/ . Embryol. exp. Morph., Vol. 17, 2, pp. 359-365, April 1967 With 2 plates Printed in Great Britain 359 L'influence favorable du foie embryonnaire sur Fhematopoiese in vitro dans la moelle osseuse de Fembryon de poulet ParGERMANO SALVATORELLI1 Institut d'Embryologie experimental du College de France et du C.N.R.S., Directeur: Professeur Etienne Wolff Pendant le developpement embryonnaire du poulet, on peut noter la succession de differents foyers d'erythropoiiese (Romanoff, 1960; Le Douarin, 1966): (a) les ilots de Wolff dont l'activite se deroule entre le ler et 2eme jour d'incubation; (b) le sac vitellin erythropoietiquement actif du 4eme au 19eme jour d'incubation; (c) le foie et la rate dont la faible activite se deroule entre le 7eme et le lOeme jour d'incubation; (d) la moelle osseuse dont l'activite commence au 12eme jour d'incubation et qui deviendra chez l'adulte le seul organe ayant une activite erythropoietique. On connait mal les facteurs necessaires a une erythropoiese normale, c'est-adire a l'activation des cellules mesenchymateuses et a leur differentiation dans les diverses lignees sanguines. De recentes recherches ont demontre la presence de facteurs erythropoietiques dans le plasma. Mais, comme nous le verrons par la suite, leur action ne peut pas expliquer entierement le processus de l'hemopoiiese. La methode de culture in vitro permet d'etudier dans des conditions relativement simples les phenomenes de l'erythropoiese, mais il faut remarquer que, avec les methodes habituelles de culture, les differentes lignees sanguines s'epuisent apres 24 a 48 heures de culture. Les cellules qui subsistent et qui peuvent etre cultivees plus longtemps ne sont que des elements du systeme reticulo-endothelial. La methode de culture de Wolff & Haffen (1952) a permis au contraire de garder pendant plusieurs jours de culture les differentes lignees sanguines, soit des explants de moelle osseuse de poule (Pourreau-Schneider, 1962), soit des explants de moelle osseuse humaine normale et leucemique (Pourreau-Schneider, Bernard, Boiron & Wolff, 1963), soit d'aire vasculaire d'embryon de poulet (Manelli, 1963; Raunich & Manelli, 1965; Raunich, Manelli, Mastrolia & Gardenghi, 1966), soit de foie embryonnaire de souris (Gallien-Lartigue, 1966). 1 Adresse de Vauteur: 49 bis, avenue de la Belle Gabrielle, 94-Nogent S/Marne, France. 23 JEEM 17 360 G. SALVATORELLI Nous avons done applique cette methode de culture a l'etude de l'hematopoiiese medullaire pendant le developpement embryonnaire du poulet. Dans la presente note, nous exposons les resultats que nous avons obtenus en cultivant la moelle osseuse d'embryons de poulet de 18 a 19 jours d'incubation, seule ou associee a d'autres organes embryonnaires. A ce stade, les phenomenes de l'erythropoiiese sont en effet particulierement actifs (Sandreuter, 1951). MATERIEL ET METHODES La moelle osseuse de femur ou de tibia d'embryon de poulets de 18 a 19 jours a ete explante"e selon la technique de Wolff & Haffen (1952) sur un milieu solide recouvert de fragments de membrane vitelline d'oeuf de poule non incube (Wolff, 1961). Le milieu solide se compose de: 10 gouttes de gelose en solution a 1 % dans le liquide de Gey; 4 gouttes de jus d'embryon de poulet de 8 jours et demi d'incubation; 4 gouttes de serum de cheval. En general, on n'a pas ajoute d'antibiotiques au milieu de culture. Nous n'avons jamais eu d'infection dans nos cultures grace aux conditions de rigoureuse asepsie dans lesquelles nous avons effectue nos experiences. Dans une premiere serie experimentale, la moelle osseuse a ete cultivee seule; dans une deuxieme serie, elle a ete associee au mesonephros d'embryons de poulet de 8 jours et demi; enfin dans une troisieme serie, au foie d'embryons de poulet de 7 a 11 jours. Au total, on a cultive avec ces differentes techniques 1.200 explants environ, dont une partie a ete fixee avec le melange de Helly ou de Bouin, et coloree au Giemsa; l'autre partie a ete utilisee pour faire des frottis, colores ensuite par la methode de May-Grunwald-Giemsa selon Pappenheim. RESULTATS (a) Moelle osseuse cultivee seule La survie des explants ne depasse pas une semaine de culture. Pendant les trois premiers jours de culture les explants gardent leur composition cellulaire normale: la differentiation des cellules souches qui sont toujours presentes dans nos explants, aussi bien que la maturation des elements, soit de la serie rouge, soit de la serie blanche, continuent normalement. A partir du 4eme jour de culture, on peut observer que la composition cellulaire des explants a subi une brusque variation: les erythrocytes montrent des signes evidents de degenerescence; les erythroblastes deviennent de plus en plus rares, et, au 6eme jour de culture, ont presque disparu. Les cellules souches et les elements de la serie granulocytaire, au contraire, meme apres 5 a 6 jours de culture, sont tres nombreux et maintiennent leur capacite de se diviser par mitose (Planche 2, figs. A, B). Dans certains explants, on peut observer apres 4 a 5 jours de culture, la J. Embryo/, exp. Morph., Vol. 17, Part 2 PLANCHE 1 Fig. A. Moelle osseuse associee au mesonephros apres 2 jours de culture. Les granulocytes ont envahi les espaces intertubulaires. x 450. Fig. B. Moelle osseuse associee au foie embryonnaire apres 14 jours de culture: presence d'une grande lacune vasculaire pleine d'elements sanguins. x 1125. G.SALVATORELLI facing p. 360 / . Embryol. exp. Morph., Vol. 17, Part 2 PLANCHE 2 • # * B . • « • $ Fig. A. Moelle osseuse cultivee seule sur le milieu de culture apres 4 jours (frottis): une cellule souche en mitose et quatre myelocytes. x 1400. Fig. B. Moelle osseuse caltivee seule sur le milieu de culture apres 5 jours (frottis): un macrophage et un myelocyte en mitose. x 1400. Fig. C. Moelle osseuse cultivee seule sur le milieu de culture apres 4 jours (frottis): trois monocytes et un myelocyte. xl300. Fig. D. Moelle osseuse associee avec du foie embryonnaire (frottis) apres 15 jours de culture: un element non determine en mitose, deux erithrocytes et un granulocyte. x 1400. Fig. E. Moelle osseuse cultivee associee avec du foie embryonnaire apres 15 jours (frottis): un proerithroblaste et deux erithrocytes. x 1400. Fig. F. Moelle osseuse cultivee associee avec du foie embryonnaire apres 15 jours (frottis): deux erithroblastes, deux erithrocytes et un granulocyte. x 1400. G. SALVATORELLI facing p. 361 Uhematopo'iese in vitro 361 presence d'un nombre tres eleve de macrophages (Planche 2, fig. B), souvent pleins d'elements sanguins phagocytes. Les elements monocytaires qui etaient assez rares pendant les premiers jours de culture, deviennent, a partir du 3eme jour, les elements cellulaires les plus frequents (Planche 2, fig. C). (b) Culture de moelle osseuse associee au mesonephros Dans ce cas aussi on ne peut maintenir l'hematopoiese normale pendant plus de 3 a 4 jours de culture, et les resultats sont tout a fait comparables a ceux qu'on obtient en explantant la moelle osseuse seule sur le milieu de culture. Le mesonephros garde, apres 5 a 6 jours de culture, un aspect normal, tandis que la moelle osseuse est caracterisee par un extreme appauvrissement dans sa composition cellulaire: les elements de la serie rouge disparaissent bientot et apres quelques jours de culture on ne trouve dans les explants que des cellules souches et des elements de la serie granulocytaire et monocytaire. En ce qui concerne le comportement du tissu myeloide vis-a-vis du tissu mesonephrique, on peut noter que les deux tissus conservent en general leur individualite, mais dans certains cas, quelques elements de la moelle osseuse, surtout des granulocytes, montrent un pouvoir d'invasion tres intense (Planche 1, fig. A). Us colonisent les espaces intertubulaires et penetrent a l'interieur des tubes renaux. (c) Culture de moelle osseuse associee aufoie En associant la moelle osseuse au foie embryonnaire, nous avons obtenu des resultats tout a fait differents de ceux que nous avons obtenus avec les deux premieres methodes de culture. Meme apres quinze jours de culture, la structure et la composition cellulaire sont comparables a celles qu'on peut observer in vivo. A l'examen macroscopique les explants de moelle sont d'une couleur rouge vif. Dans certains cas, on peut noter, a leur surface, un voile liquide de sang nouvellement forme. L'examen microscopique des coupes nous montre l'existence de lacunes vasculaires remplies de cellules sanguines a differents stades de leur maturation (Planche 1, fig. B). Le tissu hepatique maintient, pendant toute la periode de culture, sa structure normale, a l'exception de sa partie centrale ou Ton peut observer des phenomenes de necrose, surtout si l'explant n'etait pas suffisamment mince. II faut aussi remarquer qu'on ne trouve jamais dans le foie des centres d'hematopoiiese. La penetration des leucocytes de la moelle osseuse dans le tissu hepatique est un phenomene tres rare a cause de la structure compacte de son parenchyme. Les frottis de la moelle cultivee en association avec le foie sont tres riches en elements soit de la serie rouge, soit de la serie blanche (Planche 2, figs. D, E, F). Tous les stades de la differentiation cellulaire depuis la cellule souche jusqu'a la cellule sanguine mure, sont presents dans nos explants et dans des proportions comparables a ceux existant dans la moelle osseuse normale (voir Tableau 1). Les erythrocytes qui avec les autres 23-2 362 G. SALVATORELLI methodes de culture degenerent au bout de quelques jours, sont aussi nombreux qu'zVz vivo, et ils nous paraissent tout a fait normaux. Tableau 1. Repartition des cellules hemopoietiques entre les divers stades de maturation des series blanche et rouge dans des frottis de la moelle osseuse d'embryons depoulet de 18 jours, normale et cultivee pendant 15 jours en association avec dufoie embryonnaire de 8 jours et demi Les comptages ont ete faits sur 3.000 elements et rapportes a 100 cellules. Hemocytoblastes Proerythroblastes Erythroblastes basophiles Erythroblastes polychromatophiles Erythroplastides Erythrocytes Myeloblastes Myelocytes Granulocytes Trombocytes Elements en mitose Normale Cultivee 1,3 0,9 0,27 0,57 2,90 1,30 0,10 78,60 0,90 0,87 14,1 0,13 0,26 2,20 4,50 0,10 70,25 3,66 3,33 12,77 0,43 0,56 DISCUSSION Le processus de l'erythropoiese peut etre divise en trois phases: (a) differentiation de la cellule myeloiide multipotentielle en erythroblaste; (b) maturation des erythroblastes; (c) synthese de Phemoglobine. Des recherches experimentales sur les facteurs erythropoietiques ont demontre que l'erythropoiese est sous le controle d'une hormone, l'erithropoietine, dont la principale source est le rein. Sa structure est celle d'une glycoproteine et elle serait presente en faibles quantites dans le plasma sanguin normal. Nous avons demontre que, dans les conditions de nos experiences, le tissu hepatique embryonnaire ajoute a la moelle osseuse joue un role indispensable dans la differentiation et la maturation des elements de la serie rouge. Le foie doit agir d'une facon specifique, car la culture de moelle osseuse, seule ou bien en association avec le mesonephros, ne permet qu'une survie tres limitee des differentes lignees sanguines; dans ces conditions de culture, les erythroblastes continuent leur maturation, tandis que la differentiation des cellules souches subit un arret, bien que leur activite mitotique reste normale. L'hypothese d'un passage de substances de la cellule hepatique aux elements myeloiides nous semble tres probable. Nous pensons que l'action du tissu hepatique sur le processus de l'erythropoiese est beaucoup plus complexe que la simple action des facteurs erythropoietiques du plasma. En comparant les resultats obtenus dans nos trois series d'experiences, on peut conclure que la Uhematopo'iese in vitro 363 presence du foie conditionne la differentiation des cellules souches en erythroblastes, et leur maturation ulterieure. En ce qui concerne Faction de l'erithropoietine sur des cellules sanguines cultivees in vitro, on a demontre (Krantz & Goldwasser, 1965) que ce ou ces facteurs erythropoietiques favorisent la synthese du nouveau RNA messager qui conditionne la differentiation fonctionnelle de la cellule sanguine. Au contraire, on ignore quel est ou quels sont les facteurs hepatiques agissant dans le determinisme de l'erythropoiese in vitro de la moelle osseuse d'embryon de poulet. Par consequent, il n'est pas possible de savoir si Tun d'entre eux est identifiable avec l'erythropoietine plasmatique. II nous semble cependant que l'action primaire du foie sur la moelle osseuse puisse s'identifier avec un effet specifique sur les cellules souches: elles acquerraient de nouvelles proprietes en se differenciant vers la serie rouge, et, sous cet aspect, ou peut voir une certaine analogie d'action entre le foie et l'erythropoietine. D'ailleurs, on sait que l'erythropoietine provoque dans les cultures la synthese de l'heme dans les cellules de moelle osseuse de rat cultivees in vitro (Krantz, Gallien-Lartigue & Goldwasser, 1963). II faut enfin rappeler que l'addition d'erythropoietine a des cultures organotypiques de foie foetal de souris peut prolonger l'erythropoiese de quelques jours, mais l'amelioration obtenue avec cette methode n'est que transitoire: les capacites erithropoietiques des explants s'epuisent rapidement; la maturation continue, mais la differentiation s'arrete (Gallien-Lartigue, 1966). On ne peut comparer exactement nos resultats et ceux obtenus par GallienLartigue, etant donne la difference du material utilise. Mais si le foie de mammifere est un centre de production de facteurs erythropoietiques (comme cela nous semble etre le cas du foie embryonnaire de poulet), on ne comprend pas pourquoi dans les cultures organotypiques de foie de souris cultive en milieu prive d'erythropoietine, l'erythropoiese s'arrete apres quelques jours de culture. Au contraire, l'apport de ce facteur dans le milieu peut exercer une action favorable sur la differentiation et la maturation de la lignee erythrocytaire. Dans l'etat actuel de nos recherches, il n'est pas encore possible d'identifier le ou les facteurs presents dans le foie embryonnaire de poulet dont Faction s'est montree aussi favorable a l'erythropoiese medullaire. Mais quelle qu'en soit la cause, nos experiences ont permis d'obtenir, en associant la moelle osseuse au foie embryonnaire, une hematopoiese durable; ceci constitue un bon point de depart pour l'etude, dans des conditions experimentales, des facteurs qui influencent la differentiation des elements sanguins. RESUME On a cultive la moelle osseuse d'embryon de poulet de 18 a 19 jours d'incubation sur le milieu de culture de Wolff & Haffen, seule, en association avec du mesonephros, en association avec du foie embryonnaire de poulet. 364 G. SALVATORELLI 1. L'association du foie avec la moelle osseuse s'est montree tres favorable au maintien du processus de l'erythropoiese medullaire. 2. Les explants gardent pendant au moins quinze jours de culture leur structure et leur composition cellulaires normales: ils sont tres riches soit en elements de la serie blanche, soit en elements de la serie rouge. 3. Tous les elements de passage de la cellule souche a la cellule sanguine mure sont presents dans nos explants. Ce qui prouve que l'erythropoiese continue pendant toute la periode de culture. 4. Le foie doit agir d'une facon specifique sur la differentiation et la maturation des elements de la serie rouge, puis que la culture de la moelle seule, ou bien association avec le mesonephros, ne permet qu'une survie limitee des elements de la serie rouge. SUMMARY The promotion of haemopoiesis in cultured chick embryonic bone marrow by embryonic liver Bone marrow of chick embryos of 18-19 days of incubation has been cultivated on the culture medium of Wolff & Haffen, alone or associated with mesonephros or liver of chick embryo. 1. The association of liver with bone marrow is shown to favour continuing medullary erythropoiesis. 3. These explants maintain their normal structure and cellular composition for at least 15 days of culture, and they are very rich in cells of the white and red series. 3. All stages of transition from stem cells to mature blood elements are present in these cultures. This is proof that erythropoiesis continues during the whole of the culture period. 4. The liver seems therefore to act specifically on the differentiation and maturation of the cells of the erythroid series, as culture of bone marrow alone or associated to mesonephros allows only a short survival of the cells of the red series. Ce travail a ete fait grace a l'aide d'une bourse du Ministero della Pubblica Istruzione et grace a une subvention du C.N.R. de la Republique Italienne. L'auteur tient a exprimer sa reconnaissance au Professeur Etienne Wolff pour l'hospitalite qu'il lui a accordee dans son laboratoire et pour son encouragement durant ces recherches. TRAVAUX CITES O. (1966). Action du facteur erythropoietique du plasma sur l'hemopoiese in vitro du foie de Souris embryonnaire. Expl Cell Res. 41, 109-16. KRANTZ, S. B. & GOLDWASSER, E. (1965). On the mechanism of erythropoietin-induced differentiation. Biochim. biophys. Acta 103, 325-32. KRANTZ, S. B., GALLIEN-LARTIGUE, O. & GOLDWASSER, E. (1963). The effect of erythropoietin upon heme synthesis by marrow cell in vitro. J. biol. Chem. 238, 4085-90. GALLIEN-LARTIGUE, Vhematopoiese in vitro 365 N. (1966). L'hematopoiese dans les formes embryonnaires et jeunes des vertebres. Ann. Biol. 5, 105-71. MANELLI, H. (1963). 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