CellulesSouchesCours1.doc

Cours1
14.03.2008
EC CELLULES SOUCHES
Il s'agit d'un domaine assez ancien mais qui a subit des avancées extraordinaires depuis 10 ans.
On va parler ici des cellules souches somatiques(=adultes), embryonnaires, et de la capacité de
reprogrammer les cellules adultes pour en faire des cellules pluripotentes.
La notion de bioéthique est également essentielle.
Les cellules souches s'autorenouvellent par division symétrique. Une cellule souche donne une autre
cellule souche , puis subit une division asymétrique , elle peut donner une cellule déjà différente ,
s'engageant dans la différenciation. Les cellules progénitrices se divisent 3 à 4 fois pour donner des
cellules différenciées assurant une fonction. Elles ne prolifèrent presque plus.
Beaucoup de tumeurs solides contiennent des cellules souches. Donc même traitées les tumeurs
peuvent réapparaître.
 Il y a des tumeurs à renouvellement rapide (ex: l'épiderme qui se renouvelle toutes les 3
semaines, l'intestin , les cellules hématopoïétiques.)
 Des tissus qui ne se renouvellent pas ( ex: muscles , cerveau , foie , coeur). Mais qui en cas de
blessure peuvent quand même régénérer de manière efficace (foie+++)
La cellule souche est importante pour la thérapie embryonnaire. On n'utilise pas les même cellules
selon les traitements.
Ex: Je me blesse , on me donne des précurseurs matures (GR), mais pas de progéniteur.
Pour les grands brûlés , il y a perte de peau, on doit soigner immédiatement, sur le moment,
mais cette peau doit perdurer , il faut alors inclure des cellules souches. Pour sauver à court et
long terme.
Ex: Dans les leucémies, il existe un moyen d'irradier le patient pour détruire les cellules
hématopoïétiques mauvaises. On doit regreffer des cellules souches de MO.
On peut avoir des besoins de progéniteurs intermédiaires aussi (ilôts  , endothéliaux...)
On prend des neurones issus de foetaux pour les cerveaux de patients atteints de parkinson.
Il faut 5 foetus par patient, sur une durée de 2 à 3 ans!!
I) La peau
Elles protège de l'environnement, contre les aggressions, elle maintient la thermorégulation.
Il s'agit d'un épithélium pluristratifié , fait de kératinocytes (=cellules épidermiques).
Au niveau de la couche basale (jonction dermo-épidermique) , il y a des kératinocytes proliférants .
Parmis ces cellules on y trouve quelques cellules souches.
Une cellule souche donne des progéniteurs qui arrêtent de se diviser, perdent leurs attaches,
migrent, et se différencient, jusqu'à la perte de leur noyau (=cornification) puis il y a désquamation.
Chez l'homme, l'ensemble de cette étape dure 3 semaines.
Ex1: Les grands brûlés: On effectue un prélèvement par biopsie dans un endroit protégé, puis mise en
culture, et amplification des kératinocytes. Au bout de 3 semaines on obtient des feuillets
épidermiques. Ce sont des rectangles que l'on va greffer sur les patients. Attention , même avec cela ,
une greffe n'est jamais parfaite car il manque toujours les annexes cutannées (poils, cheveux, glandes
sébacées et sudoripares). Les follicules pileux ont des cellules souches qui sont importantes pour le
renouvellement. Les glandes sudoripares sont importantes pour la thermorégulation.Ces patients là
ont une peau sèches car ne sécrétant pas de sébum!
Ex2: Les cellules souches hématopoïétiquesprogéniteurscellules différenciées (cellules
dendritiques , hématies, GR, NK...). Celles-ci proviennent d'une seule et unique cellule souche de la MO.
En irradiant une souris , elle meurt d'aplasie sauf si on lui greffe des cellules de moelle osseuse. Elle
peut reconstituer son stock de cellules hématopoïétiques. Ces cellules souches reprennant le relai.
Le potentiel d'une cellule souche est différent selon sa localisation;
LA cellule souche par définition est l'ovocyte . Il est totipotent , capable de reformer tous les types
cellulaires incluant les feuillets embryonnaires (et les cellules des 3 premiers jours).
Le jour suivant on a un blastocyste (juste avant la nidation). Il a déjà des types cellulaires différents
(le trophoblaste va donner le placenta , dans la cavité vide on retrouve le bouton embryonnaire fait de
40 à 100 cellules pouvant reformer tous les types de cellules de l'organisme sauf le placenta biensûr!)
Ces cellules du bouton embryonnaire peuvent être extraites , mises en culture, et donner
des cellules souches embryonnaires (cellules ES) qui sont pluripotentes (NB: ne donnent pas le
placenta!!!)
Très dynamiques , elles restent peu longtpemps à ce stade. Il faut donc les stopper à ce stade pour
qu'elles gardent leur potentiel de manière immortelle (impossible in vivo).
Dans l'embryon on a des cellules foetales, pouvant être pluripotentes , mais qui sont de manière
générale multipotentes.
A la naissance, on coupe le cordon ombilical du bébé, dans lequel on retrouve du sang contenant des
cellules pluri et multipotentes. Elles constituent un grand espoir .
L'idée est née de garder les cellules du cordon , de les stocker pour les réinjecter chez l'individu qui ,
plus tard , aurait un problème de santé.
Chez l'adulte, il existe encore quelques rares cellules multipotentes (ex: dans la peau , les
follicules pileux) ou unipotentes (ex: les hépatocytes se divisant donnant d'autres hépatocytes).
Les cellules tumorales testiculaires (=tératocarcinome) , mises en cultures, peuvent donner des
cellules aux mêmes caractères que les cellules souches embryonnaires.
Pourquoi s'interresser aux cellules souches?
Si on a un déficit de fonction , et qu'on connait bien les mécanismes, on peut pousser les
cellules souches à se différencier. L'autorenouvellement est aussi une caractéristique des cellules
souches tumorales, on peut alors mieux comprendre comment cette tumeur se forme et quels sont
les moyens de la stopper.
On ne reconnait pas une cellule souche à sa tête! Souvent , pour la reconnaitre , c'est une
détection indirecte rétrospective! Mais cela constitue bienévidemment un gros problème!
Comment identifier une cellule souche?
1) On prend les cellules que l'on met en suspension dans un tube , que l'on fait traverser par des
rayons lasers qui détectent les tailles des cellules, leur nombre, leur granulosité, ou bien on utilise
des Ac , et selon le  mesuré on détermine le nombre de cellules reconnues par les Ac. Cela permet
de quantifier par émission de laser et recueil de longueurs d'ondes. C'est ce qu'on appelle : la
Cytométrie de Flux.
Les cellules de Hoechst rentrent dans les cellules , s'intercalent dans l'Adn, émettent de la
fluorescence à une certaine  .
On retouve aussi une population de SP beaucoup moins intense (+vers la gauche), celles-ci
excluant l'agent fluorescent.Elles possèdent un transporteur qui exclue le colorant. Ces cellules pour
le système hématopoïétique (SHP)sont les cellules les plus proches du SHP.
2) Le Label Retaining Ability
C'est la capacité des cellules à retenir le colorant. Sur la diapo on observe une couche de cellules
colorées. Le BrDU rajouté dans l'eau de boisson remplace les désoxyriboT de l'Adn dans une cellule
qui se divise.
On ajoute ensuite des Ac anti BrDU, et on constate que les cellules basales sont BrDU+.
Les cellules basales sont donc proliférentes.
Ensuite on va passer plusieurs semaines sans BrDU.Les cellules se divisant rapidement vont donc
perdre ce BrDU. Celles qui le gardent sont semi-quiescentes! =Ce sont les cellules souches.
Donc les cellules souches in-vivo sont semi-quiescentes! C'est une une détermination rétrospective !
3) Clonogénicité
C'est la capacité d'une cellule souche à proliférer de manière importante.
On effectue un prélèvement par biopsie cutannée, on prélève des kératinocytes, puis on effectue un
ensemencement dilué (les cellules ne se touchent pas!). On voit alors lesquelles forment des clônes.
Une cellule différenciée ne donne pas de clones.Les clones détectés sont repiqués et réensemencés.
Paraclone: cellule qui ne se divise pas.
Méroclone: Progéniteur, intermédiaire
Holoclone: cellule souche
La cellule souche est semi-quiescente et se divise si besoin (in vivo).Elle sait qu'elle va être
utilisée toute sa vie donc elle ne se presse pas :) . En culture par contre , elle n'arrête pas de se
diviser.
On a effectué un marquage au BrDU et on a vu qu'il y avait une faible activité mitotique au niveau de la
partie basse du follicule pileux (cellules souches).Par contre la forte activité mitotique se situe au
niveau du bulbe.
Les seules cellules à capacité prolfératives sont au niveau du Bulge!
In vivo= le bulge a des cellules souches.Il a une forte incorporation de BrDU
In vitro= Il a une faible activité clonogénique.
4) Reconstitution In Vivo
En irradiant une souris on peut reconstruire un système hématopoïétique.
5) Marqueurs de surface
Ormis le système hématopoïétique, on ne connait aucun tissus où il existe des marqueurs de surfaces
des cellules souches.
Même ches les cellules HP il y a peu ou pas de marqueurs en réalité.
En général ce sont plutôt des combinaisons de marqueurs. Mais il n'y a pas de marqueurs de la cellule
souche elle-même!
Comment démontrer la multipotence?
Ex: pour la peau et les glandes sébacées.
Est-ce que les cellules du bulge sont capable de ne refaire que des follicules pileux, ou bien également
de l'épiderme et des annexes?
Expérience: On prend un follicule pileux de souris transgénique. Elle a intégré un gène spécifique (le
gène code pour l'enzyme galactosidase, transmis dans le génome des descendants).Si ces souris
boivent du x-gal, elle deviennet bleue).
On prélève le bulge de cette souris et on le met dans une autre souris, en lui donnant le x-gal(substrat
du gal).Donc elle va devenir bleue uniquement au niveau des structures produites par les cellules du
bulge car la souris n'exprime pas naturellement la gal.
Ils l'ont injecté dans l'embryon d'une souris gestante.pb: à la naissance le souriceau va rejeter la
greffe Ils ont ensuite coupé un morceau de la peau(peau+bulge) de cet embryon pour le donner à une
souris nude (immunodéprimé).Après 10 semaines on effectue une coloration. Dans certaines parties:
tout est bleu. Donc les cellules du bulge ont formé le follicule pileux, l'épiderme, et les glandes
sébacées!
Les cellules du bulge sont donc multipotentes.
Exemple2: Utilisation d'un rétrovirus qui exprime la galactosidase. On gratte la peau de la souris: on
l'infeste! Toutes les cellules de sa peau sont infectées: sont bleues. Si on attends longtps, l'épiderme
se régénère, et seules les cellules souches ayant intégré le rétrovirus et leur descendance resteront
bleues (attention, les cellules descendantes sont des cellules différenciées!).
Il existe des cellules souches dans les glandes sébacées en dehors de l'épiderme. Mias c'est une
situation de réparation!Alors en réalité, est ce que ce sont vraiment des cellules souches? ou bien
plutot des cellules stimulées par les blessures?
Concept de niche
C'est l'environnement de la cellule souche.Elles fabriquent elles-mêmes des facteurs d'adhésion, et
des facteurs solubles. Les cellules mésenchymateuses environnantes participent également.
La cellule-souche produit elle-même son envirronnement, la niche , avec des fibroblastes et d'autres
cellules envirronnementales: notion d'intéraction!
Il existe de nombreuses voies de signalisation qui ont été mises en évidence dans la niche . Mais la
cellule issue de la cellule souche par division va perdre le contact avec la niche (à cause de
l'encombrement stérique) donc va se différencier, entre en différenciation et devient une cellule
progénitrice. Cette cellule progénitrice va migrer, entrer en contact avec une nouvelle niche, et ce
contact va lui permettre de se différencier dans une spécificité. Mais on ne sait pas si cette cellule
progénitrice qui quitte la niche initiale est pluripotente ou est destinée à une seule voie: unipotente.
Pourquoi les cellules souches existent-elles?
Est-ce dû au génome?à l'épigénétique? à une modification au niveau de la chromatine? ++++
Estce que le progéniteur est mutlipotent? Unipotent? La cellule qui la niche est-elle déjà prédestinée?
autant de questions auxquelles on ne sait pas encore répondre.
La cellule souche est-elle une cible privilégiée de la cancérogénèse?
Il existe différentes protéines dans le cycle cellulaire qui vérifient l'intégrité du génome.
Les gènes sont soumis à un stress génotoxique, induisant des dommages à l'Adn.
Ex: La p53: c'est la gardienne du génome, se situant au niveau des check points. S'il existe un
problème , elle va bloquer le cycle , puis induit chez la cellule soit une réparation soit l'apoptose.
Attention, si il y a une mutation sur p53 ou bien un stress très rapide et massif, ce mécanisme peut
ne pas fonctionner
Sénescence: la cellule arrête de se diviser grâce à l'absence de l'enzyme télomérase.
Dans le processus de cancérogénèse, l'instabilité télomérique est induite, il n'y a plus de sénescence.
(dans la diapo, au niveau de la couche basale on retrouve des cellules souche et progénitrice. On a
utilisé des Ac anti p53 muté). Notre corps subit de multiples mutations à cause de notre exposition au
soleil depuis tout petit.
Les cellules porteuses de cette mutation ont une répartition spéciale: les progéniteurs mutés forment
une sorte de "colonne". Cette mutation peut avoir lieu sur les cellules souches ou progénitrices.
Il faut un deuxième évènement pour avoir une expansion clonale. La mutation sur un oncongène
transforme puis amplifie cette cellule. Ainsi on aura plus de chance dans ce pool modifié d'avoir une
accumulation d'anomalies. D'autre part, ces cellules perdurent toute la vie donc ont plus de chance
d'être ou de devenir anormales.
On a déterminé que les cancers les plus fréquents sont les cancers cutannés , et parmis eux,
le plus grave est le mélanome.
On peut aussi avoir des carcinomes spinocellulaires , dûs à une mutation sur RAS, cellules provenant
des cellules souches épidermiques.
Egalement des cancers basocellulaires (carcinomes du bulge), ou encore trichofolliculaires.
Plasticité des cellules souches
1) Chez les invertébrés
Chez les animaux, les capacités de régénération sont beaucoup plus importantes. Par exemple, si on
coupe un ver de terre en 2, on obtient... 2 vers de terre ! Cela est dû à la présence d'un pool de
cellules totipotentes ayant une mémoire d'embryogénèse.
2)Chez les invertébrés
La salamandre peut régénérer une patte , ou encore un oeil, par un phénomène de cicatrisation et de
dédifférenciation, formation d'un blastème puis par redédifférenciation.
Morphophylaxie: régénération d'une partie du corps . Attention, à distinguer de la division, qui est une
prolifération normale.
La transdifférenciation (plasticité)
Certains chercheurs ont pris des précurseurs de cerveau, puis ont introduit les cellules neuronales
dans des cellules préalablement irradiées, et ont découverts avec stupéfaction que ces cellules
avaient pu se renouveler. Donc ces cellules ont une très grande plasticité. Pour commencer , ils ont
donc compris que le cerveau possédait des cellules souches. En
définitive il existe une telle plasticité que l'homme pourrait se
rapprocher de la salamandre. (moyens d'identifier les cellules
greffées: faire une transplantation hommefemme). A partir de
cellules de MO mises en culture , en plusieurs semaines, on obtient
des cellules progénitrices multipotentes (MAPC).Les chercheurs ont
donc conclu que les MAPC avaient un potentiel plus important que les cellules souches
hématopoïétiques. En gros, que les MAPC sont les mères de toutes les cellules souches. Mais en
réalité, ces travaux ont été effectués à l'aide de cellules contaminées, donc tout était biaisé.Les
chercheurs n'ont pas vérifié l'homogénéité des populations (il y a eu mélange des cellules neuronales,
circulantes et HP).Il a donc fallut tout revérifier à l'échelon clonal (c.à.d par cultivation d'une seule
cellule ).
La Fusion
Si on met des cellules neuronales en présence de cellules ES (autorenouvellement) , les
cellules ES pourraient induire les autres à devenir progénitrices. Les chercheurs utilisent des
marqueurs très spécifiques (OCT4, jamais exprimé dans les cellules adultes).
Ils ont pris le promoteur de oct4, les ont mis dans les cellules neuronales. Ce promoteur est inactif
normalement mais actif dans les cellules ES.
Donc si oct4 est actif c'est que les cellules sont pluripotentes. (gfp gène qui fluoresce).
Si les cellules neuronales sont fluorescentes c'est qu'elles sont pluripotentes, donc résistantes à la
fluomicyne (oct4 actif que quand ce sont des cellules pluripotentes).
Le promoteur va être mis en amont d'un gène connu (ici gfp=fluo).