bioremediation des sols pollués aux hydrocarbures
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MASTER 2 – 2014 BIOLOGIE GESTION MARKETING UNIVERSITE DE RENNES 1, UFR SVE SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE BIOREMEDIATION DES SOLS POLLUÉS AUX HYDROCARBURES Les hydrocarbures aromatiques et les alcanes AUTEUR : GAUDU FLORIAN TUTEUR : ERMEL GWENNOLA EA 1256 : Microbiologie et Risques Infectieux REMERCIEMENTS J’adresse mes remerciements à Mme Gwennola Ermel, professeur d’Université à l’université de Rennes 1 et chargée de Recherche à l’AFSSA. En tant que tuteur de cette synthèse bibliographique, elle m’a guidé dans mon travail. Je la remercie également pour sa disponibilité. Notes des responsables du diplôme : «Le tuteur chercheur a pour rôle de conseiller l'étudiant, l'orienter dans ses recherches bibliographiques, l'aider à comprendre les articles, en faire une synthèse de manière logique et rigoureuse. Il ne peut vérifier toutes les citations et interprétations de l'étudiant. Il ne peut donc s'engager vis à vis d'éventuelles erreurs ». Master Biologie Gestion - SBBB - Gaudu Florian Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures 2 BIOREMEDIATION DES HYDROCARBURES AROMATIQUES Résumé L’impact de la pollution par les hydrocarbures est de plus en plus important. Il est donc nécessaire de décontaminer des milieux pollués. La bioremédiation s’avère être une alternative très intéressante. Cette étude définit une liste incomplète de bactéries dégradant les hydrocarbures et notamment les hydrocarbures aromatiques et alcanes. En s’intéressant aux mécanismes de dégradation des hydrocarbures en milieu aérobie et anaérobie, cette synthèse tient aussi compte des différents paramètres pouvant influencer cette biodégradation. La diversité des hydrocarbures ainsi que celle des bactéries rend la mise en place des méthodes de biodégradation très difficile. Cependant, ces diversités offrent aussi de nombreuses perspectives. Certaines bactéries dégradent spécifiquement certains hydrocarbures dans des conditions bien précises. Ainsi, les perspectives de la bioremédiation sont très vastes. Sommaire Introduction ............................................................................................................................................ 4 I. Pollution et dépollution des sols ..................................................................................................... 5 Les polluants des sols ......................................................................................................................... 5 Les hydrocarbures .............................................................................................................................. 5 La Bioremédiation des sols ................................................................................................................ 7 II. Dégradation microbiologique des polluants hydrocarbonés ........................................................... 9 Bactéries dégradant les hydrocarbures ............................................................................................... 9 Mécanismes généraux de biodégradation des hydrocarbures ........................................................... 10 III. Dégradation des hydrocarbures aromatiques ............................................................................ 11 Les hydrocarbures aromatiques ........................................................................................................ 11 Bactéries dégradant les hydrocarbures aromatiques ......................................................................... 11 Mécanismes de dégradation des hydrocarbures aromatiques ............................................................ 14 Conditions influençant la biodégradation des hydrocarbures mono-aromatiques ............................. 19 IV. Dégradation des alcanes ........................................................................................................... 21 Les alcanes ....................................................................................................................................... 21 Bactéries dégradant les alcanes ........................................................................................................ 21 Mécanismes de dégradation des alcanes ........................................................................................... 22 Conclusion ........................................................................................................................................... 24 Bibliographie ........................................................................................................................................ 25 Master Biologie Gestion - SBBB - Gaudu Florian Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures 3 Introduction La décontamination des sols pollués est aujourd’hui devenue une nécessité croissante. Les zones désaffectées sont vouées à être requalifiées et parallèlement à cela, les réglementations concernant la pollution des sols sont de plus en plus nombreuses. De plus, la diversité des polluants et donc leurs propriétés physico-chimiques accentuent la difficulté de cette décontamination. C’est pour cela que, malgré certains risques fonciers dus à des méthodes pas encore maîtrisées, nombre d’entreprises se sont lancées dans ce projet. Plusieurs voies d’élimination des hydrocarbures polluants les sols sont étudiées. Le lessivage par l’eau ou encore la bio-augmentation endogène sont des méthodes peu efficaces voire négligeables. A l’inverse, la biodégradation par des souches exogènes est la principale voie étudiée. Cependant, les microorganismes dégradant les hydrocarbures ne sont pas encore tous connus. Les mécanismes de dégradation utilisés par les bactéries sont aussi très étudiés. Cette synthèse bibliographique traitera tout d’abord de généralités concernant la pollution et la dépollution des sols. Après avoir décrit la dégradation microbiologie des hydrocarbures au sens large, une partie sera consacrée à la biodégradation des hydrocarbures aromatiques, principaux hydrocarbures polluants les sols. Enfin, une présentation de la dégradation des alcanes viendra compléter cette synthèse. Master Biologie Gestion - SBBB - Gaudu Florian Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures 4 I. Pollution et dépollution des sols Les polluants des sols Les polluants des sols sont très variés et sont aussi souvent toxiques pour l’homme (Roger et Jacq, 2000). A l’instar des pesticides, des phtalates, de solvants chlorés, de l’azote, de certains éléments traces comme le cuivre, le mercure ou l’argent, les polluants peuvent à la fois être présents naturellement dans les sols ou être le résultat d’activités humaines. Les hydrocarbures constituent la classe de polluants qui nous intéressent dans le cadre de cette synthèse. Ils sont en effet la source de nombreuses préoccupations pour les entreprises exerçant dans le secteur pétrolier. Les hydrocarbures Composés exclusivement d’atomes de carbone et d’hydrogène, les hydrocarbures sont donc des composés organiques de formule brute : CnHm où n et m sont des entiers naturels. De par leur abondance naturelle, ils font partie des produits chimiques les plus importants pour l’humanité et sont notamment utilisés comme source d’énergie primaire (Chakraborty et Coates, 2004). Ces hydrocarbures sont souvent classés selon leur nature. On distingue ainsi les hydrocarbures saturés et insaturés. Ceux-ci peuvent être linéaires, ramifiés ou cycliques. Leur structure moléculaire varie et influe sur les propriétés de ces hydrocarbures. Plus le nombre de carbones est important, plus la masse volumique, le point de fusion et le point d’ébullition seront, d’une manière générale, élevés (Tarayre 2012). On distingue donc parmi les hydrocarbures : les alcanes, les alcènes et alcynes et les composés aromatiques. Les alcanes (méthane, éthane, propane, butane, etc.) sont composés de liaisons simples, qu’elles soient aliphatiques ou cycliques (cours BTS BTP 1ère année). Les alcènes (éthylène, propène, butène, etc.) comportent des doubles liaisons carbone-carbone alors que les alcynes en comportent des triples. Les composés aromatiques possèdent des cycles à doubles liaisons alternées (Tarayre 2012). Master Biologie Gestion - SBBB - Gaudu Florian Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures 5 Les hydrocarbures sont formés à partir de biomasse (Figure 1). Outre les composés soufrés par exemple, 80% du pétrole sont constitués d’hydrocarbures saturés et aromatiques (Tableau 1) (Tarayre 2012). Figure 1 : Formation des hydrocarbures Hydrocarbures pétroliers saturés Paraffines linéaires Paraffines ramifiées Cyclo-paraffines monocycliques Cyclo-paraffines polycycliques Hydrocarbures aromatiques Molécules mono-aromatiques Molécules poly-aromatiques Tableau 1 : Différents types d’hydrocarbures pétroliers saturés et aromatiques Il existe différents types de carburants. Les essences sont par exemple composées de 35% d’alcanes, 36% de BTEX, 9% de n-alcanes, 4% d’alcènes, 2% de cyclo-alcanes et enfin 14% d’autres composés aromatiques. Le diesel, combustible employé comme carburant est composé de 46% d’iso-alcanes et cyclo-alcanes, 24% de n-alcanes et 30% d’autres composés aromatiques (Colombano, Présentation du guide BRGM). Le naphtène constitue la majeure partie des cyclo-alcanes présents dans le diesel. Plus les hydrocarbures pétroliers sont composés d’atomes de carbone, plus la solubilité, la volatilisation et surtout la biodégradabilité diminuent. En revanche l’adsorption augmente si le nombre d’atomes de carbone est élevé (Colombano, Présentation du guide BRGM). Étant une source d’énergie fondamentale, les hydrocarbures sont aussi une source de pollution importante. Dans cette synthèse, nous allons nous focaliser principalement sur les hydrocarbures mono et poly-aromatiques. Ces hydrocarbures sont en effet les plus répandus dans l’environnement (Cao et al. 2009). Master Biologie Gestion - SBBB - Gaudu Florian Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures 6 La Bioremédiation des sols En fonction de la localisation du site, de son usage futur ou du coût, certains sites pollués peuvent ne pas être décontaminés. Lorsqu’ils sont dépollués, les sols peuvent être soumis à des traitements chimiques, physiques ou biologiques. Ces derniers utilisent l’action de microorganismes ou de végétaux pour dépolluer les sols. Il s’agit donc de la bioremédiation. Jugée rentable et efficace contre l’élimination de composés pétroliers et notamment des hydrocarbures BTEX, la bioremédiation est de plus en plus utilisée (Tarayre 2012 ; Mi Jin et al. 2013). Types de bioremédiation Plusieurs techniques de bioremédiation sont connues. Grâce à une dégradation par la microfaune ou d’autres processus naturels (dilution, absorption, évaporation), la teneur en polluants des sols peut diminuer. Réalisée par l’intermédiaire d’actions de microorganismes ou de plantes, cette dégradation naturelle est appelée l’atténuation naturelle. Des microorganismes exogènes, parfois génétiquement modifiés, peuvent être nécessaires à la dépollution de sols. Cette technique, la bio-augmentation, repose sur la capacité de certains microorganismes à minéraliser, décomposer ou transformer des contaminants en substances moins nocives. Pouvant être employée isolément ou simultanément, la bio-stimulation peut par exemple consister en l’apport de nutriments et de surfactants accompagnés d’oxygène dans le sol (bioventing) ou encore dans des eaux souterraines (biosparging) (Tarayre 2012). Enfin, l’utilisation de bio-surfactants comme la surfactine est parfois intéressante. La surfactine est considérée comme le bio-surfactant le plus efficace. Cette molécule est un lipopeptide permettant par exemple de réduire la tension de surface de l’eau et faciliter la biodégradation des hydrocarbures saturés et aromatiques. De plus, la surfactine est produite par de nombreux microorganismes et est biodégradable (Sponza et Gok 2011 ; Tarayre 2012). Master Biologie Gestion - SBBB - Gaudu Florian Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures 7 Facteurs influençant la biodégradation Les propriétés physico-chimiques telles que la densité, la solubilité ou le coefficient de partage influent par exemple sur cette biodégradabilité. Le coefficient de partage correspond au rapport des concentrations en substances polluantes absorbées par le milieu récepteur et la concentration de substances polluantes dissoutes dans le fluide. Cependant, la biodégradation des hydrocarbures dépend de nombreux paramètres comme la température ou la présence d’eau dans les sols. Ainsi, il est important de connaître la structure et la nature du sol. L’humidité, la salinité, le pH, le taux d’oxygène ainsi que la composition chimique sont des paramètres à suivre. En effet, ceux-ci doivent permettre une efficacité optimale des microorganismes et donc se rapprocher au maximum des conditions optimales de croissance de ces microorganismes (Bouderhem 2011). Malgré la diversité des hydrocarbures et par conséquent de leur biodégradabilité, cette dernière est soumise à quelques règles. Plus la chaîne d’un hydrocarbure aromatique sera longue, plus sa biodégradabilité sera difficile. Concernant les solvants chlorés, ils sont d’autant plus dégradables s’ils ne comportent que très peu d’atomes de chlore. Plus l’hydrocarbure comportera de cycles, plus sa biodégradabilité sera importante (Tarayre 2012). La biodégradation des hydrocarbures est aussi plus importante lorsque l’on sélectionne au préalable un consortium bactérien adapté aux polluants (Mazzeo et al. 2010). Dans un milieu pollué par de l’essence sans plomb, un consortium contenant des bactéries des genres Pseudomonas, Shewanella, Burkholderia, Alcanivorax, Rhodococcus et Bacillus, est capable de dégrader 95% des hydrocarbures BTEX présents dans le milieu (Morlett-Chávez et al. 2010). Malgré des conditions optimales à l’activité des microorganismes, la concentration en polluant peut en effet être toxique si celle-ci est trop élevée. Le carbone des hydrocarbures jouant le rôle de substrat pour la croissante des microorganismes, la concentration en polluant ne doit pas non plus être trop faible. Les hydrocarbures doivent être en solution, disponibles pour les microorganismes (Tarayre 2012). Enfin, l’apport en nutriments ainsi que la disponibilité en oxygène peuvent faciliter la biodégradation des hydrocarbures. D’autres molécules peuvent jouer le rôle d’accepteurs d’électrons comme les nitrates ou les sulfates par exemple. C’est pour cela que cette synthèse traitera à la fois de la biodégradation aérobie et anaérobie. Master Biologie Gestion - SBBB - Gaudu Florian Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures 8 II. Dégradation microbiologique des polluants hydrocarbonés Bactéries dégradant les hydrocarbures Outre les bactéries, les champignons sont aussi capables de dégrader les hydrocarbures. En revanche, la culture de bactéries étant plus rapide, ajouté au fait que les bactéries assimilent mieux certaines molécules, l’usage de ces dernières est préféré. Dans cette optique, cette synthèse traitera donc des bactéries dégradant les hydrocarbures. Lorsque l’on nomme les bactéries capables de dégrader les hydrocarbures, presque tous les clades phylogénétiques sont représentées. Aussi, on retrouve aussi bien des bactéries Gram négatives que des bactéries Gram positives (Técher 2011). De nombreux genres bactériens ont été recensés et décrits comme aptes à dégrader des hydrocarbures : (Morlett-Chávez et al. 2010 ; Tarayre 2012). - Aeromonas - Corynebacterium - Myxobacterium - Acetobacter - Cycloclasticus - Nocardia - Achromobacter - Cytophaga - Peptococcus - Acinetobacter - Erwina - Pseudomonas - Actinomyces - Flavobacterium - Rhodococcus - Alcaligenes - Klebsiella - Sarcina - Alcanivorax - Lactobacillus - Serratia - Bacillus - Leucothrix - Shewanella - Beneckea - Micrococcus - Spherotilus - Brevibacterium - Moraxella - Xanthomonas - Burkholderia - Mycobacterium Certaines espèces bactériennes sont capables de dégrader des hydrocarbures précis dans des conditions précises. Geobacter metallireducens est ainsi capable de dégrader le toluène en anaérobie. Master Biologie Gestion - SBBB - Gaudu Florian Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures 9 Mécanismes généraux de biodégradation des hydrocarbures Trois voies permettent aux bactéries de capter les polluants : - La solubilisation : possible pour les hydrocarbures de faible poids moléculaire - Formation de microgouttelettes - Formation de macrogouttelettes Les bactéries aérobies commencent par consommer la matière organique en présence d’oxygène. En effet, les sources d’énergie et de carbones sont alors la matière organique. L’accepteur final est l’oxygène qui est ainsi réduit en eau. Les bactéries capables de réaliser cela sont donc des bactéries dites aérobie strictes (AS) et/ou des bactéries aérobie-anaérobie facultatives (AAF). Lorsque la teneur en oxygène est réduite, on retrouve davantage de bactéries aérobi-anaérobie facultatives (l’accepteur final d’électrons peut alors être une molécule endogène) et des bactéries micro-aérophiles. Celles-ci peuvent utiliser l’oxygène mais aussi d’autres éléments tels que les nitrates, les sulfates ou encore l’oxyde de fer. Dans un milieu anaérobie (l’oxygène n’est plus présent), les bactéries présentes sont donc des bactéries anaérobies strictes. La consommation d’oxygène n’étant plus possibles, les nitrates, les sulfates ou l’oxyde de fer peuvent ensuite jouer le rôle d’accepteurs d’électrons. (Tarayre 2012). La diversité des bactéries permet de dénombrer un grand nombre de facteurs permettant l’assimilation d’hydrocarbures et notamment d’hydrocarbures aromatiques qui sont des substances hydrophobes. La production de bio-surfactants, d’émulsifiants, de stabilisants, les mécanismes d’endocytose ou des processus d’attraction (chimiotactisme) par exemple expliquent parfois la capacité de certaines bactéries à dégrader les hydrocarbures (Técher 2011). La biodégradabilité des hydrocarbures pétroliers est fonction de certains paramètres. Elle augmente si l’aromaticité de l’hydrocarbure est importante. A l’inverse, elle diminue si le nombre d’atomes de carbone est important et si les ramifications et cyclisations le sont aussi (Colombano, Présentation du guide BRGM). Master Biologie Gestion - SBBB - Gaudu Florian Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures 10 III. Dégradation des hydrocarbures aromatiques Les hydrocarbures aromatiques Les hydrocarbures mono-aromatiques Le benzène, le toluène, l’éthylbenzène et les xylènes (BTEX) sont des composés monoaromatiques volatiles, inflammables et ayant des propriétés toxiques. Ils sont notamment présents dans les sols. Cela résulte des fuites de réservoirs de carburants, de déversements et d’effluents des raffineries de pétrole (Cao et al. 2009). Provenant de la dégradation de la lignine et du pétrole brut, les hydrocarbures mono-aromatiques sont aussi d’origine pétrolière et pétrochimique (Negraia 2010). Les hydrocarbures poly-aromatiques Composés d’au moins deux cycles aromatiques condensés de type benzène, les hydrocarbures aromatiques polycycliques sont issus de la combustion incomplète de matières carbonées (Técher 2011). Souvent associés à des hydrocarbures BTEX ou alcanes, les hydrocarbures poly-aromatiques sont difficilement dégradables. Les hydrocarbures aromatiques sont des contaminants hydrophobes et donc faiblement biodisponibles. Ainsi, ils résistent à la biodégradation. En revanche, la biodégradation des hydrocarbures polyaromatiques augmente avec la température (Cao et al. 2009). Bactéries dégradant les hydrocarbures aromatiques Certaines espèces bactériennes ont la capacité de dégrader des hydrocarbures aromatiques (insaturés). La biodégradabilité des hydrocarbures aromatiques est possible en aérobie et anaérobie (Roger et Jacq, 2000). Le tableau 2 présente une liste incomplète de bactéries dégradant certains hydrocarbures BTEX (Farhadian et al. 2007 ; Mi Jin et al. 2013). Master Biologie Gestion - SBBB - Gaudu Florian Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures 11 Sources bibliographiques Bactéries Hydrocarbures utilisés Rhodococcus rhodochrous Rhodococcus sp. RR1, RR2 Rhodococcus pyridinovorans PYJ-1 Rhodococcus sp. strain DK17 Pseudomonas sp. ATCC 55595 Pseudomonas putida Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens Pseudomonas putida F1 Pseudomonas putida souche mt-2 Ralstonia picketii PKO1 Burkholderia cepacia G4 Cladophialophora sp. souche T1 Blastochloris sulfoviridis ToP1 Azoarcus sp. souche EB1 Azoarcus tolulyticus Td15 Dechloromonas sp. Souche RCB Thauera aromatica K172 Geobacter gerbiciae TACP-2T Geobacter metallireducens GS15 Geobacteraceae Desulfobacula toluolica To12 Desulfobacterium cetonicum Achromobacter xylosoxidans Janibacter sp. SB2 Be, To, Eb, Xy Be, To, Eb, mXy, pXy Be, To, mXy Be, To, Eb, oXy Be, pXy Be, To, Eb, oXy Be Be, To, Eb, oXy Be, To, Eb To, mXy, pXy To To Be, To, Eb, Xy To Eb To, mXy Be, To To To To Be, To, Xy To To Be, To, Eb, Xy Be, To, Eb, Xy Farhadian et al. 2007 Farhadian et al. 2007 Farhadian et al. 2007 Farhadian et al. 2007 Farhadian et al. 2007 Farhadian et al. 2007 Farhadian et al. 2007 Farhadian et al. 2007 Farhadian et al. 2007 Farhadian et al. 2007 Farhadian et al. 2007 Farhadian et al. 2007 Farhadian et al. 2007 Farhadian et al. 2007 Farhadian et al. 2007 Farhadian et al. 2007 Farhadian et al. 2007 Farhadian et al. 2007 Farhadian et al. 2007 Farhadian et al. 2007 Farhadian et al. 2007 Farhadian et al. 2007 Farhadian et al. 2007 Farhadian et al. 2007 Mi Jin et al. 2013 Tableau 2 : Liste incomplète de bactéries dégradant certains hydrocarbures BTEX (Be : Benzène, To : Toluène, Eb : Ethylbenzène, Xy : Xylènes, oXy : o-xylène, pXy : p-xylène, mXy : m-xylène) Aucune souche ne peut dégrader tous les hydrocarbures BTEX individuellement. En revanche, certaines espèces bactériennes sont capables de dégrader des hydrocarbures BTEX en anaérobie en utilisant différents mécanismes (Tableau 3). Bactéries Hydrocarbures Type de Sources bibliographiques utilisés métabolisme Souche BS-TN Thauera aromatica K172 Thauera aromatica T1 Azoarcus spp., diverses souches To To To To RN RN RN, RF RN Widdel et Rabus, 2001 Widdel et Rabus, 2001 Chakraborty et Coates, 2004 Widdel et Rabus, 2001 Master Biologie Gestion - SBBB - Gaudu Florian Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures 12 Azoarcus spp. souches mXyN1, M3,Td3, Td15 Azoarcus tolulyticus Tol4, Td15 Azoarcus sp. souche T Azoarcus sp. souche EbN1 Azoarcus sp. souche EB1 Azoarcus sp. souche PbN1 Azoarcus sp. souche pCyN1 Halomonas sp.NS-TN Vibrio sp. NAP-4 Pseudomonas sp. NAP-3 Souche NaphS2 Clone 30 Souche ToN1 Souche mXyS1 Souche EbS7 Souche oXyS1 Desulfobacterium cetonicum Desulfobacula toluolica Clone SB29 Geobacter metallireducens Geobacter gerbicium Dechloromonas souche RCB Dechloromonas souche JJ mXy, To To To Eb, To Eb Eb, Pb pCy, To To Nap Nap Nap Be To mXy, oEt, To Eb oXy, oEt, To To To Be To To To To RN RF RN, RF RN RN RN RN RN RN RN RS RS RF RS RS RS RS RS RS RF RF RF RF Widdel et Rabus, 2001 Chakraborty et Coates, 2004 Chakraborty et Coates, 2004 Widdel et Rabus, 2001 Widdel et Rabus, 2001 Widdel et Rabus, 2001 Widdel et Rabus, 2001 Widdel et Rabus, 2001 Widdel et Rabus, 2001 Widdel et Rabus, 2001 Widdel et Rabus, 2001 Widdel et Rabus, 2001 Chakraborty et Coates, 2004 Widdel et Rabus, 2001 Widdel et Rabus, 2001 Widdel et Rabus, 2001 Chakraborty et Coates, 2004 Widdel et Rabus, 2001 Widdel et Rabus, 2001 Widdel et Rabus, 2001 Chakraborty et Coates, 2004 Chakraborty et Coates, 2004 Chakraborty et Coates, 2004 Tableau 3 : Liste incomplète de bactéries dégradant certains hydrocarbures BTEX (Be : Benzène, To : Toluène, Eb : Ethylbenzène, Xy : Xylènes, oXy : o-xylène, pXy : p-xylène, mXy : m-xylène, Pb : n-propylbenzene, Nap : naphtalène, oEt : o-ethyltoluene, pCy : p-cymene, RN : dénitrification, RS : sulfato-réduction, RF : réduction de Fe III) Geobacter metallireducens et Geobacter gerbicium permettent de dégrader le toluène en anaérobie. L’accepteur d’électrons est ici le Fe(III). En revanche, il n’a pas été démontré que ces souches bactériennes soient capables de dégrader d’autres hydrocarbures monoaromatiques (Chakraborty et Coates, 2004). Pseudomonas putida est décrit comme l’un des seuls microorganismes capable d’utiliser le benzène, le toluène, l’éthylbenzène, le phénol et d’autres composés aromatiques comme seule source de carbone et d’énergie (Mazzeo et al. 2010). La souche FMB08 appartenant au genre Pseudomonas est pratiquement aussi efficace qu’un consortium bactérien. Lorsqu’un consortium dégrade 90%, cette souche est en effet capable de biodégrader 85% des hydrocarbures BTEX dans les mêmes conditions (MorlettChávez et al. 2010). Que ce soit dans des conditions aérobies ou anaérobies, une co-culture de Master Biologie Gestion - SBBB - Gaudu Florian Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures 13 Pseudomonas putida et Pseudomonas fluorescens peut permettre de dégrader tous les hydrocarbures BTEX (Shim et al. 2001). En n’utilisant qu’un nombre restreint d’enzymes et sans y avoir été préalablement exposées, les Pseudomonas ont la capacité de dégrader de nombreux hydrocarbures aromatiques (Técher 2011). Certaines souches de Pseudomonas sont ainsi capables de dégrader des hydrocarbures poly-aromatiques. Pseudomonas paucimobilis est en effet capable de dégrader le phénanthrène. En plus de cette molécule, Pseudomonas putida dégrade le naphtalène (Seo et al. 2009). Essentiellement en aérobiose, certaines souches bactériennes ne sont aptes à dégrader que quelques hydrocarbures aromatiques polycycliques. Rhodococcus sp est ainsi capable de dégrader le naphtalène. Mycobacterium sp et Rhodococcus sp UW1 sont eux capables de dégrader le pyrène (Roger et Jacq, 2000). De nombreuses autres souches bactériennes peuvent dégrader des hydrocarbures poly-aromatiques. Ainsi, le fluoranthène est dégradable par Alcaligenes denitrificans, certaines souches de Mycobacterium sp, Mycobacterium flavescens, Pasteurella sp, Rhodococcus sp, certaines souches de Stenotrophomonas maltophilia ou encore Sphingomonas paucimobilis. La souche Janibacter sp YY-1 est capable de dégrader plusieurs composés aromatiques comme le dibenzofurane, fluorène, phénanthrène, anthracène (Seo et al. 2009). Les principales souches bactériennes dégradant les HAP se retrouvent souvent chez les taxons Pseudomonas, Burkholderia, Sphingomonas, Mycobacterium et Nocardia (Técher 2011). Mécanismes de dégradation des hydrocarbures aromatiques Mécanismes de dégradation des hydrocarbures mono-aromatiques Plus stables que les alcanes, les molécules aromatiques sont toutefois bien dégradées par les bactéries. Les études portant sur la biodégradation des hydrocarbures BTEX montrent que le toluène est l’hydrocarbure le plus facilement dégradable, suivi dans l’ordre par le pxylène, le m-xylène, le benzène, l’éthylbenzène et le o-xylène (Cao et al. 2009). Les enzymes en jeu sont les mono-oxygénases ou di-oxygénases. Ces enzymes permettent d’activer la réaction de dégradation. Ainsi, l’hydrocarbure est oxydé, de l’énergie Master Biologie Gestion - SBBB - Gaudu Florian Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures 14 est produite et une partie de l’hydrocarbure est assimilée par la cellule. La figure 2 décrit l’équation type de la biodégradation d’un hydrocarbure en milieu aérobie (Widdel et Rabus, 2001) : Figure 2 : Dégradation d’un hydrocarbure en milieu aérobie. L’hydrocarbure est oxydé, une partie est assimilée par la bactérie et une autre partie permet de produire de l’énergie (catabolisme). Même s’il n’est pas toujours le substrat utilisé, l’oxygène est nécessaire pour activer la réaction. Plus précisément, cinq voies métaboliques ont été identifiées concernant la biodégradation des BTEX en milieu aérobie. Prenons l’exemple du toluène. La première voie consiste en l’oxydation du substituant alkyle et la production d’un composé di-hydroxylé. Suite à une fission du cycle aromatique, on obtient des intermédiaires du cycle de Krebs. Les quatre autres voies débutent par l’hydroxylation du cycle aromatique. Les di-oxygénases attaquent les cycles aromatiques et produisent des composés di-hydroxylés alors que les monooxygénases produisent des oxydes d’arène. Ceux-ci sont très instables et convertis en phénols. Parfois soumis à de nouvelles mono-oxygénations, ils peuvent être convertis en catéchols. La formation de catéchol permet alors l’ouverture d’un cycle. Les souches débutant la dégradation du toluène par une hydroxylation ont une croissance plus rapide que les souches débutant par l’oxydation du groupe méthyle (Cao et al. 2009). Master Biologie Gestion - SBBB - Gaudu Florian Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures 15 C’est seulement à la fin des années 1980 que l’on observait la capacité de certains microorganismes à dégrader les hydrocarbures aromatiques en anaérobie. Aussi, une large diversité de microorganismes est aujourd’hui connue pour dégrader le benzène, le toluène, l’éthylbenzène et les trois isomères du xylène. Ces composés sont utilisés comme source de carbone et d’énergie par certaines bactéries. Le fumarate est souvent utilisé pour activer le processus catabolique des hydrocarbures (Chakraborty et Coates, 2004). Les mécanismes d’activation de la biodégradation des hydrocarbures en anaérobie peuvent varier. NO3-, Fe(III) et SO42- sont ainsi différents accepteurs d’électrons utilisés pour la dégradation d’un hydrocarbure en anaérobie (figure 3) (Widdel et Rabus, 2001). Figure 3 : Dégradation d’un hydrocarbure en milieu anaérobie. L’hydrocarbure est oxydé, une partie est assimilée par la bactérie et une autre partie permet de produire de l’énergie (catabolisme). NO 3-, FeIII et SO42- jouent le rôle d’accepteurs d’électrons. Des mécanismes d’activation sont nécessaires. Master Biologie Gestion - SBBB - Gaudu Florian Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures 16 Cas du toluène : Lorsqu’il est dégradé par les microorganismes, il se convertit alors en dioxyde de carbone et en eau. En dégradant le toluène, la croissance des microorganismes est plus rapide que lors de la dégradation d’autres hydrocarbures aromatiques (Widdel et Rabus, 2001). En anaérobie, le benzylsuccinate est ainsi le produit d’une simple réaction entre le toluène et le fumarate. Cette première étape de la dégradation du toluène est donc possible grâce à l’intervention d’une enzyme, la benzylsuccinate synthétase. La réduction d’oxydants tels que le chlorate ou le perchlorate ainsi que celle de substances humiques peut être couplée à la dégradation du toluène en anaérobie (Chakraborty et Coates, 2004). Cas du benzène : Le benzène est dit facilement biodégradable. La photo-oxydation, la volatilisation, l’advection et la biodégradation influent sur son devenir (Negraia 2010). Le benzène par exemple subit cette voie de dégradation (Figure 4) : Figure 4 : Dégradation du benzène. Inspiré par les propos recueillis dans Tarayre 2012. Cas de l’éthylbenzène : L’éthylbenzène subit une déshydrogénation de son groupe méthyle par l’éthylbenzène déshydrogénase. Ainsi est formé le 1-Phényléthanol qui sera ensuite oxydé. Ici, l’accepteur d’électron est le nitrate (Chakraborty et Coates, 2004). Lorsque l’accepteur d’électron est le sulfate, la première réaction de dégradation de l’éthylbenzène est aussi le produit d’une réaction entre l’hydrocarbure et le fumarate. Il en résulte aussi un succinate, le 1-phenylethyl succinate. En revanche, avec une molécule d’eau, l’éthylbenzène est déshydrogéné pour donner un alcool secondaire (Widdel et Rabus, 2001). Master Biologie Gestion - SBBB - Gaudu Florian Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures 17 Cas des xylènes : C’est en oxydant le noyau aromatique et les groupements méthyle des xylènes que les microorganismes les dégradent. On les retrouve alors sous la forme de diméthylphénols, d’acide méthylsalicilique, d’acides toluiques ou de méthylcatéchols (Negraia 2010). De la même manière que pour l’éthylbenzène, les xylènes, en présence de fumarate et par l’intermédiaire de l’enzyme methylbenzylsuccinate synthétase, forment le benzylsuccinate correspondant. Par exemple, on obtient du 3-methylbenzylsuccinate par la dégradation de mxylène (Widdel et Rabus, 2001). Mécanismes de dégradation des hydrocarbures poly-aromatiques La principale source de biodégradation des hydrocarbures aromatiques polycycliques comme l’anthracène est principalement possible en aérobiose (Roger et Jacq, 2000). En anaérobie, la dégradation des hydrocarbures aromatiques polycycliques est parfois possible sous certaines conditions. En effet, les ions nitrates, ferreux ou sulfates jouent alors le rôle de réducteur (Técher 2011). En aérobie, les hydrocarbures aromatiques polycycliques de faible poids moléculaires, c'est-à-dire ne comportant qu’environ 2 à 3 cycles aromatiques, peuvent suffire à la croissance de certaines souches bactériennes. Celles-ci utilisent donc les hydrocarbures comme source de carbone et d’énergie (Técher 2011). La voie principale de dégradation des hydrocarbures poly-aromatiques consiste en l’oxydation d’un cycle aromatique par une mono ou di-oxygénase. Un ou deux atomes d’oxygène sont incorporés au niveau d’un cycle aromatique. La première étape de la biodégradation des hydrocarbures poly-aromatiques est en effet la formation de catéchols. La formation de gentisate à partir d’acide salicylique est aussi possible. L’ouverture d’un cycle aromatique est ensuite possible et la dégradation complète aussi (Técher 2011). En fonction du positionnement des oxygènes apportés par la di-oxygénase, on distingue deux voies métaboliques. Le catéchol peut en effet subir un clivage méta ou un clivage ortho. Après plusieurs étapes, le clivage méta induit la formation de pyruvate puis d’acétaldéhyde alors que le clivage ortho induit, après plusieurs réactions, la formation de succinyl-CoA puis d’acétyl-CoA et enfin de succinate. Master Biologie Gestion - SBBB - Gaudu Florian Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures 18 Dans le cas de la formation de gentisate, le clivage du gentisate permet la formation de composés pouvant entrer dans le cycle de Krebs (Cao et al. 2009). Cas du naphtalène : Utilisé comme source de carbone et d’énergie par de nombreux genres bactériens (Mycobacterium, Rhodococcus, Pseudomonas, Sphingomonas, etc.), le naphtalène est l’un des hydrocarbures poly-aromatiques les plus simples et les plus solubles. Suite à l’action de l’enzyme naphtalène di-oxygénase puis d’une déshydrogénation, le naphtalène est transformé en un 1,2-dihydroxynaphtalène. Cette molécule est ensuite métabolisée en un salicylate qui sera ensuite décarboxylé en catéchol (Seo et al. 2009). En milieu anaérobie, la réaction initiale de la dégradation du naphtalène résulte de la formation de 2-Naphtoate. Cette réaction, couplée avec l’utilisation de CO2 et la production d’H+, permet de produire de l’énergie (Widdel et Rabus, 2001). Conditions influençant la biodégradation des hydrocarbures mono-aromatiques Présence d’accepteurs d’électrons : En anaérobie, la concentration en accepteurs d’électrons tels que les nitrates ou les sulfates peut être limitante (Schaefer et al. 2010a). Ethanol : En aérobie, la dégradation du toluène est ralentie par la présence d’éthanol. Dans un milieu pauvre en carbone, la présence d’éthanol à de faibles concentrations (1mg/L) a même une influence positive sur la dégradation du benzène. L’effet positif de l’éthanol sur la croissance de la cellule de la bactérie l’emporte sur l’effet négatif qu’il a sur le flux métabolique du benzène. En revanche, de fortes concentrations en éthanol diminuent la dégradation du benzène. (Lovanh et al. 2002). En anaérobie et en présence de nitrates, l’éthanol améliore la biodégradation des hydrocarbures TEX. En revanche, sans accepteurs d’électrons, l’éthanol ralentit la vitesse de dégradation de ces hydrocarbures (Schaefer et al. 2010a). Master Biologie Gestion - SBBB - Gaudu Florian Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures 19 En aérobie, la présence d’éthanol ralentit la biodégradation des hydrocarbures BTEX (Schaefer et al. 2010b). Présence de peroxyde d’hydrogène : En anaérobie, la biodégradation du toluène et du benzène par une co-culture de Pseudomans putida et Pseudomonas fluorescens peut être améliorée grâce à l’ajout d’H202. Le peroxyde d’hydrogène est ainsi utilisé comme source d’oxygène (Shim et al. 2001). Concentrations en BTEX : Globalement, plus la concentration en hydrocarbures BTEX est élevée (supérieure à 240mg/L), plus la biodégradation sera lente (Mi Jin et al. 2013). En anaérobie, certains consortiums bactériens sont adaptés et peuvent dégrader les hydrocarbures BTEX. En revanche, la concentration d’un mélange d’hydrocarbures BTEX dans un sol joue un rôle important sur la rapidité de la biodégradation. Avec un mélange d’hydrocarbures BTEX de concentration 30mg/kg de sol (5mg/L de chacun des 6 hydrocarbures BTEX), tous ces hydrocarbures sont biodégradés en une vingtaine de jours. Or, plus on augmente la concentration du mélange dans le sol, plus les biodégradations du benzène et des xylènes seront lentes. En revanche, celles du toluène et de l’éthylbenzène restent rapides. Avec un mélange d’hydrocarbures de concentration 300mg/kg, pratiquement 100% du toluène et de l’éthylbenzène sont dégradés en 50 jours alors que seulement 31% du benzène et 48% du pxylène le seront (Jufeng et al. 2007). Acétate de sodium : En présence d’acétate de sodium, la dégradation des hydrocarbures BTEX est renforcée (Jufeng et al. 2007). Master Biologie Gestion - SBBB - Gaudu Florian Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures 20 IV. Dégradation des alcanes Les alcanes Contrairement aux hydrocarbures aromatiques, les alcanes sont des hydrocarbures saturés. Ceux-ci peuvent être linéaires, ramifiés ou cycliques. Ils sont aussi appelés paraffines (Tableau 1). On les retrouve abondamment dans les gisements de pétrole notamment. Aussi, les alcanes sont non miscibles à l’eau (Bourgeais 2009). Bactéries dégradant les alcanes Différentes souches de bactéries sont capables de dégrader les alcanes. En fonction de la longueur des chaînes des alcanes, différents types de bactéries sont spécialisés dans leur dégradation. Le méthane n’est lui dégradable que par des bactéries méthylotrophes strictes. Ces bactéries Gram négatives appartiennent, entre autres, aux genres suivants : Methylobacter, Methylococcus, Methylomonas, Methylocystis, Methylosinus (Bouderhem 2011). La souche Pseudomonas oleovorans est une souche de référence concernant la dégradation des alcanes. Rhodococcus erythropolis NTU-1 est une souche bactérienne largement capable de biodégrader les alcanes en milieu aqueux. En milieu salé, cette bactérie a la capacité de floculer. Cela permet la capture des hydrocarbures dans le milieu. Ceux-ci sont alors disponibles pour les bactéries. (Liu et al. 2009). Certaines bactéries sont reconnues pour dégrader des hydrocarbures saturés (alcanes par exemple) en l’absence d’oxygène (Tableau 4) (Widdel et Rabus, 2001). Bactéries Hydrocarbures utilisés Type de métabolisme Sources bibliographiques Azoarcus sp. Souche HxN1 Souche OcN1 Souche HdN1 Souche TD3 Souche Hxd3 Alc Alc Alc Alc Alc RN RN RN RS RS Widdel et Rabus, 2001 Widdel et Rabus, 2001 Widdel et Rabus, 2001 Widdel et Rabus, 2001 Widdel et Rabus, 2001 Master Biologie Gestion - SBBB - Gaudu Florian Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures 21 Souche Pnd3 Souche AK01 Clones B1–B3 Alc Alc Alc RS RS Widdel et Rabus, 2001 Widdel et Rabus, 2001 Widdel et Rabus, 2001 Tableau 4 : Liste incomplète de bactéries dégradant les alcanes (Alc : alcanes, RN : dénitrification, RS : sulfatoréduction) Mécanismes de dégradation des alcanes En aérobie L’oxygène moléculaire est nécessaire à la dégradation aérobie des alcanes. Malgré une toxicité importante des alcanes à courte chaîne pour les bactéries, ceux-ci s’évaporent facilement. Les alcanes à plus longue chaîne sont eux principalement dégradés par oxydation terminale et parfois di-terminale (Figure 5) (Tarayre 2012). Figure 5 : Dégradation d’un n-alcane. Inspiré par les propos recueillis dans Tarayre 2012. L’absence de groupements terminaux méthyliques sur les cycles des alcanes cycliques réduit les possibilités de dégradation par les bactéries. L’attaque enzymatique est en effet plus difficile. En revanche, la présence de groupes alkyles rend les molécules plus sensibles. En anaérobie Le 1-Methylpentyl succinate est le résultat d’une réaction entre un n-hexane et une molécule de fumarate. Cette réaction est la première de la dégradation d’un n-hexane en milieu anaérobie. Master Biologie Gestion - SBBB - Gaudu Florian Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures 22 Cas du méthane : Petit et très stable, le méthane est le plus simple des hydrocarbures. Il fait partie des alcanes. Sa biodégradation est couplée à la réduction de sulfates. En effet, on observe par exemple une diffusion de méthane provenant des sédiments marins vers l’air. Or, avant même le contact avec l’oxygène, le méthane disparaît. Cette disparition est accompagnée d’une réduction de sulfates (Widdel et Rabus, 2001). CH4 + SO42- => HCO3- + HS- + H2O Un consortium de bactéries sulfato-réductrices seraient à l’origine de cette réaction (Widdel et Rabus, 2001). Master Biologie Gestion - SBBB - Gaudu Florian Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures 23 Conclusion Les impacts environnementaux, sanitaires et économiques de la pollution par les hydrocarbures sont de plus en plus importants. Il est donc nécessaire de décontaminer des milieux pollués. La bioremédiation s’avère être une alternative très intéressante. Constituant entre 65% et 95% des pétroles bruts, les hydrocarbures et notamment les alcanes et hydrocarbures aromatiques sont donc soumis à de nombreuses recherches (Bouderhem 2011). Afin d’obtenir des taux de dégradation conséquents, les bactéries, sous la forme de consortiums bactériens, sont les microorganismes les plus utilisés. Ainsi, les voies métaboliques d’oxydation des hydrocarbures par les bactéries sont particulièrement étudiées. Des souches telles que Pseudomonas putida sont aujourd’hui considérées comme très performantes. En milieu anaérobie, les bactéries utilisent d’autres accepteurs d’électrons : NO3-, SO42et FeIII. Les alcanes sont eux principalement dégradés en milieu aérobie. Ils sont en effet dégradés par oxydation terminale et parfois di-terminale. En sachant que la mise en œuvre de cette méthode est peu couteuse, de nombreuses voies de recherche sont donc à envisager. Il est en effet nécessaire de définir des consortiums bactériens efficaces. Préalablement, tous les paramètres des sols à décontaminer doivent être minutieusement étudiés. Master Biologie Gestion - SBBB - Gaudu Florian Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures 24 Bibliographie SUPPORTS PAPIERS : Ouvrage complet : Tarayre. C. Bioremédiation de sols pollués aux hydrocarbures. 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