L`ensemencement se fait par les techniques habituelles.
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BOUILLON ET GELOSE NUTRITIVE Ces milieux permettent la culture des bactéries peu exigeantes. Composition Formule en g/L d'eau distillée : Peptone pancréatique d’organe 10 g Extrait de viande 10 g Chlorure de sodium 5g Agar 20 g pH = 7.5 Rôles des composants - peptone : protéine plus ou moins dégradée par action enzymatique avec des peptides et des acides aminés source d’azote organique - extrait de viande : -NaCl à 5 g/l : protéines peu dégradées glucides sels minéraux vitamines hydrosolubles source d’azote organique source de carbone organique et d’énergie MILIEU DE CHAPMAN Le milieu de Chapman est un milieu sélectif, surtout utilisé en microbiologie médicale, permettant la croissance des germes halophiles. Parmi ces germes figurent au premier rang les bactéries du genre Staphylococcus, mais aussi les Micrococcus, lesEnterococcus, les Bacillus, et de rares bactéries à Gram négatif. Composition Sa composition, en grammes par litre d'eau distillée, est la suivante : Peptones Extrait de viande Chlorure de sodium Mannitol Rouge de phénol Agar Eau distillée (qsp) 11,0 g 1,0 g 75 g 10,0 g 0,025 g 15 g 1000 mL Rouge de phénol Principe Ce milieu contient un inhibiteur : fortes concentrations en chlorure de sodium (75 g.L-1), ce qui permet un isolement sélectif de Staphylococcus tolérant les fortes concentrations en NaCl. On peut étudier la fermentation du mannitol par virage au jaune de l’indicateur coloré, le rouge de phénol, autour des colonies. Technique L'ensemencement doit être massif, en stries serrées ou par inondation. Ne pas sécher le milieu à l’étuve avant l’ensemencement : la déssication du milieu pourrait entraîner une augmentation de la concentration en NaCl et rendre le milieu trop inhibiteur. Lecture L'utilisation du mannitol se traduira par une acidification du milieu, provoquant le virage au jaune de l'indicateur de pH. Les colonies mannitol + sont entourées d’une auréole jaune. L'utilisation du mannitol est un caractère discriminatif important dans le genreStaphylococcus, Staphylococcus aureus étant mannitol +. Ne pas confondre la pigmentation des colonies et le virage de l’indicateur coloré. Ainsi des colonies pigmentées en jaunes et mannitol + : forte suspicion de S. aureus Remarque : le milieu de Chapman permet la sélection des Staphylococcus et une orientation pour l’identification de l’espèce S. aureus.Mais il ne s’agit que d’un test de présomption et une confirmation par des tests plus spécifiques (coagulase. ADNase…) reste obligatoire. .GELOSE HEKTOEN La gélose Hektoen est un milieu d'isolement des Salmonelles et des Shigelles, bien que de nombreuses bactéries à Gram négatif puissent se développer sur ce milieu. L'identification d'entérobactéries pathogènes repose sur la non utilisation des glucides présents dans le milieu. Composition En g par litre d'eau distillée Protéose peptone Extrait de levure Chlorure de sodium Thiosulfate de sodium Sels biliaires Citrate de fer III et d'ammonium Salicine Lactose Saccharose Fuschine acide Bleu de bromothymol Agar Eau distillée (qsp) 12g 3g 5g 5g 9g 1,5g 2g 12g 12g 0,1g 0,065g 14g 1000mL Bleu de bromothymol Principe Ce milieu contient trois types de glucides : la salicine (qui est un hétéroside), le saccharose et le lactose. L'orientation de l'identification des colonies isolées est fondée sur l'attaque de ces trois glucides, les salmonelles et les shigelles n'attaquant aucun de ces glucides. Un autre caractère biochimique que l'on peut suivre sur ce milieu est la production d'H2S à partir de thiosulfate. Elle se traduit par l'obtention de colonies à centre noir, coloration due à la formation de sulfure de fer. Ce caractère est important car il permet de différencier les Salmonella (H2S +) des Shigella (H2S -). Deux indicateurs sont présents dans le milieu : - le bleu de bromothymol (indicateur de pH) - la fuschine acide (qui se colore en présence d'aldéhyde. On observe alors une teinte saumonée si la souche utilise un ou plusieurs des glucides présents). Technique L'ensemencement se fait par les techniques habituelles. Résultats Colonies saumon Escherichia, Levinea, Citrobacter diversus, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Yersinia Colonies saumon à centre noir Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Colonies bleu-vert à centre noir Suspicion deSalmonella, à différencier deProteus mirabilis Colonies bleu-vert ou vertes Suspicion deShigella ou deSalmonella GELOSE SS Gélose Salmonella-Shigella. Milieu sélectif permettant l’isolement d'entérobactéries pathogènes. Il est très utilisé pour la recherche de Salmonella dans les selles et les denrées alimentaires peu pour les Shigella car trop sélectif. Composition Formule en g/L d'eau distillée : Extrait de viande de bœuf Bio-polytone Sels biliares Lactose Citrate de sodium Thiosulfate de sodium Citrate ferrique Vert brillant Rouge neutre Agar pH = 7,0 5 5 8,5 10 8,5 8,5 1 0,330 mg 0,025 13,5 Rouge neutre Principe Le milieu contient 3 inhibiteurs : sels biliaires, vert brillant et forte concentration en citrate de sodium. Ceux-ci empêchent la pousse de toutes bactéries Gram+, et rendent difficile la croissance des bactéries Gramautres que Salmonella et Shigella. Le milieu contient du lactose dont la fermentation est révélée par le virage de l’indicateur coloré, le rouge neutre, à sa teinte acide. Si la bactérie ensemencée fermente le lactose, le milieu devient rouge, par virage du rouge neutre, du fait de l’acidification du milieu. Le milieu contient du thiosulfate à partir duquel les bactéries qui en sont capables peuvent produire H 2S, qui sera révélé par le citrate ferrique. Si la bactérie ensemencée produit H2S, en présence du fer III, un précipité noir se forme au centre de la colonie. Ensemencement Isolement par la méthode des cadrans. Incuber 18 à 24 h à 37°C. Lecture colonies rouges : lactose + colonies incolores : lactose – colonies à centre noir : H2S + MILIEU MAC CONKEY Milieu sélectif pour l'isolement des bacilles GramSalmonella et Shigella ainsi que des bactéries coliformes dans les eaux, les produits alimentaires, les produits pharmaceutiques et biologiques . Composition Formule en g/L d'eau distillée : Peptone Lactose Sels biliaires Cristal violet Rouge neutre Chlorure de sodium Agar 20 10 1.5 0.001 0.05 5 15 pH = 7,1 Rouge neutre Principe Ce milieu contient deux inhibiteurs de la flore Gram+, les sels biliaires et le cristal violet. Le milieu contient un critère de différenciation, le lactose dont l’utilisation est révélée par l’indicateur coloré du milieu, le rouge neutre. Il vire au rouge en milieu acide. si la bactérie ensemencée fermente le lactose, le milieu devient rouge, par virage du rouge neutre, du fait de l’acidification du milieu. Ensemencement Isolement par la méthode des cadrans. Incuber 18 à 24 h à 37 °C. Lecture Colonies rouges entourées d’un hâlo opaque de la même couleur du à la précipitation des sels biliaires: lactose+ Colonies jaunes ou incolores : lactose- MILIEU BCP au pourpre de bromocrésol C’est un milieu utilisé pour la détection et l’isolement des entérobacteriacées dans l’eau, les produits alimentaires, l’urine et les selles. Intérêt : Ce milieu facilite la différenciation des colonies par le caractère lactose. Il inhibe l’envahissement de la surface de la boite par des nappes de Proteus car il ne contient pas d'électrolytes. Composition Peptone 5g Extrait de viande 3g Lactose 10g Agar 15g Pourpre de bromocrésol Eau qsp 0,025g 1L pH7 Pourpre de bromocrésol Technique Réaliser un isolement. Incuber 18 à 24 h maximums à 37°C. Principe C’est un milieu non sélectif qui est utilisé pour l’isolement de nombreuses espèces n’appartenant pas aux entérobactéries. C’est un milieu contenant une base nutritive ordinaire permettant la pousse des bactéries non exigeantes. Il contient un critère de différenciation : la fermentation du lactose révélée par le virage en milieu acide de l’indicateur coloré de pH, le bromocrésol pourpre. Il est déficient en électrolytes : absence d'ions minéraux. Lecture La fermentation du lactose se traduit par le virage du bromocrésol pourpre à sa teinte acide jaune. Colonies jaunes bactéries lactose + Colonies bleues bactéries lactose – GELOSE BAIRD-PARKER Recherche et dénombrement de Staphylococcus aureus Composition Le tellurite et le jaune d'œuf sont ajoutés au milieu au moment de l’emploi. Formule en g/L d'eau distillée : Bio-Trypcase Extrait de viande de bœuf Extrait de levure Chlorure de lithium Pyruvate de sodium Glycocolle Tellurite de potassium Emulsion de jaune d'œuf à 10 % Agar 10 5 2 5 10 12 1 mL 1 mL 15 pH = 7,2 Principe Ce milieu contient une base nutritive riche. Il contient des accélérateurs de la croissance : le pyruvate de sodium et le glycocolle Il contient 2 inhibiteurs : le chlorure de lithium et le tellurite de potassium. Il contient 3 critères de différenciation : réduction du tellurite en tellure noir protéolyse des protéines du jaune d'œuf halo clair autour de la colonie hydrolyse par une lécithinase des lécithines du jaune d'œuf liseré blanc opaque autour de la colonie Lécithine + H20 diglycérides + choline Lecture : S. aureus donne des colonies : - noires brillantes, convexes de 1 à 2 mm de diamètre entourées d'un halo clair. La plupart des autres espèces de staphylocoques sont inhibées ou ne produisent pas de colonies caractéristiques en 24 heures. Les microcoques, Bacillus et quelques levures peuvent pousser sur ce milieu. GELOSE COLUMBIA AU SANG DE MOUTON C’est un milieu d’isolement enrichi sur lequel les Streptocoques se développent bien. Il permet, la lecture du caractère hémolytique. Composition Gélose columbia + 0.5 mL sang de mouton défibriné Principe C’est un milieu riche d’autant plus par la présence de sang. Technique Préparation de la gélose au sang : - liquéfier au bain-marie bouillant la gélose (desserrer les bouchons des tubes). - la maintenir à 45°C. - à l’aide d’une pipette Pasteur, prélever le sang stérilement. - déposer dans la boite 20 gouttes de sang, bien réparties. - rajouter par-dessus, la gélose en surfusion. - homogénéiser par des mouvements lents de rotation. - laisser sécher à l’étuve. Ensemencer. Lecture Hémolyse : zone claire d’hémolyse totale de diamètre 3-4 mm entourant les colonies. Hémolyse : zone floue et granuleuse, verdâtre de 1 à 2 mm de diamètre SABOURAUD La gélose de Sabouraud constitue un milieu classique pour la culture, l'isolement et l'identification des levures et des moisissures saprophytes oupathogènes. Elle est recommandée essentiellement pour l'isolement des moisissures dans les prélèvements peu chargés en bactéries, les contrôles de stérilité des produits pharmaceutiques, cosmétiques ou alimentaires, la culture des moisissures en vue de réaliser leur identification. Dans le cas de prélèvements fortement contaminés, il est préférable d'utiliser la gélose Sabouraud + chloramphénicol. Composition En g par litre de milieu : Peptone pepsique de viande Glucose Agar agar 10 35 15 pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C: 5, 7 +/- 0,2. 500 g de poudre permettent de préparer 8,3 litres de milieu. Préparatlon - Mettre en suspension 60 g de milieu déshydraté dans 1 litre d'eau distillée ou déminéralisée - Porter à ébullition lentement en agitant jusqu'à dissolution complète - Répartir en tubes ou en flacons. - Stériliser à l'autoclave à 120°C pendant 15 minutes. Tout chauffage excessif du milieu conduit à la dénaturation de l'agar en pH acide et par conséquent à l'obtention d'un milieu trop mou. Principe La gélose de Sabouraud est un milieu peptoné et glucosé permettant la croissance des levures et des moisissures, et en particulier des dermatophytes. La gélose de Sabouraud peut servir de base à la préparation de milieux spéciaux par addition d'antibiotiques, de sang ou de vitamines. L'ajout de triphényltétrazolium à raison de 100 mg par litre en fait un milieu de différenciation pour les Candida. Technique - Transférer l'échantillon à analyser sur le milieu. - Etaler l'inoculum en surface à l'aide d'un étaleur en verre stérile. - Incuber à 20 - 25°C de 3 à 5 jours. GELOSE T.S.N. Gélose Tryptone – Sulfite – Néomycine) Milieu de dénombrement des anaérobies sulfito-réducteurs (spores de Clostridium sulfito-réducteurs et Clostridium perfringens) dans les produits alimentaires. Composition Formule en g/L d'eau distillée : Tryptone Sulfite de sodium Sulfate de néomycine Sulfate de polymyxine Extrait de levure Citrate de fer Agar 15 1 0.05 0.02 10 0.5 13.5 pH = 7,2 Principe Ce milieu contient 1 critère de différenciation : le sulfite de sodium dont la réduction est révélée par fer (précipitation du sulfure de fer). La température d’incubation permet de sélectionner : les anaérobies sulfito-réducteurs : à 37°C Clostridium perfringens à 46°C L’incubation se fait en anaérobiose. Lecture : Colonies rouges colonies sulfito-réductrices spores de bactéries anaérobies sulfito-réductrices ou Clostridium perfringens en fonction de la température d'incubation. GÉLOSE TCBS (THIOSULFATE, CITRATE, BILE, SACCHAROSE) Principe La gélose TCBS est un milieu sélectif, préconisé par l'OMS (Organisation Mondiale de la Santé) pour la recherche et l'isolement des vibrions pathogènes présents dans les prélèvements poly microbiens. La forte concentration en bile et en citrate, associée à un pH élevé (pH = 8,6) permet l'élimination de nombreuses bactéries. La croissance des Entérobactéries et des Enterococcus n'est cependant que ralentie. Composition Formule en g/L d'eau distillée : Peptone de caséine Peptone de viande Citrate de sodium Citrate de fer III Bile de bœuf desséchée Thiosulfate de sodium NaCl Saccharose Bleu de bromothymol Bleu de thymol Agar Eau distillée (qsp) 5,0 g 5,0 g 10,0 g 1,0 g 8,0 g 10,0 g 10,0 g 20,0 g 0,04 g 0,04 g 14,0 g 1000 mL Technique Ensemencer à partir de la selle. Incuber 24 heures à 37°C. Résultats La principale source de carbone est le saccharose (dioloside : glucosefructose). L'utilisation du saccharose se traduit par une diminution du pH, et par le virage de l'indicateur de pH, qui vire au jaune. Les colonies saccharose positives apparaissent donc jaunes. La présence de thiosulfate et de citrate de fer III permet d'autre part de suivre la production d'H2S. Colonies jaunes Vibrions saccharose + :V.cholerae V. alginolyticus V. fluvialis V.furnissii V.metschnikovii Colonies vertes Vibrions saccharose - : V.vulnificus V.parahaemolyticus V.mimicus Colonies à centre noir : colonies H2S +. Colonies sans centre noir : colonies H2S -. Petites colonies jaunes Escherichia coli Klebsiella Shigella P.aeruginosa Petites colonies vertes Enterococcus faecalis MILIEU Mossel Principe Le milieu est utilisé en alimentaire pour observer une éventuelle contamination à Bacillus cereus. L’utilisation de se milieu doit être orienté préalablement. Les bactérie doivent être mannitol – . Le milieu contenant du jaune d’œuf, on peut mettre en évidence la précense de la lécithinase. Ce milieu doit selectionner uniquement les Bacillus cereus des autres espèces pouraaient avoir les mêmes profils d’orientation. Il est donc ajouté au milieu de la polymyxine en quantité variable selon la pollution présumée. Composition Valeur données en g.L-1 Extrait de viande Peptone D-mannitol Chlorure de sodium Rouge de phénol Agar pH 7.1 1 10 10 10 0,025 12 Apprès autoclavage ajouter : Jaune d’œuf au ½ Polymyxine 10 mL 1, 2, 5 ou 10 mL selon contamination Répartir une goute étalée sur le milieu. La lecture s'effectue après 18 à 24 heures d'incubation à 37°C. Rouge de phénol (indicateur de pH) Lecture Les bactéries Baccilus cereus Colonie rouge mannitol Colonie avec halo blanchâtre lécithinase + BOUILLON LACTOSE BILIE AU VERT BRILLANT (BLBVB) AVEC CLOCHE Milieu de dénombrement des coliformes en microbiologie alimentaire (analyse des eaux et des aliments). Il sera incubé à 30°C pour la recherche des coliformes totaux et à 44°C pour la recherche des coliformesthermotolérants. Composition Formule en g/L d'eau distillée : Peptone 10 Lactose 10 Bile 20 cm3 Vert brillant 0,013 pH = 7,4 Principe Ce milieu contient 1 critère de différenciation : le lactose dont la fermentation est révélée par la présence de gaz s’accumulant dans la cloche. Il contient 2 inhibiteur des bactéries Gram+ : la bile et le vert brillant. Couleur finale du milieu : verte. Lecture : Trouble du milieu et gaz sous la cloche fermentation du lactose coliformes.
