memoire de magister - Université d`Oran 1 Ahmed Ben Bella

MEMOIRE DE MAGISTER
Spécialité : phytopharmacie
Détection de Pseudomonas savastanoi, agent causal de la tuberculose de l’olivier
Evaluation et comparaison d’une technique d’isolement sur milieux de cultures et d’une
technique sérologique (immunofluorescence)
Présentée par : Mme SERDOUN BEKRI Naoual
Soutenu le : 23 / 05 / 2013, devant le jury composé de :
Mer HADADJI. Miloud……………. Professeur : ….…Université d’Oran…………..Président.
Mer GUESSAS Bettach … …….. … . Professeur : …… Université d’Oran ………...Examinateur.
Mme BENMECHERNANE ZINEB… Professeur : ……..Université d’Oran ……..….Examinateur.
Mer BABA HAMED Bey…………... Professeur : …… Université d’Oran ….……..Rapporteur.
Mer TENDJAOUI Bakhti………. ….. Directeur : ……..SRPV ORAN.……………..Membre invité.
Année universitaire : 2012-2013
Remerciements
Ce travail de magister à été réalisé à la station régionale de la protection des végétaux de
Misserghin- Oran (laboratoire de bactériologie).
Après les louanges à Dieu l’unique, l’éternel je tiens à exprimé mes sincères remerciements aux
personnes qui m’ont apporté leur aides et qui ont contribuées à l’élaboration de ce mémoire.
Je remercie le tout puissant de m’avoir donné le courage et la force de réaliser mon rêve et celui de
mes chers parents.
Mes remerciements s’adressent à Mer HADADJI. Miloud, professeur a l’université d’Oran d’avoir
accepté de présider le jury de soutenance.
J’exprime ma gratitude à Mer GUESSAS Bettach, d’avoir accepté d’examiner ce travail.
Je remercie très chaleureusement Madame BenMechernene Zineb, qui a accepté d’examiner mon
travail.
Je tiens tous particulièrement à exprimé ma gratitude envers mon encadreur Mer BABA HAMED
Bey, professeur à l’université d’Oran au département de biotechnologie ; pour sa disponibilité, pour le
temps et la patience qu’il m’a accordé tout au long de ce travail et pour son appui qui ma permis de réaliser
cette étude.
Je remercie particulièrement Mer TANDJAOUI Bakhti, directeur de la station régionale de la
protection des végétaux, qu’il trouve ici l’expression de ma profonde reconnaissance et gratitude pour
m’avoir guidé dans mon travail.
J’adresse un très grand merci à toute l’équipe du département de bio statistique à l’INESM d’ Oran,
plus particulièrement à docteur RAYEH, Madame LARBI, et Melle CHENNI, qui m’ont accueilli et m’ont
apporté leurs concours pour développer mes connaissances en statistiques.
Un grand merci à ma collègue Melle TOUATI Karima pour l’amour et le soutien qu’elle m’a
témoigné lors de la rédaction de cette thèse et à Samya SEDDAR YAGOUB pour ces conseils sa
gentillesse et sa bonne humeur ainsi qu’a Madame SEBANE Rym pour ses précieux conseils.
En fin, je remercie toute l’équipe de la SRPV d’Oran.
Naouel BEKRI
Dédicaces
Je dédie ce modeste travail :
- Aux prunelles de mes yeux, mes très chers parents qui m’ont apprit que
le succès à pour l’unité la sueur et que ça se gagne et n’est jamais offert.
A mon marie, mes frères, ma sœur, et mes belles-sœurs qui m’ont
toujours soutenu et encouragé au cours de la réalisation de cette thèse.
A mes adorables petits anges : Mes enfants Ryhem et Rayane.
Résumé :
Pseudomonas savastanoi, pathovar savastanoi, organisme de quarantaine, est l’agent causal du
chancre bactérien de l’olivier. Découverte au 4ème siècle par le grec Theophrastus, cette bactérie est
considérée comme le seul pathogène responsable de la formation des nécroses bactériennes appelées
communément tuberculose de l’olivier. Cette maladie est considérée comme un problème majeur par
son effet néfaste sur la croissance, le rendement et surtout la qualité de l’huile d’olive.
Aucun moyen de lutte curatif n’existe à ce jour
contre la nécrose bactérienne. Seul des
techniques préventives permettent de contenir la maladie. L’un des points clés de cette lutte est la
production de matériel de multiplication (bois et plants d’oliviers) indemne de cette bactérie afin
d’éviter sa dispersion.
Pour cela, des méthodes analytiques de détection de Pseudomonas savastanoi doivent être
développées et adaptées à un travail de routine. La mise en œuvre d’une technique d’isolement sur
milieux de cultures et d’une technique sérologique « immunofluorescence », est envisageable dans ce
but.
Dans la présente étude, les protocoles existants relatifs à ces deux techniques ont été évalués sur
des macérâts contaminés.
La méthode d’ensemencement sur milieux de cultures présente l’avantage d’une grande facilité
de mise en œuvre. Cependant sa sensibilité, d’environ 105 ufc.ml-1 reste assez faible. C’est pourquoi
l’utilisation de la méthode d’immunofluorescence, dont la sensibilité est beaucoup plus fine, environ 103
ufc.ml-1, peut être envisagée afin de confirmer ou d’infirmer les résultats relatifs aux échantillons
apparaissant négatifs à l’isolement sur milieux gélosés.
Il faut noter qu’il s’agit d’un pathogène particulièrement virulent des oliveraies et qui se propage
facilement, il nécessite donc pour sa détection une téchnique très sensible et à moindre coût.
Mots clés : Pseudomonas savastanoi – Tuberculose – Macérât – Bactérie de quarantaine –
olivier – Détection – Colonie bactérienne – Milieux de cultures – Isolement – Immunofluorescence.
Abstract
Pseudomonas savastanoi, pathovar savastanoi is the quarantine organism that causes bacterial
chancre of olive. Discovered in fourth century by the Greek Theopharus, this bacterium is the one
pathogen responsible of formation of the bacterial necrosis commonly called olive tuberculosis. This
disease is a hull problem with its harmful effect on the growth, the yield and the quality of olive oil.
There is no means curative treatment of bacterial necrosis just found until now. Only preventives
techniques can be used for this disease. One of the means of control is the production of multiplication
material (branch, plant) without contamination of Pseudomonas savastanoi, pathovar savastanoi.
In this case, analytical methods of detection of Pseudomonas savastanoi must be developed and
adapted with habit work. The use of technique of isolation on artificial medium and technique
immunofluorescence is considered for that.
In this study, the protocols of the two kinds of technique have been evaluated on macerates
infected.
The method of culture on artificial medium has an advantage of high easiness. However its
sensibility, ~105ufc.ml-1 stays no important. That is why the use of the immunofluorescence, whose
sensibility is so weak, ~103ufc.ml-1, can be considered for confirmation or not the results about the
samples which appear negatives at the isolation on medium.
It is important to know that we have a pathogen particularly virulent of olive’s plantation and its
propagation is so easy, it needs for its detection a real technique and not more expensive.
Lexique
Détection : Isolement et identification d’une bactérie
Bactérie : Micro-organisme procaryote (sans noyau), le plus petit capable de croitre, se nourrir et
de se reproduire de façon autonome.
OEPP : sigle Anglais pour European and Mediterranean Plant Protecti Organisation ; sigle français
pour Organisation Européenne et Méditerranéenne pour la protection des plantes.
Nécrose : mort d’une cellule ou d’un tissu à l’intérieur d’un organisme vivant.
Organisme de quarantaine : organisme nuisible qui présente une menace économique potentielle
pour la zone menacée. Soit il n’y est pas encore présent, auquel cas on lutte contre son entrée ; soit
et est présent de façon restreinte, auquel cas il fait l’objet d’une lutte visant à son éradication.
Phytopathogène : agent pathogène pour les végétaux.
Ufc : sigle pour unité formant colonie (en Anglais cfu : colony forming unity) ; bactérie isolée à
partir de laquelle se forme une colonie par division mitotique.
Analyse : c’est l’ensemble des opérations aboutissant à un résultat, pour un pathogène, à l’aide
d’une méthode.
Antisérum : liquide se séparant du caillot après coagulation du sang extrait d’un animal immunisé
contre un antigène. L’antisérum contient des anticorps. L’antisérum est utilisé dans les analyses
sérologiques pour détecter les antigènes présents dans l’échantillon.
Diagnostic : ensemble des techniques permettant l’identification d’un agent pathogène précis sur
un végétal dépourvu de symptôme.
Sensibilité : aptitude pour une méthode d’analyse à détecter des quantités plus moins faible de
bactéries.
Spécificité : aptitude pour une méthode d’analyse à mettre en évidence un agent pathogène
spécifique.
– SOMMAIRE :
Sommaire :
I.
II.
Introduction
Présentation de la SRPV 2
2.1 Présentation générale
2.2 Cadre juridique
2.3 Organisation de la SRPV
1.3.1 Place de la SRPV d’Oran dans l’organigramme de l’INPV.
2.4 Missions
2.4.1
De la SRPV D’Oran
2.4.2
Les Missions du laboratoire de bactériologie de la SRPV d’Oran.
2.4.3
Le processus de travail du laboratoire de bactériologie.
2.4.4
Les bactéries phyto-pathogènes les plus contrôlés dans le laboratoire de
Bactériologie.
III.
Etudes bibliographiques sur la production des oliviers en Algérie :
1. Systématique de l’olivier.
2. Répartition de l’olivier dans le monde.
3. Répartition de l’olivier dans la région du Maghreb.
4. Position des oliviers en Algérie.
5. intérêt de l’olivier.
6. Variété Algérienne de l’olivier.
7. Etude bibliographique sur le groupe des Pseudomonas.
a- Historique.
b- Définition.
c- Caractéristiques des Pseudomonas.
8. Les principales maladies de l’olivier.
1. Tavelure.
2. Verticilliose
3. Le Chancre bactérien.
IV.
Choix des méthodes d’analyses pour la détection de Pseudomonas savastanoi.
V.
Matériels et Méthodes
VI.
Résultats et Discussion
I.
Essai d’isolement des macérâts contaminés sur milieu de culture.
1. Observation macroscopique :
– SOMMAIRE :
a. Caractéristiques morphologiques des bactéries.
b. Caractéristiques phénotypiques des colonies sur trois milieux.
2. Observation microscopique :
a. Coloration de Gram.
b. Tests biochimiques.
c. Démembrement sur milieu BK.
d.
Démembrement sur milieu Levane.
e. Démembrement sur milieu LPGA.
II.
Estimation des concentrations des solutions mères après croissance sur les milieux
de cultures.
1. Sur milieu LPGA.
2. Sur milieu BK.
3. Sur milieu Levane.
III.
Tableau des analyses des variances.
1. Comparaison des moyens
IV.
Les tests biochimiques :
V.
Conclusion
–INTRODUCTION:
I. Introduction :
Les plantes constituent la majorité des ressources énergétiques dont dépendent les hommes et
les animaux. Malheureusement, lorsqu’une plante est atteinte d’une maladie, sa croissance, sa fertilité
et sa productivité sont affectées. Des symptômes se développent et tout ou une partie de l’organisme
peut mourir. Les agents responsables des maladies de plantes sont très similaires à ceux rencontrés
chez l’homme et les animaux. Ils peuvent être biologiques ou physiques (Benizri et al. 2001).
Les maladies des plantes sont parfois regroupées par types de symptômes, par types d’organes,
qu’elles affectent et par type de plantes, mais le critère le plus utile reste la classification selon le
pathogène responsable de la maladie (Benjama, 2003).
Les oliviers sont parmi les plus anciens arbres fruitiers cultivés dans le bassin méditerranéen y
compris l’Algérie (Benjama, 2003).Ces dernières occupent toutefois une part très importante dans
l’économie agricole de certains pays méditerranéens (source FAO, 2009).
L’oliveraie en Algérie occupe une superficie de 250 000 d’hectares, elle présente 3% de la
production mondiale distribués essentiellement dans les zones montagneuses (Bartolini & Petrucelli,
2002).
L’Algérie (via le ministère de l’agriculture) a lancé un vaste programme (2009-2014) de
plantation d’environ un million 1 000 000 d’hectares à travers une quinzaine de wilayas. Il s’agit, en
fait, d’un programme très ambitieux dont l’objectif principal est de hisser la filière oléicole algérienne
au rang des pays producteurs d’olives.
Cependant, l’intensification de l’oléiculture pose un certain nombre de problèmes comme par
exemple l’infection des arbres par des bactéries phythopathogène entre autre le genre Pseudomonas
qui forment un large groupe de bactéries colonisant le sol, les plantes et l’eau. Certaines peuvent
causer des infections mortelles chez l’humain (Mavrodi et al. 2001).
Suite aux résultats des diagnostics effectués au niveau du laboratoire de bactériologie de la
Station Régionale de la Protection des Végétaux sur des échantillons d’oliviers surtout jeunes plants
programme PNDA (2001-2004), il a été décelé la présence importante des symptômes de tuberculose
et notamment au niveau de la wilaya d’Oran et Ain-Temouchent.
L’importance économique de cette maladie est ponctuelle mais préoccupante. Elle peut
entrainer des chutes de récolte de 50 à 70%, et même le dépérissement.
1
–INTRODUCTION:
S’agissant d’un parasite de quarantaine dont la lutte est obligatoire et doit être prise en charge
sérieusement par les services de la protection des végétaux, et compte tenu de l’importance du
programme quinquennal 2010-2014 à mettre en place +25000 ha pour la Wilaya d’Oran et AinTémouchent. Le laboratoire de bactériologie de la SRPV d’Oran s’est engagé à mener une enquête sur
le terrain qui a débuté le 26 juillet 2010 et qui a touché l’ensemble des wilayate
de notre
circonscription.
En réponse aux souhaits des agriculteurs, et des demandes du ministère de l’agriculture et du
développement rurale ainsi que les contrôleurs phytosanitaires des services de la protection des
végétaux, plusieurs outils analytiques ont été testés ou développés par l’INPV , afin de détecter la
bactérie sur des échantillons d’oliviers. Ces outils reposent sur la mise en culture et l’isolement sur des
milieux nutritifs et sur une technique sérologique à savoir l’immunofluorescence. La plupart de ces
travaux n’ont menés jusqu'à ce jour qu’a titre expérimental.
Dans tout les cas, ces méthodes doivent être spécifiques, sensibles, rapides, rapides,
reproductibles et peu couteuses.
Le rôle de la SRPV d’Oran consiste maintenant à comparer les techniques disponibles, à
évaluer les protocoles existants, à les optimiser et à les valider en vue d’une utilisation pour la
détection de cette bactérie. Dans le cadre de cette étude, j’ai été chargé de mettre en œuvre et de
comparer
deux
tests,
l’un
isolement
sur
des
milieux
de
cultures
l’autre
sérologique
(immunofluorescence), sans chercher à modifier les protocoles décrits.
2
– PRESENTATION de la SRPV D’ORAN :
II.
II.
Présentation de la SRPV d’Oran :
1 – Présentation générale :
La SRPV d’Oran est l’une des 14 stations régionales de l’INPV central d’Alger. Elle a
été créée en 1976. Elle est située à 15 kilomètres à l’Ouest de la ville d’Oran, avec une superficie
de 4 hectares.
Elle regroupe une vingtaine d’employés, et une dizaine de pré-emplois, tous sous la
direction du Directeur Régional Mr TANDJAOUI Bakhti.
Elle dispose :
Des laboratoires d’analyses et de diagnostics pour les besoins du contrôle
phytosanitaire et de dépistage des organismes prohibés.
De terrains agricoles, pour la réalisation des protocoles d’essais expérimentaux
menant à des études bioécologiques, et les observations liées à l’élaboration des
situations phytosanitaires et la lutte contre les bio-agresseurs.
3
– PRESENTATION de la SRPV D’ORAN :
II. 2 – Cadre juridique :
La loi 87-17 du 1er Août 1987 est le texte de base qui régit la protection des végétaux en
Algérie, cinq décrets ont été promulgués en application de cette loi :
Décret exécutif n° 93-286 du 23 Novembre 1993.
Il porte sur le contrôle phytosanitaire aux frontières. Il définit les interdictions, les restrictions,
les points d’entrée, le transit, le certificat phytosanitaire, les dispositions particulières en matière
de semences ainsi que les listes des organismes nuisibles indésirables en Algérie.
Décret exécutif n° 95-387 du 28 Novembre 1995.
Il porte sur la protection phytosanitaire à l’intérieur du territoire. Il établie deux listes
d’organismes nuisibles. Une liste A d’organismes nuisibles dont le dépistage et la lutte sont
obligatoires et permanents, et une liste B d’organismes nuisibles dont la lutte devient obligatoire
en cas de péril.
Les missions du Ministère de l’Agriculture et du développement rural en matière de protection
des végétaux sont assurées par l’INPV.
Décret exécutif n° 95- 405 du 02 Décembre 1995.
Il réglemente la
commercialisation des pesticides en Algérie. Il organise la Commission
Nationale des Pesticides à usage agricole qui s’appuie sur deux
Comités techniques (le Comité
d’Etude Biologique et le Comité Toxicologique) pour statuer et proposer au Ministère de
l’Agriculture et da la Pêche, l’homologation ou le refus d’homologation des marques
commerciales des pesticides.
Décret exécutif n° 93- 1439 du 14 Juin 1933.
Il réaménage Les statuts de l’INPV est de désigne Autorité Phytosanitaire Nationale.
Décret exécutif n° 96- 270 du 3 Août 1996.
4
– PRESENTATION de la SRPV D’ORAN :
Il porte Statut particulier des personnels phytosanitaires de l’INPV et prévoit leur
assermentation et leur commissionnement. Il est complété par décret n° 98-308 du 26 Septembre
1988 qui fixe le régime indemnitaire spécifique de ces agents.
II.
3 – Organisation de la SRPV :
II.
3. 1. Place de la SRPV d’Oran dans l’organigramme de l’INPV :
MADR
DIRECTION
CENTRALE
INPV
d’ALGER
48 DSA
14 SRPV
48 IPW
22 Postes
Frontaliers
13 SRPV
régionales des
autres Wilayate
Secrétariat
Mycologie
Virologie
Nématologie
Bureau
Technique
Entomologie
4 Bases
acridienne
SRPV d’Oran
06 Laboratoires
Bureau
administratif
Bactériologie
Malherbologie
Figure N° 01 : l’organigramme de l’INPV Misserghin.
5
– PRESENTATION de la SRPV D’ORAN :
II.
4 – Missions :
II.
4. 1- de la SRPA d’Oran :
La SRPAV d’Oran est l’artisan essentiel de la veille phytosanitaire au niveau de la Wilaya
d’Oran est Ain T’émouchent. Elle a pour mission :
Le contrôle phytosanitaire des produits agricoles objets d’échanges commerciaux
internationaux, ainsi que les plants et semences produits localement.
La surveillance et la lutte contre les fléaux agricoles auxquels les agriculteurs n’ont pas les
capacités d’intervenir.
La veille de proximité en apportant aux agriculteurs l’information préventive sous forme
d’avertissement agricole.
Le développement et la maîtrise des techniques de protection des cultures en privilégiant les
solutions non polluantes, dont la lutte biologique.
Elle dispose de six laboratoires de diagnostic et d’analyses spécialisés en protection
phytosanitaire :
Nématologie
Entomologie
Malherbologie
Virologie
Mycologie
Bactériologie
6
– PRESENTATION de la SRPV D’ORAN :
II.
4. 2- Les missions du laboratoire de Bactériologie de la SRPV D’Oran :
Le laboratoire de bactériologie de la SRPV d’Oran a pour mission de procéder à des analyses
bactériologiques réglementaires et de proximités pour les besoins du contrôle phytosanitaire aux
frontières et à l’intérieur du pays, en vue de dépistage des bactéries prohibés ou bactéries phytopathogènes de quarantaines.
Les bactéries de quarantaine sont des bactéries nuisibles qui ont une importance potentielle
pour l’économie de la zone menacée et qui ne sont pas encore présents dans cette zone ou bien qui sont
présent mais n’y pas largement disséminés et font l’objet d’une lutte officielle.
II.
4. 3- Le processus de travail du laboratoire de bactériologie :
Demande
d’analyse par
les inspecteurs
phytosanitaires
de Wilaya ou de
frontières
(IPW- IPF)
Analyses par
le
laboratoire
de
bactériologie
Elaboration
d’un bulletin
d’analyse par
le laboratoire
Information
des parties
concernées
Déclenchement
d’une alerte
générale en cas
de présence
d’une bactérie
de quarantaine
II. 4. 4 - Les bactéries phyto-pathogènes de quarantaine (liste A1 –A2) les plus
contrôlés dans le laboratoire de Bactériologie :
Ce sont des bactéries susceptibles d’infecter les végétaux et d’y déclencher des maladies :
• Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus sur pomme de terre.
• Ralstania solanacearum sur pomme de terre.
• Xanthomonas arboricola pv. pruni sur les rosacées à noyaux (genre prunus).
• Erwinia amylovora sur rosacées à pépins (poiriers, pommiers,..).
• Pseudomonas savastanoï sur l’olivier.
7
- Etude bibliographique
III - Etude bibliographique sur la production des olives en Algérie
III. 1 – Systématique de l’olivier
L’olivier appartient : (Lazzeri Y., 2009)
o Règne : Plantae
o Sous-règne :Tracheobionta
o Division :Magnoliophyta
o Classe : Magnoliopsida
o Sous-classe : Asteridae
o Ordre : Scrophulariales
o Famille : Oléacées
o Genre : Olea
o Espèce : europaea
L’espèce Oléa europaea a longtemps été subdivisée en deux sous-espèces, Oléa europaea var.
Europaea pour l’olivier domestique, et Oléa europaea var sylvestris pour l’oléastre, ou olivier sauvage.
La famille des oléacées comporte environ 30 genres et 600 espèces. Les variétés cultivées ; se composent
souvent de spécimens se ressemblant d’un point de vue morphologiques, mais aux caractères génétiques
différent (Guignard δ Dupont, 2004 δ Tourte et al. ,2005)
Fig. N° 02 : Variétés d’olivier
8
- Etude bibliographique
III. 2- Répartition de l’olivier dans le monde :
Le patrimoine oléicole mondial est d’environ 830 millions d’oliviers, dont 180 millions en
Espagne. La production
Les principaux vergers d’olivier se situent en Espagne, Tunisie, Italie, Turquie, Grèce, Maroc,
Syrie et Portugal.
Les principaux pays producteur de l’olivier sont Espagne, Italie, Grèce, Turquie, Tunisie, Maroc,
Syrie et Portugal.
Pays
Nombre des pieds
(millions)
Pays
Nombre des pieds
(millions)
Espagne
180
Liban
6
Italie
140
Albanie
5
Grèce
130
France
5
Turquie
80
Argentine
5
Tunisie
64
Slovénie
4
Maroc
52
Lybie
4
Portugal
50
Jordanie
3
Algérie
48
Etats-Unis
2
Syrie
30
Egypte
2
Chine
20
Chypre
1
Tableau N° 01 : Les principaux pays producteur de l’olivier dans le monde.
9
- Etude bibliographique
Maroc3%
Tunisie5%
Algérie 3%
Jordanie1%
portugal 3%
Autres 4%
Espagne40%
Turquie5%
Syrie1%
Grèce 13%
Italie22%
Fig. N° 03 : La production mondiale de l’huile d’olive.
III. 3- Répartition de l’olivier dans la région du Maghreb :
Au Maghreb, l’olivier fait partie de l’identité du peuple Maghrébin, la culture de ce dernier est
largement dominé par le verger oléicole Tunisien.
En effet la Tunisie occupe la 5ème place de la production mondiale avec plus de 64 millions de
pieds d’olivier sur 900 000 hectares de superficies cultivée, qui s’étale dans 3 régions centre, sud et nord
(Karray B et al. 2009).
Au Maroc, la culture de l’olivier est très importante, elle occupe la 8eme place mondiale avec plus
de 25 milles de pieds d’olivier sur une superficie de 540000 hectares dont 200 milles hectares dans les
zones montagneuses et 220 milles hectares dans les zones irriguées,100 mille dans les zones de Bour
favorables et 40 milles dispersé à travers le pays (Ylldiz T et Khadari B.,2009).
Par contre l’Algérie occupe la 10ème place avec plus de 20 millions de pieds d’olivier sur une
superficie de 195500 hectares, la surface est répartie dans trois régions : le centre, avec 54,3%, l’est avec
28,3% et l’ouest avec 17%, de la superficie totale. La plupart des oliveraies (80%) sont situées dans des
zones de montagne (dans les vallées de Soummam et de la Seybouse, d’El-Kantara à philippeville, à
Gastu et à Jemmapes, et dans les régions de la Galle,Batna Guelma et Tebessa), caractérisés par une
pluviométrie moyenne comprise entre 400 et 900mm/an et une altitude comprise entre 50 et 700 mètre.
10
- Etude bibliographique
En Kabylie l’olivier se rencontre jusqu'à 1000 mètre d’altitude sur quelques verseaux montagneux
tournés vers la mère. Le reste des oliviers (20%) sont situées dans les pleines occidentales du pays
(Masera-Sig-Relizane), ou la pluviométrie moyenne annuelle est de 300-400 mm (Lazzeri Y., 2009).
Pays
Position mondial
Nombre de pied (million)
Superficie (Hectares)
Tunisie
5ème
64
+ 900000
Maroc
8ème
52
+ 540000
Variétés
- Chetoui
- Chemllel
- Picholine
- Meslala
- Sigoise
9ème
Algérie
48
+ 389000
- Sévillane
- Rougette
- Chemllel
Tableau N° 02 : Les différentes variétés d’oliviers produits par les pays du Maghreb.
(Ylldiz T et Khadari B., 2009 ; Karray B et al.2009 ; Lazzeri Y., 2009).
III. 4- Position des oliviers en Algérie :
L’oliveraie Algérienne est répartie sur trois zones oléicoles importantes :
•
La zone de la région ouest :
Représentant 31400 hectares réparties entre 5 wilayas à savoir Tlemcen,
Ain Temouchent, Mascara, Sidi Belabes et Relizane. Cette zone représente 16,40% du
verger oléicole National.
•
La zone de la région centrale du pays :
C’est la plus importante, couvre une superficie de 110200 hectares répartis entre les wilayate
de : AinDefla,Blida, Boumerdes, Tizi-Ouzou, Bouira ,Bejaia. La Kabylie (Tizi-Ouzou,
Bouira, Bejaia) elle seule occupe pré de 44% de la superficie oléicoles national, il s’agit
surtout des vergers extensifs.
11
- Etude bibliographique
•
La zone de la région est :
La superficie totale de cette région set de 49900 hectares, répartie sur plusieurs Wilayate à
savoir : Jijel, Skikda, Mila et Guelma.
III. 5- Intérêt de l’olivier :
L’olivier est cultivé pour ces fruits et particulièrement pour son huile, en effet l’huile représente
93% de la production mondiale.
Une trentaine de pays produisent l’huile d’olive, certain sont de gros producteur comme l’Espagne
et l’Italie produisant à eux seuls plus de 60% de production mondiale, ce pendant d’autres pays
producteurs important comme la Tunisie, la Turquie, la Syrie, le Maroc, L’Algérie, l’Argentine, le
Jordanie, produisent respectivement plus de 20000 tonnes d’huile d’olive pat an.
L’olivier constitue à l’échelle nationale une des principales essences fruitières .Le verger oléicole
occupe 240000ha et produit prés de 20.103 tonnes d’huile.
L’huile d’olive est utilisée traditionnellement en Méditerranée pour les soins de la peau et la
fabrication d’onguents ou de savons. Le savon d’Alep et le savon de Marseille, qui contiennent de l’huile
d’olive.
D’autre part, l’huile a des avantages sur la santé notamment sur le plan cardio-vasculaire, grâce à
sa teneur en vitamine A, vitamine E et en acides gras mono insaturés, les bienfaits liés aux vitamines sont
surtout observé lors de consommation d’huile froide, comme les salades.
III. 6- Variété Algérienne de l’olivier :
Parmi les principales variétés d’oliviers qui existent en Algérie sont :
La variété Chemllel : qui existe dans toute la Kabylie du littoral au sud de la vallée de la
Soummam, est considéré comme la meilleure productrice de l’huile de bonne qualité (Haas δ Défago,
2005).
12
- Etude bibliographique
Les variétés Limli, Azeradj et Bouchouk : se trouvent surtout dans la vallée de la Soummam
(Cottier,1999 ;Duffy et al,2003). Ces variétés représentent les trois quarts de la production oléicoles
nationale. Une autre variété est destinée à la consommation (olives de table) c’est la variété Sigoise
répartie au niveau de la région de Sig wilaya de Mascara. Les variété introduites durant l’époque
coloniale sont Cornicabra, la Lucque, la Frontoio et la leccino, d’origine Italienne ou Française et se sont
bien adaptées aux conditions climatiques de notre pays (Haas δ Défago, 2005).
III. 7- Etude bibliographique sur le groupe des Pseudomonas :
III. 7. a - Historique :
En raison de leur présence généralisée dans l’eau et des graines de plantes telles que les
dicotylédones, les Pseudomonas ont été observés au début de l’histoire de microbiologie. Le nom
générique Pseudomonas crée pour ces organismes a été défini en terme assez vague, en 1894 par Migula,
comme un genre de bactéries à gram- négatives, en forme de tige et possédant des flagelles polaires. Peu
de temps après, les Pseudomonas ont été isolées de nombreuses niches naturelles et un grand nombre de
noms d’espèces a été initialement attribuée au genre. Selon la deuxième édition du « Bergey’s Manual of
Systématique Bactériology, 1986 ».
III. 7. b. Définition :
Les Pseudomonas appartiennent aux Gramma-Protéobactéries. Ce groupe englobe la majorité des
espèces de bactéries phytopatogènes.
Le genre Pseudomonas appartient à la famille des Pseudomonaceae, il contient une soixantaine
d’espèces. Plusieurs études ont souligné le haut degré de diversité au sein de Pseudomonas fluorescens,
ce qui a mené à la subdivision de cette espèce en différentes biovars. Le groupe de Pseudomonas se
compose de bactéries sous forme de bâtonnets, Gram négatifs, mobiles par ciliature polaire, non sporulant
elles sont organotrophes, peu exigeantes, et incapable de fermenter le glucose, se caractérisent par la
pluralité des substances hydrocarbonées utilisées comme source de carbone et d’énergie, produisant des
pigments, la plupart étant saprophytes et pouvant coloniser les cellules corticales mortes des racines
(Cook et al.,1996 δ Frey et al.,2006).
13
- Etude bibliographique
Avant la fin 2006, sur la base de caractères phénotypiques et sur les bases génétiques.
Pseudomonas syringae a été retrouvé presque partout, avec une large diversité interspécifique, dont
génétique dans ceux des vergers de poirier, cerisier doux, cerisier acide et prunier qui ont été étudiés dans
les régions belges de Gembloux et de Gorsem (Bossis et al., 2000 δ Iacobellis,2001).
III. 7. c. Caractéristique des Pseudomonas :
Selon Schroth et al. Les espèces de Pseudomonas sont reconnues selon différents critères :
•
Les caractères biochimiques :
-
Les possibilités d’assimilation de substrats carbonés.
-
Les besoins en facteurs de croissance.
III. 8- Les principales maladies de l’olivier :
III. 8- 1- Tavelure de l’olivier :
C’est la maladie la plus connue de l’olivier. Elle existe, en plus de payes méditerranéennes. En
Afrique du Sud, en Erythrée, aux Etat Unis et au Chili. C’est un parasite quasi exclusif d’Olea europaea,
quoique certains auteurs aient rapporté des attaques d’une souche du parasite sur les genres Phyllirea et
Ligustrum.
Elle est connue sous les noms vulgaires de repilo en espagnol ; olho de pavao en portugais ;
occhio di pavone en italien ; tavelure de l’olivier en français et olive leaf spot en anglais.
- Description de l’agent causal :
L’agent causal de la maladie est le champignon Spilocaea oleagina (Castagne) Hughes. Il s’agit
d’un phycomycète qui se développe et forme des colonies sous la cuticule supérieure des feuilles. Ces
colonies évaluent parallèlement à la surface foliaire et leur appareil végétatif est composé par des hyphes
très fines, hyalines, ramifiées et cloisonnées d’une manière intermittente.
Le mycélium croît en se dirigeant vers la superficie des lésions et acquiert la forme typique des anneaux
concentriques.
14
- Etude bibliographique
A partir des hyphes, émergent des conidiospores, courts, peu différenciés et dans la majorité des
cas, unicellulaires. De ceux-ci sortent successivement des conidies pouvant aller jusqu’à 8 par
conidiophore. Sur les feuilles chutées des arbres, se forme un corps végétatif étendu sur lequel on peut
observer des masses stomatiques denses.
- Biologie :
La biologie du champignon est très variable selon les régions et les années. Son développement
dépend de plusieurs facteurs comme l’humidité, la température, la pluie et les techniques culturales.
- Dégâts :
Comme conséquence des lésions produites par Spilocea oleagina, une importante chute de feuilles
se produit, ce qui se manifeste clairement sur les branches inférieures qui peuvent perdre toutes leurs
feuilles. Cette situation entraîne un affaiblissement de l’arbre d’autant plus grand que l’attaque est
importante. Ceci se manifeste par des partes de production et des bourgeons axillaires, ce qui donne lieu à
un développement très lent de l’arbre et compromet la formation des jeunes arbres.
Les pédoncules et les fruits peuvent également être affectés. Dans le premier cas, l’olivier tombe
prématurément sur le sol, produisant des pertes de récolte et affectant la qualité de l’huile selon la période
e chute (avant ou après la récolte). Dans le cas ou il affecte le fruit, l’infection retarde la maturité et
diminue la qualité et la quantité de l’huile produite.
- Facteurs qui affectent la maladie :
Les facteurs qui affectent la maladie en grande mesure le développement du champignon. Il a un
développement normal entre les limites thermiques qui correspondent à un climat tempéré, avec des
valeurs moyennes de 10 à 20 °C. Son optimum est situé autour de 9 à 18 °C.
L’agressivité de l’attaque du champignon dépend de la quantité et de la fréquence des pluies. Les
zones dans lesquelles le printemps et automne sont pluvieux et doux sont plus à des infections élevées du
pathogène. De la même manière, ceci peut avoir lieu dans les zones ou l’hiver et doux et l’été est peu
chaud. Dans ces cas, l’activité du champignon est ininterrompue et les infections se chevauchent.
L’humidité élevée est nécessaire pour le développement du champignon. Pour cette raison. La
pluie, la rosée et les humidités relatives élevées sont des facteurs importants pour que la maladie évolue
favorablement. D’autres facteurs influent indirectement en favorisant la présence de l’humidité sur l’arbre
notamment le manque d’ensoleillement, des arbres mal aérés, des zones basses ou s’accumule l’humidité,
15
- Etude bibliographique
etc. Pour la germination des conidies, il est nécessaire d’avoir une humidité suffisante qui peut provenir
indifféremment de l’eau de pluie ou de la rosée. Les conidiophores perdent la capacité de produire des
conidies après 7 jours dans un environnement sec ou à une température de 18 °C.
La durée de la période d’humectation de la feuille est d’une grande importance pour que se
produise d’infection. Il a été observé, dans le cadre d’expériences réalisées à température contrôlée que
cette période est de 48 heures à 16 °C , de 24 heures à 20 °C et de 36 heures à 24 °C.
En général, dans les pays riverains de méditerranée, on considère deux époques typiques
d’infection : le printemps et l’automne. Durant l’été et l’hiver, la propagation est limitée par les
conditions climatiques défavorables : le pathogène reste à l’état latent ou son activité est très réduite.
Les pratiques culturales telles que des irrigations
excessives, une taille insuffisante ou la
proximité de rivières favorisent le développement du pathogène, car l’olivier reste pendant une large
période de temps a des humidités élevées. L’excès de flétrissement azoté et le manque de calcium
prédisposent la plante à la maladie.
L’âge des feuilles influe sur l’infection de Spilocaea oleagina. Il y a quelques années, on pensant
que les feuilles plus âgées et plus développées étaient plus réceptives que les feuilles jeunes qui étaient
protégées par leurs poils. Dans les études réalisées récemment, il a été vérifié que l’attaque du
champignon est plus grande sur les jeunes feuilles. (Manuel Civantos Lopez- Villalta. 1999)
Figure N° 04 : Tavelure sur l’olivier.
16
- Etude bibliographique
III. 8- 2- Verticilliose de l’olivier :
Ce pathogène est très répandu puisqu’il attaque un grand nombre d’espèce, aussi bien ligneuses
qu’herbacées. Sur l’olivier, il a été décrit pour la première fois en Italie en 1946 et a été observé dans
différents pays du bassin méditerranéen, notamment en Espagne, en France, en Grèce et en Turquie, amis
également en Asie mineure, en Syrie et aux Etats-Unis (Californie).
Il est connu sous le nom vulgaire verticilosis del olivo en espagnol, Verticillium wilt en anglais,
verticilliose de l’olivier en français et tracheoverticillosi en italien.
- Description de l’agent causal :
La maladie est produite par le champignon Verticillium dahliae Kleb.
C’est un champignon qui développe un mycélium hyalin, sur lequel apparaissent les conidiophores
qui se caractérisent par trois verticelles avec 3 à 4 fialides, sur le sommet desquels sont disposées les
conidies.
- Dégâts :
Il s’agit d’une maladie qui présente un grand potentiel de développement. Elle affecte
actuellement de vastes zones oléicoles, surtout les nouvelles plantations qui sont réalisées dans les pays
ou la culture est en expansion ou bien dans les régions ou des plantes de restructuration de l’olivier
traditionnel sont en cours, en générale, elle affecte les oliveraies irriguées plus ou moins intensivement
et localisées dans les zones irriguées complantées d’espèces sensibles à la maladie.
Les dégâts se manifestent par un dessèchement des branches secondaires, des branches principales
et parfois même de l’arbre complet.
En Grèce, les pertes occasionnées par la maladie ont été évaluées à 2 à 3 % sur les 14 Millions
d’arbres testés affectées. Un pour cent de ces arbres affectes ont été
complètement détruits. En
Andalousie, sur 122 exploitations inspectées avec un total de 350.000 arbres, 38,5 % des arbres étaient
affectés avec une incidence moyenne de la maladie qui oscille entre 10 et 90 % des arbres affectés.
- Facteurs influençant la maladie :
L’humidité du sol et la température extérieure méritent une attention particulière. L’incidence de
la maladie est plus grande dans les oliveraies irriguées. En ce qui concerne la température, la sévérité de
l’infection est favorisée au printemps par des températures de l’air durant la journée qui n’excèdent pas
20 à 25 °. Pendant l’été, les moyennes maximales diumes ne doivent pas être supérieures à 30 – 35 °C
17
- Etude bibliographique
pour favoriser la maladie. Dans des conditions expérimentales, avec une humidité optimale du sol, les
conditions de développement maximal de la maladie se produisent à des températures comprises entre 21
et 27 °C, avec un maximum à 24 °C.
En découvrant la zone vasculaire, on observe sur le bois, une couleur brune, symptôme de la
maladie. (Manuel Civantos Lopez- Villalta. 1999).
Fig. N° 05: Verticilliose de l’olivier.
III. 8- 3- Le chancre bactérien de l’olivier :
C’est une maladie infectieuse causée par une bactérie P.savastanoi qui a été signalée au 4éme siècle
par le grec, Theophrastus. Le pathogène semble avoir été disséminé avec des plantes d’olivier (Olea
europaea subsp. Europaea) puis étendus et propagés dans beaucoup de régions dans le monde. Cette
bactérie, a été isolée par Luigi savastanoi (Bradbury, 1986).
Le nom actuel est Pseudomonas syringae pv. savastanoi (Gardan et al. 1992). Cette bactérie est
considérée comme le seul pathogène responsable de la formation des nœuds (nécroses) bactériennes es
olives (Philippe, 2007). En Italie, la maladie est appelée « rogne » de l’olivier, en Espagne « verrue » ou
« Tuberculose » de l’olivier, en France et en Afrique du Nord on lui donne le nom de Tuberculose ou le
chancre bactérien de l’olivier.
La maladie agit sur la croissance des repousses et elle affecte les organes reproducteurs, et
s’attaque même à d’autres plantes comme le laurier rose, le frêne, le troène, le jasmin,…ect.
La maladie peut tuer les arbres si les infections se produisent sur la ceinture et les troncs de jeunes
arbres pour cause de blessure de taille.
18
- Etude bibliographique
Cette maladie est considérée comme un problème majeur par effets néfaste sur la croissance, le
rendement et surtout la qualité de l’huile d’olive (Guido., 2005).
Cette maladie très contagieuse sur certaines variétés, peut être également transmise par les
techniques de multiplications (greffage et bouturage) à partir de rameaux provenant d’arbres contaminés.
Cette maladie est parmi celles qui produisent le plus de dommages sur la culture de l’olivier, affectant
même la qualité des fruits et donnant naissance à des odeurs indésirable. (Hall et al., 2004 δ Quesada et
al., 2008). Suivant le décret exécutif : 93-286 23/11/1993 Pseudomonas savastanoi est considéré comme
un parasite de quarantaine.
Site à Ain Témouchent
Figure N° 06 : Le chancre bactérien de l’olivier
19
- Etude bibliographique
- Les symptômes de la maladie et description des galles :
Elle se manifeste par des tumeurs parenchymateuses à forme irrégulière de couleur vertes au début
et à surface lisses. Le nœud d’olive apparait comme galle bruts ou gonflement d’environ 0,5 à 2 cm de
diamètre sur les rameaux, branches troncs principal, racines, feuilles abimées, tiges fruits les jeunes
pousses. Après quelques mois les galles acquièrent un aspect spongieux et irrégulier, devenant dur et brun
sur les petites pousses. Ces galles apparaissent isolément ou rapprochées sur toute la partie de la plante.
Les galles peuvent endommager la structure de la tige et déformer l’échafaud de l’arbre si l’infection est
sévère durant les premiers stades du développement des arbres (Icobelli, 2001 δ Philippe, 2007).
Selon Nielsen (1990), l’impact de la maladie se traduit sous divers aspect :
•
Perte de feuilles du fait de l’étranglement mettant hors circuit l’alimentation des feuilles en
aval ;
•
Dessèchement du bois par suite d’une photosynthèse défaillante ;
•
Réduction de production ;
•
Dans une phase ultérieure, réduction même de la taille des arbres par suite d’une végétation
désordonnée.
20
- Etude bibliographique
A : dégâts sur rameaux
B : dégâts sur feuilles
C: dégâts sur tronc
Figure N°7 : Tumeurs dues au Pseudomonas savastanoi sur les branches et les rameaux (A), les
feuilles (B) et le tronc (C), d’un arbre d’olivier.
21
- Etude bibliographique
- Origine de la maladie :
Pseudomonas savastanoi est l’agent causal de la tuberculose de l’olivier, observé pour la première
fois par Savastanoi en 1870 puis au début du vingtième siècle par Smith et Rorer 1904 (Guido M., 2005).
- Principaux caractères bactériologiques :
Se sont des bactéries bâtonnets (0.4-0.8 x1.0-3.0), Gram négatives, catalase positive, mobiles avec
1 ou plusieurs flagelles polaires, une croissance plutôt lente, les colonies sont blanche grise ou crème,
lisses plates, scintillantes, produisant une réaction d’hypersensibilité sur tabac, métabolisme respiratoire,
n’hydrolyse pas la gélatine et l’amidon, assimile plusieurs sucre : sucrose, L-arabinose, gluconate,
caprylate (Bergey., 2003).
Figure N° 08 : Bactérie Pseudomonas savastanoi.
- Systématique de la bactérie :
Le Genre Pseudomonas est classé dans la famille des Pseudomonadaceae (ordre des
Pseudomonadales, classe des Gammaproteobacteria, division ou phylum des « Proteobacteria »,
domaine ou empire des « Bacteria »).
22
- Etude bibliographique
- Classification de Pseudomonas savastanoi :
Règne
Bacteria
Division
Proteobacteria
Classe
Gammaproteobacteria
Ordre
Pseudomonadales
Genre
Pseudomonas
- Les espèces de la bactérie :
La bactérie a été isolée pendant plusieurs années à partir de la famille des oléacées, d’où on peut
trouver des espèces qui produisent ou nom de levane a partir de saccharose. Ces espèces ont été devisées
en 05 pathovars :
Pseudomonas Savastanoi pathovar Savastanoi qui cause la galle, ou bien la tumeur dans la famille
des oléacées.
P.Savastanoi pathovar Glycinea cause de la rouille bactérienne du soja.
P.Savastanoi pathovar phasealicola cause la rouille de halo de l’haricot.
P.Savastanoi pathovar fraxini .
P.Savastanoi pathovar nerri.
Le nom de Pseudomonas savastanoi a été mis pour la première fois par Stevens en 1913, mais la
bactérie a té inclus dans la liste des pathovars des espèces de Pseudomonas syringae (Young J et al.,
1996 ; Bergey.,2003).
23
- Etude bibliographique
- Pouvoir pathogène :
Jusqu’à présent la seule information présente dans la littérature sur le pouvoir pathogène de P.
savastanoi est sa capacité d’induire la formation des Gall (tumeurs), par la stimulation des
phytohormones l’acide indole-acétique et le cytokinine (Penyalver R., 2005 ; Moretti C., 2008). Et cela
est du à un plasmide qu’on l’appelle « Ti » (tumeur induisant) qui est transféré dans les tissu végétaux, et
qui s’intègre dans le génome de la cellule hôte pour être transcrit, le nouveau ADN formé déclenche une
production autonome des phytohormones : l’acide indole-acétique (AIA) qui joue un rôle dans
l’élargissement des cellules et le cytokinine qui favorise la division cellulaire (Carol C., 2008).
De nombreux auteurs utilisent la protéine reporteur d’auto fluorescence combiné à la technologie
GFP (green fluorescent protéine) afin de déterminer les interactions entre bactérie-plante (Luis R et al.,
2009).
D’autre part, GFP en combinaison avec des techniques de microscopie d’epifluorescence a été
employé largement pour la visualisation des cellules de Pseudomonas dans la rhizosphère (Boldt et al.
2004) et sur des surfaces de la feuille (Wang et al. 2007) et dans les tissus infectés. (Wang et al., 2007).
- Cycle de la maladie :
Bien que la bactérie puisse être présente tout au long d’un verger, il ne peut inciter à la maladie
qu’après l’entrée passive de l’hôte par des blessures ou des cicatrices foliaires (Savastanoi, 1987).La
transmission de la maladie est liée à la pluie événement qui stimule la croissance de la population
bactérienne et facilite la circulation de l’agent pathogène. Les pluies de printemps sont particulièrement
propices au développement de la maladie parce qu’un grand nombre de feuilles tombe en mai et juin,
laissant des cicatrices foliaires sensibles aux agents pathogènes. Les cicatrices foliaires sont plus sensibles
à l’infection dans les deux jours après une pluie, mais peuvent rester sensibles pendant sept jours après la
pluie. Une fois la bactérie infecte la plante, elle produit des hormones de croissance des végétaux
(l’auxine et cytokinines) qui stimulent la prolifération des tissus résultant en une galle ou nœud (Surico,
1989 δ Smidt δKosuge, 2000). Des études récentes montrent que la bactérie peut être transportée dans la
plante par les vaisseaux du xylène, ce qui provoque des nœuds « secondaire » le long de la tige. Cette
nouvelle information souligne l’importance de la prévention des infections initiales de la gestion des
populations de l’agent pathogène à l’extérieur de l’arbre (Young δTriggs, 1994).
24
- Etude bibliographique
Figure N° 10 : Coupe transversale d’une galle bactérienne évolutive sur un rameau d’olivier
(Lavermicocca et al. 1999).
Impact de la maladie :
Il se traduit sous divers aspect, perte de feuilles, desséchement de bois suite d’une photosynthèse
défaillante, réduction de production, dans une phase ultérieure, il est montré réduction même de la taille
des arbres suivi d’une végétation désordonnée.
Figure N° 11 : Dégâts sur fruits.
25
- Etude bibliographique
Gestion de la maladie :
Sachant que, la tuberculose de l’olivier est considérée comme un parasite de quarantaine suivant le
décret exécutif : 93-286 23/11/1933.
Il n’ya malheureusement, à ce jour, aucun remède connu et efficace contre cette maladie. Il faut
cependant suivre quelques recommandations afin de limiter la propagation de cette bactérie dans les
vergers oléicoles :
La principale est de désinfecter soigneusement tous les outils de taille.
Toutes les parties atteintes seront arrachées sectionnées et incinérées par le feu.
Eviter les excès d’irrigation de l’arbre.
Eviter les blessures au moment de la taille.
Selon les conseils locaux de la société centrale d’agriculture de Nice et des Alpes – Maritimes
(SCAH) il faut appliquer des produits cupriques au printemps et à la fin de l’automne tel que la
bouillie bordelaise à 1% afin de désinfecter et cicatriser les plaies de taille.
Des travaux ont montré que les pulvérisations supplémentaires au printemps ainsi que l’application
après la récolte habituelle permettront d’améliorer sensiblement le contrôle des maladies (Botelho δ
Leda, 2006).
S’agissant d’un parasite de quarantaine dont la lutte est obligatoire et eu égard à la gravité de la
maladie et de sa propagation rapide il est nécessaire que ce problème phytosanitaire doit être prise en
charge sérieusement par les services de la protection des végétaux, et cela compte tenu de l’importance
du programme quinquennal 2004-2014 à mettre en place + d’un million d’hectares d’olivier à l’échelle
nationale.
26
- Etude bibliographique
VI. Choix des méthodes d’analyse pour la détection de Pseudomonas savastanoi :
VI. 1- Avantages et inconvénients des différentes méthodes d’analyses envisageables :
Les contrôles visant à détecter des végétaux porteurs de la bactérie sans qu’il y ait de symptômes
sont importants. Pour cela, de nombreuses recherches sont faites pour diminuer les seuils des procédures
de détection et pour augmenter leur spécificité. Chaque méthode présente des avantages et des
inconvénients.
II. 2- L’isolement sur milieux sélectifs :
L’isolement consiste à mettre en culture une bactérie recherchée à partir d’un échantillon végétal.
On peut utiliser pour cela des milieux de cultures semi-sélectifs limitant le développement des
microorganismes saprophytes (bactéries, champignons). On sélectionne ensuite les colonies afin de les
purifier et d’obtenir des souches pures. La lecture est basée sur les caractéristiques macroscopiques des
colonies formées (taille, forme, couleur, aspect) sur un milieu donné dans un temps donné.
VI. 3 - Les critères de sélection des milieux semi-sélectifs sont basées sur :
a- Les critères qualitatifs :
Une observation visuelle des caractéristiques morphologiques sur les 03 milieux gélosés, ensuite
une comparaison de la structure des colonies est réalisée à savoir : la taille, le diamètre et l’aspect
muqueux ainsi que la durée de la croissance de la bactérie.
b- Les critères quantitatifs :
Cette technique est basée sur le dénombrement des colonies existantes et la comparaison de la
vitesse de développement sur les 03 milieux de cultures.
Le Laboratoire National de la Protection des Végétaux, a choisi les milieux de cultures de la
bactérie, Pseudomonas savastanoi, sur la base d’un protocole OEPP.
27
- Etude bibliographique
VI.
4 - Les milieux de cultures :
Il s’agit de 3 milieux de cultures coulés en boites de pétri après autoclavage :
Le milieu King-B.
Le milieu LPGA.
Le milieu Levane.
VI.
5- Les tests biochimiques :
Ces tests réalisables après isolement, reposent sur la constitution et le métabolisme cellulaire des
bactéries. La réalisation d’une galerie de tests permet de mettre en évidence diverse propriétés
biochimiques spécifiques d’une espèce bactérienne et son identification.
Les tests biochimiques donnent des résultats très fiables qui peuvent venir confirmer ou infirmer
les résultats d’autres méthodes moins sensibles ou moins spécifiques.
Cependant la réalisation des tests biochimiques implique un isolement préalable.
Certains tests biochimiques sont relativement longs à mettre en œuvre (1 à 2 semaine).De plus ces
tests ne sont pas adaptés au traitement de grandes quantités d’échantillons.
VI. 6- Les analyses sérologiques :
L’immunofluorescence (IF) :
Cette technique fait intervenir une réaction immunologique (liaison anticorps- antigène). La
bactérie possède des antigènes, intégrés dans sa paroi, qui lui est spécifique. Cela déclenche chez les
vertébrés, la synthèse d’anticorps spécifiques. On recherche alors la présence de la bactérie Pseudomonas
savastanoi, en additionnant à l’échantillon analysé les anticorps anti-Pseudomonas savastanoi. Les
complexes Ag-Ac sont mis en évidence grâce à un second anticorps, conjugué à un fluorochrome.
Celui-ci se fixe spécifiquement sur l’Ac anticorps, Pseudomonas savastanoi et fluoresce lorsqu’il
est soumis à des rayons UV. Cette technique consiste à préparer directement la solution bactérienne avec
les anticorps fluorescents. Les bactéries de Pseudomonas savastanoi apparaissent fluorescentes sous la
lumière ultra violette, la sensibilité de cette technique est assez bonne du faite qu’elle permet de détecter
l’agent pathogène, mais la méthode du comptage est un peu difficile à réaliser car la concentration
bactérienne est très importante par lame.
28
– MATERIELS & METHODES :
I. MATERIEL BIOLOGIQUE :
I.
1. Souches bactériennes :
Les isolats de Pseudomonas savastanoi utilisées dans cette étude proviennent du matériel
végétal contaminé (rameaux infectés) d’origine de la Wilaya d’Oran et d’Ain Temouchent.
Les souches de bactéries sont maintenues par repiquage de colonies tous les 3 à 4 jours. Les
isolats de Pseudomonas savastanoi sont cultivés sur milieu King-B. toutes les boites sont misent en
incubation à 260C.
I.
2. Purification des souches bactériennes :
Une suspension bactérienne réalisée dans de l’eau stérile est étalée sur boites de milieu King-B
à différentes dilutions et incubée à 260C (Lelliot R.et Stead G., 1987). Après une croissance de 24 h à
72h. Une lecture des boites se fait par observation visuelle, précisant les caractères phénotypiques de la
bactérie, et celles possédant les caractéristiques morphologiques de Pseudomonas savastanoi sont
étalés par épuisement sur une nouvelle boite de milieu BK et remise à incuber.
Apres une croissance suffisante ; les cultures sont soumises à un ensemble de tests
biochimiques, décrit par Schaad et Stall (1988). Ce test est utilisé pour confirmer la détermination de
l’espèce bactérienne et d’effectuer un diagnostic sur des colonies de Pseudomonas savastanoi
prélevées à partir du milieu King-B.
I.
3. Gamme de dilutions bactériennes :
Des suspensions bactériennes ont été réalisées à partir de 48h à 72h dans de l’eau stérile. Un
prélèvement initial ajusté à 108cfu /ml a été soumis à des dilutions en cascade de 0 en 10, de façon à
obtenir une gamme de dilution bactérienne.
A partir du tube n prélever 1mL de la nouvelle solution mère. Réaliser des dilutions successives au 1/10
29
– MATERIELS & METHODES :
1000µL
D1
D2
D3
D4
D5
D6
Fig.12 : Gamme de dilution de la souche bactérienne.
Etaler les suspensions de D3 à D6 sur les milieux de cultures, à raison de3 boites par dilution.
Incuber les boites de pétri à 260C pendant la durée recommandé.
Dénombrer les bactéries sur les trois boites à la dilution la plus lisible, en faire la moyenne pour
déterminer la concentration du tube D0 puis des tubes 1à6.
I.
4. L’isolement sur les 3 milieux de cultures :
L’isolement de souches bactériennes
est une étape indispensable pour caractériser avec
certitude une espèce bactérienne.
Une dose de 100ul de chaque concentration est étalée sur les trois milieux de cultures : King-B,
Levane, LPGA, pour dénombrer les bactéries après une croissance de 3 jours à 260C.
Selon (Guido M., 2005) Levane peut être utilisé comme un milieu de culture.
Le dénombrement sert à déterminer la concentration exacte de la suspension bactérienne.
30
– MATERIELS & METHODES :
I.
5. Coloration de Gram :
La coloration de Gram est utilisée pour différencier les bactéries Gram positif des bactéries
Gram négatif. Cette coloration différentielle repose sur l’aptitude ou non de la paroi bactérienne à
s’opposer à la coloration par éthanol. Les bactéries dites Gram positif possèdent une paroi épaisse,
composée de peptidoglycane en leur donnant une imperméabilité à l’éthanol, tandis que les bactéries
Gram négatif ne contiennent qu’une fine couche de peptidoglycane et surtout de lipide en quantité
importante et c’est ce qui va rendre la décoloration effective.
A l’aide d’une anse à ensemencement on prélève une colonie qu’on dépose sur une lame.
Une goutte d’eau distillée est déposée sur le frotti qui sera séché puis fixé à la flamme bleue.
La lame est colorée au violet de gentiane pendant 1min puis rincée abondamment à l’eau
distillée. On fait agir le Lugol pendant 20 secondes en vu de consolider la fixation du premier colorant
sur la paroi. Apres rinçage à l’eau distillée, la violet de gentiane est éliminé par lavage à l’éthanol
jusqu’à décoloration totale. Une seconde coloration à la fuchsine est réalisée pendant 1min. on lave
doucement à l’eau distillée. Apres séchage au bec bunsen, la lame est observée au microscope en
ajoutant une goutte de l’huile d’immersion.
II.
Tests biochimiques :
- Les tests biochimiques constituent une approche classique pour l’identification de l’espèce
bactérienne.
- Tous les tests biochimiques sont effectuées sur des souches âgées de 24h, en effet, les
colonies isolées sont repiquées sur milieu solide King B et incubés pendant 24 h à 26 °C.
a. Le test Catalase :
Ce test est important pour la première orientation dans l’identification de l’espèce bactérienne.
Il permet de mettre en évidence la présence ou l’absence de l’enzyme catalase.
Sur une lame, on dépose à l’aide d’une ance, une goute d’eau oxygénée et une colonie
bactérienne cultivée sur milieu King B solide. La lecture se fait après quelques secondes.
31
– MATERIELS & METHODES :
b. Hugh et Leifson :
Le milieu de Hugh et Leifson permet de déterminer la voie métabolique, oxydative, ou
fermentative empruntée par la bactérie étudiée.
On ensemence une colonie bactérienne qui provient du King B solide dans deux tubes
contenant le milieu Hugh et Leifson. Apres homogénéisation, l’un des tubes est recouvert d’huile de
vaseline en vue de conditions d’anaérobiose. Les tubes sont fermés et laissés à température ambiante.
La lecture se fait après 24 h.
Le milieu Hugh et Leifson est composé pour un litre d’eau distillée de 2 g de bacto peptone,
5 g NaCl, 0,3g Kh2Po4, 10g Glucose, 0.03g Bleu de Bromothymol (BBM).
c. Péctinase :
Le test péctinase permet de déterminer la présence ou l’absence de l’enzyme péctinase.
Dans notre étude nous utilisons comme substrat des rondelles de pomme de terre. Ce tubercule
étant riche en pectine et son hydrolyse en présence de péctinase se traduit par l’apparition de nécrose.
Des tranches de pomme de terre sont stérilisées à l’éthanol 700 puis lavées à l’eau distillée
stérile et séchées. Dans une boite de pétri contenant du papier filtre mouillé, les tranches sont
déposées, et inoculées de colonies bactériennes fraichement prélevées. L’ensemble et recouvert de para
film et laissé à incubé à 270C. La lecture se fait après 4jours.
d. Le test d’hyper sensibilité sur feuille de tabac :
Le test d’hypersensibilité sur feuille de tabac sert à mettre en évidence le pouvoir
phytopatogènes des Pseudomonas fluorescentes (Schaad N. et al ., 2001). Et ce par dessèchement des
zones d’inoculation sur les feuilles de tabac.
A l’aide d’une seringue on injecte la suspension bactérienne provenant du milieu King B
liquide dans la nervure principale de la feuille de tabac. Après 24 heures à température ambiante on
fait la lecture.
32
– MATERIELS & METHODES :
III.
L’immunofluorescence (IF) :
Cette technique fait intervenir une réaction immunologique (liaison anticorps- antigène).
Les anticorps spécifiques de Pseudomonas savastanoi contenus dans l’antisérum se fixent sur
les antigènes de la bactérie. Des anticorps conjugués sont alors dirigés contre les premiers anticorps
fixés. Ces anticorps conjugués sont marqués par un fluorochrome qui émet une fluorescence sous
lumière ultraviolette. Le complexe bactérie- anticorps conjugués est alors observable par microscope
optique.
Un dépôt de 40ul de la suspension bactérienne est réalisé sur des lames IF, mettre en incubation
pendant 20mn et fixer les lames à l’éthanol 900. Un témoin positif a été utilisé comme estimateur de la
sensibilité de la méthode.
Dépôt de 40uL de SM-D1-D2-….-D6 sur chaque lame IF
40uL
Macérat 1
Macérat 2
Macérat 3
Fig.13 : dépôt de la suspension bactérienne sur lames (IF).
33
– MATERIELS & METHODES :
50µL
Dans 900 µL d’eau
100µ
50µL
100µ
Dans 900 µL d’eau
50µL
100µ
Dans 900 µL d’eau
1 ml de la Solution
Dépôt de 50 µL sur
100µ
50µL
Bactérienne
BK- LPGA- Levane
100µ
Dans 900 µL d’eau
100µ
50µL
Dans 900 µL d’eau
50µL
Dans 900 µL d’eau
1 dépôt de 40 µL de chaque tube
sur lame IF
Fig.14 : Gamme de dilution et ensemencement sur boites de milieux de cultures.
34
– MATERIELS & METHODES :
Echantillons
Macération avec tampon antioxydant
Lame IF
Isolement direct
LPGA
KB
Levane
Tests biochimiques
Les techniques expérimentales utilisées pour la détection de Pseudomonas savastanoi
Suivant le protocole OEPP.
35
– Résultat et discussion :
I. Résultat et discussion :
Les expériences dont a fait l’objet cette étude avaient pour but de tester et comparer la sensibilité
des méthodes de dépistage de Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi sur échantillons symptomatiques,
proposées par l’OEPP. Ces techniques sont donc censées pouvoir déceler de faibles concentrations de la
population de Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi existantes chez les plantes hôtes.
1- Essai d’isolement des macérâts contaminés sur milieu de culture :
La technique d’isolement bactériologique sur milieux de culture répond à une démarche de
diagnostic classique, en repérant les colonies ayant des caractéristiques phénotypiques de Pseudomonas
savastanoi pv. savastanoi. (Voir le tableau de dénombrement).
2- Observation macroscopique :
Après 24 h d’incubation à 26°C les bactéries ont poussées sur les milieux King B et LPGA, par
contre sur le milieu Levane la bactérie nécessite 3 à 5 jours pour se développées.
a- Caractéristiques morphologiques des bactéries :
Cette caractérisation est basée sur le critère de l’impact des colonies, sur les trois milieux :
•
Sur le milieu King B, la condensation des colonies est forte donc on peut dire que
l’impact est fort, ce qui explique la formation d’une crème bactérienne.
•
Par contre le milieu LPGA, la condensation des colonies est moyenne donc l’impact est
moyen, les colonies sont un peu dispersé avec un nombre moyen.
•
En fin le milieu Levane, la condensation des colonies est faible donc l’impact est faible,
avec un nombre des colonies très faible.
b- Caractères phénotypiques des colonies sur les trois milieux :
Sur milieu LPGA, la figure 15 on voit les colonies de couleur crème, de forme circulaire, un
diamètre de 2.5 mm à 3.5 mm, convexe, translucide, lisse, brillante identique à celle décrite par (Bergey,
2003).
Par contre sur le milieu Levane, dans la figure 15 on voit des colonies de couleur blanc gris avec
un aspect visqueux, une forme circulaire, convexe, translucide, diamètre 2.5 mm à 3.5 mm, identique à
celle décrite par (Guido M et al.2005).
36
– Résultat et discussion :
En fin sur le milieu King B, la figure 15 montre les mêmes caractéristiques observées dans le
milieu LPGA.
Les colonies bactériennes de Pseudomonas savastanoi ensemencées sur milieu King-B, donnent un aspect
fluorescent et prennent une couleur vert-jaune fluorescente, cela est du à la présence du pigment fluorescéine.
(Balestra J. et al. 2009).
Milieu Levane
Milieu LPGA
Milieu BK
Figure N° 15 : Isolement Pseudomonas savastanoi.
37
– Résultat et discussion :
3- Observation microscopique :
a-
Coloration de Gram :
La figure N°16 montre des bacilles de Pseudomonas savastanoi « Gram négatif », identique
à celle décrite dans le manuel Bergy (2003).
Figure N° 16 : Observation microscopique à l’immersion de Pseudomonas savastanoi
après coloration de Gram (grossissement 1000)
b. Tests biochimiques :
Les tests biochimiques constituent une approche pour l’identification des bactéries, ils ne sont pas
particulièrement utiles pour la détermination de certaines espèces et sous- espèces de bactéries.
Touts les tests biochimiques sont effectués sur des colonies âgées de 16 à 24 h.
38
– Résultat et discussion :
b. 1- Catalase :
Le résultat de ce test nous montre la formation des bulles d’oxygène, du à la présence de
l’enzyme catalase, donc Pseudomonas savastanoi est catalase positif.
Figure N° 17 : Test de Catalase.
b. 2. Levane :
Les colonies de la bactérie Pseudomonas savastanoi sur milieu levane sont visqueuse entouré par
une marge luisante du à la dégradation du sucrose en levane par la bactérie, en effet selon (Guido M et
al.2005) les Pseudomonas savastanoi sont de levane positif.
Figure N° 18 : aspect d’une crème bactérienne de Pseudomonas savastanoi sur milieu levane
39
– Résultat et discussion :
b. 3. Hugh et Leifson :
Sur le test Hugh et Leifson on observe le virage de la couleur du vert au jaune pour le tube qui ne
contient pas de l’huile, ceci est du à la dégradation de glucose par la bactérie.
B
A
Figure N°19 : test de Hugh et Leifson.
b. 4. Péctinase :
Pour le test Péctinase, on observe l’absence de zone de lyse, selon (Guido M et al.2005) les
Pseudomonas savastanoi ne dégrade pas les pectines.
Figure N° 20 : Test de Péctinase.
40
– Résultat et discussion :
b. 5. Arginine déshydrolase :
Le milieu arginine apparait en couleur jaune, selon (Guido M et al.2005) les Pseudomonas
savastanoi sont arginine négatif.
Figure N° 21 : test d’Arginine déshydrolase.
b. 7. Le test d’hyper sensibilité sur feuille de tabac :
Le test d’hypersensibilité sur feuille de tabac sert à mettre en évidence le pouvoir phytopatogènes
des Pseudomonas fluorescentes (Schaad N. et al ., 2001). Et ce par dessèchement des zones d’inoculation
sur les feuilles de tabac.
A l’aide d’une seringue on injecte la suspension bactérienne provenant du milieu King B liquide
dans la nervure principale de la feuille de tabac. Après 24 heures à température ambiante on fait la
lecture.
Figure N° 22 : hypersensibilité de feuille de tabac après inoculation bactérienne.
41
– Résultat et discussion :
c.
Dénombrement sur milieu BK :
• Ensemencement du macérât contaminé N°1 :
Dénombrement D0
D1
D2
D3
D4
D5
Boite 1
25
Boite 2
29
Boite 3
2700000
270000
27000
2700
270
27
D3
D4
D5
Concentration D0 (ufc/ml = 2,7. 106)
• Ensemencement du macérât contaminé N°2 :
Dénombrement D0
D1
D2
Boite 1
29
Boite 2
31
Boite 3
3000000
300000
30000
3000
300
30
D3
D4
D5
Concentration D0 (ufc/ml = 3,0. 106)
• Ensemencement du macérât contaminé N°3 :
Dénombrement D0
D1
D2
Boite 1
11
Boite 2
13
Boite 3
1200000
120000
12000
1200
120
12
D3
D4
D5
Concentration D0 (ufc/ml = 1,2. 106 ufc/ml)
d.
Dénombrement sur milieu levane :
• Ensemencement du macérât contaminé N°1 :
Dénombrement D0
D1
D2
Boite 1
25
Boite 2
23
Boite 3
2400000
240000
24000
2400
240
24
Concentration D0 (ufc/ml = 2,4. 106 ufc/ml)
42
– Résultat et discussion :
• Ensemencement du macérât contaminé N°2 :
Dénombrement D0
D1
D2
D3
D4
D5
Boite 1
25
Boite 2
23
3000000
Boite 3
•
300000
30000
3000
300
30
Concentration D0 (ufc/ml = 3. 106 ufc/ml)
• Ensemencement du macérât contaminé N°3 :
Dénombrement D0
D1
D2
D3
D4
D5
Boite 1
30
Boite 2
25
3200000
Boite 3
•
320000
32000
3200
320
32
Concentration D0 (ufc/ml = 3.2. 106 ufc/ml)
e. Dénombrement sur milieu LPGA :
• Ensemencement du macérât contaminé N°1 :
Dénombrement D0
D1
D2
D3
D4
D5
Boite 1
29
Boite 2
27
Boite 3
2800000
280000
28000
2800
280
28
D3
D4
D5
Concentration D0 (ufc/ml = 2,8. 106 ufc/ml)
• Ensemencement du macérât contaminé N°2 :
Dénombrement D0
D1
D2
Boite 1
37
Boite 2
35
Boite 3
3600000
360000
36000
3600
360
36
Concentration D0 (ufc/ml = 3,6. 106 ufc/ml)
43
– Résultat et discussion :
• Ensemencement du macérât contaminé N°3 :
Dénombrement D0
D1
D2
D3
D4
D5
Boite 1
11
Boite 2
09
Boite 3
1000000
100000
10000
1000
100
10
Concentration D0 (ufc/ml = 1,02. 106 ufc/ml)
Les étalements correspondants aux dilutions D4 - D5 et D6 sont plus faciles à dénombrer. A ce
stade de dilution, les colonies apparaissent de couleur jaune pâle légèrement bombées, circulaires à bord
lisse ; brillantes et muqueuses.
Dans cet essai le but est de tester le développement de la bactérie sur les trois milieux de culture
sur un échantillon de trois souches pures de Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi.
Les résultats sont donnés en pourcentages de récupération des bactéries ensemencées ayant formé
une colonie, et ceci pour chaque prélèvement et pour chaque spot ensemencé.
Le calcul des pourcentages de récupération est expliqué dans les tableaux suivants :
Trois macérâts contaminés de Pseudomonas savastanoi pv. Savastanoi différents ont fait l’objet
d’expérimentation afin de constituer trois répétitions et calculer une moyenne et un écart type.
SM
solution mère. D1
D3
la 3ème dilution (10 -3). D4
D5
la 5ème dilution (10 -5).
la 1ère dilution (10 -1). D1
la 2ème dilution (10 -2).
la 4ème dilution (10 -4).
Le dénombrement a été effectué on comptant les colonies de la dilution D5 (10 -5), les autres dilutions sont
calculées par extrapolation.
Ceci nous a conduits à faire une étude statistique.
44
– Résultat et discussion :
II.
Estimation des concentrations des solutions mères après croissance sur milieux de
cultures :
II. 1- Sur milieu LPGA :
Concentration
Concentration
Pourcentage de
estimé
initiale
récupération
M1
2 ,8 . 106
2,7. 106
103%
2,6. 10²
M2
3,6. 106
3,0. 106
120%
3,0. 10²
85%
1,05. 0²
Moyenne
102%
2,21
Ecart type
17,50
1,02
Souches
M3
1,02. 10
6
1,2. 10
6
Seuil sensibilité
II. 2 - Sur milieu BK, milieu de référence :
Concentration
Concentration
Pourcentage de
estimé
initiale
récupération
M1
2 ,7 . 106
2,7. 106
100%
2,4. 10²
M2
3. 106
3. 106
100%
2,0. 10²
M3
1, 2. 106
1,2. 106
100%
1,05. 10²
Moyenne
100%
2
Ecart type
00
0,86
Souches
Seuil sensibilité
II. 3 - Sur milieu Levane :
Concentration
Concentration
Pourcentage de
estimé
initiale
récupération
M1
2 ,4 . 106
2,7. 106
88%
2,1. 10²
M2
3. 106
2.6 106
86%
2,3. 10²
M3
3.2. 106
3,2. 106
100%
1,10. 10²
Moyenne
91,33%
1,8
Ecart type
7,57
0,7
Souches
Seuil sensibilité
45
– Résultat et discussion :
Les résultats obtenus permettent de calculer les pourcentages de récupération des milieux, c’est-àdire de nombre de bactéries ayant poussé, par rapport au nombre de bactéries déposées sur le milieu.
La sensibilité du milieu LPGA permet de trouver une quantité de 2,8. 106 ufc /ml
Sachant que le King-B est un milieu de référence.
Le taux de récupération des bactéries dans le milieu Levane est 91, 3 % qui représentent un faible
pourcentage en comparant avec le milieu BK et LPGA, cela montre que la bactérie a un développement
moyen sur milieu Levane qui représente une sensibilité très faible.
III.
Tableau analyses des variances
S.C.E
DDL
C .M
VAR TOTALE
48423,55
8
6052,944
VARFACTEUR 1
44677,55
2
22338,78
3746
6
624,3333
VAR
RESIDUELLE 1
TEST F
PROBA
35,78021
0,00072
E.T
C.V
24,9866627
12,44%
III. 1 - COMPARAISONS DE MOYENNES :
Le coefficient de variance qui représente 12.44 %, montre qu’il y a une différence faiblement
significative entre les milieux. On y retrouve, le classement croissant des moyennes de récupération pour
une souche par milieu, ainsi que leur répartition dans des groupes homogènes.
Le test statistique permet de dégager un groupe homogène d’un milieu que l’on peut considérer
comme le plus adapté à la culture avec un seuil de sensibilité important.
POURCENTAGE
F1
LIBELLES
2
LPGA
102 %
A
1
BK
100 %
A
3
Levane
91.33%
DES MOYENNES
GROUPES HOMOGENES
B
46
– Résultat et discussion :
Levane 91,33%
King B 100%
LPGA 102%
Figure N° 23 : Secteur de Pourcentage des Colonies dans les trois milieux
(King B, LPGA, Levane)
Rapport des concentrations estimées
La comparaison des concentrations estimées nous révèle se qui suit :
Les milieux
Concentration estimé
King B
1.2 x 106
LPGA
1.02 x 106
Levane
3.2 x 106
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Levane
BK
LPGA
D3
D4
D5
D6
Concentration bactérienne en ufc/ml dans les trois milieux (BK, Levane, LPGA)
Figure N° 24 : Variation de la sensibilité en fonction des milieux (LPGA-BK-Levane)
47
– Résultat et discussion :
III. 2 - Discussion :
Le travail sur souches de macérât contaminés permet d’évaluer les critères suivants :
-
Croissance de Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi: vitesse et taux de récupération obtenus par
dénombrement des colonies à différentes dilutions et pour les différents milieux.
-
Aspect phénotypique permettant une reconnaissance rapide de Pseudomonas savastanoi pv.
savastanoi.
Le taux de récupération des bactéries, correspond au rapport de la concentration bactérienne
estimer à l’aide du dénombrement, sur la concentration initiale de la suspension bactérienne déterminée
pour le milieu de référence.
Le milieu King-B a été retenu come milieu de référence car c’est le milieu de plus principalement
utilisé pour la culture de Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi.
Le seuil de détection ou sensibilité de la méthode est déterminée par le niveau de concentration
bactérienne le plus faible permettant de considérer la présence de colonies typiques de Pseudomonas
savastanoi pv. savastanoi.
Une comparaison des trois milieux a pu être réalisé voir les tableaux de synthèses.
La quantité de colonies se développant sur chacun des 3 milieux est globalement équivalente. Le
milieu Levane laisse se développer une quantité de bactérie inférieure, par rapport aux autres milieux.
Le temps d’apparition des colonies est de 24 heures en moyenne pour Levane ainsi que BK et
48heures pour LPGA. La quantité d’ufc dénombrées sur milieu Levane est inférieure à celle des autres
milieux et le temps de croissance est généralement beaucoup plus long. Le milieu BK permet une bonne
culture du pathogène, certes plus au moins rapides, mais ce critères seul n’est pas d’une grande
importance. L’isolement du pathogène dépendra beaucoup plus de la sélectivité du milieu.
48
– Résultat et discussion :
IV.
Les tests biochimiques :
Ces tests ont été utilisés pour identifier les souches bactériennes de Pseudomonas savastanoi pv.
Savastanoi .observées sur les milieux.
IV. 1 - Les essais d’immunofluorescence sur macérât contaminés :
Les lames IF ont été visualisées au microscope et les bactéries fluorescentes de Pseudomonas
savastanoi pv. savastanoi.ont été dénombrées à une concentration favorable à la lecture malgré la
présence des saprophytes et les débris végétaux.
Figure N°25 : l’aspect fluorescent des bactéries sur lame IF.
Tableau 3 – concentration des bactéries sur lames IF
Dilution
SM
D1
D2
D3
D4
D5
D6
M1
+++
+++
+++
++
0,62. 103
0,62. 10²
0,62. 101
M2
+++
+++
+++
++
0,56. 103
0,56. 10²
0,56. 101
M3
+++
+++
+++
++
0,82. 103
0,82. 10²
0,82. 101
Souches
Les résultats de la lecture des lames IF au microscope se traduisent par la présence de cellules
fluorescentes dont la taille et la morphologie sont typiques à Pseudomonas savastanoi pv. Savastanoi.
Donc cette technique est validée et optimisée, car la sensibilité est généralement moyenne 10 3 ufc / ml.
49
– Résultat et discussion :
Tableau 4 : Estimation des concentrations des solutions mères après coloration des lames IF
Souches
SM estimée
CI initiale
Taux de récupération
M1
6,2. 103
2 ,7. 103
200%
M2
5,6. 103
3. 103
186%
M3
8,2. 103
1,2. 103
600%
Ecart type = 235,08
Discussion :
Compte tenu des écarts types, il apparait que la méthode d’isolement IF donne un seuil de détection
de 103. Le pourcentage de récupération des résultats est très élevé car la méthode IF repère des bactéries
fluorescentes et les cellules mortes de Pseudomonas savastanoi pv. Savastanoi. Le plant expérimental
n’a pas pu mettre la vérification si ces méthodes donnent une détection au dessous de 103. Il aurait dû
intégrer deux dilutions supplémentaires (D7- D8).
En comparant cette technique à l’isolement sur milieux de cultures, on peut dire qu’elle est plus
irrégulière, mais elle permet quant même de détecter un grand nombre de bactéries, ce qui a certain
avantage, par rapport à d’autre techniques. Elle permet une meilleure sensibilité de détection.
Analyse de variance
DDL
27
C.M
6,64 E-02
TEST F
Var totale
S.CE
1.791525
Var facteur 1
8,36 E-02
1
8 ,36E-02
1,325439 0,26019
Var facteur 2
0 ,1808035
1
0,1808035 2,866431 0,09979
Var Interf 1 2
1,33 E-02
1
1,33 E-02
24
6,31 E-02
Var residuelle 1 1,513829
PROBA
E.T
C.V
0,25114974
83,02%
0,210687 0,65439
L’analyse de variance Stat Box nous révèle un coefficient de variance très élevé de 83,02%, donc
statistiquement la méthode IF est considérée comme la technique la plus optimisée pour la détection de
Pseudomonas savastanoi.
50
– Résultat et discussion :
Statistiques de groupe
Milieu
d1
d2
d3
d4
d5
bk
levane
bk
levane
bk
levane
bk
levane
bk
levane
N
Moyenne
Ecart-type
9
3
9
3
9
3
9
3
9
3
230000,00
240000,00
23000,00
24000,00
2300,00
2400,00
230,00
240,00
23,00
24,00
84409,715
10000,000
8440,972
1000,000
844,097
100,000
84,410
10,000
8,441
1,000
Erreur standard
moyenne
28136,572
5773,503
2813,657
577,350
281,366
57,735
28,137
5,774
2,814
,577
Test d'échantillons indépendants
Test de Levene
sur l'égalité des
Test-t pour égalité des moyennes
variances
Intervalle de confiance 95% de la
F
Hypothèse de
variances égales
11,538
Sig.
,007
t
ddl
Sig.
Différence
Différence
(bilatérale)
moyenne
écart-type
différence
Inférieure
Supérieure
102343,773
-,198
10
,847
-10000,000 50420,454
-122343,773
-,348
8,627
,736
-10000,000 28722,813
-75406,661
55406,661
-,198
10
,847
-1000,000
5042,045
-12234,377
10234,377
-,348
8,627
,736
-1000,000
2872,281
-7540,666
5540,666
-,198
10
,847
-100,000
504,205
-1223,438
1023,438
-,348
8,627
,736
-100,000
287,228
-754,067
554,067
-,198
10
,847
-10,000
50,420
-122,344
102,344
-,348
8,627
,736
-10,000
28,723
-75,407
55,407
-,198
10
,847
-1,000
5,042
-12,234
10,234
-,348
8,627
,736
-1,000
2,872
-7,541
5,541
d1
Hypothèse de
variances inégales
Hypothèse de
variances égales
11,538
,007
d2
Hypothèse de
variances inégales
Hypothèse de
variances égales
11,538
,007
d3
Hypothèse de
variances inégales
Hypothèse de
variances égales
11,538
,007
d4
Hypothèse de
variances inégales
Hypothèse de
variances égales
d5
11,538
,007
Hypothèse de
variances
inégales
51
– Résultat et discussion :
Statistiques de groupe
d1
d2
d3
d4
d5
Moyenne
Erreur standard
moyenne
Milieu
N
Ecart-type
bk
9
230000,00
84409,715
28136,572
lpga
bk
lpga
bk
lpga
bk
lpga
bk
9
9
9
9
9
9
9
9
246666,67
23000,00
24666,67
2300,00
2466,67
230,00
246,67
23,00
115650,335
8440,972
11565,034
844,097
1156,503
84,410
115,650
8,441
38550,112
2813,657
3855,011
281,366
385,501
28,137
38,550
2,814
lpga
9
24,67
11,565
3,855
Test d'échantillons indépendants
Test de Levene
sur l'égalité des
Test-t pour égalité des moyennes
variances
Intervalle de confiance 95% de
F
Sig.
t
ddl
Sig.
Différence
Différence
(bilatérale)
moyenne
écart-type
la différence
Inférieure
Hypothèse de
variances égales
1,456
,245
Supérieure
-,349
16
,731
-16666,667
47726,070
-117841,416
84508,082
-,349
14,639
,732
-16666,667
47726,070
-118611,134
85277,801
-,349
16
,731
-1666,667
4772,607
-11784,142
8450,808
-,349
14,639
,732
-1666,667
4772,607
-11861,113
8527,780
-,349
16
,731
-166,667
477,261
-1178,414
845,081
-,349
14,639
,732
-166,667
477,261
-1186,111
852,778
-,349
16
,731
-16,667
47,726
-117,841
84,508
-,349
14,639
,732
-16,667
47,726
-118,611
85,278
-,349
16
,731
-1,667
4,773
-11,784
8,451
-,349
14,639
,732
-1,667
4,773
-11,861
8,528
d1
Hypothèse de
variances inégales
Hypothèse de
variances égales
1,456
,245
d2
Hypothèse de
variances inégales
Hypothèse de
variances égales
1,456
,245
d3
Hypothèse de
variances inégales
Hypothèse de
variances égales
1,456
,245
d4
Hypothèse de
variances inégales
Hypothèse de
variances égales
1,456
,245
d5
Hypothèse de
variances inégales
52
– Résultat et discussion :
Statistiques de groupe
Milieu
N
Moyenne
Ecart-type
Erreur standard moyenne
levane
3
240000,00
10000,000
5773,503
lpga
9
246666,67
115650,335
38550,112
levane
3
24000,00
1000,000
577,350
lpga
9
24666,67
11565,034
3855,011
levane
3
2400,00
100,000
57,735
lpga
9
2466,67
1156,503
385,501
levane
3
240,00
10,000
5,774
lpga
9
246,67
115,650
38,550
levane
3
24,00
1,000
,577
lpga
9
24,67
11,565
3,855
d1
d2
d3
d4
d5
Test d'échantillons indépendants
Test de Levene
sur l'égalité des
Test-t pour égalité des moyennes
variances
Intervalle de confiance 95%
F
Sig.
t
ddl
Sig.
Différence
Différence
(bilatérale)
moyenne
écart-type
de la différence
Inférieure
Hypothèse de variances
égales
8,885
,014
Supérieure
-,097
10
,925
-6666,667
69024,955
-160463,851
147130,518
-,171
8,346
,868
-6666,667
38980,052
-95910,103
82576,770
-,097
10
,925
-666,667
6902,496
-16046,385
14713,052
-,171
8,346
,868
-666,667
3898,005
-9591,010
8257,677
-,097
10
,925
-66,667
690,250
-1604,639
1471,305
-,171
8,346
,868
-66,667
389,801
-959,101
825,768
-,097
10
,925
-6,667
69,025
-160,464
147,131
-,171
8,346
,868
-6,667
38,980
-95,910
82,577
-,097
10
,925
-,667
6,902
-16,046
14,713
-,171
8,346
,868
-,667
3,898
-9,591
8,258
d1
Hypothèse de variances
inégales
Hypothèse de variances
égales
8,885
,014
d2
Hypothèse de variances
inégales
Hypothèse de variances
égales
8,885
,014
d3
Hypothèse de variances
inégales
Hypothèse de variances
égales
8,885
,014
d4
Hypothèse de variances
inégales
Hypothèse de variances
égales
8,885
,014
d5
Hypothèse de variances
inégales
53
– Résultat et discussion :
Statistiques de groupe
Erreur standard
Milieu
N
Moyenne
Ecart-type
bk
9
230,00
84,410
28,137
if
3
666,67
136,137
78,599
bk
9
23,00
8,441
2,814
if
3
66,67
13,614
7,860
moyenne
d4
d5
Test d'échantillons indépendants
Test de Levene
sur l'égalité des
Test-t pour égalité des moyennes
variances
F
Hypothèse de
d4
variances égales
Sig.
1,311
t
,279
Hypothèse de
variances inégales
Hypothèse de
variances égales
1,311
,279
ddl
Intervalle de confiance
Sig.
Différence
Différence
(bilatérale)
moyenne
écart-type
95% de la différence
Inférieure
Supérieure
-6,753
10
,000
-436,667
64,659
-580,735
-292,598
-5,231
2,535
,020
-436,667
83,483
-732,161
-141,173
-6,753
10
,000
-43,667
6,466
-58,074
-29,260
-5,231
2,535
,020
-43,667
8,348
-73,216
-14,117
d5
Hypothèse de
variances inégales
Statistiques de groupe
Milieu
N
Moyenne
Ecart-type
Erreur standard moyenne
levane
3
240,00
10,000
5,774
if
3
666,67
136,137
78,599
levane
3
24,00
1,000
,577
if
3
66,67
13,614
7,860
d4
d5
54
– Résultat et discussion :
Test d'échantillons indépendants
Test de Levene
sur l'égalité des
Test-t pour égalité des moyennes
variances
F
Hypothèse de
d4
variances égales
Sig.
9,470
t
,037 -5,414
Hypothèse de
d5
variances égales
Différence
(bilatérale)
moyenne
4
-5,414 2,022
variances inégales
Hypothèse de
ddl
Sig.
9,470
,037 -5,414
Hypothèse de
4
-5,414 2,022
variances inégales
Différen
Intervalle de confiance
ce écart-
95% de la différence
type
Inférieure
Supérieure
,006
-426,667
78,811
-645,480
-207,853
,032
-426,667
78,811
-762,316
-91,018
,006
-42,667
7,881
-64,548
-20,785
,032
-42,667
7,881
-76,232
-9,102
Statistiques de groupe
d4
d5
Milieu
N
Moyenne
Ecart-type
Erreur standard moyenne
lpga
9
246,67
115,650
38,550
if
3
666,67
136,137
78,599
lpga
9
24,67
11,565
3,855
if
3
66,67
13,614
7,860
Test d'échantillons indépendants
Test de Levene sur
l'égalité des variances
Test-t pour égalité des moyennes
Intervalle de confiance 95% de la
F
d4
Hypothèse de
Sig.
,017
,900
t
ddl
Sig.
Différence
Différence
(bilatérale)
moyenne
écart-type
différence
Inférieure
Supérieure
-5,249
10
,000
-420,000
80,019
-598,292
-241,708
-4,798
3,034
,017
-420,000
87,544
-696,841
-143,159
-5,249
10
,000
-42,000
8,002
-59,829
-24,171
-4,798
3,034
,017
-42,000
8,754
-69,684
-14,316
variances égales
Hypothèse de
variances inégales
d5
Hypothèse de
,017
,900
variances égales
Hypothèse de
variances inégales
55
– Résultat et discussion :
Test Anova est utilisé pour comparer les moyennes en se basant sur des analyses de variances.
On a calculé les moyennes entre les 3 milieux de cultures ensuite, on a fait ressortir l’ecart type de
chaque milieu (BK- Levane- LPGA).
Le PN c’est le degré de signification.
Si le PNS qui figure sur le tableau est inferieur à 0.05 donc cela implique que la comparaison est
significative.
Suivant les résultats obtenus du test Anova concernant la comparaison entre les trois milieux de
cultures de la bactérie Pseudomonas savastanoi a savoir le BK, Levane et LPGA, aucune différence
significative n’a été constatée. Cela implique que le développement de la bactérie peut se faire dans les
différents milieux d’ensemencement, sachant que la différence des moyennes enregistrées sur le tableau
des statistiques de groupe résulte que le milieu BK reste toujours un milieu de référence.
La comparaison entre la technique d’isolement sur milieu de culture et la technique d’analyse
sérologique d’immunofluorescence est hautement significative du moment que le PN est inferieur à 10 - 4.
On comparant les moyennes enregistrées sur le tableau des statistiques de groupe, et le PN
bilatéral, la technique de détection de la bactérie Pseudomonas savastanoi d’immunofluorescence
permet d’avoir un taux de récupération des colonies de la bactérie important par rapport à la technique
d’isolement sur les milieux de cultures.
56
– CONCLUSION :
Conclusion :
Dans cette étude, deux techniques, l’une isolement sur milieux de cultures, l’autre
sérologique (immunofluorescence), ont été mises en œuvre dans le cadre de la détection
de
Pseudomonas savastanoi. Ces techniques ont été évaluées sur des échantillons symptomatiques,
sans chercher à modifier les protocoles décrits.
Le but de l’ensemble des manipulations était de comparer la sensibilité et la spécificité de
chaque méthode.
Lors de cette étude comparative, deux tests statistiques ont été réalisés le premier était le
test de Newman et Keuls à l’aide du logiciel Stat Box Pr, qui est une extension de Microsoft Excel
dédiée aux statistiques, le deuxième était le test Anova .
Donc on se contente de rapporter les moyennes et l’écart type des différents essais.
Après une étude comparative entre les trois milieux de cultures (King –B – Levane et
LPGA), les résultats statistiques ont montrés que le milieu King-B est considéré comme un milieu
de référence et le plus sensible pour le développement de Pseudomonas savastanoi. L’interprétation
des résultats est basée sur le pourcentage de récupération des bactéries ensemencées ayant formé
une colonie, et ceci pour chaque échantillons et pour chaque spot ensemencé.
Les résultats statistique mettent en évidence qu’il n’ya pas de différence significative pour
les trois milieux de cultures, bien que les moyennes permettent de donner un classement suivant le
seuil de détection.
L’isolement de la bactérie sur milieu levane permet un développement maximal et rapide
des colonies, ce qui peut nuire la lecture des résultats ainsi que la détection de Pseudomonas
savastanoi .
Par contre sur milieu King –B et LPGA la bactérie pousse plus nettement, et en quantité
moins importante, ce qui nous permet d’avoir une lecture plus lisible et ça nous aide à mieux
détecter la bactérie en cause. Il convient donc d’utiliser en priorité ces deux milieux de cultures
pour une meilleure identification de Pseudomonas savastanoi .
57
– CONCLUSION :
En comparant cette technique sérologique à la technique d’isolement sur milieux de cultures,
on peut dire que l’immunofluorescence est plus irrégulière car elle révèle la présence d’un grand
nombre de saprophytes et de débris végétaux en plus des cellules fluo-végétales qui gênent la
lecture, mais elle permet quant même de détecter un grand nombre de bactéries qui ont un aspect
fluorescent, ce qui est certain avantage, par rapport à d’autre techniques. Elle permet une meilleure
sensibilité de détection.
L’analyse de variance Stat Box nous révèle un coefficient de variance très élevé de 83,02%,
donc statistiquement la méthode IF est considérée comme la technique la plus optimisée pour la
détection de Pseudomonas savastanoi.
Cependant il s’avère que ce test est reproductible à ce jour pour la détection de Pseudomonas
savastanoi p. L’expérimentation du Protocol de coloration des lames IF devra également être
répété afin de pouvoir vérifier la sensibilité et spécificité de la méthode.
Suivant les résultats obtenus du test Anova concernant la comparaison entre les trois milieux de
cultures de la bactérie Pseudomonas savastanoi a savoir le BK, Levane et LPGA, aucune différence
significative n’a été constatée. Cela implique que le développement de la bactérie peut se faire dans
les différents milieux d’ensemencement, sachant que la différence des moyennes enregistrées sur le
tableau des statistiques de groupe résulte que le milieu BK reste toujours un milieu de référence.
La comparaison entre la technique d’isolement sur milieu de culture et la technique d’analyse
sérologique d’immunofluorescence est hautement significative du moment que le PN est inferieur à
10 - 4.
On comparant les moyennes enregistrées sur le tableau des statistiques de groupe, et le PN
bilatéral, la technique de détection de la bactérie Pseudomonas savastanoi d’immunofluorescence
permet d’avoir un taux de récupération des colonies de la bactérie important par rapport à la
technique d’isolement sur les milieux de cultures.
58
– REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES :
Français :
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Liste des Figures :
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Figure N° 01 : L’organigramme de l’INPV Misserghin.
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Figure N° 02 : Variété d’olivier.
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Figure N° 03 : La production mondiale de l’huile d’olive.
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Figure N° 04 : Tavelure sur l’olivier.
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Figure N° 05 : Verticilliose de l’olivier.
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Figure N° 06 : Le chancre bactérien de l’olivier.
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Figure N°07 : Tumeurs dues au Pseudomonas savastanoi sur le tronc, les feuilles, les branches et
rameaux d’un arbre d’olivier.
•
Figure N° 08 : Bactérie Pseudomonas savastanoi.
•
Figure N° 09 : Cycle de la maladie.
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Figure N°10 : Coupe transversale d’une galle bactérienne évolutive sur un rameaux d’olivier.
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Figure N°11 : Dégâts sur fruits.
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Figure N°12 : Gamme de dilution de la souche bactérienne.
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Figure N°13 : Dépôt de la suspension bactérienne sur lames IF.
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Figure N°14 : Gamme de dilution.
•
Figure N°15 : Isolement de Pseudomonas savastanoi
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Figure N°16 : Observation microscopique à l’immersion de Pseudomonas savastanoi après
coloration de Gram (grossissement 1000).
•
Figure N°17 : Test catalase.
•
Figure N°18 : Aspect d’une crème bactérienne de Pseudomonas savastanoi sur le milieu Levane
•
Figure N°19 : Test de Hugh et Liefson.
•
Figure N°20 : Test Péctinase.
•
Figure N°21 : Test d’Arginine déxhydrolase.
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Figure N°22 : Hypersensibilité des feuilles de Tabac après inoculation bactérienne.
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Figure N°23 : Secteur de pourcentage des colonies dans les trois milieux (King B, LPGA,
Levane).
•
Figure N° 24 : Variation de la sensibilité en fonction des trois milieux (King B, LPGA, Levane).
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Figure N° 25 : l’aspect fluorescent des bactéries sur lame IF.
Liste des Tableaux :
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Tableau N° 01 : Les principaux pays producteurs de l’olivier dans le monde.
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Tableau N° 02 : Les différentes variétés d’oliviers produits par les pays du Maghreb .
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Tableau N° 03 : Concentration des bactéries sur lame IF.
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Tableau N° 04 : Estimation des concentrations des solutions mères après coloration des lames IF.
Technique Serologique : Immunofluorescence (IF) :
La base de ce test sérologique consiste en l’utilisation d’un anticorps spécifique à la bactérie
(antisérum), la visualisation des cellules bactérienne est rendue possible grâce à l’anticorps marqué à la
fluorescéine (IgG).
Méthode :
Purification de la crème bactérienne : centrifugation à 1200tr/mn pendant 10 minutes (3
répétitions).
Déposer 20µl de suspension purifiée/ puit (lames multi puits).
Mettre la lame sur une boite de pétri en verre.
Incubation à 50°c pendant 30 mn.
Fixer à l’alcool.
Sécher à l’air libre.
Déposer 20µl d’antisérum.
Incubation pendant 30 mn à température ambiante (à l’obscurité).
Laver avec du PBS en utilisant une pissette.
Sécher la lame à l’air libre.
Appliquer 20µl de conjugué (IgG).
Incubation pendant 30 mn à température ambiante (à l’obscurité).
Laver avec du PBS en utilisant une pissette.
Sécher la lame à l’air libre.
Observation au microscope photonique à fluorescence à un grossissement 100.
Matériels et réactifs :
Autoclave.
Etuve réglable.
Microscope à fluorescence (chambre noire).
Centrifugeuse.
Balance de précision
Micropipettes de 1000,50, 20 et 10µl
Lames pour IF
Agitateur à tube.
Agitateur magnétique.
Anse de platine.
Bec bunsen.
Pinces.
Scalpel
Portoir.
Flacons (pour la préparation des milieux).
Boites de Pétri stériles en verre.
Boites de Pétri en plastique
Tubes à essai à vise.
Tubes pour centrifugeuse.
Barreau magnétique.
Coton
Huile de vaseline.
Huile d’émersion.
Solution KOH 3%
Papier wattman.
Alcool 90°.
Ethanol 95°
Ethanol70°
Eau oxygénée
N, N Diméthyle paraphénylène diamine dihydrochloride
Plant de tabac
Composition des milieux cultures :
1-
Milieux L.P.G.A. (Levure-Peptone-Glucose-Agar)
Extrait de levure…………………………………………..05g
Peptone……………………………………………………05g
Gélose……………………………………………………..15g
Glucose……………………………………………………10g
Eau distillée………………………………………………..01l
2- Milieu de Hugh et Leifson : H & L
-
3-
Bacto peptone…………………………………………….02g
NaCL………………………………………………………..05g
KH2PO4………………………………………………….…0,3g
Glucose…………………………………………………….10g
Bleu de Bromothymol (BBM)………………………….0,03g
Eau distillée………………………………………………...01l
Milieu Levane :
Protéase peptone……………………………………………20g
Glycérine bidistillé (Glycérol) ..………………..……….…..10g
Potassium phosphate,dibasique K2HPO4……………….…1.5g
Sulfate de magnésium MgSO4, 7 H2O………………..…….1.5g
Agar bactériologique de type A ………………………..….15g
Eau distillée……………………………………………..…...01l
4- Milieu King B
- Protéase peptone n°3 ………………………………….... 20g
- Glycérine bi distillé (Glycérol) ………………………….10à15 ml
- Sulfate de magnésium (MgSO4,7 H2O) ……….. ………1.5g
- Potassium phosphate dibasique (K2HPO4) ………….…1.5g
- Agar bactériologique ……………………………………15g
- Eau distillée………………………………………………...01l
5- PBS
- NaCL………………………………………………..…08g
-
KH2PO4.......................................................................0,2g
Na2HPO4……………………………………………..1,15g
KCL……………………………………………………0,2g
Na2HPO4, 12H2O………………………………………3g
Eau distillée…………………………………………....01l
*Les milieux sont stérilisés à l’autoclave à 120° pendant 20mn.
Résumé
Pseudomonas savastanoi, pathovarsavastanoi, organisme de quarantaine, est l’agent causal du
chancre bactérien de l’olivier. Découverte au 4ème siècle par le grec Theophrastus, cette bactérie est
considérée comme le seul pathogène responsable de la formation des nécroses bactériennes appelées
communément tuberculose de l’olivier. Cette maladie est considérée comme un problème majeur par
son effet néfaste sur la croissance, le rendement et surtout la qualité de l’huile d’olive.
Aucun moyen de lutte curatif n’existe à ce jourcontre la nécrose bactérienne. Seul des techniques
préventives permettent de contenir la maladie. L’un des points clés de cette lutte est la production de
matériel de multiplication (bois et plants d’oliviers) indemne de cette bactérie afin d’éviter sa dispersion.
Pour cela, des méthodes analytiques de détection de Pseudomonas savastanoidoivent être
développées et adaptées à un travail de routine. La mise en œuvre d’une technique d’isolement sur
milieux de cultures et d’une technique sérologique « immunofluorescence », est envisageable dans ce
but.
Dans la présente étude, les protocoles existants relatifs à ces deux techniques ont été évalués sur
des macérâts contaminés.
La méthode d’ensemencement sur milieux de cultures présente l’avantage d’une grande facilité
de mise en œuvre. Cependant sa sensibilité, d’environ 105 ufc.ml-1 reste assez faible. C’est pourquoi
l’utilisation de la méthode d’immunofluorescence, dont la sensibilité est beaucoup plus fine, environ 103
ufc.ml-1, peut être envisagée afin de confirmer ou d’infirmer les résultats relatifs aux échantillons
apparaissant négatifs à l’isolement sur milieux gélosés.
Il faut noter qu’il s’agit d’un pathogène particulièrement virulent des oliveraies et qui se propage
facilement, il nécessite donc pour sa détection une téchnique très sensible et à moindre coût.
Mots clés :
Pseudomonas savastanoi; Tuberculose; Macérât; Bactérie de quarantaine; olivier; Détection; Colonie
bactérienne; Milieux de cultures; Isolement; Immunofluorescence.