03/02/14 TIBOURTINE Mehdi L2 AIH Pr. LA SCOLA

AGENTS INFECTIEUX, HYGIENE, ASPECTS GENERAUX - Anatomie, physiologie, taxonomie et génétique bactérienne
03/02/14
TIBOURTINE Mehdi L2
AIH
Pr. LA SCOLA
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14 pages
Anatomie, physiologie, taxonomie et génétique bactérienne
Plan
A. Introduction
B. La membrane plasmique
C. La paroi
D. Le glycocalyx
E. La capsule bactérienne
F. Les appendices bactériens externes
G. Composition du cytoplasme
H. Le génome bactérien
I. Les endospores, formes de résistance
J. Nutrition et croissance bactérienne
K. Génétique bactérienne
A. Introduction
•
Deux formes principales :
– Coccis (forme arrondie)
– Bacilles (forme allongée)
•
Variété presque infinie de morphologies : vibrions, spirales, mycelium …
•
Arrangements caractéristiques :
– Paires
– Chaînes
– Grappes
– Tétrades
•
Taille très variable : 0,1μm à 10μm
✔ Les bactéries géantes :
– Epilopiscium fishelsoni (80/600μm)
– Thiomargarita namibiensis (750μm)
✔ Les « nanobactéries »:25-200 nm
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Structure cellulaire schématique
Constitution d'une bactérie :
Cytosol entouré d'une membrane , elle-même entourée d'une paroi.
Autour de la paroi, il y a parfois une capsule ou glycocalyx.
Des échanges entre les milieux intérieur et extérieur se font via la membrane plasmique.
Appendices externes longs (flagelle) ou courts (pilis).
A l'intérieur on trouve le nucléoïde, le cytosol, des ribosomes et des vésicules.
Membrane cytoplasmique : limite mécanique, barrière perméable sélective, permet le transport d’éléments, les
processus métaboliques, le chimiotactisme.
Paroi : forme de la bactérie, solidité, protection.
Capsule : résistance à la phagocytose, adhérence.
Endospore : résistance, survie en milieu extrême.
Pilis, fimbriae : attachement aux surfaces, conjugaison bactérienne.
(ex : chez E.coli, ce sont des facteurs de pathogénicité)
Flagelle : mobilité.
Nucléoïde : matériel génétique.
Vacuoles gazeuses, ribosomes, inclusions...
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B. La membrane plasmique
Elle est présente chez toute les bactéries (structure obligatoire) :
– Mosaïque fluide (Singer et Nicholson)
– Bicouche lipidique semi-perméable (phospholipides) (10nm)
– Pas de stérols ni de lécithine
– Protéines avec plusieurs fonctions : transporteurs, récepteurs, métabolisme énergétique (ex:
mitochondrie)
C. La paroi
Généralités :
– structure quasi-obligatoire (absente chez les Mycoplasmes)
– enveloppe rigide
– assure l’intégrité de la bactérie (protection)
– responsable de sa forme (cocci, coccobacille, bacille, spirille)
Structure variable :
– Gram+ (épaisse)
– Gram- (fine)
– mycobactéries (paroi Gram+ avec cires (acides mycoliques et arabinogalactanes)).
Composant commun : peptidoglycane (absent des Eucaryotes et Archées), cible des antibiotiques
(ex: pénicilline).
I. Composition de la paroi des bactéries à Gram positif :
→ Peptidoglycane +++ 20-80 nm
→ Acides teichoïques (charge -) :
– Polymères de glycérol ou de ribitol
– Phosphorylés
– Fixés sur NAG du peptidoglycane
→ Acides lipoteichoïques (charge -) :
Fixés sur des glycolipides membranaires
→ Polysaccharides neutres.
→ Protéines et enzymes.
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II. Composition de la paroi des bactéries à Gram négatif :
→ Périplasme
→ Peptidoglycane et protéines (3 nm)
→ Membrane externe (7-8 nm) :
– Feuillet externe : lipopolysaccharide LPS ou endotoxine (pyrogène +++).
– protéines : porines (canaux, pénétration de certains antibiotiques), lipoprotéines, récepteurs.
III. Composition de la paroi des Mycobactéries :
→ Peptidoglycane++
→ Cires (étanches, hydrophobes) :
– acide mycoliques
– arabinogalactanes
Propriétés de la paroi des Mycobactéries :
– résistance à l'environnement, à la phagocytose,
– acido-alcoolo résistance (coloration de Ziehl-Nielsen).
IV. La coloration de Gram
Les bactéries sont fixées sur une lame de verre :
✔ Coloration au cristal violet (aniline)
✔ Insolubilisation au Lugol (iode)
✔ Décoloration à l'alcool/acétone
✔ Recoloration à la fuchsine/safranine
✔ Lecture au microscope optique (x1000)
→ violet : Gram +
→ rose : Gram -
V. Conclusions sur la paroi bactérienne
•
Taxonomie : Bactéries à Gram + ou -
•
Diagnostic :
– Examen direct : forme, Gram, mobilité
•
Thérapeutique :
– Cibles des antibiotiques
– Cibles de phages
– Cibles du système immunitaire/vaccin
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D. Le Glycocalyx (~« colle biologique »)
•
•
•
•
•
Très fréquent
Réseau de polysaccharides entourant la paroi, recouvrant la surface des bactéries
Rôle dans l’adhésion sur cellules ou supports inertes +++
Protection contre la dessiccation
Modification de l’environnement :
– Concentration des micronutriments
– Limitation du contact avec les antibiotiques
E. La capsule bactérienne
C'est un glycocalyx structuré et dense, sa présence est inconstante.
Elle est composée de :
– Polysaccharides acides : acides uroniques (galacturonique,
glucuronique, hyaluronique)
– Polymères ramifiés
– Eau (98%) et cations divalents
– +/- polypeptides (ex : B. anthracis)
Présente l'aspect d'un gel.
Mise en évidence d'une capsule bactérienne :
• Aspect muqueux des colonies bactériennes (lisses, brillantes)
• Coloration à l'encre de Chine : le fond devient noir et la capsule apparaît en blanc :
• Utilisation d'anticorps anti-capsules (vaccin)
• Microscopie électronique
Propriétés de la capsule bactérienne :
• Réversible, exprimée ou non en fonction des conditions de l’environnement,
• Facteur de virulence majeur,
• Permet l'adhésion à certains supports,
• Résistance aux défenses de l’hôte et à la phagocytose (ex : S.pneumoniae),
• Possède des antigènes qui permettent de générer des vaccins,
• Résistance à la dessiccation et à l’environnement.
Remarque : La majorités des bactéries capables de donner une méningite (traversent la barrière hématoencéphalique) possèdent une capsule.
F. Les appendices bactériens externes
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Ils sont fixés aux membranes et à la paroi bactérienne (flagelles, pili).
Les flagelles :
– Assurent la mobilité de la bactérie
– Sont visible en microscopie optique après coloration (20nm de diamètre, 15 à 20μm de long).
– Long et fin filament : une protéine : la flagelline ; antigène H (AgH).
Les pili sexuels Cf génétique bactérienne
Les pili classiques (ou fimbriae) :
– Nombreux sur les bactéries à Gram– Fibrillaires, rigides, protéiques
– Rôles dans l’adhésion (colonisation)
– Mobilité saccadée (P.aeruginosa, N.gonorhoeae, E.coli)
– Mobilité par glissement (Myxococcales)
G. Composition du cytoplasme
C'est un milieu aqueux avec différentes protéines et acides nucléiques, un cytosquelette et un système de
traduction (ribosome, ARNm), pas de structure membranaire complexe (pas de noyau…).
H. Le génome bactérien
Les bactéries possèdent deux structures supports de l'information génétique :
➢ Le chromosome bactérien
- Le plus souvent unique et circulaire,
- ADN bicaténaire (0,15 à 12Mb), formant un nucléoïde (chromosome superenroulé+protéines+ARN+
enzymes) visible en microscopie électronique.
➢ Les plasmides
- ADN circulaires++ (ou linéaires) de taille réduite,
- Extra chromosomique,
- Réplication autonome,
- Non indispensables à la survie bactérienne,
- Nombre de copies élevé ou contrôlé,
- Incompatibilité pour des plasmides similaires.
Les fonction des plasmides :
• Synthétisent les pili sexuels
• Portent des gènes qui sont des facteurs de virulence, des toxines, des bactériocines (toxiques pour
les bactéries)
• Résistance aux antibiotiques et à l’environnement (donc une bactérie à la base non résistante peut
le devenir en absorbant un plasmide possédant des gènes de résistance aux antibiotiques)
• Capacités métaboliques inhabituelles (dégradation de toluène, pesticides... ; fixation d'azote)
• Très utiles en microbiologie et génétique : construction et transfert de nouvelles combinaisons,
clonage de gènes, réplication indépendante du chromosome → nombreuses copies dans une seule
cellule.
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I. Génome bactérien : base actuelle de la taxonomie bactérienne
But de la classification : « attribuer une identité à un objet »
Taxonomie : « délimitation de groupes de microorganismes »
Nomenclature : « permet de donner un nom à un individu ou groupe d'individus »
En pratique :
– Médias permettant l'identification d'un nouvel individu.
– Médias permettant une communication rapide et claire entre biologiste et clinicien.
II. Taxonomie bactérienne : nomenclature
lignée......classe, famille, genre, espèce
Pratique : Genre espèce
– Latin italique
– Genre : majuscule
– Exemple : Staphylococcus aureus
Sous espèce :
– pas de définition formelle
– Souvent « pathovar »
– ex : Francisella tularensis tularensis
Francisella tularensis holarctica
Sérotype :
– Rarement utilisé
– Salmonella enterica a plusieurs sérotypes, certains sont pathologiques
– Sérotype Typhi ( Salmonella enterica de sérotype Typhi → fièvre typhoïde chez l'Homme)
– Appelé par abus Salmonella Typhi (“Typhi” est le sérotype et pas l'espèce)
III. Taxonomie phénotypique
•
•
•
Caractères culturaux
Caractères microscopiques (Gram +/-...)
Métabolisme :
– Recherche d’enzymes
– Assimilation ou fermentation de sucres :
- voie d’attaque du glucose
- fermentation des hydrates de carbone
- auxonogramme : eau, sels minéraux, azote, facteurs de croissance + sucre
– Recherche de métabolites intermédiaires.
IV. Taxonomie génotypique
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•
Hybridation ADN-ADN : Notion d’espèce en bactériologie :
– Technique
– Définition : deux bactéries appartiennent à la même espèce si leurs génomes s'hybrident à plus
de 70% et si les hybrides sont stables (∆Tm < 5°c).
•
Séquençage des gènes
•
Technique : PCR + séquençage automatique
•
Choix de la cible :
Gène de l'ARN 16S ribosomique (1500 pb),c'est un gène universel fait d'une succession de régions très
conservées et très variables. En pratique, avec deux amorces de PCR, on va pouvoir amplifier et séquencer le
gène 16S de toutes les bactéries existantes. En revanche, la séquence de ce gène est spécifique à une espèce (la
plupart du temps) ou au moins du genre.
En pratique, deux bactéries qui ont une similarité dans le gène 16S inférieure à 98,5% ne sont
probablement pas de la même espèce.
I. Les endospores, formes de résistance
•
Structure reproductive très résistante dans l’environnement
→ chaleur, UV, désinfectants, froid, dessiccation, vide…
•
Visible en microscopie optique (bleu de méthylène).
•
Uniquement
– pour les espèces dites sporulées.
– dans un environnement défavorable.
Structure intracellulaire shématique : endospores
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•
•
Importance pratique en microbiologie alimentaire, industrielle et médicale :
– Stérilisation via : chaleur, UV, radiations gamma, stérilisation chimique, dessication.
–
Certaines espèces sont dangereusement pathogènes (ex : B. anthracis).
–
Problématique de stérilisation : autoclave (Température supérieure à 100°C et sous pression).
Coloration de Gram : zones incolores dans les bactéries colorées :
Spores de Bacillus anthracis (charbon)
J. Nutrition et croissance bactérienne
Plusieurs conditions sont nécessaires à la culture des bactéries :
1. Nutriments (oses, acides aminés, lipides...)
2. Conditions environnementales :
– température
– pH
– pression osmotique
– pression partielle en oxygène
→ Définitions de milieux et de conditions de cultures.
I. Les nutriments
Les nutriments sont directement assimilables et sont nécessaires à l'entretien et la croissance.
Besoins élémentaires : C, H, O, N, S, P, Fe, Ca, Mg, K… (95% poids sec)
–
Bactéries hétérotrophes : nécessitent du carbone organique
–
Bactéries autotrophes et lithotrophes : utilisent directement les composés minéraux (CO2, N…)
Besoins spécifiques de certaines bactéries :
–
–
Facteurs de croissance (acides aminés, vitamines, bases, Fer)
(Bactéries auxotrophes : besoin d’apport extérieur de facteurs de croissance
Bactéries prototrophes : pas de besoins spécifiques).
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Besoins énergétiques :
–
–
–
Pour la synthèse d’ATP, G6P, …
Utilisation du glucose le plus souvent
Bactéries chémotrophes : oxydoréduction
(Bactéries phototrophes : photosynthèse).
II. Les conditions environnementales
1. Température
Optimum thermique
– Thermophiles : ≥ 40°C
– Mésophiles : 20-40°C (++ pathogènes pour l’Homme)
– Psychrophiles : ≤ 20°C
– Cryophiles : ± 4°C (Listeria monocytogenes)
Température d’inactivation des bactéries: stérilisation
– Ebullition : inactive sur endospores
– Autoclavage (121°C, pression, ≥ 20 mn)
– Pasteurisation (71.7°C, 15 sec)
– UHT (>135°C, 2 à 5 sec)
– Flammes (bec bunsen)
2. pH
–
–
–
Neutre ou légèrement alcalin le plus souvent (pH 7,5) : neutrophiles.
Bactéries acidophiles : milieux acides (yaourts, …).
Bactéries alcalinophiles : milieux alcalins (vibrion cholérique).
3. Pression osmotique
Tolérance aux sels :
– Bactéries halophiles : milieux hypertoniques, riches en NaCl
– Bactéries hyperhalophiles : milieux très riches en NaCl (20-30%)
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4. Pression partielle en Oxygène
➢ Comportement des bactéries face à l ’Oxygène : lié aux métabolismes énergétiques
–
–
Oxygène nécessaire
- Métabolisme aérobie : respiration
Oxygène non nécessaire
- Métabolisme fermentatif
- Métabolisme anaérobie
➢ Comportement des bactéries face à l ’Oxygène : lié à la toxicité de l’Oxygène
•
Pas de toxicité pour les bactéries
– aérobies
– aéroanaérobies facultatives
– anaérobies possédant une superoxyde dismutase (SOD) : aérotolérantes
•
Toxicité pour les bactéries
– anaérobies strictes (sans SOD)
– microaérophiles
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III. Cycle de réplication cellulaire bactérienne : 3 phases
Phase C : réplication chromosomique, synthèse de l'ADN
Phase G : latence, ségrégation chromosomique
Phase D : division
Croissance bactérienne : exponentielle (2n), le temps de doublement (td) est variable selon les bactéries :
– Pseudomonas aeruginosa = 10 mn
– Escherichia coli = 20 mn
– Mycobacterium tuberculosis = 18 - 27 h
– Mycobacterium leprae = 10 - 20 j
IV. Culture sur milieu solide
•
Géloses nutritives
•
Durée de la culture ( ≥ 18 h)
•
Formation de colonies visibles à l’oeil nu (les colonies ont différentes formes selon les bactéries)
V. Les milieux de culture
•
Supports nutritifs stériles
•
Liquides : bouillons
•
Solides : géloses (boîte de Petri)
•
En fonction de l’utilisation: 3 types de milieux
Milieux d’enrichissement
Milieux d’isolement ± sélectifs
Milieux d’identification
Milieux d’isolement ± sélectifs :
✔ Milieux d’isolement non sélectifs (milieu non stérile) :
–
–
–
–
Gélose nutritive ordinaire
Gélose au sang (hémolyse)
Gélose au sang cuit (chocolat)
Gélose BCP (Bromocrésol pourpre, utilisation du lactose).
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✔ Milieux d’isolement sélectifs (milieu stérile) :
–
Mc Conkey : sels biliaires + cristal violet
Inhibe la flore G+
Isolement de BGN, colonies rouges lactose +
–
Chapman : très concentré en NaCl,
Isolement de Staphylocoques
Fermentation du mannitol : rouge → jaune (S. Aureus)
–
Cetrimide : antiseptique (cétrimide) + acide nalidixique
Isolement sélectif de Pseudomonas aeruginosa
Coloration jaune = pyoverdine
Coloration bleu= pyocyanine
✔ Milieux d’isolement sélectifs : coprocultures
–
Hektoen : isolement de BGN
Fermentation du lactose et saccharose (+ = jaune, - = bleu vert)
Colonies jaune saumon : E. coli, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter, Serratia
Colonies jaunes saumon à centre gris : Proteus vulgaris
Colonies vertes à centre noir : P. mirabilis, Salmonelle
Colonies bleues/vertes : Shigella, Morganella, Providentia
Colonies bleuâtre oxydase+ : Pseudomonas
–
Drigalski : BGN non exigentes
Desoxycholate de Na et cristal violet: inhibe les G+
Fermentation du lactose (+ = jaune, - = bleu)
✔ Isolement en condition respiratoires particulières :
–
–
Culture de bactéries anaérobies strictes en jarre.
Culture de bactéries anaérobies strictes en sachet plastique et en atmosphère contrôlée.
Milieu d’identification
•
Drigalski (sels biliaires + cristal violet + lactose + indicateur de pH).
•
Milieu de Chapman (hypersalé + mannitol + indicateur de pH).
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K. Génétique bactérienne
I. Introduction
Le génome bactérien :
a. Réplicon ADN :
– Possède une origine de réplication (ori)
– Capable d’auto-réplication
– Chromosome
– Plasmide (s) : ADN extrachromosomique
b. Séquence d’ADN :
– GC%
– Séquence nucléotidique (H. Influenza – 1995)
c. Organisation des gènes :
– Regroupement en îlots des opérons, ou gènes de fonctions apparentées
– Orientation dans le sens de la réplication pour les gènes les plus transcrits.
Variations phénotypiques = comportement de la bactérie
Elles peuvent résulter de l’adaptation de l’ensemble d’une population bactérienne ayant le même génotype, à
diverses conditions extérieures.
Variations génétiques = affectent le génome bactérien.
Les agents mutagènes:
•
•
Agents chimiques:
– Modification de base
– Agents intercalants (BET)
– Analogues de bases (5- bromo-uracile)
Agents physiques:
– Rayons X
– Rayons UV (dimères thymine)
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II. Les variations génétiques par mutation
1. Caractère de la mutation génétique bactérienne
•
•
•
•
•
•
•
•
Changement spontané (hasard) ou provoqué par un agent mutagène
Héréditaire (stable)
Brusque (discontinu)
Rare (10-6 à 10-9)
Indépendant dans les caractères d’une bactérie
Elle est liée à une modification du génome bactérien : ADN
Spécificité – indépendance : la probabilité pour une bactérie de subir simultanément deux mutations
distinctes est le produit des probabilités individuelles de ces mutations (traitement antituberculeux)
Mécanisme mineur d’évolution bactérienne, sauf pour la résistance aux antibiotiques.
2. La mutation à l'échelon moléculaire
Les modifications portées par l’ADN peuvent être :
– la perte
– l’addition
– le remplacement
• Soit d’une base en un point donné: mutation ponctuelle
• Soit d’une séquence de bases: remaniement génomique
✗
Les mutations ponctuelles
Les mutations peuvent être des accidents de copie au cours:
– de la réplication de l’ADN
– de remaniement de l’ADN
– de la réparation de l’ADN
Les types de mutations :
– Substitution
– Délétion
– Insertion
– Inversion
Les mutations sans changement du cadre de lecture :
– Conservatrices (synonymes)
– Faux sens (non synonymes)
– Portant sur le codon STOP.
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Les mutations avec changement du cadre de lecture :
– déphasages
Additions ou délétions de bases:
– altèrent le cadre de lecture de l’ARN messager
– Modifications de la séquence en acides aminés de la protéine
✗
Remaniement génomique : délétion ou insertion d’une séquence
•
Délétion : suppression d’un ou de plusieurs nucléotides dans la séquence primaire d’un acide nucléique.
– De 1 ou 2 nucléotides : décalent le cadre de lecture.
– De 3 nucléotides : suppression d’un acide aminé dans la protéine exprimée.
– De grande longueur: peuvent supprimer l’expression d’un ou plusieurs exons, voire d’un gène entier.
•
Insertion : addition d’un ou de plusieurs nucléotides dans la séquence primaire d’un acide nucléique.
– De 1 ou 2 nucléotides : décalent le cadre de lecture.
– De 3 nucléotides : addition d’un acide aminé dans la protéine exprimée.
– De grande longueur : peuvent modifier la traduction des exons.
(la suite au prochain cours du Pr LA SCOLA)
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