la production régulière de vaccin. b) Méthodes de culture La semence de vaccin doit être lyophilisée et conservée à –20 °C, dans des ampoules de 2 ml. Lorsqu'elle est liquide, des températures inférieures ou égales à –70 °C lui assurent une meilleure stabilité. Pour obtenir un rendement maximum, le virus doit être cultivé sur des cellules de première ou seconde explantation de TA provenant de moutons à laine. Les cellules Vero peuvent également être utilisées. c) Validation de la semence candidate comme semence vaccinale Les lots de semence doivent répondre aux critères suivants : 1164 Manuel terrestre de l’OIE 2008 Chapitre 2.7.14. — Clavelée et variole caprine i) Pureté : ils ne doivent comporter aucun autre virus, en particulier de pestivirus, comme celui de la pestivirose ovine (border disease) ou celui de la maladie des muqueuses (bovine viral diarrhoea), ni aucune contamination par des bactéries, des champignons et/ou et des mycoplasmes. ii) Innocuité : le vaccin ne doit entraîner aucune réaction clinique quand il est injecté à des ovins et à des caprins, toutes races confondues, par la voie d'administration recommandée. iii) Efficacité : le vaccin doit procurer une immunité totale vis-à-vis de l'infection à capripox, chez toutes les races d'ovins et de caprins, pendant un an au moins. Les tests exigés sont décrits dans la Section C.4. 2. Méthode de fabrication La production des lots de vaccin s'effectue sur des cultures de cellules de seconde explantation de TA ou des cultures de cellules de première explantation de RA en monocouches fraîches. On lave la monocouche de cellules TA ou RA avec du PBS tiède, puis on lui inocule le contenu d'une ampoule de virus préalablement reconstituée avec du GMEM. On laisse la monocouche absorber le virus pendant 15 min à 37 °C, puis on la recouvre avec du GMEM. Dans un délai de 4 à 6 jours, l'ECP se sera bien étendu (50 à 70 %). On devra rechercher alors dans la culture la présence d'ECP non-spécifique, une turbidité du milieu ou une variation du pH du milieu. La culture est congelée-décongelée 3 fois, puis on retire la suspension et on la centrifuge à 600 g pendant 20 min. Un second passage peut s'avérer nécessaire pour produire le vaccin en quantité suffisante en vue d'un lot de production (il faut 5 flacons de 175 cm2 pour obtenir 106 doses). On répète la procédure et on mélange séparément la récolte provenant de chaque flacon numéroté, avec un volume équivalent réfrigéré du mélange constitué de 5 % d'hydrosylat de lactalbumine et de 10 % de saccharose. On transfère ensuite les contenus de ces flacons dans des ballons que l'on maintient à –20 °C. Avant de stocker le virus, on prélève 0,2 ml dans chaque ballon pour effectuer des tests de stérilité. On prélève des échantillons de 0,2 ml supplémentaires dans 10 ballons et on les mélange de façon à obtenir un volume de 2 ml avec lequel on effectuera un titrage du virus. Toutes les manipulations concernant les lots de vaccin doivent être consignées par écrit. Les vaccins à virus inactivé sont généralement produits à partir de souches de capripoxvirus sauvages nonatténuées, qui sont multipliées en culture tissulaire comme cela a été décrit précédemment, inactivées avec 0,03 % de formol, puis mélangées à un volume équivalent de gel d'alumine jouant le rôle d'adjuvant. Le formol n'est désormais plus considéré comme un adjuvant approprié pour d'autres vaccins viraux, car son mode d'action ne garantit pas l'inactivation complète et efficace de tous les virus vivants. Ceci n'a pas été étudié avec précision dans le cas des capripoxvirus. 3. Contrôles en cours de fabrication Cellules : les cellules doivent provenir des testicules ou des reins d'un jeune agneau en bonne santé issu d'un troupeau de moutons à laine indemne de tremblante. On surveillera l'apparition d'ECP et la morphologie des cellules (qui sont à prédominance fibroblastique) durant toute la culture. Généralement, on réussit à effectuer jusqu'à 10 passages. Pour la production du vaccin, il convient d'entretenir parallèlement des cultures témoins non-infectées qui subiront un passage supplémentaire pour examen ultérieur. Les techniques d'immunofluorescence et d'immunoperoxidase permettent de rechercher la présence de souches virales dépourvues d'effet cytopathogène de maladie des muqueuses ou de pestivirose ovine. Il convient si possible de préparer et d'observer les cellules avant de produire le vaccin. Un stock de cellules doit être conservé dans du DMSO (sulphoxide diméthyle) stérile, en azote liquide (aliquots de 1 ou 2 ml contenant 20 × 106 cellules par ml). Le sérum utilisé dans le milieu de culture ne doit contenir aucun anticorps vis-à-vis du capripoxvirus et ne doit pas être contaminé par un pestivirus. Virus : le virus de semence et le vaccin final doivent être titrés dans des tubes de culture cellulaire ou sur microplaques. Il est impératif de rechercher, dans les échantillons de vaccin, la présence de virus contaminants, y compris de souches de pestivirus entraînant ou non un effet cytopathogène. Ces échantillons doivent être mélangés à un sérum anti-capripoxvirus, possédant un titre élevé, et qui s'est avéré dépourvu d'anticorps contre les pestivirus. Cela évitera toute interférence avec le virus vaccin lui-même lors du test. Le vaccin stock peut être conservé à –20 °C jusqu'à ce que les tests de stérilité et le titrage aient été effectués, tests après lesquels il doit être lyophilisé dans des ampoules par aliquots de 1 ml contenant 100 doses. La récolte de virus-vaccin diluée en hydrolysat de lactalbumine et de saccharose doit avoir un titre minimum, après lyophilisation, de 4,5 DICT50 par ml ce qui équivaut à une dose vaccinale de 2,5 DICT50. On effectue un titrage supplémentaire sur 5 ampoules de préparation lyophilisée choisies de façon aléatoire, afin de confirmer la valeur du titre. Manuel terrestre de l’OIE 2008 1165 Chapitre 2.7.14. — Clavelée et variole caprine 4. Contrôles des lots a) Stérilité Pour les tests de stérilité et de non-contamination du matériel biologique, se reporter au Chapitre 1.1.9., « Contrôle de la stérilité ou de l’absence de contamination des matériels biologiques ». b) Innocuité On place 4 moutons et 4 chèvres dont on connaît la sensibilité à l'infection à capripox dans des animaleries ayant un niveau de confinement élevé, et on prélève leur sérum. On reconstitue 5 ampoules de vaccin lyophilisé choisies de façon aléatoire dans du PBS stérile, puis on les mélange. On inocule à un mouton et à une chèvre 0,2 ml de vaccin concentré, par voie intradermique. On dilue 20 fois le vaccin restant dans du PBS stérile, puis on inocule à 2 moutons et à 2 chèvres la dose vaccinale recommandée, à savoir 0,2 ml, par voie sous-cutanée. Les moutons et les chèvres restants serviront de témoins. On procède à l'examen clinique des animaux quotidiennement, et on relève leur température rectale. Au 21e jour après la vaccination, on prélève à nouveau du sérum sur les 8 animaux, puis on les éprouve en leur inoculant une souche virulente de capripoxvirus par voie intradermique. On suit la réaction clinique au cours des 14 jours suivants. Tandis que les animaux témoins doivent développer les signes classiques de l'infection à capripox, les animaux vaccinés ne doivent présenter aucune réaction locale ou systémique autre qu’une réaction d’hypersensibilité retardée, qui disparaitra en 4 jours. On procède à des prélèvements supplémentaires de sérum au 30e jour après la vaccination. Dans les prélèvements du 21e jour on recherche les anticorps vis-à-vis de quelques maladies virales susceptibles d'avoir contaminé le vaccin. On compare les prélèvements datant du jour de la vaccination et ceux du 30e jour afin de s'assurer de l'absence d'anticorps vis-à-vis d'un pestivirus. On contrôle également le vaccin reconstitué, sur des souris et des cobayes. On inocule 0,5 ml de vaccin dans la patte arrière de 2 cobayes, par voie intramusculaire, ainsi que des doses respectives de 0,5 ml et 0,1 ml à 2 cobayes et 6 souris, cette fois par voie intrapéritonéale. Deux cobayes et 4 souris non-inoculés serviront de témoins. Après 3 semaines d'observation, les animaux sont euthanasiés, et autopsiés. Ils ne doivent présenter aucune lésion imputable au vaccin. c) Activité Moins de 1 DICT50 de la souche 0240 suffit pour protéger les ovins et les caprins. Toutefois, il est nécessaire d'effectuer des tests d'activité lorsqu'on ignore la dose immunisante minimum. Pour cela, on compare le titre d'une souche d'épreuve virulente inoculée sur les flancs d'animaux vaccinés et d'animaux témoins. Après vaccination, on rase le flanc d'au moins 3 animaux vaccinés et 3 animaux témoins. On prépare des dilutions log10 de virus d'épreuve dans du PBS stérile, puis on injecte six de ces dilutions (0,1 ml par inoculum) par voie intradermique réparties sur toute la longueur du flanc de l'animal. On injecte 4 aliquots de chaque dilution dans la partie basse du flanc. Chez les animaux témoins, un oedème peut se développer au niveau des 24 sites d'injection. En revanche, les 4 sites concernés par les inoculums les plus dilués présentent peu ou pas de réaction. Les animaux vaccinés présentent, quant à eux, une réaction d'hypersensibilité passagère au niveau des sites d'injection lors des premières 24 h. Celle-ci doit rapidement régresser. Des zones discrètes de nécrose peuvent apparaître au niveau des sites d'injection où le virus d'épreuve est le plus concentré. La taille des macules/papules est mesurée entre 8 et 10 jours après l’épreuve. On calcule le titre du virus d'épreuve sur les animaux vaccinés et les animaux témoins. La protection est suffisante lorsque la différence de log titre est >log10 2,5. d) Durée de l'immunité A la suite d'une vaccination des ovins et des caprins avec la souche 0240, l'immunité vis-à-vis du virus virulent dépasse un an et l'animal reste protégé contre une infection généralisée causée par une inoculation intradermique pendant 3 ans au moins, mais on constate qu’en réalité cette protection demeure le plus souvent à vie. La durée de l'immunité procurée par d'autres souches de vaccin doit être confirmée sur des ovins et des caprins, par des épreuves effectuées dans un milieu où aucune souche de terrain de capripoxvirus n'est susceptible de fausser les résultats. Les vaccins à virus inactivé protègent moins d’un an. Pour les raisons précedemment citées au début de cette section, ils ne protège pas l'animal contre la forme de capripoxvirus généralement associée à une transmission naturelle. e) Stabilité Les préparations de vaccin contre l'infection à capripox convenablement lyophilisées, et plus particulièrement celles comportant un agent protecteur (saccharose et hydrolysat de lactalbumine), restent stables plus de 25 ans si elles sont conservées à –20 °C, et entre 2 et 4 ans à 4 °C. Il a été démontré que ces préparations restent stables à des températures plus élevées, mais aucun contrôle à long terme n'a encore été rapporté. 1166 Manuel terrestre de l’OIE 2008 Chapitre 2.7.14. — Clavelée et variole caprine Les vaccins inactivés doivent être conservés à 4 °C, leur délai de péremption est généralement de 1 an. f) Agents de conservation Aucun produit de conservation autre qu'un agent protecteur comme le saccharose et l'hydrolysat de lactalbumine, n'est nécessaire pour les préparations lyophilisées. g) Précautions d'emploi et mise en garde Il n'existe aucune précaution à prendre autre que celles décrites précédemment ayant trait à la stérilité et à la présence éventuelle d'agents contaminants. Les vaccins obtenus à partir de la souche 0240 ne doivent pas être utilisés chez les taurins (Bos taurus). L'homme ne peut être infecté par un capripoxvirus. 5. Contrôles du produit fini a) Innocuité Des tests d'innocuité doivent être effectués sur le produit final de chaque lot, comme cela est décrit dans la Section C.4.b. b) Activité Une fois que l'activité d'une souche utilisée pour la production du vaccin a été déterminée en termes de dose immunisante minimum, il n'est pas nécessaire de la déterminer à nouveau pour chaque lot de produit final à condition que le titre de virus qu'il contient ait été vérifié. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. BERHE G., MINET C., LE GOFF C., BARRETT T., NGANGNOU A., GRILLET C., LIBEAU G., FLEMING M., BLACK D.N. & DIALLO A. (2003). Development of a dual recombinant vaccine to protect small ruminants against pestedes-petits-ruminants virus and capripoxvirus infections. J. Virol., 77, 1571–1577. 2. BLACK D.N., HAMMOND J.M. & KITCHING R.P. (1986). Genomic relationship between capripoxviruses. Virus Res., 5, 277–292. 3. CAPSTICK P.B. (1961). Annual Report. Kenya Veterinary Department, Kenya, 45–47. 4. CARN V.M. 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Health Prod., 17, 64–74. * * * NB : Il existe plusieurs Laboratoires de références de l’OIE pour la Clavelée et Variole caprine (se reporter à la liste de la partie 3 de ce Manuel terrestre ou consulter le site internet de l’OIE pour une liste actualisée : www.oie.int). 1168 Manuel terrestre de l’OIE 2008
