Références bibliographiques
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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE KASDI MERBAH, OUARGLA FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE DEPARTEMENT DES SCIENCES BIOLOGIQUES Projet de Fin d’Etudes En vue de l’obtention du diplôme de Licence Domaine : Sciences de la nature et de la vie Filière : Biologie Spécialité : Biochimie fondamentale et appliquée Thème Synthèse bibliographique sur les techniques d’isolements et de culture des macrophages In vitro Encadreur : Mr. BOUAL Zakaria Co-encadreur : Mlle. BENAOUN Fatima Examinatrice : Mme. BAYOUSSEF Zahia Présenté par : DAHMANI Souraya BAZZINE Messaouda SENANE Soltana Année universitaire 2013/2014 Remerciements Avant tout, nous remercions Dieu tout puissant de nous avoir donné la force, le courage,la persistance et nous a permis d’exploiter les moyens disponibles à fin d’accomplir ce modeste travail. Merci de nous avoir éclairé le chemin de la réussite. Nous tenons à remercier particulièrement M BOUAL Zakaria, Maître Assistant au Département des Sciences de la Nature et de la Vie à la Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie et Sciences de la Terre et de L’Univers de l’Université Kasdi Merbah-Ouargla,et Melle BENAOUN FATIMA qui ont encadrés ce travail depuis les premiers instants, leur pédagogie, leur écoute, leur ouverture d’esprit et leur vision de la recherche scientifique, ont été importants pour nous que leurs connaissances éclectiques et ont largement contribué à l’évolution de ce travail. Nous exprimons nos profondes reconnaissances à M OULD ELHADJMohamed Didi,Professeur au Département des Sciences de la Nature et de la Vie à la Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie et Sciences de la Terre et de L’Univers de l’Université Kasdi Merbah-Ouargla, qui nous a ouvrir les portes de l’écosystème. Nous tenons aussi à remercier Mme BAYOUSSEF Zahia,Docteur au Département des Sciences de la Nature et de la Vie à la Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie et Sciences de la Terre et de L’Univers de l’Université Kasdi Merbah-Ouargla, pour avoir accepté d’examiner ce travail. Nous remercions Dr.BRADAI Lyès de nous pour son ouverture et son attention vis-à-vis de nos questions et sa soutenance depuis les trois derniers années. On n’oublie pas nos parents pour leur contribution, leur soutien et leur patience. Un grand merci pour DAHMANI Omar pour leur soutien et leur générosité. Enfin, nous adressons nos plus sincères remerciements à tous nos proches et amis, qui nous ont toujours encouragées au cours de la réalisation de ce mémoire. Merci à tous et à toutes. II Abréviations BSA : Albumine bovine sérique MPO : Myéloperoxydase BCG : Mycobacterium bovis bacillus MPS : Système Phagocytaire calmette-guérin Mononucléaire CCE : Elutriation centrifuge à Contre- NK: Naturel Killer courant NO :Oxide Nitrique CMH : Complexe Majeur PAMP: Pathogen Associated Molecular d’Histocompatibilité Patten DMEM: Milieu d’Eagle modifié par PBMC : Cellules Mononuclées du Sang Dulbecco Périphérique EDTA : Acide Ethylène Diamine Tétra PBS: Phosphate Buffered Saline acétique PGDF: Platelet-Derived Growth Factor EGF: Epidermal Growth Factor PGN: Peptidoglycane EtOH: éthanol PRR: Pattern-Recognition Receptors FCS: Sérum de veau Fœtal RPMI -1640 : Roswell Park Memorial FIM: Factor Increasing the Institute Monocytopoiesis S.M.A.F : Macrophage Armés par un GM-CSF: Granulocyte-macrophage Facteur Spécifique colony-stimulating factor TGF-β : de Transforming Growth HBSS : Solution saline équilibrée de Hank Factor-β HS :Sérum de cheval TLRs: Toll-Like Receptors IFN-γ :Interféron TNF: Tumor Necrosis Facteur IL-1 : Interleukine -1 TNF α : Tumor Necrosis Facteur α IL-10 : Interleukine-10 DTH : Hypersensibilité retardée IL-12 : Interleukine-12 MCP-1 : Protéine Chimio-attractive IL-15 : Interleukine-15 Monocytaire 1 IL-4 : Interleukine-4 SR : Récepteur Scavenger IL-6 : Interleukine-6 PGE2 : Prostaglandine E2 iNOS: inductible Nitric Oxide GBSS : Gey de l'équilibre Solution de Synthetase Sel KC: Cellule Küpffer GBS : Gélose de Base LPS: Lipopolyscharides LCM : Cellule Milieu Conditionné M-CSF: Monocyte colony-stimulating factor III Liste des tableaux No Titre Page 01 Les phénotypes de deux meilleurs caractéristiques des monocytes 07 chez le mammifère (GORDON et TAYTOR, 2005) Liste des figures No 01 Titre (A) Image prise en microscopie électronique à balayage (SEM) montrant des macrophages alvéolaires humains isolés par lavage bronchioalvéolaire adhérant sur verre pendant 15 min avant fixation (×3000),(B) Image prise en microscopie électronique à transmission (TEM) montrant une coupe axiale de macrophages alvéolaires humains (N :noyau) (FEREOL, 2005). Page 05 02 Schéma illustrant les différentes étapes de la différenciation de la cellule souche en macrophage (FEREOL, 2005). 11 03 Apoptose des neutrophiles et clairance de phagocytose par les macrophages dans la résolution de l’inflammation (PEARLINE TEO, 2003). 14 IV Table de matière Abréviation Liste des tableaux Liste des figures Introduction 02 Chapitre I Cellules mononuclées macrophages I.-Macrophages 04 I.1.-Définition et historique 04 I.2.- Monocytes 05 I.2.1.- Hétérogénéité des monocytes chez l’homme 05 I.2.2.- Hétérogénéité des monocytes chez les souries 06 I.3.- Origine des macrophages 09 I.4.- Morphologie des macrophages 10 I.5.- Rôle des macrophages 11 I.5.1.- Filtration 11 I.5.2.- Reconnaissance et phagocytose 12 I.5.3.- Présentation de l’antigène aux lymphocytes T 12 I.5.4.- Sécrétion des cytokines 12 I.5.5.- Synthèse des protéines du complément 13 I.5.6.- Régulation de la production des monocytes au cours d’une inflammation aiguë 13 I.5.7.- Apoptose 14 I.5.8.- Autres rôles 14 Chapitre II Isolement et purification des macrophages II.1.- Isolement des monocytes 17 II.1.1.- Séparation des cellules mononuclées par gradient de densité 17 II.1.2.- Isolement des monocytes par la méthode de PETIT HORY et HO THIN SAUJ 17 II.1.2.1.- Principe 17 II.1.2.2.- Méthode 17 II.1.3.- Isolement des monocytes par contre-centrifuge II.2.- Purification des monocytes 18 18 II.2.1.- Epuisement des monocytes utilisant L-leucine méthyle ester V 18 II.2.2.- Purification des monocytes utilisant la gélatine 19 II.2.2.1.- Principe 19 II.2.2.2.- Méthode 19 II.3.- Isolement des macrophages 20 II.3.1.- Isolement des macrophages de la moelle osseuse II.3.1.1.- Méthode 20 20 II.3.2.- Isolement des macrophages alvéolaires 21 II.3.3.- Isolement des macrophages testiculaires 21 Chapitre III Culture des monocytes et des macrophages III.1.- Culture cellulaire 24 III.1.1.- Types de culture cellulaire 24 III.1.1.1.- Culture primaire 24 III.1.1.2.- Culture secondaire 24 III.1.1.3.- Culture du linge cellulaire 24 III.1.2.- Milieu de la culture cellulaire 25 III.1.3.- Culture des monocytes in vitro 25 III.1.4.- Mesure de la libération de NO et de l’activité iNOS 25 III.1.5.- Induction de maturation des monocytes humains en macrophages in vitro par la vitamine 1,25- dihydroxyvitamine D3 III.2.- Activation des macrophages 26 27 III.2.1.- Macrophages M1 et macrophages M2 28 III.2.2.- Prés-activation 29 III.2.3.- Voies d’activation 29 II.2.3.1.- Activation par la voie classique 29 II.2.3.2.- Activation par voie alterne 30 III.2.4.- Agents activateurs 31 III.2.4.1.- Agents d’origine bactérienne 31 III.2.4.1.1.- Lipopolysccharides (LPS) 31 III.2.4.1.2.- Peptidoglycane (PGN) 32 III.2.4.2.- Agents d’origine fongique 33 III.2.4.3.- Agents d’origine végétale 33 III.2.4.4.- Agents chimiques 34 III.2.4.4.1.- H2O2 34 Conclusion 36 Références bibliographiques 38 Annexes VI Introduction Introduction Historiquement, les macrophages sont décrits comme acteurs clés de la réponse immunitaire innée. ELIE METCHNIKOFF fut un pionnier dans la caractérisation des macrophages en tant que cellules effectrices de la réponse immunitaire avec la description de la phagocytose (GALES, 2009). Ces derniers sont une population de cellules dérivée de progéniteurs de moelle osseuse CD34+ (MARUOTTI et al.,2013). Ils appartiennent à la lignée myéloïde. Ils représentent la forme mature des monocytes qui circulent dans le sang et qui migrent continuellement dans les tissus où ils se différencient après leur rencontre avec un antigène (BERNARD, 2011). Ils représentent une partie importante du système immunitaire, fournir a l’organisme de première ligne de défense et dans le même temps responsable de la maintenance quotidienne de l’homéostasie, les macrophages sont donc des cellules essentielles à la réponse immunitaire (GRATCHEV et al., 2012). La réserve en macrophages tissulaires reste relativement constante dans un organisme sain. Cependant ils sont constamment remplacés par de nouveaux qui proviennent de monocytes circulants. Il est devenu clair que les différentes maladies impliquent une modification de la fonction des monocytes circulants (GRATCHEV et al., 2012). La complexité des interactions cellulaires qui génèrent une réponse immunitaire a conduit les immunologistes à se tourner bien souvent vers divers types de systèmes de culture cellulaire in vitro, y compris les macrophages (KINDT et al., 2008). La culture cellulaire est donc devenue une technique de routine pour certaine applications. Les techniques s’affinent pour devenir de plus en plus contrôlées et reproductibles (OVAGUIMIAN, 2004). Certains des domaines importants dans lesquels la culture cellulaire joue actuellement un rôle majeur les tests de toxicité, recherche sur le cancer, virologie et découverte de nouveaux médicaments (RYAN, 2007). Pour cela l’objectif de ce travail est de décrire les différentes techniques d’isolement et de culture des macrophages in vitro. A cet effet cette étude s’articule autour trois parties, le premier partie correspond à une synthèse bibliographique présentant les cellules mononuclées monocytes /macrophages, origine, morphologie, hétérogénéité et rôles. Le second chapitre de ce manuscrit explique des différentes techniques d’isolement des monocytes et macrophages. Le dernier chapitre de ce mémoire présente des techniques de culture des monocytes in vitro, ainsi les différentes voies d’activations des macrophages avec quelques exemples d’agents activateurs. 2 Chapitre I Cellules mononuclées macrophages Chapitre I Cellules mononuclées macrophages I.- Macrophages I.1.- Définition et historique Les macrophages sont des globules blancs a durée de vie longue qui assurent la surveillance immunitaire dans les tissus et qui y jouent un rôle d’entretien important. Ils dérivent des monocytes qui circulent dans le sang et ils se différencient en quittant le flux sanguin. Comme les neutrophiles, ils ingèrent et détruisent les micro-organismes (DEFRANCO et al., 2009). Ils sont impliqués dans la phagocytose, dans le déclenchement et la régulation de l’inflammation, dans l’apprêtement et la présentation des antigènes aux lymphocytes T ainsi que dans la production de cytokines telles que l’IFN-y, le TNF-a et l’IL-la, qui régulent l’immunité adaptative (STEVENS et al., 1997). Ils tiennent leur nom de gros mangeur du grec (makros = grand, phagein = manger) (SCHWARTZ, 2012). Ils sont initialement comptabilisés par ELIE METCHNIKOFF en 1838 que les cellules phagocytaires responsables de l’élimination des agents pathogènes et des fonctions d’entretien ménager dans un large éventail d’organismes, d’invertébrés au vertébrés (MARTINEZ et al., 2008). En 1924, ASCHOFF a proposé la conceptualisation au système réticulo-endothélial (RES) et inclus les macrophages (histiocytes) comme un élément majeur de ce système, avec des cellules réticulaires et réticuloendothélial (TAKAHASHI, 2000). Bien que plusieurs tentatives ont été faites pour classer les macrophages, les plus réussis définitions est le système phagocytaire mononucléaire (MPS), qui englobe ces cellules phagocytaires (phagocytes professionnels) et leur les progéniteurs de la moelle osseuse, les macrophages tissulaires adultes sont définis comme des cellules de la lignée phagocytaire mononucléaire dérivée d’extrémité à partir de monocytes qui prennent naissance dans la moelle osseuse de circulation (WYNN et al., 2013). Ce n’est qu’en 1972 que VAN FURTH à compris qu’a une grande dispersion macrophagique correspondait en fait une fonctionnalité unique (BENE et al., 2005). Les macrophages sont une population hétérogène de cellules réparties de façon ubiquitaire dans les diverses organes et des tissus des êtres humains et des animaux; ils montrent différentes morphologies et ont des fonctions variables selon les exigences des tissus dans les quels ils se produisent (TAKAHASHI, 2000). Chez les mammifères adultes, ils se trouvent dans tous les tissus où ils affichent une grande diversité anatomique et fonctionnelle. Dans les tissus, ils sont organisés en motifs définis à chaque cellule occupant son territoire, un type de macrophage dans un tissu (WYNN et al., 2013). 4 Chapitre I Cellules mononuclées macrophages Fig.01- (A) macrophages alvéolaires humains en microscopie électronique à balayage (×3000), (B) coupe axiale de macrophages alvéolaires humains en microscopie électronique à transmission (FEREOL, 2005). I.2.- Monocytes Les monocytes appartiennent au système des phagocytes mononuclées (GALES, 2009). Ces cellules sont de grands leucocytes, 10 à 20μm caractérisées par un noyau en forme de fer à cheval et possédant de nombreux lysosomes qui contiennent un large panel d’enzymes (BARANEK, 2007). Ils représentent 2 à 10 % des leucocytes (HELLAL, 2007). 5 à 10 % des leucocytes circulants chez l’homme et 2 % des leucocytes circulants chez la souris (BELIARD-LASSERRE, 2011). Les monocytes circulent dans le sang de 1 à 3 jours avant de se différencier en différents types de cellules phagocytaires (BARANEK, 2007). I.2.1.- Hétérogénéité des monocytes chez l’homme Les monocytes circulants donnent lieu à une variété de macrophages tissulaires résidants dans tout le corps. Les premiers travaux sur les monocytes humains ont permis de rendre compte de l’hétérogénéité, tout d’abord la morphologique des monocytes. En effet ces études permettant une séparation des cellules sur des critères morphologiques (GALES, 2009). Les monocytes du sang périphérique montrent une hétérogénéité morphologique, tels que la variabilité de la taille, la granularité et la morphologie nucléaire (GORDON et TAYLOR, 2005). Ces trois critères ont constitué les premiers constats d’une hétérogénéité de la population monocytaire. Deux populations sont alors distinguées. Une première, majoritaire, correspond aux monocytes «réguler». Ces monocytes présentent une forte capacité de phagocytose et une importante activité myéloperoxydase. Une seconde, minoritaire, constituée de « petits » monocytes, est initialement caractérisée comme ayant une capacité importante à produire de l’IL-1(GALES, 2009). L’identification ultérieure de l’expression différentielle des marqueurs 5 Chapitre I Cellules mononuclées macrophages antigéniques ont montré que les monocytes dans le sang périphérique humain sont hétérogène, et sont les premiers indices sur les différentes activités physiologiques de sous-ensembles des monocytes (GORDON et TAYLOR, 2005). L’expression différentielle de CD14 et CD16 (également connu sous le nom de Fc RIII γ ) divise les monocytes en deux sous-ensembles. La première sous-population dite « classique » parce que son phénotype ressemble à la description originale de monocytes. Elle correspond aux monocytes présentant un faible taux d’expression du marqueur CD16 mais une expression importante du marqueur CD14 (CD14haut CD16-). Elle représente plus de 80% des monocytes circulants chez un sujet sain. La deuxième sous-population est caractérisée par la co-expression des deux marqueurs CD14 et CD16 (CD14+ CD16+), elle représente environ 10% des monocytes circulants. Ils expriment une quantités plus élevée de molécules CMH de classe II et CD32 ( également connu sous le nom de Fc γ RII ) , et il a été suggéré que Ces cellules ressemblent à des macrophages tissulaires matures (GORDON et TAYLOR , 2005) . Des expériences in vitro ont permis des suggérer que ces différentes sous-populations de monocytes pourraient avoir des fonctions différentes. En effet des différences dans leur capacité de phagocytose et d’activation ont été reportées. Cependant, le rôle spécifique de chaque ses sous-populations ainsi que leur importance physiopathologique restent à déterminer (CHATENOUD L et BACH., 2012). I.2.2.- Hétérogénéité des monocytes chez les souries Une étape clé dans la caractérisation des cellules du système des phagocytes mononuclées est l’arrivée des anticorps monoclonaux (GALES, 2009). Il émergea deux marqueurs des cellules de ce système chez la souris (F4/80 et CD11b), les monocytes identifiés chez la souris par leur phénotype F4/80+ CD11b+. De manière comparable à la population monocytaire humaine, les monocytes de souris sont subdivisés en deux souspopulations distinctes basées sur les niveaux d’expression de deux marqueurs de surface CCR2 (également connu sous le nom de L-sélectine) et CX 3 CR1 récepteur de chimiokine C-1. Un sous-ensemble de monocytes exprimé CCR2 et seulement des quantités modérées de CX 3 CR1dit population « résidente », tandis que la seconde n’exprime pas le récepteur CCR2 ou CD62L mais a exprimé des quantités plus élevées de CX 3 CR1, cette population dite « inflammatoire » (GORDON et TAYLOR, 2005). 6 Chapitre I Cellules mononuclées macrophages Tableau 01- : Les phénotypes de deux meilleurs caractéristique des monocytes chez les mammifères Antigè ne “Monocytes inflammatoi res” Humains CD14hi CD16 - “monocyte s résidentes” Humains CD14+CD 16+ “Monocytes inflammatoi res” Souries CCR2+ CX3CR1LO W “monocy tes résidente s” Souries CCR2CX3CR1 hi “Monocytes inflammato ires Rat CD43low “Monocy tes residente s” Rat CD43hi Les récepteurs de chimiokines CCR1 CCR2 ‡ CCR4 + + - ND + ND - ND + ND - + - ND ND ND ND CCR5 CCR7 CXCR 1 CXCR 2 CXCR 4 CX3C + + + - ND ND ND ND ND ND ND + ND ND ND + - ND ND ND ND + ++ ND ND ND ND + ++ + ++ - + + - ND Autres récepteurs ND ND ND R1 ‡ CCR1 CD4 CD11a CD11b CD11c CD14 + ND ++ ++ +++ + ND ++ +++ + ND + ++ ND ND ++ ++ + ND +/ND ++ ND ++ ND ++ + ND CD31 CD32 CD33 CD34 +++ +++ +++ ND +++ + + ND ++ ND ND - + ND ND + ND +++ ND - ND + ND + 7 Chapitre I Cellules mononuclées macrophages CD49b CD62L CD80 CD86 CD115 CD116 CD200R F4/80 Ly6C ND ++ ND + ++ ++ ND ND ND ND ND ++ ++ ++ ND ND ND + + ND ND ++ ++ ND + + ND ND ++ ++ ND + - ND + ND ND ND ND + ND ND ND ND ND ND ND ND ND 7/4 CMH classe II ND + ND ++ + - - ND ND ND ND (-) : Aucune expression, (+ / -) : expression marginale, (+) : Existence d’une expression, (++, …) : Expression en plus, (ffi) : Ces récepteurs présentent une bonne conservation des différences d'expression. 8 Chapitre I Cellules mononuclées macrophages La population CCR2+ CD62L+ CX3CR1bas Ly6C+ est assimilée à la population de monocytes « classique » humaine. Parallèlement la population CCR2- Ly6C- est corrélée à la population CD14+ CD16+ humaine. Ces monocytes Ly6C- CX3CR1haut auraient un rôle de patrouilleurs dans les vaisseaux sanguins et assureraient l’élimination des lipides oxydés, des cellules mortes mais seraient alors aussi impliqués dans la pathogenèse de l’athérosclérose. Cependant ces monocytes patrouilleurs seraient très réactifs en cas de dommages tissulaires et l’extravasation vers le tissu lésé serait réalisée très rapidement. Ces correspondances entre sous-populations murines et humaines qui sont encore actuellement étudiées, sont importantes afin d’appuyer la relevance de l’étude des populations monocytaires, leurs caractéristiques fonctionnelles chez la souris pour mieux comprendre les phénomènes (GALES, 2009). I.3.- Origine des macrophages Sabin et al. (1925) après coloration supra-vitale a signalé que les macrophages sont tirées à partir de monocytes. Aussi EBERT et FLOREY (1939) au cours des études in vivo, faites à l’oreille de lapins, ont constaté que les macrophages dans les foyers inflammatoire étaient obtenues à partir de monocytes migrent du sang périphérique. Ainsi AMANO en 1948 a également maintenu sur la base des études par coloration supra-vitale que les macrophages dans les foyers inflammatoires ou a l’état d’équilibre normal sont obtenues à partir de monocytes migrent du sang périphérique (TAKAHASHI, 2000). Les monocytes proviennent de cellules souches pluripotentes de la moelle osseuse (WILSON et al., 2005). En présence de granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) et de monocyte colony-stimulating factor (M-CSF), les cellules souches exprimant CD34 se différencient en monocytes (BURMESTER et al., 2000). Ils se transforment par diverses étapes de maturation en monoblastes, puis finalement en monocytes qui sont rapidement libérés dans la circulation (WILSON et al., 2005). Les monocytes circulants sont hétérogènes. Cette hétérogénéité reflète la spécialisation de la fonction qui est adopté par les macrophages dans différents emplacements anatomiques (GORDON et TAYLOR, 2005). Ils y restent de un à trois jours ou moins dans le cas de maladies inflammatoires avant de migrer dans les tissus et de se différencier en macrophages ou cellules dendritiques (WILSON et al., 2005). De façon intéressante, la rate constitue un réservoir de monocytes dites inflammatoires peuvent être recruté rapidement en particulier lors d’une défaillance cardiaque (CHATENOUD et BACH, 2012). Au départ, les monocytes roulent sur la surface de l’endothélium et sont exposés à des chimiokines telles que CCL5 et CXCL8 liées à CD44 et aux protéoglycanes à sulfate 9 Chapitre I Cellules mononuclées macrophages d’héparine sur la surface de la cellule endothéliale. Ces interactions activent les intégrines leucocytaires, comme LFA-1, Mac-1 et VLA4, ce qui accroît leur affinité pour leurs ligands endothéliaux. Ceci favorise une adhésion ferme et par la suite la diapédèse à travers l’endothélium (WILSON et al., 2005). L’activation des cellules endothéliales accentue l’efficacité avec laquelle elle interagit avec les monocytes, et des preuves que l’activation par différentes cytokines influence les propriétés de transmigration des monocytes apparaissent. Le recrutement par des chimiokines particulières influence également la maturation ultérieure des monocytes. Les événements qui dictent si un monocyte va maturé en cellule dendritique ou en macrophage et le type de macrophage qu’il va devenir surviennent très rapidement après la migration et la localisation dans le foyer inflammatoire, et dépendent des signaux de compétence délivrés par l’endothélium. Malgré cela, le microenvironnement des tissus endommagés fournit probablement les signaux dominants à la fois pour la différenciation et l’activation. En conséquence, IL-4, IL-15 et TNF- α conduisent les monocytes vers un phénotype de cellule dendritique, alors que IFN- γ, IL-6, IL-10 et l’activation des récepteurs de type Toll (TLR) favorisent un phénotype macrophage (WILSON et al., 2005). I.4.- Morphologie des macrophages La différenciation d’un monocyte en un macrophage tissulaire implique de nombreux changement ; la cellule grossit cinq a dix fois, ces organites intracellulaires augmentent en nombre et en complexité ; elle acquiert une plus grande capacité phagocytaire, produit des taux plus élevés d’enzymes hydrolytique et commence à sécréter toute une série de facteurs solubles. Les macrophages sont dispersés dans tout l’organisme. Certains élisent résidence dans des tissus particuliers, où ils deviennent des macrophages résidents, tandis que d’autres demeurent mobiles et sont appelés macrophages libres ou voyageurs. Les macrophages libres se déplacent grâce à des mouvements amiboïdes à travers les tissus (KINDT et al., 2008). Des cellules semblables aux macrophages assument divers fonctions dans des différents tissus et sont dénommées en fonctions de leurs localisations tissulaires , macrophages de moelle osseuse, cellules du Küpffer, macrophages spléniques, macrophage cérébraux et les cellules microglies, ostéoclastes, macrophages alvéolaires, et macrophages des cavités séreuses. 10 Chapitre I Cellules mononuclées macrophages Fig.02- Schéma illustrant les différentes étapes de la différenciation de la cellule souche en macrophage (FEREOL, 2005). I.5.- Rôle des macrophages Les macrophages ont des nombreuses fonctions importantes. Il débarrassent l’organisme des matériels étrangers ou des cellules mortes. Ils ont également un rôle important dans la réponse immunitaire et d’autres activités spécialisées (COUJARD et al.,1980). I.5.1.- Filtration Les macrophages ont un rôle crucial dans la filtration car ils sont présents dans tous les territoires proches de l’extérieur, le poumon, le foie où les cellules de Küpffer sont situées en première ligne face à ce qui vient du tube digestif et les ganglions (DEGOS, 1987). On les trouve aussi dans la rate qui peut être considérée, notamment, comme un filtre du sang, le sang lui-même sous forme de monocytes, les séreuses, le rein et le cerveau où ils constituent la microglie (DEGOS, 1987). Les macrophages sont les principales cellules responsables de nettoyage du matériel autochtone usagé et sachent le reconnaitre ; hématies vieilles, lymphocyto-phagocytose dans les organes lymphoïdes (COUJARD et al., 1980). 11 Chapitre I Cellules mononuclées macrophages I.5.2.- Reconnaissance et phagocytose D’un point de vue fonctionnel, les macrophages sont doués par ses possibilités de phagocytose ou de reconnaissances (DEGOS, 1987). Après sa mobilisation vers la cible la macrophage doit reconnaitre l’antigène à ingéré puis l’ingérer, c’est la phagocytose proprement dit dont le terme doit êtres la destruction et la digestion de cet agent agressif (COUJARD et al.,1980). La phagocytose propremendit est exepliquer comme suit, une fois acculée à la membrane cellulaire, les substances à phagocyter est entouré par des pseudopodes se rejoingent fusionnent forment alors des visicules de phgocytose ou phagosome (COUJARD et al.,1980). Dans cette vois, un phagosome se déplace vers l’interieur de la cellule, où il fusionne avec un lysosome, pour former un phagolysosome, les lysosomes contiennent du lysozyme et de toute une gamme d’autres enzymes hydrolytiques qui digérent le matériel ingéré (KINDT et al., 2008). Le macrophage est capable de restaurer non seulement la membrane cytoplasmique par la formation de ces vacuoles, mais aussi les récepteurs membranaires (COUJARD et al., 1980). Et finalement les constituants digérés du phagolysosome sont ensuite éliminés par un processus dit exocytose (KINDT et al., 2008). I.5.3.- Présentation de l’antigène aux lymphocytes T La lyse des micro-organismes phagocytés se fait au sein de la cellule à l’aide de dérivés activés de l’oxygène, de l’oxyde nitrique et d’enzymes lysosomiales (BURMESTER et al., 2000), et notamment grâce aux péroxydases et aux estérase, cette digestion n’est cependant pas complète car le macrophage doit présenter les antigènes aux lymphocytes T (DEGAS, 1987). Le macrophage présente les antigènes sous forme de fragments, qui sont des peptides présentés dans le contexte des molécules de classe II d’histocompatibilité, ce qui signifie que le signal transmis par le macrophage aux lymphocytes est constitué d’un assemblage du fragment antigénique et de molécules de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité (DEGOS, 1987). Les lymphocytes T représentent avec les macrophages les cellules de l’immunité cellulaire (COUJARD et al.,1980). I.5.4.- Sécrétion des cytokines Les macrophages sont des cellules sécrétrices responsables de la sécrétion et la libération des produits dans le milieu extracellulaire. Ils réalisent la synthèse des substances intervenant dans la défense anti-infectieuse (COUJARD et al.,1980). Les macrophages sécrètent des facteurs de croissance ; PGDF, TGF-β, EGF, TNF-α et IL-1 induit la 12 Chapitre I Cellules mononuclées macrophages prolifération de l’endomètre (BELAISCH et al., 2003 ). Ils activent aussi la myélopoïèse (CSF), cette dernière c’est la production des cellules myéloïdes ; globules rouges, polynucléaires, monocytes et plaquettes (DEGOS, 1987). Les macrophages jouent également un rôle dans la coordination des autres cellules et tissus du système immunitaire ou d’autres système de soutien, Ils exercent cette influence par la sécrétion d’une variété de cytokines, incluant I’IL-1, le TNF-α et L’IL-6, ces cytokines sont particulièrement aptes à activer la réponse inflammatoire, bien que chacun de ces agents ont des effets variés (KINDT et al., 2008). Par exemple, les macrophages stimulés par l’inflammation peuvent contribuer à produire de l’IL-15, une faible concentration de ces cytokines donne lieu à un processus de compétition entre les lymphocytes T CD8 mémoire, les événements les plus dépendantes de l’IL-15 comprennent le développement et l’homéostasie des cellules T CD8 mémoire, les cellules tueuses naturelles et les lymphocytes intra-épithéliaux (CASTILLO, 2012). Ainsi que l’IL-1 active les lymphocytes, et l’IL-1, l’IL-6 et le TNF-α favorisent la fièvre en influent sur le centre thermorégulateur situé dans l’hypothalamus (KINDT et al., 2008). De même, que de nombreuses autres cellules produisent de l’interféron lors d’une atteinte virale et d’autant plus que l’individu est immunisé contre les virus (COUJARD et al.,1980). Les macrophages sécrètent des facteurs non spécifiques qui inhibent la réponse immunitaire comme les prostaglandines (DEGOS, 1987). I.5.5.- Synthèse des protéines du complément Avec les cytokines, les cellules du système phagocytaire mononuclée ; monocytes et macrophages des organes lymphoïdes réalisent la synthèse des fractions C1, C2 et C3 du complément (COUJARD et al.,1980). Les macrophages activés produisent des protéines du complément qui favorisent l’inflammation et aident dans l’élimination des pathogènes, bien que le site principal de la synthèse des protéines du complément soit le foie, ces protéines sont également produites dans les macrophages et d’autre type cellulaire (KINDT et al., 2008). I.5.6.- Régulation de la production des monocytes au cours d’une inflammation aiguë Le plasma et le sérum recueilli au cours de l’apparition d’une réaction inflammatoire contiennent un facteur qui stimule le monocytopoiesis. Ce facteur est appelé facteur augmentant le monocytopoiesis (FIM). Le FIM est synthétisé et sécrété par les macrophages au site inflammatoire et ensuite transporté par l’intermédiaire de la circulation de la moelle osseuse, où il exerce son action stimulatrice (VAN FURTH, 1985). 13 Chapitre I Cellules mononuclées macrophages I.5.7.- Apoptose Les macrophages participent également dans la clairière de cellules apostoliques. L’apoptose est crucial dans le développement et l’homéostasie de tous les organismes multicellulaires. Les caractéristiques typiques de cellules apoptotiques sont la fragmentation nucléaire, bourgeonnement de la membrane et la présentation des signaux « mange- moi ». L’intégrité de la membrane est préservée, et les cellules sont soigneusement englouties par les cellules voisines et les phagocytes professionnels (PEARLINE TEO, 2003). Fig.03- Apoptose des neutrophiles et clairance de phagocytose par les macrophages dans la résolution de l’inflammation (PEARLINE TEO, 2003). I.5.8.- Autres rôles Dans la réponse secondaire de l’immunité de type humorale, les macrophages sont également des cellules effectrices par leur phagocytose augmentée en présence d’opsonines (COUJARD et al.,1980). L’opsonine molécule qui se fixent à la fois à l’antigène et aux macrophages et intensifient la phagocytose, l’anticorps et le complément fonctionnent comme des opsonines (KINDT et al., 2008). Ou par la destruction des cellules entourées par des anticorps cytophiles (COUJARD et al.,1980). Ce processus par la quel des antigènes particulières sont rendus plus sensibles à la phagocytose est appelé opsonisation (KINDT et al., 2008). Dans l’immunité anti-tumorale, les lymphocytes T après avoir reconnu la cellule tumorale, transmettent aux macrophages une substance les rendant capables de détruire 14 Chapitre I Cellules mononuclées macrophages spécifiquement ces cellules tumorales. Les macrophages prennent alors le nom de macrophage armés par un facteur spécifique (S.M.AF) (COUJARD et al.,1980). Les macrophages sont impliqués dans la défense anti-tumorale, ce pouvoir tumoricide est considérablement amplifié par l’IFN-γ actif à très faibles concentrations à l’inverse, une modulation négative peut-être exercée par l’IL-1, l’IL-10 et le TGF-β, cependant ,il a été également démontré que les macrophages associés aux tumeurs peuvent, dans certains cas ,exercer des effets pro-tumoraux en particulier via une activité angiogénique ( BACH, 2008). 15 Chapitre II Isolement et purification des macrophages Chapitre II Isolement et purification des macrophages II.1.- Isolement des monocytes Il ya environ de 300 à 500 monocytes par µl de sang chez l’homme, soit 3 à 7% des leucocytes dans la moelle. Pour un homme de70 kilos, le nombre totale est d’environ 7,3 ×109 dans la moelle et 1,7×109 dans le sang (GADAIS, 1981). II.1.1.- Séparation des cellules mononuclées par gradient de densité Le sang périphérique est le principale source de cellules lymphoïdes et des cellules du système immunitaires (KANOF et al., 1996). Le sang total prélevé sur anticoagulant est dilué dans une solution saline, puis déposé sur une solution de Ficoll-Hypaque (Voir annexe 1) (VAUBOURDOULLE, 2007). Après centrifugation, les hématies et les polynucléaires qui ont une densité plus élevée se déposent au font du tube, alors que les cellules mononuclées ; monocytes et lymphocytes formant un anneau à l’interface Ficoll-plasma (VAUBOURDOULLE, 2007). Les monocytes sont sélectionnés à partir des cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) par tri sélectif magnétique positif à l’aide d’anticorps anti-CD14 (BELLO, 2008). Les monocytes sont analysées par cytométrie en flux FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorter) en utilisant un double marquage anti-CD3 humain-FITC (isothiocyanate de fluorescéine) et anti-CD14 humain-PE (phycoérythrine). Les monocytes sont caractérisés par un phénotype CD14+/CD3-. La pureté des monocytes après tri cellulaire est au moins supérieure à 90% à chaque fois (BELLO, 2008). II.1.2.- Isolement des monocytes par la méthode de PETIT HORY et HO THIN SAUJ II.1.2.1.- Principe Cette méthode est basée sur la centrifugation du sang prélevé avec anticoagulant, l’élimination des plasma et la lyse des érythrocytes par l’utilisation d’une solution hypotonique (DULAT et al., 1984). II.1.2.2.- Méthode 1. Prélever 10ml de sang dans des tubes stériles (vacutainer) avec deux anticoagulants, Héparine 50 U.I (2 gouttes), et Rhéomacrodex (1ml). 2. Centrifuger à une vitesse de 3000-4000tours/mn. Après l’obtention de 3 couches, Plasma, leucocytes et hématies. 17 Chapitre II Isolement et purification des macrophages 3. Eliminer le plasma par aspiration sous vide, et laver le culot constitué de leucocytes et d’hématies 3 fois par de l’eau physiologique, et centrifuger à chaque lavage. 4. Après ces lavages à l’eau physiologique, hémolyser les hématies par 30 gouttes de saponine à 2% dans le sérum physiologique. 5. Laisse agir la saponine durant 2 minutes puis on centrifuge de nouveau pour ne laisser se déposer que les leucocytes, un dernier lavage à l'eau physiologique donnera un culot de centrifugation dépourvu d’hématies. II.1.3.- Isolement des monocytes par contre-centrifuge La centrifugation à contre-courant (CCE) est une méthode très efficace pour un grand nombre de monocytes de PBMC purifiées (WAHL et al., 2005). La séparation des différentes populations cellulaires se fait en fonction de leur taille et de leur densité. Le contenu de la poche de cytaphérèse est introduit, à l’aide d’une pompe péristaltique, dans une chambre d’élutriation conique tournant à grande vitesse (BARANEK, 2007). Le protocole comprend quatre parties, montage du système de CCE, préparation de cellules mononucléaires, et l’isolement des monocytes par le CCE. L’avantage de cette méthode que le CCE ne conduit pas à l’activation de monocytes lorsqu’elle effectué en l’absence complète de l’endotoxine (WAHL et al., 2005). II.2.- Purification des monocytes II.2.1.- Epuisement des monocytes utilisant L-leucine méthyle ester Les monocytes peuvent également être épuisés à partir de suspensions de cellules mononuclées du sang périphérique ; PBMC par une procédure qui prend avantage de leur riche teneur en enzyme lysosomale. Cette procédure utilise un agent méthyle de L-leucine lysosomotropique ester qui est repris par des cellules phagocytaires et des cellules cytotoxiques. Cette molécule est concentrée dans les lysosomes, où il est converti par des enzymes lysosomales à l’ester méthylique de L-leucyl-L-leucine, qui est toxique pour les lymphocytes B et la majorité des cellules T (cellules non riches en lysosomes). Toutefois, cet agent ne supprime pas les cellules NK et les lymphocytes T cytotoxiques (KANOF et al., 1996). 18 Chapitre II Isolement et purification des macrophages II.2.2.- Purification des monocytes utilisant la gélatine II.2.2.1.- Principe Les monocytes de sang périphérique humain sécrètent une glycoprotéine associée à la membrane cellulaire, de la globuline insoluble à froid (fibronectine). Etant donné que la fibronectine se lie à la surface de la gélatine revêtue. La technique la plus simple pour la séparation des monocytes du sang périphérique provenant de la préparation de cellules mononucléaires ensemble. Ces préparations sont caractérisées par un degré de pureté élevé de monocytes (plus de 90%), de la contamination des plaquettes bas et une excellente viabilité (HASSAN et al., 1986). II.2.2.2.- Méthode 1. Préparer des Flacons revêtus de gélatine de 2 g de gélatine. 2. Ajouter à 100 ml d’eau bi distillée et passer à l’autoclave à 110 ° C pendant 40 min. 3. Porter la solution de gélatine à 2% à la température ambiante et ajouter 10 ml à 75 cm2 Corning flacons de culture tissulaire. 4. Incuber les flacons de culture à 37 ° C dans un incubateur sec pendant 2 h. 5. Eliminer la gélatine complètement par aspiration et stocker les flacons à 37 ° C dans un incubateur sec pendant 48 h avant utilisation. Ces flacons peuvent être utilisés pendant au moins 2 semaines. 6. Rincer deux fois les flacons de culture revêtues de gélatine avec du tampon de DMEM (Voir annexe 3) et ajouter à chaque flacon 15 ml de suspension de cellules mononucléaires (2-4. 106/ml) Après 1 h d’incubation à 37 ° C, 5% CO2, éliminer les cellules non adhérentes par aspiration et laver doucement les flacons plusieurs fois avec du DMEM préchauffé à 37°C. 7. Ajouter 5 ml de mélange 1: 1 de 10 mM d’acide éthylène diamine tétra acétique (EDTA) en Ca 2 +, Mg2 +, libre PBS avec du DMEM 20% de sérum de cheval (HS) préchauffé à 37 ° C. 8. Incuber à 37 ° C pendant 10 à 15 minutes pour éliminer les cellules adhérentes. 9. Tapotant doucement avant et après l’incubation le détachement cellulaire optimale. 10. Centrifuger les cellules, et remis en suspension dans un milieu DMEM, (20% HS). 19 Chapitre II Isolement et purification des macrophages II.3.- Isolement des macrophages L’isolement de cellules de Küppfer (KC) à partir de souris par élutriation de centrifugation à contre-courant (CCE) a été décrit en 1977 par Knook et Sleyster mais l'isolement des macrophages spléniques est beaucoup plus difficile puisque la rate possède différents types de macrophages y compris les macrophages de la zone marginale et macrophages de la pulpe rouge, la feuille péri-artériolaire, et les metallophils marginaux qui tous possèdent des caractéristiques différentes (TEN HAGEN et al., 1996). L’élutriation centrifuge à contre-courant est un procédé de séparation qui permet la séparation des différentes populations de cellules mononuclées du sang périphérique (DUPONT, 2011). Et même est une méthode de choix pour obtenir des macrophages tissulaires résidants, tels que ceux qui sont présents dans le poumon ou le foie qui ne sont pas facilement isolé (JANOUSEK, 1993). Cette technique combine deux principes physiques ; La centrifugation qui est un procédé de sédimentation sous l’effet d’une force centrifuge. L’élutriation qui est un procédé de séparation sous l’effet d’un flux de tampon dont la vitesse d’écoulement est contrôlée par une pompe péristaltique (DUPONT, 2011). La séparation des différentes populations cellulaires se fait en fonction de leur taille et de leur densité. Le contenu de la poche de cytaphérèse est introduit, à l’aide d’une pompe péristaltique, dans une chambre d’élutriation conique tournant à grande vitesse (BARANEK, 2007). II.3.1.- Isolement des macrophages de la moelle osseuse La moelle osseuse des os de la jambe de souris est une grande source macrophages (MO) qui peuvent être facilement cultivées (DORRINGTON, 2011). II.3.1.1.- Méthode 1. Verser le milieu contenant les os dans la première petite boîte de Pétri. 2. Transférer les os avec pinces stériles à la deuxième boîte de Pétri contenant 70 % d’EtOH pendant une minute, puis à la troisième boîte de Pétri contenant du PBS stérile. 3. Retirez un os de la PBS avec des pincettes et couper les extrémités. 4. Rincer la moelle osseuse dans le tube Falcon de 50 ml en insérant une aiguille de calibre 26 fixée à la seringue de 20 ml remplie de PBS sur le côté du genou des deux types d’os. 20 Chapitre II Isolement et purification des macrophages 5. Passer le PBS à travers l’os jusqu’à ce que la couleur de l’os passe du rouge au blanc, ce qui indique que toute la moelle a été expulsée. 6. Lorsque tous les os ont été lavés de la moelle, ajouter tout le PBS restant de la seringue dans le tube Falcon. 7. Disperser la moelle osseuse par aspiration dans un 20 ml seringue vide à travers une aiguille de calibre 19 deux fois, faire cela plus de deux fois pour cisailler les cellules. 8. Centrifuger les cellules à 1500rpm pendant 5 minutes à 4 ˚ C. 9. Rejeter le surnageant dans un récipient avec l’eau de Javel ou Virkon et remettre les cellules en milieu 15mL R10 contenant 15% de LCM, le volume de 15 ml est suffisant pour ensemencer 3 grandes plaques ou 3 flacons T175 (5mL/plate). 10. Chaque plaque ou flacon doivent être préparés avec les médias 20 ml R10 + 15 % LCM. Ajouter 5 ml de suspension cellulaire et agiter à distribuer cellules dans un milieu. 11. Incuber à 37 ˚ C et 5 % de CO2. Ne pas sceller la plaque avec du parafilm II.3.2.- Isolement des macrophages alvéolaires Les macrophages alvéolaires sont isolés à partir de poumon de rats ou rates sains pesant environ rats 375-400g. Dans un premier temps, les animaux sont anesthésiés par une injection de 30 mg /kg de pentobarbital de sodium. Après l’exsanguination, un cathéter est placer dans la trachée et des lavages broncho alvéolaire avec massage des poumons, sont réalisés avec 100 ml de solution I contenant 140ml de NaCl,5 mM de KCl, 2,5de PBS, 10 mM d’Hepes, 6 Mm de D-glucose, et 0,2 Mm d’ EDTA (acide éthylène diaminotétraacétique sel disodique) à 37 C. Les premiers 10 ml du liquide de lavage sont jetés afin de ne sélectionner que les macrophages les plus adhérents et ceux réellement issus des alvéoles pulmonaires. En effet, LAPLANTE et COLL ont montré que les macrophages alvéolaires issus de 3 premiers lavages broncho-alvéolaires sans massage sont moins adhérents que ceux issus des 5 derniers lavages avec massage. Les liquides de lavages sont ensuite centrifugés à 500g pendant 10 minutes. Le culot cellulaire est repris dans le milieu de culture RPMI complété avec 0,1 % BSA. Une moyenne de 4.106/rat est obtenue (FEREOL, 2005). II.3.3.- Isolement des macrophages testiculaires Macrophages testiculaires isolé à partir du tissu interstitiel par digestion enzymatique du testicule suivie par centrifugation en gradient de densité et élutriation cellulaire. Testicules décapsulés ont été lavées trois fois dans du PBS stérile. Six testicules ont été incubés dans 50 ml de PBS contenant de la collagénase (30U) dans un bain -marie à agitation à 34 ° C pendant 10 min. Les tubes séminifères ont ensuite été autorisés les sédiments, et le surnageant a été 21 Chapitre II Isolement et purification des macrophages soigneusement retiré avec seringue stérile. La suspension de cellules interstitiel ont ensuite été déposés délicatement sur 15 ml de Ficoll -Hypaque et centrifugés (1200 x g) à 4°C pendant 20 min pour sédimenter les restes tubules des cellules germinales, les érythrocytes, et les débris cellulaire. Une fraction contenant des macrophages brut était recueillies à partir de l’interface surnageant-Ficoll, lavé deux fois par centrifugation dans du HBSS (Voir annexe 2) à 250 X g pendant 5 min, et remises en suspension dans 10 ml de HBSS prêt pour élutriation, et pour cela, une centrifugeuse BeckmanJ2 -21 et Beckman JE- 6B élutriation rotor ( Beckman Instruments , Palo Alto , CA) utiliser à une vitesse constante de 2000 + /- 40 rpm. HBSS stérile contenant 1 % de BSA a été pompé à travers le rotor sous une pression positive par une pompe à Desaga (Heidleberg, Allemagne). La préparation des cellules testiculaires (10 ml) était injecté dans la chambre d’élutriation de mélange, et après un premier lavage de 150 ml avec la pompe fixée à un taux de 15 ml / min, trois fractions de cellules (150 ml chacune en volume) ont été éluée. Fractions collectées au taux de débit de la pompe 19 ml /min, 28 ml /min, et 31 km / min à condition que les rendements les plus élevés de macrophages telles que décrites par DIRAMI et al. Les cellules dans ces fractions ont été lavées une fois par centrifugation (250 X g pendant 5 minutes) et remises en suspension dans du RPMI -1640 (Voir annexe 4) (KERN, 1995). 22 Chapitre III Culture des monocytes et des macrophages Chapitre III Culture des monocytes et des macrophages III.1.- Culture cellulaire La culture de cellule animale en dehors l’organisme permet l’observation de cellules vivantes dans des conditions favorables (DE ROBERTIS et al., 1983). L’utilisation et la culture de cellule eucaryote isolée sont plus récentes début de XX siècle que celles d’autres cultures (BRANGER et al., 2007). Depuis de 1912 alors que CARREL le premier réussissait à faire croitre des explants tissulaires durant plusieurs génération cellulaires des progrès considérables ont été accomplis dans la technique des cultures cellulaires (DE ROBERTIS et al., 1983) . Les cellules en culture présentent plusieurs avantages sur l’organisme intacts pour la recherche en biologie cellulaire (MASSON et al., 2005). III.1.1.- Types de culture cellulaire On peut distinguer trois types principaux de culture, primaire, secondaire, et les cultures utilisant la lignée cellulaire établit (DE ROBERTIS et al., 1983). III.1.1.1.- Culture primaire La culture primaire est obtenue directement de tissu animal, ce type de la culture peut être considérée comme telle jusqu’à son premier repiquage. Les cellules peuvent dans certains cas se diviser, mais pour de nombreux types cellulaires, il s’agira seulement d’un maintien en survie (RYAN, 2007). III.1.1.2.- Culture secondaire La culture secondaire obtenue par repiquage à partir d’une culture primaire et dans un milieu de culture frais (DE ROBERTIS et al., 1983). III.1.1.3.- Culture du linge cellulaire La culture utilisant de lignée cellulaire établies qui sont adapté à une croissance prolongée in vitro, parmi les lignées cellulaires les plus connues, les cellules L et 3T3 de l’embryon de souris, les cellules BHK extrais de rein d’un hamster nouveau-né et les cellules CHO de l’ovaire de hamster chinois (POPESCU et al., 1998). 24 Chapitre III Culture des monocytes et des macrophages III.1.2.- Milieu de la culture cellulaire Les conditions de culture doivent permettre l’entière satisfaction des besoins des cellules afin d’assurer de maintien de l’activité cellulaire, mais aussi la croissance, la multiplication et la différenciation (MASSON et al., 2005). Le milieu de culture et l’environnement physicochimique idéaux (PH, température, pression osmotique, oxygénation) reproduirait exactement les conditions dans les quelles les cellules se trouvent in vivo (BRANGER et al., 2007). III.1.3.- Culture des monocytes in vitro 1. Les cellules obtenues sont remises en suspension dans un milieu de culture, et supplémenté avec le sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (FCS). 2. Ensemencer les cellules, lorsque le tapis de culture arrive à confluence il faut décoller les cellules du support, les disperser et les réensemencer à une densité plus faible dans un nouveau récipient de culture. Cette opération est appelée repiquage, La dispersion des cellules peut être réalisée par grattage du tapis, ou plus classiquement par utilisation d’un mélange de trypsine et d’EDTA). 3. Incuber les cellules dans une atmosphère humidifiée au CO2. 4. Eliminer les cellules non adhérentes par aspiration, et laver le ballon deux fois avec un tompon stérile. 5. Déplacer les monocytes adhérents et par la suite incuber dans le tompon et d’éthylène diamine tétra acétate (EDTA) à 37 ° C avec 5% CO2. La population de cellules obtenue est de 70 à 90% des monocytes. Etaler ces cellules dans du milieu de culture, et de FCS, à une densité de 3-2× 106 cellules / ml et cultiver à une atmosphère humidifiée au CO2 (MACKENZIE et al., 2002). III.1.4.- Mesure de la libération de NO et de l’activité iNOS On détermine la production de NO indirectement, par dosage de nitrite dans le surnagent de culture, le produit final stable de NO réagit avec l’oxygène moléculaire (YANG et al., 2007). Les macrophages adhérés sont cultivées avec différentes concentrations de LPS ou de PPA, H2O2 à 37 °C pendant 36h après le traitement (YANG et al., 2007 ). 25 Chapitre III Culture des monocytes et des macrophages Après l’activation, les phagocytes expriment des taux élevés de l’enzyme inductible NO synthétase (iNOS de inductible nitric oxide synthetase), une enzyme qui oxyde la Larginine pour donner la L-citrulline et l’oxyde nitrique (NO de nitric oxyde). L’oxyde nitrique a une activité antimicrobienne puissante et peut se combiner avec l’anion superoxyde pour donner des substances antimicrobiennes encore plus puissantes. Des preuves récentes indiquer que l’oxyde nitrique et les substances qui en dérivent comptent pour beaucoup dans l’activité antimicrobienne des macrophages contre les bactéries, les champignons, les helminthes ou les protozoaires (KINDT et al., 2008). 100µl de surnagent sont isolés et mis à réagit avec le réactif de Greiss (1% sulfanilamide, 0 ,1% N-1- naphtyle éthylène diamine di chlorhydrate, 2 ,5% l’acide phosphorique) à la température ambiante pendant 10 min (YANG et al., 2007 ). La production de nitrite a été déterminée par la mesure de l’absorbance à 550nm par rapport à une courbe standard NaNO2 (YANG et al., 2007 ). L’activité de iNOS a été déterminé par l’utilisation d’un kit de dosage de réactif Jiancheng BioEngineering. Le dosage de l’activité iNOS dépend de la capacité de catalyser l’arginine pour former NO, qui peut en outre réagir avec des substances nucléophiles pour produire le composé chromophore, qui a une absorbance maximale à 530 nm (longueur d’onde) (LI et al., 2008). Une unité d’activité de iNOS a été défini comme la production de NO par 1 mol .1 × 106 cellules par min et exprimée en U / m (YANG et al., 2007 ). III.1.5.- Induction de maturation des monocytes humains en macrophages in vitro par la vitamine 1,25- dihydroxyvitamine D3 Les cellules du système des phagocytes mononuclées proviennent de monocytes du sang circulant qui subissent une maturation supplémentaire à la sortie du système vasculaire et la migration dans les divers tissus et des cavités du corps. Cette étape de différenciation terminale est également observée in vitro dans le sang lors de monocytes sont cultivées en présence de sérum (KREUTZ et al., 1990). On constaté que le métabolite actif de la vitamine 1,25-dihydroxyvitamine D3 [l, 25(OH) 2D3] pourrait déclencher la maturation des monocytes purifiée à partir du sang et mettre en culture primaire d’élutriation en macrophages et aussi en l’absence de tout protéines de sérum. La vitamine 1,25- dihydroxyvitamine D3 peut jouer un rôle essentiel dans l’ontogenèse du système des phagocytes mononuclées (KREUTZ et al., 1990). 26 Chapitre III Culture des monocytes et des macrophages Les cellules doivent être cultivées pendant 7 jours en présence la vitamine 1,25dihydroxy vitamine D3. La vitamine 1,25- dihydroxyvitamine D3, est dissous dans l’éthanol 100% à une concentration de 2 x 10-3 mol / L et stockés à 2O°C (KREUTZ et al., 1990). À une concentration optimale de 10-8 mol / L de la vitamine 1,25- dihydroxyvitamine D3 (1,25 (OH) 2 D3) a favorisé le développement de macrophages complètement différenciées dont le phénotype et la compétence fonctionnelle en termes de libération de cytokines (facteur de nécrose tumorale α (FNTα), l’interleukine-6, la fibronectine, et lysozyme) était comparable aux macrophage cultivés dans le sérum (KREUTZ et al., 1990). III.2.- Activation des macrophages Les monocytes et les macrophages répondent à un certain nombre d'agents exogènes par des altérations dans le métabolisme et l'expression des gènes dans un procédé de façon lâche appelé «activation» (CARLSEN et PRYDZ, 2006). Le concept d’activation des macrophages daté les années 1960, et lié aux études de NORTH ET MACKANESS ( WILSON et al., 2005). Ces études qui montrent que l’infection des souris avec Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) ou Listeria monocytogenes accroit l’activité antimicrobienne des macrophages de façon antigène-non-spécifique. Ce concept d’activation cellulaire a été développé a partir d’observation de cellule en culture in vitro qui réagissent à une variété de substance en alternat leurs propriétés biochimiques et leurs activités fonctionnelles (DE GAGNE, 2005). Les macrophages équipé par des récepteurs pour les cytokines des lymphocytes T auxiliaires, de cellules IFN- c et de l’IL -4, les macrophages sont soumis à des programmes d'activation spécifiques au cours de la réponse immunitaire de type Th1 ou Th2. Ces profils d'activation, appelés classique ou respectivement alternatif d’activation, elles sont réglés en outre par la présence et la reconnaissance des modèles de microbiennes associées moléculaires, d'autres cytokines, des lipides, et même une adhérence au substrat. L’activation des macrophages s'appuie également sur le fond de la maturation des cellules, le déclenchement de complexes cascades de signalisation intracellulaires, et la diaphonie entre les différents éléments de signalisation (MARTINEZ, 2011). Les macrophages activés répondent à l’activation par une augmentation de la taille et nombre des granules cytoplasmiques, dont un phagocyte mononucléaire activé par les lymphokines à une taille deux fois plus grosse à un macrophage au repos. Les fonctions vont aussi être altérées. On remarque un métabolisme plus actif ainsi qu’un transport d’acides aminées et du glucose , une augmentation d’activité enzymatique , de prostaglandine, du 27 Chapitre III Culture des monocytes et des macrophages GMPc , du l’activateur du plasminogène, du calcium intracellulaire, de la phagocytose, de la pinocytose et la capacité à lyser les bactéries et les cellules cancéreuses(DE GAGNE, 2OO5) .Et par conséquence la phagocytose des bactéries et la production de cytokines comme l’ IL-1, le TNFα et l’IL-6 qui déclenchent la réponse inflammatoire et activent les lymphocytes du bras adaptatif du système immunitaire (REICHHART et IMER ,2000 ). III.2.1.- Macrophages M1 et macrophages M2 Selon leur réponse immunologique, les macrophages ont été classés en deux sous catégories (MALU DIANE ,2011). Polarisation fonctionnelle des macrophages en M1 ou M2 est une utilité opérationnelle, conceptuel simplifié cadre décrivant la plasticité des mononucléaires phagocytes (MANTOVANI et al.,2005). D’une autre façon les macrophages peuvent s’orienter vers un phénotype pro-inflammatoire (M1) ou anti-inflammatoire (M2) qui va permettre de moduler la réponse immunitaire (CASSARD-DOULCIER et PERLEMUTER ,2011). Les macrophages de type1 (polarisation M1) sont dits activés et sont impliqués dans les réponses inflammatoires . Ils interviennent dans la résistance de l’hôte aux pathogènes intracellulaires, la destruction tissulaire et la résistance anti-tumorale. Ils sont activés lorsqu’ils sont stimulés par l’IFN-γ, le TNF-α ou par des composants bactériens comme le LPS. Leur activation est bloquée par L’IL-4 et l’IL-13. Les macrophages M1 sont caractérisés par une forte capacité à présenter les antigènes, à produire de l’IL-12 et de l’IL-23 (24) et par conséquent à polariser la réponse immune vers la voie Th1 (BERNARD ,2011). En revanche, les macrophages de type 2 (polarisation M2), activés de manière alternative, ont une activité modulatrice (MALU DIANE ,2011). Ils interviennent dans les phénomènes de réparation, de remodelage tissulaire, dans l’allergie, la résistance contre les parasites et le développement de tumeurs. Il existe 3 sous-classes de macrophages M2 : M2a, M2b, M2c. Les macrophages sont activés alternativement lorsqu’ils sont stimulés par l’IL4 ou l’IL13 (M2a), par les complexes immuns ou des agonistes de l’IL-1R (M2b) ou par l’IL-10 (M2c) (28). Ils sont caractérisés par une forte production d’IL-10, (TGF-β) et une faible production de cytokines pro-inflammatoires (IL-12, d’IL-1, d’IL-6, TNF-α), orientant la réponse immunitaire vers la voie Th2 (BERNARD ,2011). 28 Chapitre III Culture des monocytes et des macrophages III.2.2.- Prés-activation La prés-activation est une première étape très efficace avant une activation complète, la cellule est préparée par une insulte initiale et elle est prête lors d’une insulte subséquente. Cependant, la cellule pré-activée, n’a pas le phénotype d’une cellule activée et par conséquence ne produit pas de cytokines pro-inflammatoire ou autres médiateurs cytotoxique. Les macrophages tissulaires sont souvent prés-activés avant de subir l’activation classique ou ils subissent une activation alternative. L’activation est toujours accompagnée par la désactivation ou par la mort cellulaire (DE GAGNE, 2005). III.2.3.- Voies d’activation II.2.3.1.- Activation par la voie classique La compréhension de l’activation classique des macrophages remontent aux année 60 et provient d’études de NORTH ET MACKANESS comme nous avant montré précédemment (DE GAGNE, 2005).Cette activation nécessite une exposition à deux stimuli (WILSON et al., 2005). L’INT-γ semble être le stimulus le plus important dans l’activation des macrophages (DE GAGNE, 2OO5). Mais c’est pas lui-même qui active les macrophages directement (MOSSER, 2003).Suivi de l’exposition aux microbes ou un produit microbien qui lient les récepteurs de type Toll (par exemple CpG, LPS) ou les cytokines proinflammatoires comme IL-1 et le facteur de nécrose tumorale (TNF) ( WILSON et al., 2005). Ce dernier qui est Le deuxième stimulus, lui-même ou leur inducteur.TNF exogène peut agir en tant que second signal , mais le deuxième signal physiologiquement pertinente généralement à le résultat de récepteur type Toll ( TLR ) , qui induit TNF endogène la production par les macrophages lui-même (MOSSER, 2003). Les macrophages activés par la voie classique sécrètent des médiateurs pro- inflammatoires qui détruisent et dégradent les bactéries en augmentant la production d’espèces oxygénées toxiques et de monoxyde d’azote (NO). Ils expriment des niveaux élevés de CMH de classe II, de molécules Co-stimulatrices (telles que les CD86) et de cytokines (par exemple l’IL-12) qui soutiennent les réponses immunitaires exercées par Th1 [24]. Ils sécrètent également des chimiokines et des cytokines pro-inflammatoires mais expriment peu de récepteurs du mannose et ont une capacité réduite à ingérer les cellules apoptotiques [27] (WILSON et al., 2005). L’INT-γ induit l’expression des molécules du CMH II et les récepteurs Fcγ augmenté la respiration oxydative, et augmenté la libération de TNF, augmenté la production de cytokine pro-inflammatoire, diminué sélectivement l’activité des récepteurs (DE GAGNE, 2005). 29 Chapitre III Culture des monocytes et des macrophages II.2.3.2.- Activation par voie alterne Au début des années 1990, pendant l'examen de la réglementation de l'expression des récepteurs de mannose induite par les macrophages, GORDON ET COLL a remarqué que la manière particulièrement efficace pour déclencher l'expression du récepteur était de traiter ces macrophages avec IL-4. Les auteurs ont conclu que les macrophages traités avec IL-4 assumé un phénotype d’activation alternative. Il s'agit donc de la première description d'un macrophage qui présentait des signes d'activation mais était clairement distincte de son homologue classique activé. Des études ultérieures par GOERDT ET ORFANOS ont défendu de cette cellule comme un macrophage réglementaire avec divers rôles biologiques différents du cellule activée par la voie classique (MOSSER, 2003). L’activation alternative des macrophage par l’IL-4 et l’IL-13 est beaucoup moins définie .Ces cytokines sont généralement produits dans des réponses de type Th2 (anticorps et défense antiparasitaire) , particulièrement dans les allergies, les réponses cellulaires et hormonales aux parasites et pathogènes extracellulaires (DE GAGNE, 2005). Cette activation survient lorsque les macrophages sont incubés avec IL-4, IL-13 ou des glucocorticoïdes. Ces macrophages ne sont pas cytotoxiques, mais ils sont essentiellement impliqués dans la réparation tissulaire et provoquent une augmentation de la déposition de matrice extracellulaire ( WILSON et al., 2005).dans cette voie d’activation en présence d’ ’IL-4 et d’IL-13qui signalent aux macrophages en partie par un récepteur commun, IL-4Rα (DE GAGNE, 2005). L’IL-4 et IL-13 ont pour effet d’induire l’expression des molécules du CMH II et d’augmenter le niveau d’activité des récepteurs mannoses des macrophages dans le but d’accroître les mécanismes d’apprêtement et de présentation des antigènes. Contrairement à l’activation de type classique, les macrophages activés alternativement démontrent une diminution de la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires et ils sont résistants à la réactivation (DE GAGNE, 2005). Les macrophages activés par la voie alternative caractérisés par l’expression des molécules du CMH II, une augmentation de l’expression des récepteurs du mannose (WILSON et al., 2005), dans le but d’accroître les mécanismes d’apprêtement et de présentation des antigènes (DE GAGNE, 2005). Ainsi que d’autres récepteurs « scavenger » et des récepteurs antagonistes de l’IL-1 (IL-1ra). Et Ils neutralisent faiblement les agents pathogènes intracellulaires en raison de l’inaptitude à produire des radicaux NO( WILSON et al., 2005). Contrairement à l’activation de type classique, les macrophages activés 30 Chapitre III Culture des monocytes et des macrophages alternativement démontrent une diminution de la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires et ils sont résistants à la réactivation (Voir annexe 5) (DE GAGNE, 2005). III.2.4.- Agents activateurs III.2.4.1.- Agents d’origine bactérienne III.2.4.1.1.- Lipopolysccharides (LPS) Au début du 20 e siècle, une certaine activité toxique des bactéries fut associée à un facteur composé de lipides et carbohydrates (SZALO et al., 2006). L’infection bactérienne constitue un bon exemple qui est les bactéries à gram négative expriment sur leur paroi externe des lipopolysaccharides (LPS), cette molécule est fortement immunogène. le LPS représente la principale composante non-protéique de la membrane externe des bactéries G - et est composé de trois parties. Le lipide A, situé à la partie proximale du LPS et à l’intérieur de la bicouche lipidique, possède un caractère hydrophobe (SZALO et al., 2006), est responsable de la majeure partie de l'activité immunostimulante du LPS (DOUGHTY , 2011) . l’antigène O (pour Ohne Kapsel), situé à la partie distale du LPS, de nature polysaccharidique, possède un caractère hydrophile ,le noyau (ou core ) de nature polysaccharidique représente le pont entre les deux autres parties et est divisé à son tour en deux parties : le noyau interne plutôt hydrophobe et le noyau externe plutôt hydrophile (SZALO et al.,2006). Ces composants du LPS sont pas les mêmes à partir de toutes les bactéries à Gram négatif et peuvent être distinguées par des variations de phosphorylation, des chaînes acyles, le nombre de monosaccharides, des liens, et la composition en acides gras. Ces variations sont très importantes pour l’activité immunostimulante du lipide A et le LPS (DOUGHTY, 2011). Lors d’une d’infection, le récepteur CD14, réparti sur la membrane des monocytes et des macrophages, est le récepteur du LPS par excellence. L’activation cellulaire intervient après un laps de temps de 15 à 30 minutes, délai lié à l’internalisation du complexe LPS/CD14.L’activation est déclenchée grâce à la coopération de la CD14 avec la protéine TLR4 et MD2 . Ensuite, deux protéines adaptatrices MyD88 et TIRAP mobilisent la voie de signalisation dépendante des protéines IRAK4, TRAF6, TAB1 et TAK1. La protéine TAK1 est capable d’activer la voie des MAP kinase et plus particulièrement la protéine. Cette cascade d’activations moléculaires induit l’activation d’AP1 menant à l’activation transcriptionnelle. AP1 est largement connu pour jouer un rôle dans la prolifération, la différenciation, l’apoptose, la survie mais surtout l’inflammation. Les gènes de l’inflammation régulés par AP1 sont très variés comme les gènes codant pour 31 Chapitre III Culture des monocytes et des macrophages des cytokines (IL-1, IL-6, TNF…), des chimiokines (IL-8…) , des métallo protéases (MMP-1…), des molécules d’adhésion (intégrine…) ou encore des enzymes comme COX-1 et 2 . Cette cascade d’activations moléculaires induit l’activation d’AP1 menant à l’activation transcriptionnelle. AP1 est largement connu pour jouer un rôle dans la prolifération, la différenciation, l’apoptose, la survie mais surtout l’inflammation. Les gènes de l’inflammation régulés par AP1 sont très variés comme les gènes codant pour des cytokines (IL-1, IL-6, TNF…), des chimiokines (IL-8…), des métalloprotéases (MMP-1…), des molécules d’adhésion (intégrine…) (ou encore des enzymes comme COX-1 et 2 (FOLLOT, 2011). III.2.4.1.2.- Peptidoglycane (PGN) Le peptidoglycane (PGN) est un polymère présent dans la paroi cellulaire de la plupart des espèces bactériennes (LAWRENCE C et NAUCIEL , 1998), et le composant majeur de la paroi cellulaire des bactéries à Gram positif (CHEN et al., 2006) . Dont il est responsable de la rigidité de la paroi cellulaire (LAWRENCE C et NAUCIEL , 1998). PGN est composé de chaînes linéaires d’une alternance de N-acétylglucosamine et l'acide N- acétylmuramique qui sont réticulés par des chaînes peptidiques constituant un grand polymère .Cette macromolécule associée à des glycolipides tels que les lipoprotéines LTA et qui sont ancrées dans la membrane interne de la cellule au PGN (DOUGHTY, 2011) . Comme le lipopolysaccharide (LPS) le PG possède diverses activités immunomodulatrices et donc joue probablement un rôle important dans le déclenchement des réponses de l'hôte à des infections bactériennes (LAWRENCE C et NAUCIEL , 1998). Le D14 a été proposé pour être le récepteur à la fois PGN et LPS .Par conséquent, il a été démontré que la liaison de PGN et LTA à CD14 conduire à l'activation des cellules CD14dépendante. Ce agent bactérien stimule la libération excessive de cytokines pro -inflammatoires comme le facteur de nécrose tumorale (TNF) , l’IL- 1 et IL-6, et autres médiateurs inflammatoires à partir des cellules immunitaires , y compris les macrophages (SCHWANDNER et al., 1999) Ces molécules inflammatoires sont la principale cause des divers signes et des symptômes qui se produisent pendant les infections bactériennes, y compris la fièvre, l'inflammation et des réponses de phase aiguë (CHEN et al., 2006) . 32 Chapitre III Culture des monocytes et des macrophages III.2.4.2.- Agents d’origine fongique Plusieurs polysaccharides d'origine fongique sont capables de stimuler simultanément les différentes composantes du système immunitaire, ce qui leur confère différentes propriétés thérapeutiques, notamment des propriétés anti-tumorales et antiinflammatoires (SANCHEZ, 2006). La paroi cellulaire et la surface des cellules composantes de nombreux types de champignons ont été identifiés comme critiques pour PAMP et déclencher des réponses inflammatoires. Zymosan, mannane, et phospholipomannan glucane sont PAMP exprimés sur une variété de pathogènes fongiques importantes, notamment Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Cryptosporidium neoformans(DOUGHTY, 2011). La plupart de ces polysaccharides sont essentiellement des (1,3)-p-D-glucanes présentant souvent des ramifications simples P-(l, 6). Quelques-uns de ces polysaccharides seront décrits dans le texte qui suit (SANCHEZ, 2006). Les champignons présentent de nombreux PAMP et nécessitent de nombreux types de systèmes PRR de contrôle des infections, le TLR2/6 hétérodimères reconnaissent zymosane, homodimères de TLR2 reconnaissent glucane, et phospholipomannan, et TLR4 reconnaît mannane (DOUGHTY, 2011). Puisque les polysaccharides, y compris les 3-glucanes, ne peuvent pas pénétrer dans les cellules en raison de leur grande taille moléculaire, ils exercent leur action en se liant à des récepteurs spécifiques à la surface des cellules immunes telles que les macrophages, les neutrophiles, les cellules cytotoxiques naturelles (NK) et les lymphocytes T. Parmi ces récepteurs, le CR3, un des plus importants récepteurs membranaires chez les phagocytes impliqués dans la reconnaissance des pathogènes, a été identifié comme un des récepteurs des P-glucanes, au même titre que le CRI (SANCHEZ, 2006) . III.2.4.3.- Agents d’origine végétale La plupart polysaccharides issus de plantes supérieures sont relativement non toxique et ne pas causer d’importants effets secondaires, contrairement aux polysaccharides immunomodulatrices des bactéries ou composés synthétisé. Ainsi, polysaccharides végétaux sont les candidats idéaux pour thérapeutiques avec immunomodulatrices, anti-tumorale et la cicatrisation action (SCHEPETKIN et QUINN, 2005). Il existe 35 espèces végétales parmi les 22 familles différentes fournissent des polysaccharides indiquer pour améliorer les fonction des macrophages (SCHEPETKIN et QUINN, 2005). Ces composés montrent une augmentation d’activité cytotoxique des macrophages contre les cellules tumorales et les microorganismes par l’activation de phagocytose, augmenter la production de dérivés oxygénés réactifs (ROS), production de l'oxyde nitrique (NO) et renforcer la sécrétion de 33 Chapitre III Culture des monocytes et des macrophages cytokines et chimiokines, comme facteur de nécrose tumorale (TNF-a), l'interleukine (IL)-1h, IL-6, IL-8, IL-12, IFN-g et IFN-h2 (SCHEPETKIN et QUINN, 2005). III.2.4.4.- Agents chimiques III.2.4.4.1.- H2O2 Au cours de l’évolution, l’adaptation des espèces vivantes à l'oxygène s'est traduite par l'apparition d’enzymes facilitant non seulement sa consommation, mais également la détoxification de ses métabolites réduits que sont le radical superoxyde O2- et le peroxyde d'hydrogène H2O2 .Ces espèces sont appelées espèces réactives de l’oxygène (ERO) car elles sont beaucoup plus toxiques que ne l'est l'oxygène lui-même (GARDES-ALBERT et al.,2003). Un tel déséquilibre entre systèmes producteurs d'ERO et systèmes de défense caractérise l'état de stress oxydant , sans qu'il soit aisé de déterminer si ce dernier est causal ou s'il constitue seulement une réponse de l'organisme à des stimuli, notamment inflammatoires (GARDES-ALBERT et al., 2003). Fait important, le processus d'activation confère également des signaux de survie essentiels pour l'intégrité fonctionnelle des monocytes permettant aux cellules de rester viables dans des micro-environnement de lésions inflammatoires ou immunitaires qui sont riches en médiateurs inflammatoires et cytotoxiques espèces radicalaires réactives (PERERA et WALDMANN,1998) . Phagocytes répondre à une stimulation par une salve de la consommation d'oxygène , une grande partie, sinon la totalité, de l'oxygène supplémentaire consommé est converti d'abord à l'anion superoxyde, puis à H2O2 ( KLEBANOFF et HEADLEY,1999).La myéloperoxydase (MPO) (libérée des granules cytoplasmiques des neutrophiles et des monocytes) et de peroxydase éosinophile (sorti à partir de granules de polynucléaires éosinophiles) peut réagir avec le H2O2 formé pour oxyder un halogénure et former des oxydants puissants, qui sont toxiques pour les microorganismes ingérés et des cibles extracellulaires adjacents( KLEBANOFF et HEADLEY,1999). 34 Conclusion Conclusion Il était difficile d’étudier les activités des cellules immunitaires en absence de modèles animaux génétiquement définis, et sans les techniques modernes de culture de tissus. Aussi il est difficile à isoler et cultiver les macrophages humains en quantités suffisantes à partir de tissu. En outre, les cellules obtenues présentent souvent une hétérogénéité phénotypique importante. Les macrophages dérivés de monocytes fournissent une excellente alternative, depuis monocytes sanguins humains facilement disponibles en grand nombre et qui peuvent être différenciées en macrophages in vitro. Les monocytes/macrophages sont légèrement adhérents et peuvent être séparés des autres cellules qui poussent en suspension. L’isolement par dissection est souvent utilisé quand le tissu à mettre en culture est très petit, l’obtention nécessaire pour avoir des couches cellulaires confluentes est relativement long (environ 30 jours), la méthode enzymatique est beaucoup plus rapide avec un bon rendement mais certaines cellules à membrane fragile peuvent être lésées par cette méthode. Les cellules in-vitro présentent deux propriétés fondamentales qui sont la capacité proliférative et leur fonction différentiée. Ces propriétés ont tendance à évoluer de manière très différente quelle que soit la méthode de culture employée. Les avantages dans de nombreux cas, une cellule unique peut rapidement se développer en une colonie constituée de nombreuses cellules identiques Un des principaux inconvénients des cellules en culture est le fait qu’elles ne sont pas dans leur environnement normal et que, par conséquent, leurs activités ne sont pas régulées par les autres cellules comme dans le cas d’un organisme intact, ainsi que la culture cellulaire nécessite des conditions de stérilité absolues, toute contamination microbienne entraîne la lyse des cellules La culture cellulaire permet d’étudier la cellule eucaryote et ses relations avec son environnement. Ainsi l’utilisation des cellules en culture permet l’étude des mécanismes de la physiologie cellulaire, contrôle de cycle cellulaire, métabolisme, régulation de l’expression des gènes, l’étude des mouvements et des jonctions cellulaires. 36 Références bibliographiques Références bibliographiques BACH J.F., 2008- Immunologie .5eme édition, Flammarion Médecine –science, Paris, 29 P. BAEZA GARCIA A., 2012- Rôle de MIF (Macrophage Migration Inhibitory Factor) dans l’immunité innée et la réponse anti-schistosome chez Biomphalaria glabrata , Université Lille Nord de France-Inserm U1019-CNRS UMR 8204-Institut Pasteur de Lille, 12 P. BARANEK T., 2007- Régulation des monocytes et des cellules dendritiques par les produits de dégradation de l’élastine chez l’Homme, Université de Reims ChampagneArdenne U.F.R. de pharmacie, 174 P. BELAISCH J., AUDEBERT A., 2003- L’endométriose, 2eme édition, MASSON, Paris,16 P. 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Diatrizoate de sodium (M. 635,92) est le sel de sodium de l’acide 3,5-diacetamido-2, 4,6triiodobenzoïque de densité 1,077. 47 Annexe Annexe 2 Solution saline équilibrée de Hank HBSS Composition Masse molaire Concentration (mg/l) Molarité (mM) Sels inorganiques Chlorure de calcium CaCl2 111 0.14 1.26 Le chlorure de potassium KCL 75 0.40 5.33 Kh2PO4 136 0.06 0.44 MgCl2-6H2O 203 0 .10 0 .50 MgSO4-7H2O 246 0.10 0 .41 NaCl 58 8.00 138.00 NaHCO3 84 0.35 4 .00 Na2HPO4 142 0.048 0.30 Autres composition D-Glucose 180 1 .00 5.60 Phénol 398 0 .01 0.03 48 Annexe Annexe3 Milieu d’Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) Avec 4.5grams glucose par litre et de la L-Glutamine Sans bicarbonate de sodium, le phosphate de sodium et le pyruvate de sodium Ingrédients mg /l Sels inorganiques -Chlorure de calcium di hydraté -Ferrique non hydraté Fe (NO 3)3・9H2O -Le sulfate de magnésium anhydre -Le chlorure de potassium KCL -Chlorure de sodium NaCl 265.000 0.100 97.720 400.000 6400.000 Acides aminés -Glycine -L-Arginine chlorhydrate -L-cystine di chlorhydrate -L-glutamine -L-histidine monohydrate -L-isoleucine -L-Leucine -Le chlorhydrate de L-Lysine -L-méthionine -L-phénylalanine -L-sérine -L-Thréonine -L-tryptophane -L-Tyrosine sel disodique - L-Valine 30.000 84.000 62.570 584.000 42.000 105.000 105.000 146.000 30.000 66.000 42.000 95.000 16.000 103.790 94.000 Vitamines -Le chlorure de choline - D-Ca-pantothénate -L'acide folique -Nicotinamide -Chlorhydrate de pyridoxal -Riboflavine -Thiamine chlorhydrate -I-inositol -D-Glucose -Sel de sodium de rouge de phénol 4.000 4.000 4.000 4.000 4.000 0.400 4.000 7.200 Autres 4500.000 15.900 49 Annexe Annexe 4 Milieu RPMI-1640 Avec L-glutamine , sans glucose et bicarbonate de sodium Ingrédients mg /L sels inorganiques - Nitrate de calcium tétra hydraté - Le glutathion réduit - Le sulfate de magnésium anhydre - Sel de sodium de rouge de phénol - Le chlorure de potassium - Chlorure de sodium - Phosphate de sodium dibasique anhydre 100.000 1.000 48.840 5.300 400.000 6000.000 Acides aminés - Glycine - L-Arginine chlorhydrate - L-asparagine - Acide L-aspartique - L-cystine di chlorhydrate - L’acide L-glutamique - L-glutamine 10.000 241.000 50.000 20.000 65.200 20.000 300.000 50 Annexe Annexe 5 Etats d’activation des macrophages et propriétés fonctionnelles sélectionnées de différentes populations Stimulus Propriétés Fonctions Classique Alterne Fixation cellulaire apoptotiques INF γ+ LPS ou TNF-α Il-4 : IL-13 Cellules apoptotiques +LPS d’iNOS Il-Iβ TNF-α. Il-6. Il-8. Il-12. MCP-1. MHC classe II CD 86 -Pro-inflammation -Destruction des microbes. DTH récepteur de mannose CMH II. Arginase. SR.FIZZII/Yml. Il-Ira. d’iNOS.TNF.Il-6. TGF-β. PGE2. Anti-inflammatoire. RégulationTh2, allergie, destruction des parasites. Anti-inflammatoire. TNF-α. Il 8. MCP-1 Immunosuppresseur 51 Annexe Résumé : Synthèse bibliographique sur les techniques d’isolements et de culture des macrophages in vitro La présente étude est consacrée à une synthèse bibliographique sur les différentes techniques d’isolements et de culture des macrophages in vitro. Macrophages, les cellules les plus plastiques du système hématopoïétique, se trouvent dans tous les tissus et montrent une grande diversité fonctionnelle. On distingue deux types de cellules, les cellules libres et circulantes comme les cellules du sang (monocytes), et les cellules en cohésion les unes avec les autres, constituant un tissu (macrophage). Les techniques d’isolement de ces deux classes de cellules sont différentes. Les cellules circulantes sont obtenues par prélèvement et centrifugation, et les cellules organisées en tissus nécessitent la mise en œuvre de techniques plus originales qui peuvent être divisées en deux groupes, la méthode par dissection et la méthode par digestion enzymatique. La complexité des interactions cellulaires qui génèrent une réponse immunitaire a conduit les immunologistes à se tourner bien souvent vers divers types de systèmes de culture cellulaire in vitro, y compris les macrophages. En biologie, la culture cellulaire désigne un ensemble des techniques utilisées pour faire croître des cellules hors de leur organisme ou de leur milieu d’origine, dans un but d'expérimentation scientifique, tests génotypiques, diagnostic direct, nous avons mis en évidence des techniques pour la survie à long terme et de la maturation des monocytes en macrophages. Le concept d’activation cellulaire est développée à partir de l’observation de cellule en culture in vitro réagissaient à une variété de substances en altérant leurs propriétés biochimiques et leurs activités fonctionnelles, nous avons touché les différentes voies d’activation des macrophages. Mots clés : Macrophage, Monocytes, Isolement, Culture, Activation. Abstract: Bibliographic review on techniques for isolation and culture of macrophages in vitro This work is bibliographic review about the various isolation techniques and culture of macrophages in vitro. Macrophages, most plastics cells of the hematopoietic system, are found in all tissues and show high functional diversity. There are two types of cells, free circulating cells such as blood cells (monocytes), and the cells cohesion with each other, forming a fabric (macrophage). The isolation of two classes of cells these techniques are different. The circulating cells are obtained by centrifugation and collection, the cells and organized tissue require the implementation of more novel techniques which can be divided into two groups, the method by dissection and enzymatic digestion method. The complexity of cellular interactions that generate an immune response leading immunologists to turn often to various types of systems in vitro cell culture, including macrophages. In biology, cell culture is a set of techniques used to grow cells outside their body or their home environment, with the aim of scientific experimentation, genotypic tests, and direct diagnosis. We demonstrated techniques for long-term survival and maturation of monocytes into macrophages. The concept of cellular activation is developed from the observation of cell culture in vitro responded to a variety of substances altering their biochemical properties and functional activities, we hit the different faces of macrophage activation. Keywords : Macrophages, Monocytes, Isolation, Culture, Activation. دراسة نظرية حول تقنيات عزل وزرع البالعات الكبيرة في المخبر:ملخص وتتواجد يف مجيع، البالعات الكبرية هي اخلاليا ادلرنة السائدة يف النظام ادلكون للدم.هذا العمل هو دراسة نظرية حول خمتلف تقنيات عزل وزرع البالعات الكبرية يف ادلخرب ) مشكلة نسيج (البالعات الكبرية، و اخلاليا ادلتماسكة مع بعضها البعض،) اخلاليا احلرة مثل خاليا الدم ( وحيدات النواة، ومنيز نوعني من اخلاليا.األنسجة و تظهر تنوعا وظيفيا عاليا . و ختتلف تقنيات عزل هذه الفئتني من اخلاليا. يتم احلصول على اخلاليا اليت تسري حرة يف الدم عن طريق استخراج عينة من الدم مث بواسطة الطرد ادلركزي أما اخلاليا ادلتواجدة يف األنسجة تتطلب تنفيذ ادلزيد من تقنيات . إما عن طريق التشريح أو باستعمال األنزميات اذلاضمة، األصلية اليت ميكن تقسيمها إىل رلموعتني ، إن التعقيدات يف التفاعالت اخللوية اليت تولد استجابة مناعية قادت علماء ادلناعة إىل االهتمام بتطوير أنواع خمتلفة من التقنيات اليت تستعمل يف زراعة اخلاليا يف ادلخرب وذلك هبدف التجارب العلمية،مبا يف ذلك البالعات الكبرية يف البيولوجيا زراعة اخلاليا هي عبارة عن رلموعة من التقنيات ادلستخدمة لنمو اخلاليا خارج العضوية أو وسطها األصلي واالختبارات الوراثية والتشخيص ادلباشر؛ تطرقنا يف دراستنا لتقنيات اليت تضمن بقاء اخلاليا على قيد احلياة على ادلدى الطويل و نضوج وحيدات اخللية إىل بالعات كبرية مت تطوير وقد أحصينا بعض الطرق، مفهوم تتحفيز اخلاليا من خالل مراقبة زراعة اخلاليا يف ادلخرب واستجابتها جملموعة متنوعة من ادلواد اليت تغري خصائصها الكيميوحيوية ونشاطها الوظيفي .لتحفيز البالعات الكبرية .تحفيز، زرع، عزل، وحيدات النواة،البالعات الكبيرة: الكلمات المفتاحية 52
